Nghiên cứu ứng dụng phương pháp điện di mao quản để định lượng các vitamin b1, b2, b6, PP trong chế phẩm thuốc tiêm becozyme

_
A a'
BỘ Y TÊ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
■ ■ ■ ■
TỐNG THỊ THANG VƯỢNG
NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN
DI MAO QUẢN ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG CÁC VITAMIN:
■ ■
b19 b2, b6, pp tr o n g chê p h ẩ m th u ố c t iê m
BECOZYME
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ ĐẠI KHOÁ 1998-2003)
Người hướng dẫn : GVC NGUYEN v ă n TUYỀN
GVC TRẦN TÍCH
Nơi thực hiện : BỘ MÔN HOÁ PHÂN TÍCH
Thời gian thực hiện : 3-5/2003
HÀ NỘI-05/ 2003
LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành bầy tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới
GVC: NGUYỄN VĂN TUYỀN
GVC: TRẦN TÍCH
đã tận tình hướng dẫn em trong suốt thời gian học tập và thực hiện khoá luận
này.
Em cũng xin bầy tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô trong bộ môn
HOÁ PHÂN TÍCH - Trường đại học Dược Hà Nội đã tận tình giúp đỡ và tạo
mọi điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình thực hiện khoá luận này.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội ngày 1/6/2003
Sinh viên
TỐNG THI THANH VƯƠNG
MỤC LỤC

Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
PHẦN 1 : TỔNG QUAN 3
1.1.Đại cương về điện di mao quản 3
1.1.1.Lịch sử ra đời và phát triển
3
1.1.2.Cơ sở lý thuyết của điện di mao quản 3
1.1.3.CƠ sở lý thuyết của điện di mao quản động học Micelle

8
l.lA C ác ưu điểm của CE
9
1.2.Phương pháp định lượng các vitamin tan trong nước trong chế
phẩm đa thành phần 11
1.2.1.Phương pháp của dược điển Anh 2001 11
1.2.2.Phương pháp của dược điển Mỹ 23 12
ì.2.3.Cắc phương pháp ngoài dược điển 13
1.2.4-Tác dụng chế phẩm multivitamin 13
1.2.5.Một số chế phẩm multivitamin 14
PHẦN 2 : THỰC NGHIỆM VÀ KẾT q u ả 15
2.1.Nguyên yật liệu và phương pháp thực nghiệm 15
2.1.1.Nguyên vật liệu và hoá chất 15
A/Phương pháp điện di mao quản 16
2.1.2.Phương pháp thực nghiệm 16
2.2.Thực nghiệm và kết quả 17
2.2.1.Lựa chọn điều kiện chạy điện di 17
2.2.2.Khảo sát độ tuyến tính 18
2.2.3.Xác định thời gian lưu của từng vitamin trong chế phẩm

18

2.2.4.Xây dựng đường chuẩn định lượng các vitamin bằng phương
pháp thêm chuẩn trong CE 20
2.2.5.Xác định tính đúng của phương pháp

24
2.2.6.Xác định độ lặp lại của phương pháp
25
B/Phương pháp HPLC 26
2.2.7.Xây dựng đường chuẩn định lượng các vitamin trong HPLC 26
C/Biện luận kết quả 31
PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 33
TÀI LIỆU THAM KHẢO 34
ĐẬT VẤN ĐỂ
Hiện nay trên thị trường dược phẩm thế giới cũng như thị trường dược
phẩm Việt Nam đang lưu hành nhiều chế phẩm vitamin đa thành phần, được
sản xuất trong nước cũng như nhập từ nước ngoài. Các chế phẩm này rất đa
dạng về mặt bào chế (thuốc tiêm, viên, bột, nước ) và rất phong phú về sự
phối hợp các vitamin và các thành phần dược chất khác. Sự phối hợp các
vitamin trong các thuốc có thể sơ bộ chia ra thành 2 loại:
- Các chế phẩm phối hợp các vitamin tan trong nước: Bj, B2, B5, Bg,
B12, pp, c. Nhóm này chiếm số lượng nhiều nhất.
- Các chế phẩm phối hợp nhóm vitamin tan trong nước, nhóm tan trong
dầu (vitamin A,D,E), các acid amin và các vi lượng khoáng.
Đây là các dạng thuốc phức tạp cả về kỹ thuật bào chế lẫn kỹ thuật
kiểm tra chất lượng và đặc biệt khó trong việc định lượng riêng biệt từng
thành phần vitamin do trong công thức có chứa nhiều loại hoạt chất cộng
thêm các chất bảo quản và tá dược.
Hiện nay đa số các dược điển chưa đưa các phương pháp định lượng
riêng biệt các vitamin trong các chế phẩm đa thành phần mà chỉ có phương
pháp áp dụng cho các chế phẩm chứa 1 thành phần.

