Ảnh hưởng của nồng độ nacl tới sự tích lũy prlin, glyxin betain và axit ascobic ở mầm đậu tương

TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN
===8dBŨIcs===
HÀ THỊ KHUYÊN
ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG Độ NaCl
TỚI Sự TÍCH LŨY PROLIN, GLYXIN
BETAIN YÀ AXIT ASCOBIC Ở MẦM
ĐẬU TƯƠNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
• • • •
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật
HÀ NỘI, 2015
TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN
HÀ THỊ KHUYÊN
ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG Độ NaCl
TỚI Sự TÍCH LŨY PROLIN, GLYXIN
BETAIN YÀ AXIT ASCOBIC Ở MẦM
ĐẬU TƯƠNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
• • • •
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật
Người hướng dẫn khoa học PGS. TS. NGUYỄN VĂN MÃ
HÀ NỘI, 2015
Đe hoàn thảnh bản khóa luận này, em xin bày tỏ lòng biết ơn, sự kính
ừọng sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Văn Mã đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ
em trong thời gian thực hiện đề tài.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới khoa Sinh -KTNN và Trung tâm
Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học và Chuyển giao Công nghệ - Trường Đại Học Sư
Phạm Hà Nội 2 đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho em thực hiện đề tài này.
Lần đầu làm quen với việc nghiên cứu khoa học, đề tài của em không
tránh khỏi những thiếu sót, rất mong được sự chỉ bảo đóng góp ý kiến của các
thầy cô và các bạn sinh viên để đề tài của em được hoàn thiện hơn

Hà Nội, tháng 5 năm 2015 Sinh viên Hà Thị Khuyên
HÀ NỘI, 2015
Tôi xin cam đoan đây là đề tài do chính tôi thực hiện trên cơ sở
nghiên cứu tài liệu tham khảo và thực nghiệm, không trùng với kết quả của
bất kì tác giả nào từng công bố.
Hà nội, tháng 5 năm 2015
Sinh viên thực
hiện Hà Thị
Khuyên
HÀ NỘI, 2015
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẤT
• • y
cDNA : Complementary DNA ( DNA bổ sung)
ĐBSCL : Đồng bằng sông cửu long.
ĐBSH : Đồng bằng sông hồng.
ĐC : Đối chứng.
NaCl : Natri clorua.
Nxb : Nhà xuất bản.
P5CS : Pyrolin - 5 - cacboxilate - synthetase .
TN : Thí nghiệm.
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU
1.
2.
1
3. MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài.
4. Đậu tương hay đỗ tương, đậu nành ( t ê n k h o a h ọ c l à
g l y c i n e m a x ) là loại cây họ đậu, là loài bản địa Đông Á có giá tri dinh
dưỡng, giá trị kinh tế khá cao và giữ một vị trí quan tong trong cơ cấu cây trồng

