Góp phần nghiên cứu định lượng artesunate trong viên nén bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến

BỘ YTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
=======oOo======
NGUYỄN QUỐC HOÀN
GÓ P PHẦN NGHIÊN cứu ĐỊNH LƯỢNG ARTESUNATE
TRONG VIÊN NÉN BANG PHƯƠNG PHÁP
ĐO QUANG PHỔ HÂP THỤ TỬ NGOẠI - KHẢ KIÊN
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ 1998-2003)
Người hướng dẫn: PGS. TS. Trần Đức Hậu
Nơi thực hiện: Bộ môn Hoá Dược
Thời gian thực hiện: 03/2003 - 05/2003
Lời cảm ơn
Sau quá trình nghiên cứu học tập tại trường tôi đã nhận được đề tài “ Góp
phần nghiên cứu định lượng ffrtesunate trong viên nén bằng
phương pháp đo quang phổ hấp íhụ íử ngoại - hhả hiến” do PGS.
TS. Trần Đức Hậu trực tiếp hướng dẫn.
Trước nhất xỉn cho tôi tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Trần Đức
Hậu - Người đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện khoá
luận này.
Tôi xin chân thành cám ơn các thầy cô giáo, cán bộ kỹ thuật viên ở bộ
môn Hoá Dược đã quan tâm giúp đỡ và tạo mọi điêu kiện để tôi hoàn thành
tốt khoá luận của mình.
Nhân dịp này tôi cũng xin được bày tỏ lồng biết ơn tới những thầy cô đã
dìu dắt, giảng dạy tôi trong những năm học tập tại trường.
Cuối cùng tôi vô cùng cám ơn gia đình, bạn bè và người thân đã động
viên và hết lòng giúp đỡ tôi để tôi hoàn thành luận văn này.
Hà Nội, tháng 5 năm 2003
Sinh viên: Nguyễn Quốc Hoàn
MỤC LỤC
Đặt vấn đ ề 1
Phần 1 - Tổng quan 3

1.1 - Vài nét về bệnh sốt rét, công tác phòng và điều trị sốt rét trong
những năm qua 3
1.2 - Cây thanh hao hoa vàng và hoạt chất của nó 5
1.2.1 - Đặc điểm thực vật 5
1.2.2 - Phân b ố 5
1.2.3 - Tác dụng và công dụng

6
1.2.4 - Thành phần hoá h ọc 6
1.3 - Tổng quan về Artesunate 8
1.3.1 - Bán tổng hợp Artesunate 8
1.3.2 - Đại cương về Artesunate 10
1.3.3 - Điểm qua một số phương pháp định lượng hiện nay

14
1.4 - Nhận xét và lựa chọn
19
Phần 2 - Thực nghiệm và kết quả 20
2.1 - Nguyên liệu và trang thiết b ị 20
2.1.1 - Dụng cụ và thiết b ị 20
2.1.2 - Hoá chất 20
2.2 - Phương pháp nghiên cứu 20
2.3 - Kết quả nghiên cứu 21
2.3.1 Khảo sát cơ sở 21
2.3.3 khảo sát các điều kiện định lượng 22
2.3.2 Xây dựng phương pháp 28
2.3.4 Áp dụng 29
2.3.5 Đánh giá phương pháp 30
Phần 3 - Kết luận và đề xuất 34
Phụ lục

Tài liệu tham khảo
ĐẶT VÂN ĐỂ
Sốt rét là một bệnh xã hội gây ra bởi ký sinh trùng sốt rét thuộc chi
Plasmodium. Những loài gây bệnh cho người thường gặp là:
Plasmodium falciparum: là loài chủ yếu, tỷ lệ mắc bệnh là 70%.
Plasmodium malariae: tỷ lệ mắc bệnh là 20 - 30%.
Plasmodium vivax: tỷ lệ mắc bệnh là 1 - 2%.
Plasmodium ovale: tỷ lệ mắc bệnh rất thấp chỉ khoảng 0,5%.
Bệnh sốt rét phát triển ở nhiều nước trên Thế giới, đặc biệt là những nơi có
khí hậu ẩm thấp (nóng, ẩm, mưa nhiều) như nước ta. Tác nhân truyền bệnh là
muỗi. Bệnh sốt rét là bệnh gây nguy hại lớn đến sức khoẻ của con người, thể
ác tính có thể dẫn tới tử vong. Dịch tễ bệnh rất phức tạp, bệnh có thể lan thành
dịch nếu không được phát hiện và ngăn chặn kịp thời.
Cho đến nay, mặc dù đã có rất nhiều đầu tư nghiên cứu nhưng việc kiểm
soát bệnh vẫn rất khó khăn, do đó vai trò của thuốc trong điều trị và dự phòng
sốt rét là hết sức quan trọng. Nhưng một số loại thuốc trước đây được coi là
đặc hiệu hiện đã bị kháng, đặc biệt là Chloroquin đã bị kháng trên 60 quốc gia
trong đó có Việt Nam [11]. Vì thế việc tìm kiếm và đưa vào sử dụng các thuốc
mới trong điều trị sốt rét luôn là một vấn đề lớn được đặt ra với những nhà
nghiến cứu [16].
Artesunate là một trong những dẫn chất của Artemisinin thuộc nhóm thuốc
điều trị sốt rét mới (Artemisinin được chiết xuất từ cây thanh hao hoa vàng).
Nhiều nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới đã công nhận những ưu điểm
của nhóm thuốc này: cắt sốt nhanh, ít độc cho cơ thể, có khả năng qua được
hàng rào máu não để điều trị sốt rét thể não.
Ở Việt Nam Artesunate đã được sản xuất và được sản xuất với quy mô
ngày càng lớn, đồng thời đã được Bộ Y tế công nhận là thuốc điều trị sốt rét
chủ yếu trong chương trình chống sốt rét quốc gia ở cả hai dạng viên nén và
1
dạng tiêm. Chính vì vậy việc kiểm tra và đánh giá chất lượng của các sản