Tuy nhiên cũng có một số ít dược điển đã cho phương pháp định lượng
riêng biệt này như USP 21, 22 với chuyên luận Decavitamin và BP 23 với
chuyên luận B.c complex. Song các phương pháp định lượng này đều phải
qua các công đoạn chiết tách hết sức phức tạp, tốn nhiều thời gian và công
sức dễ mắc sai số lớn.
Một phương pháp phân tích hiện đại hữu hiệu đã được nhiều phòng thí
nghiệm trong và ngoài nước áp dụng để định lượng các vitamin trong các chế
phẩm multivitamin là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
1
Phương pháp có độ lặp lại và độ chính xác cao, nhưng có các nhược điểm là
các hoá chất và dung môi cần dùng đều độc hại và đắt tiền.
Khoảng vài năm gần đây một phương pháp hiện đại nữa bắt đầu được
ứng dụng trong phân tích, đó là phương pháp điện di mao quản (Capillary
Electrophoresis (CE)). Đây là phương pháp mới có khả năng cho kết quả
phân tách tốt trong phân tích hỗn hợp đa thành phần tương tự như phương
pháp HPLC nhưng kinh phí cho hoá chất, thuốc thử cần thiết nhỏ hơn
nhiều so với HPLC. Ở trường, mãi đến đầu năm 2003 bộ môn hoá phân tích
mới được mua máy nên kỹ thuật này gần như chưa được triển khai ở trường
nói riêng cũng như của ngành nói chung.
Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ứng dụng phương pháp
điện di mao quản vào định lượng các vitamin trong một chế phẩm đa thành
phần với đề tài:
“Định lượng các vitamin: Bị, B2, B6, pp trong chế phẩm thuốc tiêm
Becozym bằng phương pháp điện dì mao quản” nhằm mục tiêu :
-Triển khai kỹ thuật điện di mao quản trên thiết bị mới có ở bộ môn, trường
và ngành.
-Úng dụng phương pháp điện di mao quản trong kiểm tra chất lượng các chế
phẩm multivitamin trên cơ sở đó tiếp tục nghiên cứu để áp dụng phổ biến đối
với các đối tượng khác.
2

PHẦN 1: TỔNG QUAN
1.1 ĐẠI CƯƠNG VỂ ĐIỆN DI MAO QUẢN
CAPILLARY ELECTRORESIS
1.1.1. Lịch sử ra đời và phát triển:[3]
Điện di mao quản là một kỹ thuật tách các chất dựa trên cơ sở sự di
chuyển khác nhau của các phần tử chất trong dung dịch chất điện ly có pH ổn
định (bằng một hệ đệm thích hợp ) dưới tác dụng của điện trường E xác định
được tạo ra khi áp đặt một thế V vào hai đầu mao quản. Kỹ thuật tách này
được nghiên cứu và phát triển đầu tiên bởi Tiselius (1937) trên cơ sở tách và
phân tích các hỗn hợp protein, amin, amino acid bằng kỹ thuật CE thế thấp
(110-220 V).
Kỹ thuật tách và phân tích CE đã được phát triển rất nhanh, các công
trình nghiên cứu về kỹ thuật CE cũng liên tục tăng không ngừng nhất là sau
những năm 1985 và có ứng dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là
lĩnh vực y và sinh học.
Tại Việt Nam ta, vào năm 1996 đã bắt đầu có một số cán bộ của khoa
Hoá học, ĐHQG Hà Nội, đã nghiên cứu và tìm hiểu kỹ thuật này, tham gia
nghiên cứu cùng Phòng thí nghiệm Hoá Phân tích của trường ĐHTH
Amsterdam.
1.1.2. Cơ sở lý thuyết của điện di mao quản: Capillary
Electrophoresis (CE).[3][9]
Nguyên tắc của các kỹ thuật tách điện di mao quản CE là dựa trên cơ
sở sự di chuyển của các phần tử chất tan trong ống mao quản trên nền của
dung dịch chất điện ly (có chất đệm pH thích hợp), dưới tác dụng của một
3
điện trường E xác định được cung cấp bởi một nguồn điện thế cao một chiều
(10-50 KV) đặt vào hai đầu mao quản.
Cơ chế của điện di là sự di chuyển của các phần tử chất tan trong ống
mao quản là sự di chuyển khác nhau của chất tan dưới tác dụng của lực điện
trường E nhất định (Electric Field Force: EFF) và tính chất của dòng chảy