hiện nay. Cây đậu tương được trồng chủ yếu lấy hạt để chế biến thức ăn cho
người và gia súc. Sản phẩm từ cây đậu tương được sử dụng rất đa dạng như dùng
trực tiếp hạt thô hoặc chế biến thành đậu phụ, ép thành đậu nành, nước tương, làm
bánh kẹo, sữa đậu nành, okara.[4]
5. Hạt đậu tương có thành phàn dinh dưỡng rất phong phú gồm
protein(40%), lipit (12-25%), gluxit (10-15%), có các muối khoáng ca, Fe, Mg,
P,Na,S;các vitamin A,B1, B2, E, D, F, các enzime, sáp, nhựa, cellulose
6 Đậu tương còn được xem như là một thứ dược liệu có tác dụng ức chế
7. phân hủy protein, điều hòa ngũ tạng, phòng bệnh và chữa bệnh cho con
người. Hạt đậu tương là một mặt hàng nông sản xuất khẩu có giá trị. [4]
8. Ngoài ý nghĩa về mặt dinh dưỡng, kinh tế đậu tương còn có tác
dụng cao trong cải tạo đất vì hệ rễ có nốt sàn chứa vi khuẩn cố định đạm. Hiện
nay đậu tương được gieo trồng ngày càng rộng rãi ở nước ta và trên thế giới.
9. Hiện nay trước tình trạng biển ngày càng xâm lấn, diện tích đất
nhiễm mặn ngày càng gia tăng. Việc nghiên cứu và tìm hiểu về các ảnh hưởng
của mặn tới thực vật ngày càng trở nên bức thiết để có thể ứng dụng cải tạo và sử
dụng các loài thực vật có khả năng thích nghi với từng vùng nhiễm mặn khác
nhau. Ở Việt Nam có khí hậu nhiệt đới, gió mùa nóng ẩm thích họp cho việc
trồng đậu tương. Tuy nhiên, đậu tương lại khá nhạy cảm với các điều kiện bất lợi
của môi trường đặc biệt là giai đoạn nảy mầm, việc sừess muối sẽ ảnh hưởng lớn
tới năng suất đậu tương.
7
10. Thực vật khi gặp điều kiện stress muối sẽ có các phản ứng về mặt
hình thái, sinh lý, sinh hóa để thích nghi với điều kiện bất lợi đó của môi trường
như thay đổi một số đặc điểm hình thái giải phẫu phù họp hoặc gia tăng một số
chất có khả năng bảo vệ và điều hòa áp suất thẩm thấu, trong đó quan ừọng nhất
là prolin, glyxin betain và axit ascobic.
11. Qua nghiên cứu của các nhà nghiên cứu người ta nhận thấy, prolin
tham gia vào khá nhiều các phản ứng của thực vật, có vai trò rất quan trọng đối
với thực vật và đặc biệt là trong điều kiện stress. Prolin là axit ưa nước trong cơ

thể thực vật, được tổng họp từ glutamin bởi enzim cảm ứng stress P5CS. Nhiều
nghiên cứu đã chỉ ra rằng prolin đóng vai trò là nhân tố chính bảo vệ màng tế bào,
chống lại các tác động có hại của nồng độ muối cao, làm tăng khả năng thẩm thấu
của tế bào. Sự tập trung prolin để phản ứng lại stress muối diễn ra chủ yếu trong
dịch bào. Prolin cũng có thể có chức năng như protein thẩm thấu ưa nước và như
một gốc hydroxyl. Do đó sự tích lũy prolin được coi là một phản ứng thích nghi
thông thường của thực vật bậc cao ừong điều kiện khô hạn. Prolin được xem như
một chất chỉ thị về khả năng chịu hạn của thực vật và còn là chỉ số tốt của thực
vật có khả năng chịu mặn. [14]
12. Glyxin betain là một sản phẩm của quá trình oxy hóa của choline
trong một quá trình tổng hợp methionien. Sự tích lũy glyxin betain ừong cây dưới
tác động stress muối được đề xuất đóng một vai trò quan trọng trong điều chinh
áp suất thẩm thấu, được nhiều nhà khoa học xem là một phản ứng thích nghi để
chống lại stress về nước và độ mặn [19],[22], ngoài ra glyxin betain như một chất
tan tương thích giúp bảo vệ cây trong điều kiện bất lợi.
13. Vitamin c hay axit ascorbic có tác động trực tiếp loại bỏ các gốc
superoxit, anion và H
2
02.[21]
14. Thời gian vừa qua, ở nước ngoài cũng như trong nước đã có nhiều
nghiên cứu về prolin cũng như ảnh hưởng của mặn tới hàm lượng prolin và glyxin
8
betain như: Nguyễn Thị Minh Ngọc (2007) [7]. Kim Thị Duyên (2011) [2], Bùi
Bá Đạt (2009) [3], Nguyễn Minh Hồng (2008; [8], do PGS.TS Nguyễn Văn Mã
hướng dẫn nghiên cứu. Ngoài ra còn rất nhiều các nghiên cứu khác như mới đây
nhất là Ngô Thị Anh (2014) [1]. Trong khi đó, các nghiên cứu về prolin, glyxin
betain và vitamin с trên các cây trồng khác khá nhiều [15] ,[16],[17],[18]. Trong
đó, các nghiên cứu về sự tích lũy các chất nêu trên trong điều kiện mặn còn ít.
Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu " ảnh hưởng của nồng độ NaCl tới
sự tích lũy prolin, glyxỉn betaỉn và axỉt ascobic ở mầm đậu tương”, để làm cơ sở