phẩm bào chế này là rất quan trọng. Để góp phần vào công tác này chúng tôi
triển khai thực hiện nghiên cứu một phương pháp mới để định lượng
Artesunate trong viên nén. Với mong muốn tham gia xây dựng tiêu chuẩn chất
lượng cho thuốc này
2
PHẦN 1 - TỔNG QUAN
1.1 - Vài nét về bệnh sốt rét, công tác phòng và điều trị sốt rét
trong những năm qua
Sốt rét là một bệnh truyền nhiễm, có tính chất dịch tễ quan trọng vì có thể
lan thành dịch nếu không được phát hiện và ngăn chặn kịp thời. Bệnh phát
triển ở nhiều nước trên thế giới, đặc biệt là những nước thuộc vùng khí hậu
nhiệt đới như châu Á, châu Phi, châu Mỹ Latinh. Theo thống kê của tổ chức Y
tế Thế giới (WHO), hàng năm trên thế giới có khoảng 100 - 200 triệu người bị
sốt rét thuộc 95 quốc gia trên tất cả các châu lục. Bệnh sốt rét đã gây hậu quả
hết sức nghiêm trọng đối với sức khoẻ của nhân dân ở những vùng sốt rét lưu
hành [3]. Việt Nam là một nước nằm trong vùng sốt rét lưu hành mạnh của
Thế giới. Theo báo cáo của Viện sốt rét ký sinh trùng và côn trùng TW, hàng
năm nước ta có khoảng 500.000 người mắc bệnh sốt rét và 200 - 5.000 người
chết do sốt rét, hơn 30,1 triệu người đang sống trong vùng sốt rét lưu hành
[12].
Từ những năm cuối thập kỷ 90, công tác phòng và chống sốt rét đã được
Bộ Y tế quan tâm hơn và cũng đã thu được nhiều thành tích đáng kể. Tổng kết
kết quả phòng chống sốt rét ở Việt Nam từ năm 1992 - 1997 cho thấy bệnh
nhân sốt rét năm 1997 đã giảm 59% so với năm 1991, chết do sốt rét đã giảm
97%, đồng thời số vụ dịch sốt rét cũng đã giảm 92%. Đầu tư hàng năm mua
thuốc và hoá chất phòng chống sốt rét của Chương trình phòng chống sốt rét
quốc gia khoảng 35 - 40 tỷ đồng [13].
Với tính chất nguy hiểm của bệnh, việc ngăn chặn và loại trừ sốt rét là một
trong những nhiệm vụ hàng đầu của ngành Y tế. Việc kiểm soát bệnh sốt rét là
rất khó khăn, có tới 1,7 tỷ người hiện đang sinh sống trong những vùng mà

3
trước đó sốt rét đã bị đẩy lùi, nhưng giờ đây đang phát triển mạnh trở lại. Hiện
nay, ký sinh trùng sốt rét đã kháng hầu hết các thuốc quen thuộc vẫn .dùng để
phòng và điều trị trong thời gian qua. Cloroquin đã bị Plasmodium falciparum
kháng khoảng 60%, các thuốc như Fansida cũng đã bị kháng khoảng 30 -
35%. Mefloquin tác dụng khá tốt nhưng giá thành cao và hiện cũng đã bắt đầu
bị kháng. Quinin ít bị ký sinh trùng kháng hơn nhưng lại có một số tác dụng
phụ gây khó khăn cho bệnh nhân. Chính vì vậy, nhóm thuốc Artemisinin và
dẫn chất khi mới được đưa ra áp dụng điều trị sốt rét đã gây được tiếng vang
lớn và thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học [12,15]
Vào đầu thập niên 70, các nhà khoa học Trung Quốc đã chiết được từ lá
cây thanh hao hoa vàng một loại hoạt chất có tác dụng điều trị sốt rét có tên
gọi là Quinghao Su (QHS) hay là Artemisinin chất này đã được chứng tỏ hiệu
lực chống sốt rét tốt kể cả với những bệnh nhân mắc chứng kháng thuốc. Hơn
thế nữa, Artemisinin và dẫn chất của nó có thể vượt qua hàng rào máu não nên
rất có hiệu lực trong điều trị sốt rét thể não [8]. Tuy nhiên, do độ tan của
Artemisinin trong nước kém và tỷ lệ tái phát sau khi dùng còn cao nên tác
dụng điều trị của Artemisinin phẩn nào còn bị hạn chế. Để hoàn thiện khả
năng của Artemisinin, những năm đầu thập kỷ 80, các nhà khoa học đã tiếp
tục nghiên cứu và bán tổng hợp ra một số dẫn chất mới từ Artemisinin như:
Artesunate, Artemether, Arteether, acid Artelinic có tác dụng điều trị cao
hơn chất gốc, đồng thời có thể sử dụng được cho cả đường tiêm. Trong số đó
thì Artesunate là chất được dùng phổ biến nhất. Hiện nay, ở Việt Nam đã có
nhiều cơ sở sản xuất Artemisinin dạng viên để uống và Artesunate dạng uống
và dạng tiêm để đáp ứng nhu cầu của nhân dân. Vì vậy, vấn đề cần quan tâm
của các nhà sản xuất và quản lý là đảm bảo công tác kiểm tra chất lượng
thuốc. Đã có nhiều công trình nghiên cứu trong nước về các mặt khác nhau
của nhóm thuốc này như tác dụng dược lý, độc tính, dạng bào chế, v.v về
kiểm nghiệm, cũng đã có nhiều công trình nghiên cứu về định tính, định lượng
4