điện thẩm (Electro-Osmotic Flow: EOF). Dòng EOF là một loại dòng chảy
khối của chất lỏng trong ống mao quản. Nó có quan hệ mật thiết với lớp điện
tích trên thành ống mao quản. Dòng EOF sẽ quyết định thời gian tồn tại của
chất tan trong ống mao quản. Nó tồn tại bao trùm lên dòng di chuyển của
chất tan, nghĩa là chất tan di chuyển trong dòng này. Trong CE người ta
thường phân cực mao quản sao cho dòng này hướng về catốt.
Thế tạo ra điện trường E đặt vào hai đầu ống mao quản được dùng trong kỹ
thuật CE là rất lớn, thông thường từ 10 - 40 KV. Chính lực điện trường E này
làm động lực cho các phần tử chất tan di chuyển theo một hướng nhất định .
Các chất khác nhau có điện tích và độ lớn khác nhau, sẽ di chuyển theo các
tốc độ lớn nhỏ khác nhau, do đó các chất phân tích được tách ra khỏi nhau.
Cột tách trong CE thường có độ dài từ 25 đến 100 cm, đường kính
trong (ID) là 25 - 100 )Lim (loại đường kính 50 - 75 )Lim là thích hợp nhất vì
hiệu ứng nhiệt nhỏ, dễ khống chế nhiệt độ cho mao quản). Mao quản được
chế tạo từ thuỷ tinh silica, bên ngoài có phủ một lớp polyme, để làm cho ống
mao quản mềm mại, có thể uốn được và không bị gẫy.
♦ Các thông số phân tích của CE:[9]
*Thời gian điện di (t) là thời gian cần thiết để cho một chất tan di chuyển từ
lúc nó được nạp vào đầu ống mao quản cho đến vị trí trung tâm Rowcell của
detector, được phát hiện ở vị trí pic cực đại được gọi là thời gian điện di của
chất tan .
*Vận tốc điện trường: vep (The electrophoretic velocity)
r - q v
V =|i £ = —-—X —
ep p 6%ĩ\r L
4
Trong đó: r = Bán kính của ion
q = Điện tích của ion
r| = Độ nhớt của dung dịch trong ống mao quản
V = Điện thế đặt 2 đầu ống mao quản

L = Tổng độ dài của ống mao quản.
|iep=Độ điện di của chất tan.
*Vận tốc dòng điện thẩm: veo (The electro-osmotic velocity)
v &C, V
Ve. = m 0E = — X7-
T1 L
e=Hằng số điện môi của dung môi
C, = Thế Zêta
*Vận tốc của chất tan: Velocity of the solute (v)
v=v ± V
T T ep “ T eo
*Thời gian điện di (t)
t =
ỉ lxL
vep ±veo ” (nep ±ne0)v
1 = Chiều dài hiệu dụng cột
*SỐ đĩa lý thuyết của cột mao quản:
kpiuJxVxl
N ='
2x DxL
D = Hệ số khuyết tán của phân tử chất tan trong đệm
*Độ phân giải của hai chất (Rs):
u _ ^ ^ ( ^ e p b M-epa)
4(nep± n J
|iepa và |uepb=Độ di động hiệu dụng của hai chất a và b
J.I = Trung bình cộng của độ điện di hiệu dụng của 2 chất
Oep=l/2(|uepa+|iepb))
♦ Phân loại về CE[3]
Theo cơ chế, bản chất và đặc điểm của sự tách trong mao quản mà
người ta thường phân chia thành các loại hay các kiểu khác nhau. Cụ thể gồm

các kiểu tách CE như sau:
-Điện di mao quản thông thường (Capillary Electrophoresis) : CE
-Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis) : CZE
-Điện di mao quản điện động học Micelle : MEKC
(Micellary Capillary Electro-Kenetic)
-Điện di mao quản loại Gel (Capillary Gel Electrophoresis) : CGE
-Điện di mao quản hội tụ đẳng điện (Capillary Iso-electric Focusing): CIEF
-Điên di mao quản đẳng tốc độ (Capillary Iso-Tacho-Phoresis) : CITP
♦ Các yếu tố ảnh hưởng:[9]
*Điẽn thế: Thời gian phân tích sẽ tỷ lệ nghịch với điện thế đặt vào 2 đầu ống
mao quản. Tuy nhiên nếu tăng điện thế lên quá cao sẽ sinh hiệu ứng Joule tạo
ra gradient nhiệt trong ống mao quản và dẫn đến thay đổi độ nhớt ở từng
vùng trong ống mao quản làm cho các phân tử ngay cả của một chất tan
cũng di chuyển không đồng nhất dẫn đến sự khuếch tán khác nhau và làm
mở rộng vùng mẫu.
*Nhiêt đỏ: có ảnh hưởng đến độ nhớt và độ dẫn điện của đệm vì thế nó ảnh
hưởng tới tốc độ di chuyển. Trong một số trường hợp nếu nhiệt độ trong ống
mao quản tăng là nguyên nhân làm thay đổi cấu tạo của protein, làm thay đổi
thời gian điện di và hiệu quả phân tích.
*Cốt mao quản: Kích thước của cột mao quản (chiều dài và đường kính) góp
phần vào thời gian tách và hiệu quả phân tích. Nếu tăng cả hai yếu tố là chiều
dài hiệu dụng và chiều dài cột mao quản có thể làm giảm điện trường và
tăng thời gian phân tích.
6
*Dung dich đêm:
•Loại đệm và nồng độ: Đệm thích hợp cho điện di mao quản là đệm có dung
lượng đệm lớn, độ dẫn điện tốt và giảm thấp nhất sự sinh dòng trong đệm.
•pH đệm: pH của đệm có thể tác dụng lên khả năng phân tích và làm thay
đổi dòng EOF.Tang pH của đệm thường gây tăng dòng EOF.
•Dung môi hữu cơ: Dung môi hữu cơ có thể làm tăng khả năng tan của một