cho các nghiên cứu tiếp theo về vai trò của chúng trong việc bảo vệ cây đậu tương
ở vùng bị nhiễm mặn, góp phàn đảm bảo và phát triển loại cây trồng có giá trị
này.
2. Mục đích nghiên cứu
15. Nghiên cứu hàm lượng prolin, glyxin betain và axit ascorbic của
mầm đậu tương khi bị nhiễm mặn
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Xác định hàm lượng Prolin, glyxin betain và axit ascorbic ở mầm đậu
tương trong điều kiện strees nhiễm mặn ở các nồng độ khác nhau.
- Xác định tỉ lệ nảy mầm của hạt trong dung dịch NaCl với các nồng độ khác
nhau
4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn
16. Tìm hiểu sâu hơn về sự tích lũy prolin, glyxin betain và axit ascobic
ở mầm đậu tương khi gặp stress mặn, góp phàn bổ sung nguồn tài liệu nghiên
cứu, làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo về vai trò sinh học của chúng ừong
phản ứng bảo vệ cây trồng khi gặp sừess. Kết quả nghiên cứu có thể làm cơ sở
khoa học cho việc chọn giống đậu tương chịu mặn.
17.NỘI DUNG CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sự nảy mầm và sinh trưởng của mầm đậu tưong
9
18. Sự sinh trưởng phát triển của đậu tương được chia làm các giai đoạn
sau: nảy mầm, cây con, ra hoa, hình thành quả, quả chín.
19. Trong các yếu tố ngoại cảnh thì nước là yếu tố ngoại cảnh ảnh
hưởng lớn nhất đến sinh trưởng phát triển và năng suất của đậu tương. Đậu tương
được đánh giá là cây trồng chịu hạn khá song chỉ chịu hạn được ở một mức độ
nhất định. Các giai đoạn khác nhau mẫn cảm với sự thiếu hụt nước khác nhau.
Thời kì ra hoa và hình thành quả cần nhiều nước nhất. Thời kì yêu cầu nước thấp
nhất là tò sau khi nảy mầm cho tới lúc bắt đầu ra hoa. Thời kì quả chùi yêu cầu
nước thấp hơn thời kì ra hoa. [4]
20. Ở giai đoạn nảy mầm, sau khi trồng hạt đậu tương hút nước rất

nhanh trừ một vài giống đặc biệt là loại hoang dại khả năng hút nước chậm hơn,
ừong điều kiện thuận lợi rễ xuất hiện sau khi trồng 1-2 ngày. Rễ này gọi là rễ
chính nó phát triển nhanh xuống phía dưới, đến ngày thứ 4-5 rễ phụ bắt đàu xuất
hiện. Sau 3-4 ngày lá mầm xuất hiện và đẩy lên khỏi mặt đất, sự sinh trưởng mạnh
của phần trên trụ mầm lúc đàu lá mầm có màu vàng nhạt, sau có màu xanh sau
cùng chuyển sang màu vàng và rụng xuống.
21. Thực chất quá trình nảy mầm là quá trình biến đổi sinh lí, sinh hoá
mạnh mẽ diễn ra trong hạt, chuẩn bị cho sự hình thành cây non. Đậu tương thuộc
cây hai lá mầm nên sự nảy mầm cũng gồm các pha như sự nảy mầm ở các cây hai
lá mầm đó là:
1, Pha trương hạt: tính tò khi bắt đàu nảy mầm, hạt hút nước rất mạnh làm
trương hạt.
2, Pha hình thảnh và hoạt hoá enzym: hạt có một lượng enzym nhất định
nhưng chủ yếu ở dạng liên kết khi hạt hút nước thì enzym mới được giải
phóng ở dạng tự do và bắt đầu hoạt động mạnh.
3, Pha tích luỹ chất dinh dưỡng: ngay trong những phút đầu ngâm ừong
nước, độ hấp thụ oxi của hạt tăng lên đặc biệt là chu trình
hexozomonophotphat tăng lên nhiều lần, do vây lượng ATP tích luỹ nhiều
hơn.
1
0
4, Pha động viên các chất dự trữ và xây dựng các chất hữu cơ đặc trưng cho
cơ thể ở giai đoạn nảy mầm: các chất dinh dưỡng trong hạt chủ yếu thuộc
3 nhóm chất hứu cơ là : gluxit, protein, lipit.trong quá trình nảy mầm
enzym a-amilaza tác động vào liên kết l,4-glucozit phân giải tinh bột
thành các đextrin tham gia vào quá trình hô hấp ở các dạng sacarozo tích
luỹ ở các tế bào trụ phôi. Protein được phân giải bởi emzym proteaza
thành các axit amin và các amit. Phần lớn các enzym lipaza phân giải lipit
thành axit béo và glixerol. Ngoài ra lipit còn được tái chuyển hoá thành
gluxit cung cấp năng lượng cho hạt nảy mầm. [4]