Artemisinin và Artesunate; hiện nay Dược điển Việt Nam III cũng đã có
những chuyên luận về hai thuốc này.
1.2 - Cây thanh hao hoa vàng và hoạt chất của nó
1.2.1 - Đặc điểm thực vật
Tên khoa học: Artemisia annua L. Asteraceae.
Tên dân gian: ngải si, ngải dại, ngải đắng, ngải hôi, ngải hoa vàng
Cây thảo, mọc hàng năm, thân cao tới lm, có rãnh, gần như không lông.
Lá sẻ lông chim 2 lần thành dải hẹp, phủ lông mềm, có mùi thơm. Chuỳ cao ở
ngọn mang chùm dài, hẹp, hoa đầu cao 1,8 - 2,0mm, lá bắc ngoài hẹp có lông
xanh, lá bắc giữa và lá bắc trong xoan rộng. Hoa hoàn toàn hình ống, khoảng
15 cái, hoa trong lưỡng tính. Quả bế nhấn, cao 0,5mm không có mào lông,
hoa tháng 6 - 11, có quả tháng 10 -3. thường lụi vào tháng 5 [2].
Theo thông báo của WHO, của Trung Quốc, của Mỹ, trong khoảng 40 loài
thực vật thuộc chi Artemisia, qua chọn lọc chỉ có loài Artemisia annua L. là
có chứa hoạt chất chữa sốt rét. Theo T.D.HOOKER, M.H.LECOM 1992 và
một số tài liệu khác thì trên Thế giới có khoảng 250 loài thuộc chi Artemisia,
ở Việt Nam đã biết khoảng 15 loài, trong đó có 4 loài là dễ nhầm lẫn với nhau,
đó là: Artemisia apiceaehance, Artemisia capilaris, Artemisia canpestric và
Artemisia annua [2,9].
1.2.2 - Phân bô
Thanh hao hoa vàng phân bố ờ nhiều nơi trên Thế giới chủ yếu tập trung ở
những nơi có khí hậu nhiệt đới và ôn đới như Bắc Mỹ, Đông Âu, Nga, Trung
Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản, Ấn Độ, Tại Việt Nam, cây mọc hoang dại
thành từng cụm dọc ven sông, ven suối, chân đồi nơi ẩm thấp ánh sáng nhiều.
Ta có thể gặp ở các tỉnh như: Quảng Ninh, Lạng Sơn, Cao Bằng, Bắc Cạn,
Thái Nguyên, Vĩnh Phú, Tuyên Quang, Hoà Bình, Thanh Hoá Nghệ An Do
vừa là dược liệu quý, có giá trị kinh tế cao vừa dễ trồng, dễ thích nghi với điều
5
kiện khí hậu nên thanh hao hoa vàng đã được trồng với diện tích rộng, cho
năng suất và hàm lượng hoạt chất cao hơn cây mọc hoang dại. Thời gian thu

hái vào tháng 8 - lúc cây chuẩn bị ra hoa [2]
1.2.3 - Tác dụng và công dụng
Theo YHCT Việt Nam, thanh hao hoa vàng có vị đắng (khổ), tính lạnh
(hàn) quy vào hai kinh can, đởm. Có tác dụng thanh thư tịnh uế, trừ phục nhiệt
ở âm phận dùng chữa những trường hợp cốt chưng lao nhiệt (đau xương,
nóng), đạo hãn (ra mồ hôi trộm), ngược tật (sốt rét), lở ngứa. Còn dùng chữa
mạo cảm, thanh nhiệt, giúp tiêu hoá, lợi gan mật. Có thể dùng riêng hoặc phối
hợp với các thuốc khác [9]. Theo khoa học hiện đại, dùng làm nguyên liệu
chiết Artemisinin để chữa bệnh sốt rét.
1.2.4 - Thành phần hoá học
Tất cả các bộ phận của cây thanh hao hoa vàng đều chứa tinh dầu và hàm
lượng tinh dầu trong cây rất khác nhau, nó phụ thuộc vào giống và nơi trồng,
dao động từ 0,5 - 0,6%. Tinh dầu có màu vàng nhạt và có mùi long não với
thành phần chủ yếu là Camphor, Artemisia ceton, P-myrcen [2,9,14].
Trong thành phần tinh dầu này thì hoạt chất chính có tác dụng điều trị sốt
rét là Artemisinin đã được các nhà khoa học Trung Quốc chiết tách và xác
định cấu trúc từ năm 1972, Artemisinin là một Secquiterpen lacton có cầu nối
peroxyd nội phân tử, chính nhóm này quyết định tác dụng diệt ký sinh trùng
sốt rét. Bên cạnh Artemisinin, người ta còn xác định được một loạt các hợp
chất Secquiterpen khác như sau [14]
6
Artemisin D eoxy artemisinin
Artemisitin
Arteannuin c Arteannuin B Epideoxyarteannuin B
Acid Artemisinic Arteannuin A Quinghao Su IV
(Quinghao Su I)
CH3
I
Arteannuin E
Deox y artem isin in