số chất tan trong đệm. Khi thêm dung môi hữu cơ vào trong đệm thường làm
giảm dòng EOF.
♦ Sơ đồ hệ thống điện di:[13]
Hình 1.1: Sơ đồ hệ thống điện di
Gồm các bộ phận sau:
- Hai bình điện cực, các điện cực
- Nguồn cấp thế cao một chiều (10-50 kV) biến thiên được.
- Cột tách- ống mao quản.
- Bộ phận nạp mẫu vào ống mao quản.
- Bộ phận phát hiện chất (detector).
7
- Bộ phận ghi sắc đồ (computer).
- Bộ phận điều nhiệt cho ống mao quản.
1.1.3. Cơ sở lý thuyết của điện di mao quản động học Micelle:
MEKC (Mỉcellary Capillary Electro-Kenetic).[3][9]
Bản chất và trung tâm của sự tách ở đây là sự hình thành các phần tử
Micelle trong ống mao quản và các tiểu phân này sẽ dẫn dắt đóng góp thêm
khả năng của quá trình tách các chất trên nền của dung dịch chất đệm và chất
điện ly của quá trình điện di. Sự tách của các phân tử chất tan trung hoà bằng
kỹ thuật MEKC là được điều chỉnh bởi các chất hoạt động bề mặt trong dung
dịch đệm điện di. Khi chất hoạt động bề mặt ở nồng độ cao hơn nồng độ
ngưỡng của Micelle (chuẩn giới hạn hình thành Micelle, CMC: Critial
Micellary Concentration, ví dụ CMC =9 mM đối với chất hoạt động bề mặt
SDS (Sodium Dodecyl Sulfat)), thì một tổ hợp của các phần tử tiểu phân
riêng biệt của chất hoạt động bề mặt được tích tụ lại và chúng hình thành
trong ống mao quản các tổ hợp của các tiểu phân đó. Nó chính là các
Micelle.
Hình 1.2: Cấu trúc các Micelle và dòng EOF trong MEKC
©
©

= Surfactant 1 = Electroosmotic Flow
■■ = Solute = Electrophoresis
Các Micelle ở đây hoạt động như một pha tĩnh giả. Các phân tử của
chất phân tích được phân bố vào cả trong Micelle và cả ở ngoài Micelle theo
một cân bằng động học, có hằng số phân bố Kị xác định, trong những điều
kiện nhất định đã được chọn để chạy điện di và mỗi chất tan Xị sẽ có một
hằng số phân bố nhất định. Nếu các Kị của các chất tan khác nhau rõ rệt
thì sẽ có kết quả tách tốt. Độ chọn lọc của hệ pha MEKC có thể thay đổi
được thông qua việc thay đổi nồng độ Micelle, thay đổi pH của dung dịch
đệm, thêm các chất phụ gia, thêm dung môi hữu cơ thích hợp vào trong hệ
pha của MEKC.
Các chất hoạt động bề mặt có thể dùng ở đây như các chất loại cationit
(DTAB), loại anionit (SDS), các chất ionit kép (CHAPS, CHAPSO), loại
không ionit hoá (Octylglucoside, n-Dodecyl-p-D-maltoside, Trton-X) hay là
dùng hỗn hợp của chúng với nhau.
♦ ứng dụng của MEKC: Kỹ thuật phân tích MEKC được sử dụng cho việc
tách cả các chất mang điện tích và các chất không mang điện tích trong một
vùng rộng, kể cả các loại chất có đặc tính ưa nước và cả kỵ nước. Nó cũng
được sử dụng tốt để tách và phân tích các chất amino aicd, các chất họ
nucleotit, các loại vitamin, các chất loại hydro các bon thơm, các dược phẩm,
thuốc và các hợp chất sinh học.
1.1.4. Các ưu điểm của CE[3]
- Có hiệu lực tách các chất rất cao trong ống mao quản thuỷ tinh hay
ống Teflon (đường kính trong 25-100jLim Id).
- Thế điện di rất cao, thường là từ 10-30 kV (200-500V/cm) được sử
dụng để đặt vào hai đầu ống mao quản.
- Số đĩa hiệu lực N của cột tách là rất lớn, thông thường N từ 105 đến
106 nên cho kết quả tách tốt những hợp chất phức tạp.
9
- Thời gian tách ngắn hơn so với các loại sắc ký HPLC trên cùng loại