1.2. Tình hình nhiễm mặn ở Việt Nam và thế giói .
22. Chưa có các số liệu chính xác về diện tích đất nhiễm mặn trên thế
giới mà chỉ có ước tính của các nhà khoa học đất trên thế giới. Theo Nguyễn
Văn Đạo (2012) thì số liệu diện tích nhiễm mặn ít hơn 1,5 tỉ ha. Trong đó, có
316 triệu ha ở các nước đang phát triển. Theo Dudal và Pumell (1986)[13], các
đất nhiễm mặn chiếm khoảng 7% diện tích đất thế giới. Diện tích đất nhiễm
mặn trên thế giới theo Massoud ( 1974) được trình bày ở bảng sau:
23. Bảng 1: Ước tính diện tích diện tích đất nhiễm mặn trên thế giới
24.của Massoud (1974)[13]
25. Khu vực 26. Diện tích đât nhiêm mặn( lOOOha)
27. Băc Mỹ 28. 15.755
29. Mexico và Trung Mỹ 30. 1.965
31. Nam Mỹ 32. 129.163
33. Châu Phi 34. 80.436
35. Nam A 36. 85.110
37. Băc và Trung A 38. 211.448
39. Đông Nam A 40. 19.983
41. Australia 42. 357.568
43. Châu Au 44. 50.749
45.
46. Đất bị nhiễm mặn ở Việt Nam có diện tích khoảng 1 triệu ha
( Hoàng Kim, Phạm Văn Biên và R.H Howeler, 2003), chiếm gần 3% diện tích
1
1
tự nhiên cả nước. Trong đó, hai vùng nhiễm mặn tập trung chủ yếu là hai châu
thổ lớn Đồng bằng sông Cửu Long, Đồng bằng Sông Hồng. Ảnh hưởng của
nước biển ở vùng cửa sông vào đất liền Đồng bằng Sông Hồng chỉ khoảng
15km, nhưng ở Đồng bằng sông Cửu Long lại có thể xâm nhập tới 40-50km
(FAO, 2000).
47. Các tỉnh vùng Đồng bằng sông Cửu Long như: Sóc Trăng, Bến

Tre, Tiền Giang, Trà Vinh, Bạc Liêu, Cà Mau, Kiên Giang đều bị nhiễm mặn.
Đất mặn có diện tích là 744.000ha , chiếm 18,9% làm hạn chế tăng vụ và tăng
năng suất của vùng. [13]
48. Bảng 2: Dỉện tích bị nhỉễm mặn ở Đồng Bằng Sông Cửu Long trung
bình
49. tháng 4 (1991-2000)[13]
50.
STT
51. Khu vực
52. Độ mặn
(g/1)
53. Diện tích
(ha)
54. Tỷ lệ (%)
55.
1
56. KÌLÔng ảnh hirònc
mặn
57.
58. 1.773.36
5
59. 45,5
60.
T
61. Xâm nhập mặn 62. 0,0 - 0,4 63. 107.025
64.
65.
3
66. Xâm nhập mặn
67.