(Quinghao Su in)
Arteannuin F
Hình 1 • 1: Hợp chất Serquiterpen
1.3 - Tổng quan về Artesunate
1.3.1 - Bán tổng hợp Artesunate
Artesunate được bán tổng hợp từ Artemisinin qua giai đoạn trung gian là
Dihyroartemisinin(DHA) với hiệu suất cao (> 90%) [14,19].
• Giai đoan I
Artesunate được khử hoá nhóm lacton thành Hemiacetal là
Dihydroartemisinin bởi tác nhân khử Natri borohydrid (NaBH4) trong môi
trường Methanol và ở nhiệt độ 0 - 5°c
Sơ đồ phản ứng như sau:
Hình 1.2: Sơ đồ phản ứng khử Artemisinin thành DHA.
DHA có tác dụng trị sốt rét mạnh gấp hai lần Artemisinin nhưng do ít tan
trong nước nên bất tiện cho việc sử dụng. Vì vậy người ta tiếp tục bán tổng
hợp ra Artesunate.
• Giai đoan II:
DHA được este hoá thành Artesunate khi có tác dụng với anhydrid
Succinic, xúc tác là một amin bậc 3: Dimethylamino pyridin(DMAP) hay hỗn
hợp DMAP và Dicyclohecxyl carbodiimid (DCC):
8
Sơ đồ phản ứng:
COOH
Hình 1.3: Sơ đồ tổng hợp Artesunate từ DHA.
Ngoài Artesunate, từ DHA người ta còn bán tổng hợp ra nhiều chất khác
có hoạt lực tác dụng tương tự như: Artemether (AM) và Arteether (AE) bằng
cách cho DHA tác dụng với Methanol hoặc Ethanol xúc tác là acid Lewis.
Artesunate kém bền vững hơn AM và AE do chất này có chức este dễ bị thuỷ
phân, hơn nữa AM và AE lại tan tốt trong dầu và có hoạt tính chống sốt rét
ngang với Artesunate[6,16].

Artemeter Arteeter
Hình 1.4: Công thức của Artemether và Arteether
Hiện nay người ta đã tổng hợp ra một dẫn chất mới có hoạt lực cao trên ký
sinh trùng sốt rét đó là acid Artelinic. Chất này vừa có hiệu lực cao hơn
9
Artesunate và AM, mặt khác muối Natri của nó lại tan tốt trong nước nên có
thể chế được cả dạng uống lẫn dạng tiêm [1].
H^C
h CH3
h CH3
HiC
,-H
ÓCH2— H ^ ) ^ C 0 0 R
Thuỷ Phân
Hình 1.5: Sơ đồ tổng hợp acid Artelinic
1.3.2 - Đại cương về Artesunate
Công thức cấu tạo
HiC
(X .COOH
0
Hình 1.6: Công thức của Artesunate
10
I
- Công thức phân tử: C19H280g
- Trọng lượng phân tử: 384,42
- Tên khoa học: a-Dihydroartemisinin hydrosuccinic.
- Tên khác: acid Artesunic
- Tính chất của Artesunate [4].
Tinh thể không màu hay bột kết tinh trắng, không mùi và thực tế không vị.
Rất khó tan trong nước, rất tan trong Dicloromethan, dễ tan trong Ethanol,

Aceton, Chloroform và dung dịch kiềm. Bền vững trong môi trường trung
tính, trong nước dễ bị thuỷ phân đặc biệt trong môi trường kiềm. Dạng
muối Natri dễ tan trong nước, do vậy để pha dung dịch thuốc tiêm.
Năng suất quay cực của Artesunate là: +10° đến +14° (dung dịch 4% trong
Chloroform)
■ Tác dụng , cơ chế và dược động học của Artesunate:
- Tác dụng: diệt thể phân liệt của ký sinh trùng sốt rét trong máu, kể cả
các trường hợp kháng Chloroquin. Không có tác dụng đối với ký sinh
trùng ở giai đoạn ngoại hồng cầu và thể giao tử. Tác dụng nhanh, hiệu
lực cao , độc tính thấp. Hiệu lực cao với sốt rét ác tính thể não, sốt rét
kháng Chloroquin và kháng cả thuốc sốt rét khác.
- Tác dụng diệt ký sinh trùng của Artesunate mạnh gấp 5 lần so với
Artemisinin. Nó là một trong những thuốc điều trị sốt rét hiệu quả nhất
hiện nay.
- Cơ chế [8,16]: theo Gu và cộng sự, tác dụng diệt ký sinh trùng sốt rét
của Artesunate là do cầu nối peroxyd nội phân tử tạo ra các gốc tự do.
Các gốc này tấn công vào các thành phần cơ bản của ký sinh trùng và
tiêu diệt chúng. Chính vì vậy, khi bị mất cầu nối peroxyd thì thuốc
không còn tác dụng. Ở pH cao, Artesunate tạo ra tức thì các dạng hoạt
động. Cơ chế này khác hẳn với các thuốc tổng hợp trước đây. Bằng
phương pháp đánh dấu dùng Triti các nhà khoa học nhận thấy rằng
11
I
nồng độ thuốc ở hồng cầu nhiễm Plasmodium cao hơn hẳn so với hồng
cầu bình thường. Cơ chế cụ thể là: Artesunate tấn công vào màng
Plasmodium. Ngoài ra, Artesunate Natri còn ức chế hoạt tính của
Cytocrom oxydase và hệ vận chuyển Glutathion trong hồng cầu.
- Dược động học: theo đường uống Artesunate hấp thu từ 24 - 64%. Thời
gian bán thải Tị
/2