đối tượng mẫu.
- Việc phát hiện được thực hiện trên Rowcell chính là một đoạn cửa sổ
ở đầu cuối của ống mao quản, khác với Flowcell của HPLC.
- Lượng (thể tích) mẫu cần rất nhỏ, thường là từ 5-50 nl cho một lần
bơm mẫu vào cột tách.
- Có nhiều kiểu tách theo CE, nên khả năng ứng dụng thực tế là rất
rộng rãi và đa dạng.
- Sự tách được thực hiện chủ yếu trong môi trường nước có chất đệm
pH và chất điện ly. Nên không tốn nhiều dung môi hữu cơ đắt tiền như trong
HPLC nên rất kinh tế.
-Quá trình phân tích không phức tạp ( tương tự như trong HPLC).
- Sử dụng được nhiều bộ phận của trang bị HPLC, để tạo ra hệ CE.VÌ
thế cơ sở nào đã có HPLC thì dễ dàng phát triển và ứng dụng CE.
- Có khả năng tự động hóa trong tách và phân tích hàng loạt.
Tuy nhiên do điện trở cao của mao quản, làm khó khăn dòng chảy nên
thường dễ xuất hiện hiệu ứng nhiệt Joule vì vậy phải khống chế nhiệt độ của
mao quản để đảm bảo thu được kết quả tách ổn định.
♦ Cách tính kết quả trong phương pháp CE
- Phương pháp đường chuẩn
- Phương pháp thêm chuẩn
- Phương pháp một mẫu chuẩn
10
1.2.PHƯƠNG PHÁP ĐỊNG LƯỢNG CÁC VITAMIN TAN
TRONG NƯỚC TRONG CHÊ PHẨM đa th à n h ph ầ n
1.2.1.Phương pháp cuả Dược điển Anh 2001 :[9] Định lượng Bv B2,
B6,PP,C trong chế phẩm thuốc tiêm.
*Yêu cầu hàm lươn2:
-Thiamine hydroclorid, C12H17ƠN4OS .HC1 đạt 92,0 đến 106,0% hàm lượng
ghi trên nhãn.
-Pyridoxin hydroclorid, C8HnN03 .HC1 đạt 90,0 đến 110,0% hàm lượng ghi

trên nhãn.
-Riboflavin, C17H20N4O6 đạt 90,0 đến 110,0% hàm lượng ghi trên nhãn.
-Nicotinamid, C6H6N20 95,0 đạt đến 105,0% hàm lượng ghi trên nhãn.
-Acid ascobic, C6H80 6 đạt 95,0 đến 105% hàm lượng ghi trên nhãn.
#Phương pháv đinh lươns: BP sử dụng 2 phương pháp là phương pháp sắc
ký lỏng và phương pháp đo quang.
•Phương pháp sác kv lỏng
-»Với thiamin hydroclorid, pyridoxin hydroclorid, nicotinamid: Các điều
kiện sau:
Cột: ịiBondapak C18 (30cm X 3,9mm; lOịim).
Pha động: Hệ dung môi
75 V Kali dihydro orthophosphat l,36%(kl/tt): 25 V Methanol
Điều chỉnh pH về 3.0 bằng acid orthophosphat
Hoà tan Natri heptasulfonat 0,22%(kl/tt) vào hệ dung môi trên.
Detector: 280 nm
• Phương pháp đo quang
->Với Riboflavin:
Pha loãng 1 thể tích thuốc tiêm có chứa 4 mg riboflavin bằng đệm phthalate
có pH=4 được 200ml.
Đo độ hấp thụ của dung dịch này ở bước sóng x=446nm
Tính thành phần C17H20N4O6 với A(ỉ%, lcm)=323 ở x=446nm.
1.2.2.Dược điển Mỹ 23 về viên nén hỗn hợp vitamin tan trong nước.[19]
*Yêu cầu hàm lươns:
Với Pyridoxin hydroclorid, Riboflavin, Thiamin hydroclorid, Nicotinamid
trong viên nén hỗn hợp vitamin đạt hàm lượng từ 90,0% đến 150,0% so với
hàm lượng ghi trên nhãn. (Viên không được chứa vitamin A, D, E, K, hoặc
Beta Carotene hoặc các nguyên tố khoáng)
*Phươns vháv đinh lươns : HPLC
-Chiết bằng hỗn hợp dung môi: Nước : Acetonitril: Acid acetic băng (94:5:1)
-Pha động: Nước:Methanol:acid Acetic băng (73:27:1) chứa 140mg