o
68.
lu
69.
r
71. 211816 72. 6,0
73.
4
74. Xâm nhập mặn 75. 2,0 - 4,0 76. 14&.244
77. 3
:
s
78.
5
79. Xâm nhập mạn 80. •4.0 -16,0 81. 1.378.550 82. 35,3
83.
6
84. Xâm nhập rtìặrt 85. >16,0 86. 260.000
87. 6.6
88.
89. Các vùng nhiễm mặn ở Đồng bằng sông Hồng thuộc các tinh như:
Thái Bình, Hải Phòng, Nam Định, Ninh. Bình, Thanh Hóa
90.Bảng 3: Dỉện tích các tình Đồng Bằng Sông Hồng bị nhiễm mịn.[13]
91. Tỉnh 92. Diện tích nhiêm mặn (ha)
93. Thái Bình 94. 18.000
95. Hải Phòng
96. 20.000
97. Nam Định
98. 10.000
99. Thanh Hóa

100. 22.000
101.
1
2
102. Dọc theo ven biển các tỉnh miền Trung đất cũng bị nhiễm mặn như
Hà Tĩnh có khoảng 17.979 ha, Quảng Bình có hơn 9.300ha bị nhiễm mặn và Ninh
Thuận có gần 2300ha đất bị nhiễm mặn. [13]
103. Hiện tượng nhiễm mặn ở Việt Nam và thế giới ngày càng diễn ra
với quy mô rộng, việc khắc phục ngày càng trở nên khỏ khăn . Trong khi đó Việt
Nam là một đất nước nông nghiệp nên việc khắc phục và hạn chế tác hại của mặn
đối với đời sống thực vật càng ừở nên bức thiết.
1.3. Vai trò của prolỉn, gỉyxin betain và axit ascobic trong chổng
chịu strees ở thực vật nói chung và đậu tương nói liêng.
104. Sống trong điều kiện hạn do sừess muối gây ra, thực vật có khả
năng chịu hạn nhờ hai cơ chế: tránh mất nước và chịu mất nước. Cơ chế tránh mất
nước biểu hiện qua sự thích nghi đặc biệt về cấu trúc và hình thái của rễ, chồi
nhằm giảm sự mất nước hoặc tích lũy các chất hòa tan như protein, axit amin để
tự điều chỉnh áp suất thẩm thấu nội bào. Cơ chế chịu mất nước thể hiện qua việc
nhanh chóng sinh tổng hợp các chất để bảo vệ, điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong
tế bào như ABA, axit amin (prolin, glyxin
105 betain, axit ascobic )
106. Prolin là axit ưa nước trong cơ thể thực vật, được tổng họp từ
glutamin bởi enzim cảm ứng stress P5CS. Prolin là thành phần chư yếu ừong cấu
trúc của nhóm các chất amoni bậc 4 và có vai trò quan trọng ừong việc điều chỉnh
áp suất thẩm thấu của tế bào thực vật. Vì thế việc nghiên cứu hàm lượng prolin
của hạt đậu tương trong giai đoạn mầm có thể giúp ta tìm hiểu sâu hơn sự điều tiết
quá trình ừao đổi nước ừong tế bào thực vật và khả năng của chúng chống lại sự
thiếu nước. [2]
107. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng prolin đóng vai ừò là nhân tố chính
bảo vệ màng tế bào, chống lại các tác động có hại của nồng độ muối cao, làm tăng