bằng 41 phút. Thuốc bị giảm hoạt tính do bị chuyển
hoá tại gan. Thuốc qua được hàng rào rau thai nên tránh dùng cho phụ
nữ có thai. Artesunate thải trừ qua nước tiểu và các chất thải trừ tìm
thấy trong nước tiểu gồm 9,10-Dihydroartemisinin, Deoxyartemisinin,
Dihydrodeoxyartemisinin.
- Tương tác thuốc: tác dụng của Artesunate là do cầu nối peroxyd đem
lại. Vì một lý do nào nào đó mà phân tử Artesunate bị mất cầu nối này
thì nó không còn tác dụng nữa. Do đó tác dụng của Artesunate sẽ bị
giảm đi khi có mặt của chất xúc tác thuỷ phân như Catalase hay các
chất khử như acid Ascorbic, Vitamin E, Glutathion dạng khử và tác
dụng tăng lên khi có mặt các chất oxy hoá gây stress như Misconasol,
Doxarubicin
- Các thuốc chống sốt rét khác như: Mefloquin, Primaquin, Chloroquin
khi phối hợp với Artesunate cho tác dụng hiệp đồng tăng cường hay
hiệp đồng cộng. Ngược lại các chất kháng Folat như Pyrimithamin,
Sulphamid lại có tác dụng đối kháng [8].
■ Chế phẩm và cách dùng Artesunate trong điều trị:
- Chế phẩm:
• Biệt dược: Hiện nay trên thị trường Việt Nam có khoảng trên 10
biệt dược chế phẩm Artesunate ở hai dạng bào chế:
• Dạng bào chế:
Viên nén 50 mg
12
Bột pha tiêm: lọ chứa 60mg acid Artesunic ở dạng bột khô vô trùng
kèm ống tiêm có chứa lml dung dịch Natrihydrocarbonat 5% trong
nước cất.
- Chỉ định: Điều trị sốt rét do Plasmodium fanciparum, Plasmodium
vivax, Plasmodium malarie, kể cả sốt rét do nhiễm Plasmodium
fanciparum đã kháng các loại thuốc khác.
- Liều dùng:

Dạng uống: Viên nén 50mg:
Điều trị: mỗi đợt 12 viên trong 6 ngày.
Phòng bệnh: Uống 2 viên/ lần /tuần X 5 tuần.
Dạng tiêm: hoà tan thuốc vào dung dịch Natrihydrocarbonat cho thêm
dung dịch Glucose đẳng trương để có nồng độ 10mg/ml.
Người lớn: l,2-l,6mg/kg/lần.
Trẻ em < 6 tuổi: lmg/kg/lần.
Tuỳ theo từng bệnh nhân, cứ sau 4-24-48 giờ lại nhắc lại 1 lần.
■ Độc tính:
Được thử tại bộ môn Dược lý - Trường Đại Học Y Hà Nội [3,16].
- Độc tính cấp: LD50 trên chuột nhắt trắng = 1200mg/kg (1081-1331)
bằng đường uống.
- Độc tính bán cấp: Cho thỏ uống qua xông vào dạ dày dung dịch Natri
artesunate 2ml/kg/24h tương ứng với 20mg vào giờ nhất định trong
ngày, cho uống liên tục trong 30 ngày chưa thấy có độc tính bán cấp.
Những thay đổi cấu trúc vi thể ở gan và thận chuột nhắt trắng khi uống
Artesunate liều điều trị: cho chuột nhắt trắng uống Artesunate liều 4mg/kg thể
trọng trong 5 ngày liền:
Không thấy hình ảnh tổn thương cấu trúc tế bào ở mô gan và thận. Cấu
trúc chung của gan và thận không thay đổi.
Có hiện tượng xung huyết các mạch trong thận.
13
j .
- về khả năng gây đột biến: Artesunate không làm tăng tần số rối loạn
nhiễm sắc thể ở tế bào tuỷ xương hoặc tế bào tinh hoàn, không làm xuất
hiện các rối loạn nhiễm sắc thể, không gây nên các rối loạn về sinh sản.
Các chuột con được đẻ ra không có dị tật bẩm sinh: quan sát được cả F1
và F2, số lượng cũng như trọng lượng của chuột con được đẻ ra bình
thường. Khi chuột chửa uống Artesunate không gây nên những bất
thường ở thế hệ con [10].

Năm 1994, Viện Y học lâm sàng các bệnh nhiệt đới đã tiến hành thử
nghiệm Artesunate trên người khoẻ mạnh và bệnh nhân nhiễm Plasmodium
faciparum không biến chứng. Kết quả:
Khi thử trên người khoẻ mạnh không có sự thay đổi về huyết học, sinh hoá,
điện tim trước và sau khi thử. Tại chỗ tiêm không có phản ứng, không đỏ,
không mẩn ngứa. Thuốc khuyếch tán nhanh. Dấu hiệu chủ quan: người tình
nguyện không thấy có cảm giác gì đặc biệt sau khi tiêm.
Với bệnh nhân nhiễm Plasmodium faciparum không biến chứng: thuốc có
hiệu quả điều trị trên mọi đối tượng bệnh (cả người lớn và trẻ em) có tác dụng
mạnh với ký sinh trùng sốt rét, làm giảm nhanh mật độ của ký sinh trùng (đa
số trong vòng 24 giờ đầu), cắt cơn sốt nhanh, ngăn chặn được sốt rét nặng.
Thuốc không ảnh hưởng đến chức năng gan, thận, huyết học, không ảnh
hưởng gì đến hệ tim mạch.
1.3.3 - Điểm qua một sô phương pháp định lượng hiện nay
1.3.3.1 - Các phương pháp định lượng Artesunate trên nguyên liệu
*Phương pháp đo quang phổ hấp thụ vùng tử ngoại
Sau khi đun nóng trong môi trường kiềm, Artesunate chuyển thành Q289
là sản phẩm có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 289nm, do đó có thể định
lượng Artesunate trong chế phẩm và trong nguyên liệu bằng phương pháp đo
độ hấp thụ cuả sản phẩm thuỷ phân này trên máy quang phổ tử ngoại ồ bước
sóng 289nm.
14
Artesunate sau khi thuỷ phân trong môi trường kiềm tạo thành sản phẩm
sau[ll,14,16]:
CH3
H :
coơ
I
h 3c
COOH