natri hexane sulfonat trong 100ml.
-Dung dịch chuẩn:
Cân chính xác 80mg Nicotinamid
20mg Pyridoxin hydroclorid
20mg Riboflavin
20mg Thiamin hydroclorid
Đưa vào bình 200ml, thêm khoảng 180ml dung dịch pha loãng.
Ngâm trong nước ấm 65-70° thời gian khoảng 10 , lắc hoặc khuấy cho đến
khi chất rắn tan hết.
Làm lạnh ngay bằng nước lạnh khoảng 10 đến nhiệt độ phòng.Thêm dung
dịch pha loãng cho đủ thể tích và trộn đều.
-Dung dịch thử:
Nghiền và cân lượng bột không dưới 30 viên. Cân chính xác lượng bột tương
ứng chứa lOmg PP; 2,5mg mỗi vitamin Bj B2 B6 vào ống ly tâm 50ml.Thêm
25ml dung dịch pha loãng.Trộn bằng cách khuấy trong 30s để bột phân tán
hoàn toàn. Ngâm ống ly tâm trong nước ấm 65-70°, làm nóng trong 5 , khuấy
trộn trong 30s.
12
Lọc lấy phần dung dịch trong, làm lạnh đến nhiệt độ phòng.Dùng phần
dung dịch trong làm dung dịch thử. (Chú ý: Dùng dịch lọc trong vòng 3 giờ
sau khi lọc)
Cột 3,9mm X 30cm
Tốc độ dòng :lml/phút
Detertor 280nm
1.2.3.Các phương pháp ngoài dược điển.[6]
-Năm 1995, theo tài liệu phương pháp không Dược điển Đông Nam Á, có ghi
phương pháp địng lượng đồng thời 5 vitamin Bj, B2, B6, c, pp.
-Một số tác giả cũng giới thiệu chương trình định lượng vitamin Bj và EỊ,
trong đậu tương, định lượng 4 vitamin nhóm B, định lượng vitamin B12 trong
chế phẩm có chứa B1? B6 và B12

-Theo tài liêu nghiên cứu phân tích các vitamin tan trong nước bằng HPLC
của Douglas p. Wittner và William G. Haney tại Water Asscociates, Milford,
Masachusetts, các tác giả cũng đã nghiên cứu định lượng các vitamin trong
các chế phẩm multivitamin khá sớm với nhiều chương trình sắc ký lỏng pha
đảo khác nhau (1979).
*Nhân xét :Tất cả các phương pháp đã tham khảo như: Dược điển Anh, Mỹ,
viện kiểm nghiệm đều có dùng phương pháp HPLC pha đảo cặp ion để định
lượng : Điều kiện : pH acid từ 5,2-r5,4.
Chất tạo cặp :Natri heptan sulfonat, natri hexan sulfonat.
1.2.4.Tác dụng chế phẩm multivitamin:[5]
Thuốc dùng để phòng ngừa thiếu các vitamin nhóm B như bệnh Beriberi, nứt
môi, viêm lưỡi, lở mép, bệnh Pellagra. Đáp ứng các nhu cầu vitamin gia tăng
trong thai kỳ, cho con bú. Điều trị phụ trợ trong bệnh lý gan, viêm dây thần
kinh, viêm đa dây thần kinh, trong trường hợp nuôi dưỡng hoàn toàn ngoài
đường tiêu hoá.
13
1.2.5. Một số chế phẩm multivitamin[5]
Trên thị trường dược phẩm Việt Nam từ vài năm trở lại đây, các chế phẩm
hỗn hợp vitamin cũng hết sức đa dạng, phong phú không những đủ loại về
cách phối hợp mà còn có rất nhiều nguồn gốc. Bên cạnh các thuốc được sản
xuất trong nước ngày càng tăng mà còn có nhiều biệt dược được nhập và
được các công ty nước ngoài nhập vào từ nhiều nước như: Mỹ, úc, Pháp,
Canada, Nhật, Nam Triều Tiên, Thái Lan, Philipines ví dụ như:
Bảng 1.1: Một số chế phẩm multivitamin
Tên thuốc
Dạng bào chế
Thành phần
Nơi sản xuất
Bi
b2

b6
b5
B12
pp
Becombion
Ong tiêm
X
X
X X X
X Merck
Pen-vita
Ong tiêm
X X X X
X X Choongwae
Enervon-C
Viên nén
X X
X X X X United Pharma
Pentazym Viên bao
X
X X
X
X
Danapha
Pencomzyme
Viên
X
X X
X X
Fourdiphar