KOH
50°c
H3C c °2
coo
ồ
Hình 1.7: Sơ đồ thuỷ phân Artesunate thành Q289.
Nhận xét: phương pháp này dễ thực hiện trang thiết bị để định lượng các cơ
sở đều có được. Sản phẩm đo quang không phải trực tiếp là Artesunate mà là
sản phẩm biến đổi của nó trong môi trường kiềm - Q289. Theo [3] thì hàm
lượng Dihydroartemisin (DHA) trong chế phẩm phải nhỏ phép định lượng mới
cho kết quả đúng. Tuy nhiên trong chế phẩm viên nén lượng DHA thường cao.
* Phương pháp HPLC với detector u v [12,15,17]:
Định lượng Artesunate với pha động là Acetonitril - đệm phosphate pH5,l
(38:62) hoặc với pha động Acetonitril - đệm acetat pH5,1(1:1), bước sóng
phát hiện là 235nm. Hoặc để định lượng Artesunate trong dược liệu, trong các
dịch sinh vật, người ta đã sử dụng phương pháp HPLC với chương trình sắc ký
cột Lichrosorb Rp 60 (125 X 4mm; 5|u,m), pha động: 48% CH3CN 4- 32% dung
dịch KH2P04 0,05M trong nước + 20% nước, tốc độ dòng lml/phút, detector
210nm và thể tích tiêm 20|il, với chương trình trên, Artesunate có tR=21phút.
Nhận xét: Artesunate chỉ hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở vùng bước sóng
ngắn, ở đây bước sóng phát hiện là 235nm, chất định lượng có thể không phải
là Artesunate, nên DHA(nếu có) có thể sẽ ảnh hưởng tới kết quả định lượng.
I
* Phương pháp HPLC với detector điện hoá [3,15]
Trong phân tử Artemisinin và dẫn chất của nó có chứa cầu nối peroxyd
nội phân tử, cầu nối này quyết định tác dụng điều trị sốt rét của riêng chúng.
Đồng thời chính sự có mặt này mà người ta đã sử dụng phương pháp HPLC
với detector điện hoá để định lượng Artesunate .
Quá trình xảy ra trên bề mặt điện cực được mô tả như sau:
Nhận xét: phương pháp này có độ nhạy, tính đặc hiệu cao nên thích hợp

cho việc định lượng với hàm lượng nhỏ như trong dịch sinh vật. Tuy nhiên,
không phải cơ sở nào cũng có đủ trang thiết bị để áp dụng phương pháp này
*Phương pháp HPLC với detector khúc xạ kế
Định lượng Artesunate với pha tĩnh là cột RP18 (12,5cmx3,5mm) cỡ hạt
5|um, pha động là acetonitril - đệm pH3 (l,36g KH2P04 trong 11 nước, điều
chỉnh tới pH3 bằng H3PO4) với tỷ lệ 1:1. Tốc độ dòng 0,6ml/phút, nồng độ
dung dịch mẫu 4mg/ml, thể tích tiêm mẫu 20|ul, detector khúc xạ kế.
* Phương pháp đo kiềm trong môi trường khan [22]:
Dựa vào nhóm acid tự do còn lại trong phân tử Artesunate để tiến hành
định lượng. Chế phẩm (~ 0,2g) được hoà tan trong Ethanol tuyệt đối(50ml).
Chuẩn độ bằng dung dịch Tetrabuthylaminonium hydroxyd trong 2-Propanol
(0,lmol/l). Điểm kết thúc của phép định lượng xác định bằng chỉ thị tím tinh
thể trong acid Acetic khan hoặc bằng kỹ thuật chuẩn độ đến điểm dừng.
H3C
ÒR
Hình 1.8: Sơ đồ khử cực của Artesunate trên bề mặt điện cực.
16
* Phương pháp chuẩn độ acid - base:
Cũng dựa vào nhóm acid tự do người ta có thể định lượng trực tiếp nhóm
chức này bằng dung dịch NaOH với chỉ thị là Phenolphtalein, từ đó suy ra
hàm lượng Artesunate. Hoặc có thể định lượng Artesunate bằng phương pháp
chuẩn độ gián tiếp. Cho Artesunate tác dụng với một lượng dư KOH rồi chuẩn
độ KOH dư bằng dung dịch chuẩn acid.
Nhận xét: phương pháp chuẩn độ trực tiếp chỉ áp dụng khi không có acid
Succinic tự do trong chế phẩm, nên khó có thể áp dụng cho định lượng viên
nén. Phương pháp chuẩn độ gián tiếp là phương pháp dễ thực hiện song
phương pháp này mới chỉ được nghiên cứu áp dụng cho định lượng nguyên
liệu Artesunate, muốn áp dụng trong định lượng các dạng bào chế Artesunate
thì cần được nghiên cứu thêm.
* Phương pháp đo quang phổ hấp thụ vùng khả kiêh[ 15]:

Dựa vào nhóm chức ester của Artesunate để làm phản ứng tạo Hydroxamat
sắt(III) có màu và đo quang dung dịch thu được ở bước sóng 508nm.
Nhận xét: phương pháp này không phụ thuộc sự có mặt của acid Succinic
song DHA lại ảnh hưởng tới kết quả định lượng.
*Các phương pháp khác[ 15]:
- Cầu nối peroxyd nội phân tử của Artesunate và Artemisinin còn thể
hiện sự đáp ứng trên điện cực giọt thuỷ ngân, nên người ta còn dùng
phương pháp cực phổ để định lượng.
- Phương pháp phân tích phóng xạ miễn dịch đã được áp dụng để định
lượng Artemisinin và các dẫn chất của nó.
- Các nhà khoa học Trung Quốc còn miêu tả hai phương pháp khác để
định lượng Artemisinin và các dẫn chất trong mẫu thử sinh học.
- Phương pháp đo độ phóng xạ: sau khi uống thuốc đã được đánh dấu
bằng Tritium [11].
- Phương pháp đo mật độ quang trên sắc ký lớp mỏng.
17
- Định lượng Artesunate dạng nguyên liệu bằng đo quang phổ hấp thụ
vùng khả kiến dựa vào phương pháp tách chiết (phân lập Artesunate
khỏi DHA) và phản ứng tạo Hydroxamat sắt có màu, khắc phục được
ảnh hưởng của DHA đến kết quả định lượng [15].
- Định lượng Artesunate dạng nguyên liệu bằng đo quang phổ hấp thụ
vùng tử tử ngoại ở bước sóng 289 nm, song khắc phục được ảnh hưởng
của DHA đến kết quả định lượng bằng cách tách chiết, phân lập
Artesunate khỏi DHA [17].
* Định lượng Artesunate trong nguyên liệu bằng phương pháp đo
phổ hấp thụ ở bước sóng 345nm[l 1]:
Cân chính xác khoảng 0,lg Artesunate, hoà tan trong Ethanol tuyệt đối
chuyển vào bình định mức 50ml, thêm Ethanol tuyệt đối đến vạch (dung dịch
A), lắc đều. Hút chính xác 5ml dung dịch này cho vào bình định mức 50ml.
Thêm 10ml dung dịch NaOH 0,2N. Đun cách thủy ở nhiệt độ 50°c±l°c trong

45 phút sau đó làm nguội nhanh bằng nước máy. Thêm tiếp 4ml dung dịch
acid Acetic 1,1M, lắc đều. Thêm 5ml dung dịch ZnCl2 0,5%, lắc đều. Thêm
tiếp 10ml dung dịch thuốc thử Diazoni (mới pha khoảng 15 phút trước đó).
Thêm nước cất vừa đủ 50ml, trộn đều. Để yên 15 phút. Đo độ hấp thụ ở bước
sóng 345nm. Song song tiến hành với mẫu trắng (không có 5ml dung dịch A)
và mẫu thử.
1.3.3.2 - Các phương pháp định lượng Artesunate trong viên nén đang
được áp dụng ở nước ta
*Phương pháp quang phổ [4]
Cân 0,130g chế phẩm chuyển vào bình định mức 100ml, hoà tan bằng
Ethanol tuyệt đối, thêm dung môi tới vạch và lắc đều. Lọc, bỏ 10ml dịch lọc
đầu. Lấy chính xác 5,0ml dịch lọc tiếp theo chuyển vào bình định mức 50ml,
thêm dunh dịch NaOH 0,1N đến vạch. Làm ấm trong nồi cách thuỷ 50±l°c
trong 60 phút. Làm nguội nhanh bằng nước lạnh. Đo độ hấp thụ của dung dịch
18
thu được trong vòng 20 phút ở bước sóng 289±lnm, cốc đo dày lcm và mẫu
trắng là dung dịch NaOH 0,1N.
Tính hàm lượng Artesunate trong chế phẩm bằng cách so sánh với
Artesunate chuẩn được tiến hành trong cùng điều kiện.
*Phương pháp đo kiềm trong môi trường nước:
Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với khoảng 0,150g Artesunate
vào bình nón 100ml. Hoà tan bằng Ethanol tuyệt đối đã được trung tính với
chỉ thị Phenolphtalein và lắc kỹ. Thêm hai giọt chỉ thị Phenolphtalein và
chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,05N đến khi xuất hiện màu hồng nhạt.
lml dung dịch NaOH 0,05N tương ứng với 19,22mg Artesunate.
1.4 - Nhận xét và lựa chọn
Phương pháp HPLC với detector điện hoá có khả năng phân tích tốt, tính
đúng và tính đặc hiệu cao, song hiện nay ở Việt Nam vẫn chưa thể áp dụng
được.
Các phương pháp HPLC với detector 253nm có thể không phải trực tiếp

định lượng Artesunate nên sản phẩm phân huỷ có thể ảnh hưởng tới kết quả.
Phương pháp đo phổ tử ngoại ở bước sóng 289nm thực tế cũng không thể
đánh giá được chính xác hàm lượng Artesunate khi nó đã bị thủy phân hoặc
lẫn các tạp chất khác, bởi sản phẩm thủy phân của chúng cũng bị hấp thụ vùng
tử ngoại, do đó dẫn đến sai số.
Phương pháp đo kiềm lại chỉ cho kết quả đúng khi trong viên nén
Artesunate không chứa acid Succinic.
Trong luận văn này chúng tôi triển khai nghiên cứu áp dụng phương pháp
đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng 345nm để định lượng Artesunate trong viên
nén.
19
PHẦN 2 - THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1 - Nguyên ỉiệu và trang thiết bị
2.1.1 - Dụng cụ và thiết bị
Cân kỹ thuật Sartorius; cân phân tích Sartorius (Thụy Sỹ).
Máy quang phổ Trung Quốc u v - VIS 752.
Máy quang phổ u v - VIS LAMBDA EZ 210.
Nồi đun cách thuỷ.
Bình định mức, pipet chính xác các loại.
2.1.2 - Hoá chất
Artesunate nguyên liệu do trường ĐH Dược sản xuất
Artesunate chuẩn hàm lượng 98,6% của Viện Kiểm nghiệm.
Dung dịch Natri hydroxyd 0,2N; Ethanol tuyệt đối.
Dung dịch acid Aceticl,lM; dung dịch Kẽm chlorid 0,5%.
Dung dịch Natri nitrit 2%; acid Sulfanilic; dung dịch acid Hydrochlorid
250g/L.
Viên nén Artesunate hàm lượng 50mg/viên của XN Dược phẩm 120 và của
Công ty Dược liệu TWI.
2.2 - Phương pháp nghiên cứu
Dựa vào tài liệu đã được công bố [21] (phụ lục I) và dựa vào kết quả

nghiên cứu định lượng Artesunate trong nguyên liệu [11] chúng tôi tiến hành:
- Khảo sát các điều kiện định lượng Artesunate trong viên nén theo
phương pháp đo độ hấp thụ ở bước sóng 345nm.
- Xây dựng và đánh giá phương pháp.
- Áp dụng định lượng một số chế phẩm viên nén Artesunate đang lưu
hành trên thị trường Việt Nam.
20
2.3 - Kết quả nghiên cứu
2.3.1 - Khảo sát cơ sở
* Theo bảng tóm tắt [21] thì thuốc thử tạo màu là Fast TR red salt nhưng hiện
tại do điều kiện chưa có thuốc thử này nên chúng tôi vẫn dùng thuốc thử
diazoni như [11]. Cụ thể là thuốc thử diazoni được pha dựa vào Dược điển
quốc tế (DĐQT) có sửa đổi như sau:
Dược điển quốc tế:
Cân 0,9g acid Sulphanilic và thêm 10ml dung dịch acid Hydroclorid
(250gA), thêm nước cất vừa đủ 100ml được dung dịch 1.
Lấy 3ml dung dịch 1 cho vào bình định mức 100ml khác, thêm 5ml dung
dịch Natrinitrit (3g/l) làm lạnh trong nước đá 5 phút. Thêm 20ml dung dịch
Natrinitrit (3g/l) và tiếp tục làm lạnh trong nước đá, thêm nước cất vừa đủ. Bảo
quản trong nước đá. (Diazobenzensulfonic acid phải được pha ngay vặ phải để
ít nhất 15 phút mới được dùng).
Theo cách pha này nồng độ thuốc thử là ~ 0,34mg/ml mà theo [21] thì
nồng độ thuốc thử Fast TR red salt là 5mg/ml (dung môi là nước cất) do đó
chúng tôi sửa lại là:
Lấy 20ml dung dịch 1 cho vào bình định mức 100ml khác, thêm 5ml
Natrinitrit 2%, làm lạnh trong nước đá 10 phút, thêm tiếp 20ml dung dịch
Natrinitrit 2% tiếp tục làm lạnh trong nước đá, thêm nước cất vừa đủ 100ml.
Bảo quản trong nước đá và sử dụng sau 15 phút.
* Dựa vào cách tiến hành trên nguyên liệu như [11], lúc đầu chúng tôi tiến
hành trên viên nén theo qúy trình sau:

Cân một lượng bột viên tương ứng với khoảng 0,100 Artesunate hoà tan
bằng Ethanol tuyệt đối. Chuyển vào bình định mức 50ml, thêm dung môi tới
vạch, lắc đều. Lọc, bỏ 10ml dịch lọc đầu. Lấy chính xác 5,0ml dịch lọc tiếp
theo chuyển vào bình định mức 50ml và thực hiện tiếp như phương pháp đo
quang phổ ở bước sóng 345 trên nguyên liệu (đã nêu ở phần 1.3.3.1).
21
Đem đo phổ hấp thụ thì dung dịch này hấp thụ cực đại ở bước sóng
343,5nm và D3 4 3 5 = 0,532 [phụ lục II].
Do đó trong quá trình khảo sát các điều kiện định lượng chúng tôi lấy
lượng bột cân tương ứng với khoảng 0,090gam Artesunate và đo độ hấp thụ
của sản phẩm cuối cùng ở bước sóng 343,5 ± lnm.
Để xây dựng phương pháp định lượng này chúng tôi tiến hành các khảo sát
+ Khảo sát các điều kiện phản ứng tạo Q289.
- Lượng NaOHO,2N.
- Thời gian đun cách thuỷ ở nhiệt độ 50° ±1°.
+ Khảo sát điều kiện tạo sản phẩm cuối cùng và sự ổn định của nó:
- Lượng acid Acetic 1 ,1 M.
- Lượng Kẽm clorid 0,5%.
- Lượng thuốc thử Diazoni.
- Độ ổn định của sản phẩm cuối cùng.
2.3.2 - Khảo sát các điều kiện định lượng
2.3.2.1 - Khảo sát lượng NaOH 0,2N cần dùng
Để chuyển Artesunate thành Q289 chúng tôi lấy tiêu chuẩn Dược điển Việt
Nam III làm cơ
sở
và thực hiện khảo sát trên nguyên liệu với những lượng
NaOH 0,2N khác nhau, sau đó đo độ hấp thụ ở bước sóng 289nm.
Sở dĩ phải thực hiện khảo sát này bởi vì dung dịch của sản phẩm cuối cùng
hấp thụ tối đa ở pH4 nên lượng NaOH cần không nên quá thừa gây khó khăn
cho việc điều chỉnh pH.

Cân 0,090g Artesunate cho vào bình định mức 50ml hoà tan bằng Ethanol
tuyệt đối, thêm Ethanol tới vạch cho đủ 50ml. Hút Chính xác 5ml dung dịch
trên vào bình định mức 50ml khác. Thêm 15ml NaOH 0,2N, lắc đều. Đun
cách thuỷ ở nhiệt độ 50 ± l°c trong 45 phút. Sau đó làm nguội nhanh bằng
nước máy. Thêm nước cất tói vạch. Đem đo độ hấp thụ ở bước sóng 289nm.
22