Becozyme
Ông tiêm,viên
X
X
X X X
Roche
TrivitaB
Viên bao X
X X Pharmedic
Trivit B
Ong tiêm
X X
X
XNDP TWII
Ancopir
Ong tiêm
X X
X Grossmann
Vitamin 3B
Viên bao X X
X
XNDP Nam Hà
Bevifort
Ong tiêm
X X
X Taiwan
Beplex c
Viên nang
X X X
X X Hậu Giang

Nevramin
Ông tiêm,viên
X X
Takeda
14
PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm:
2.1.1. Nguyên vật liệu và hoá chất
*Nguyên vật liệu:
-Chất đối chiếu hoá học:
+Vitamin Bx: 99,67%
+Vitamin B2:100%
+Vitamin B6: 98,92%
+ Vitamin PP:99,3 %
-Ống tiêm Becozyme 2ml của hãng Roche (Visa VN:VN-2973-97)
Có thành phần là:Thiamin chlohydrate (Bj): 10 mg
Riboflavin natri phosphate (B2): 5,47 mg
Pyridoxin chlohydrate (B6): 4 mg
Nicotinamid (PP): 40 mg
Dexpanthenol (B5): 6 mg
Tá dược: phenol, acid chlohyric và nước
*Hoá chất:
Natri tetraborat (Merck).
Sodium dodecyl sulfat (SDS) (Merck).
Natri heptan sulfonat (Merck)
Acetonitril (HPLC grade - Merck ).
Methanol (HPLC grade - Merck ).
Acid acetic băng (HPLC grade - Merck ).
Diethylamin (PA grade - Merck ).
*Dụng cụ: +Máy điện di mao quản Hewlett Packard 3D CE.

+Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
-Bơm cao áp Merck - Hitachi L-6000
15
-Detector Merck - Hitachi L-4000 ƯV
-Máy tích phân Merch - Hitachi D-2500 Chromato - integrator
-Van tiêm mẫu Kheohyne 1725-USA
- Kim tiêm mẫu.
+Máy quang phổ Beckman DU-640 spectrophotometer (Mỹ).
+Máy lọc nước siêu sạch Elga (Anh).
+Cân phân tích Satorius (Đức ).
+Máy siêu âm Branson (Mỹ ).
+Máy lắc Labinco.
+Autopipet 10-100 mcl; 100- 1000 mcl.
+Dụng cụ thuỷ tinh, ống nghiệm, bình định mức.
A/PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN
2.1.2 Phương pháp thực nghiệm:
*Điều kiên điên di
Khả nãng tách các chất trong hỗn hợp được biểu thị bằng thừa số chọn
lọc a (tốc độ di chuyển tỷ đối giữa hai chất) xem mức độ tách các chất, các
chất phải tách hẳn nhau, thời gian tách không quá dài và phát hiện dễ dàng ở
điều kiện điện di.
Chọn các thông số để lập chương trình chạy máy: Điện thế, nhiệt độ, áp suất
bơm, chiều dài cột mao quản
*Đinh lương chế phẩm thuốc tiêm Becozvme của hãng Roche.
• Xác định thời gian lưu của các vitamin: Tiến hành pha từng vitamin ra
thành nồng độ khoảng 100 mcg/ml. Chạy máy, mỗi vitamin chạy 3 lần và
xác định thời gian lưu của từng vitamin.
• Xây dựng đường chuẩn của từng vitamin có trong chế phẩm bằng phương
pháp thêm:
Pha dung dịch chuẩn theo bảng dưới đây:

16
Bảng 2.2: Dẫy mẫu chuẩn và mẫu phân tích của phương pháp thêm
Các chất
Dẫy mẫu chuẩn
Mẫu số
Cx
c,
c2
c3
c4
Cs
Lượng mẫu thử (ml) 5
5 5 5 5
5
Thêm chất
chuẩn vitamin
(AC,mcg/ml)
B,
0
10 20 30 40
50
b2
0 10 20 30
40 50
b6
0 10
20 30 40
50
pp
0 20 40 60

80 100
Đệm pH=9
SDS 30mM
Như nhau vừa đủ 10 ml
• Xác định độ lặp lại của phương pháp: Làm nhiều lần ở cùng nồng độ để xác
định sai số của phương pháp (biểu thị bằng RSD).
• Xác định tính đúng của phương pháp:
Thêm chính xác một lượng mẫu chuẩn vitamin vào mẫu thử, tiến hành chạy
điện di. Tính % vitamin chuẩn tìm lại được.
2.2. Thực nghiệm và kết quả
2.2.1. Lưa chon điều kiên chay điên di:
- Chương trình chạy: Điện thế: 20 kv
Nhiệt độ cột: 30°c
Áp suất bơm: 50mbar/50giây
Chiều dài cột mao quản: 65 cm, đường kính 50 |nm.
Detector diod array (DAD): 252 nm
- Hệ đệm: đệm borat 20mM và SDS 30mM điều chỉnh pH=9.0
2.2.2.Khảo sát đô tuyến tính:
Chúng tôi đã tiến hành khảo sát sự liên quan giữa nồng độ các vitamin
và diện tích pic đáp ứng của chúng khi đo các vitamin trong hỗn hợp chuẩn.
Kết quả thu được trình bầy ở bảng 2.3.
Bảng 2.3: Khảo sát khoảng tuyến tính
Vitamin B,
Vitamin B2 Vitamin B6
Vitamin pp
Nồng độ
mcg/ml
Diện tích
Nồng độ
mcg/ml

Diện tích
Nồng độ
mcg/ml
Diện tích
Nồng độ
mcg/ml
Diện tích
10
75,86 10
33,98 10 61,82
10
22,91
30
218,58
30 96,74
30 198,45 50
103,52
50
371,45 50
170,47 50 314,26
100 221,56
70
523,06
70 232,31 70
442,71 150
313,52
90
654,74 90
190,12 90
574,84 200

428,71
y=7,3112x+3,178
r=0,9996
y=32,393x+2,7615
r=0,9991
y=6,3515x+0,841
r=0,9997
y=2,128ÔX+0,9243
r=0,9993
Nhận xét:Trong khoảng nồng độ khảo sát của 4 vitamin, kết quả thu được có
phương trình hồi quy và hệ số tương quan hồi quy nằm trong khoảng 0,9991
đến 0,9997-»Tuyến tính với cả 4 vitamin.
2.2.3. Xác đỉnh thời sian lưu của từng vitamin.
Pha từng chất đối chiếu ra thành nồng độ khoảng 100 mcg/ml. Chạy
máy, mỗi vitamin chạy 3 lần và kết quả trung bình xác định thời gian lưu của
từng vitamin là: vitamin By 18.30 phút
vitamin B2: 11.50 phút
vitamin Bổ: 8.80 phút
vitamin PP: 7.60 phút
18
Hình 2.3: Điện di đồ tách hỗn hợp vitamin trong chế phẩm Becozym
Instrum ent 1 5/29/2003 11:12:35 A M nt
Page 1 of 1
2.2.4.Xây dưns đườns chuẩn đỉnh lươns các vitamin bans vhươne pháp
thêm chuẩn trons CE.
*Chuẩn bị dung dịch đệm:
Cân 7,6274 g Natri tetraborat hoà tan trong khoảng 700 ml nước cất,
thêm nước cất vừa đủ 1000 ml. Chỉnh pH về 9 bằng dung dịch Natrihydroxyd
IN và bằng acid boric. Cân 8,652 g SDS hoà tan trong 1000 ml dung dịch
Natritetraborat 20mM (pH=9) vừa pha ta có dung dịch đệm với SDS.

* Chuẩn bị dung dịch chuẩn:
Cân chính xác mỗi chất đối chiếu 100 mg cho vào một bình định mức
100ml, hoà tan trong dung dịch đệm bằng cách lắc siêu âm 10 phút để thu
được các dung dịch chuẩn và nồng độ các vitamin tương ứng là 1 mg/ml.
(Đây là dung dịch chuẩn gốc).
Lấy chính xác 1 ml dung dịch thuốc tiêm cho vào bình định mức
100ml, hoà tan trong dung dịch đệm được dung dịch thử gốc.
Từ dung dịch chuẩn gốc và dung dịch thử gốc, lọc qua màng lọc 0,2|j.m và
pha 4 dẫy mẫu chuẩn và mẫu phân tích với các nồng độ như bảng 2.2.
Tiến hành chạy điện di, xác định thời gian lưu và diện tích pic của các
vitamin tương ứng. Mỗi nồng độ chạy 3 lần, đo diện tích pic của từng vitamin
và lấy giá trị trung bình ta có bảng kết quả sau:
Bảng 2.4: Kết quả diện tích pic chạy MEKC
Các chất
Dẫy mẫu chuẩn
Mẫu số
Cx
c, c2
C,
c4
C5
Diện tích pic
trung bình 4
lần chạy
B,
184,65
250,62 334,50
413,49
490,81 545,23
b 2

44,99
75,28
111,29
151,86 174,61
212,24
b6
63,85 121,11
196,17
260,33
324,54
380,18
pp
209,89
250,07 293,52 334,46
381,33
421,04
So s.
s2 s3
s4
Ss
20