khả năng thẩm thấu của tế bào. Sự tập trung prolin để phản ứng lại stress muối
1
3
diễn ra chủ yếu trong chất nguyên sinh. Prolin cũng có thể có chức năng như
protein ưa nước và như một gốc hydroxyl. Do đó sự tích lũy prolin được coi là
một phản ứng thích nghi thông thường của thực vật bậc cao trong điều kiện khô
hạn. Prolin được xem như một chất chỉ thị về khả năng chịu hạn của thực vật và
còn là chỉ số đặc trưng của thực vật về khả năng chịu mặn [14]
108. Glyxin betain là một sản phẩm của quá trình oxy hóa của choline.
Sự tích lũy glyxin betain trong cây dưới tác động stress muối được đề xuất đóng
một vai trò quan trọng trong điều chỉnh áp suất thẩm thấu, được nhiều nhà khoa
học xem là một phản ứng thích nghi để chống lại stress về nước và độ mặn [15],
[22], chức năng của glyxin betain như một chất tan tương thích giúp cây thích
nghi với các điều kiện bất lợi hoặc bảo vệ trong tế bào chất và lục lạp.
109. Vitamin c là tên gọi thông dụng của axit ascorbic, có tác dụng bảo
vệ thực vật khi bị stress phi sinh học. Shalata và Newman (2001)[21] phát hiện ra
rằng axit ascorbic tác động trực tiếp đến loại bỏ các gốc superoxit, và như là một
chất chống oxy hóa thứ cấp trong chu kỳ khử các dạng oxy hóa của a- tocopherol.
Axit ascorbic là một chất chống oxy hóa quan trọng, mà phản ứng không chỉ với
H
2
0
2
mà còn với 0
2
, OH' và hydroperoxidases lipit [21].
1.4. Tình hình nghiên cứu sự tích lũy proỉin, glyxin betain và
vitamin c trong điều kiện strees nói chung và nhiễm mặn nói riêng ở
thực yật.
110. o « o • o 1 •

1.4.1. Trên thế giới.
111. Trên thế giới với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kĩ thuật, đã có
nhiều công trình nghiên cứu về tính chống chịu của thực vật như các nghiên cứu
của các tác giả: Barnet N.M, Naylor A.W (1996) [19], Zhao và cộng sự
112 (2000), nghiên cứu về tính chịu hạn, chịu mặn và chịu lạnh ở lúa, lúa
mì
113. và thực vật nói chung.
1
4
114. Ảnh hưởng của mặn liên quan đến các giai đoạn của cây chịu ảnh
hưởng của mặn như: độ mặn của muối, tính chất của muối và thời gian chịu mặn.
Vì vậy để biết được sự ảnh hưởng của nồng độ muối lên sự sinh trưởng và phát
triển của thực vật nói chung cũng như đậu tương nói riêng ta phải thử nghiệm và
quan sát trong suốt quá trình sinh trưởng của cây.
115. Có khá nhiều công trình nghiên cứu tập trung tìm hiểu có chế sinh
hóa của tính chịu mặn trong đó có đề cập tới vai trò của prolin, glyxin betain và
axit ascobic. Theo Wyn Jones (1977) [21] nhưng hợp chất được coi là tác nhân
cạnh tranh thẩm thấu, trong đó đáng kể nhất là prolin, nó được xem như một chất
đóng vai ừò chỉ đạo trong sự thích ứng thẩm thấu tế bào chất của thực vật nhằm
điều hòa thẩm thấu giữa chất nguyên sinh và dịch bào. Sự tích lũy prolin là một
phản ứng thông thường của thực vật bậc cao đối với áp lực muối và đó cũng là
vấn đề được nghiên cứu gần đây như: Barnet N.M., Naylor A.w. (1966)[20],
Goyal K., LJ Walton, A. Tunnacliffe (2005),
116 Ingram J, D Bartel
(1996), thomashow MI. (1998) nghiên cứu về tính
117. chịu hạn, chịu mặn và chịu lạnh ở lúa, lúa mì và thực vật nói chung.
118. về đậu tương có một số tác giả nghiên cứu như: Whisitt và cộng sự
(1997) đã cho thấy lượng nước mất trên 60% thì đậu tương không thể phục
119 hồi được.
Nhưng nghiên cứu của Matra N, Cushman J,c (1994) đã nhận

120. thấy rằng cDNA của dehidrin của lá đậu tương mất nước bị phân lập,
dehidrin là một trong những LEA với chức năng bảo vệ tế bào khi mất nước. Và
còn rất nhiều nghiên cứu khác của các nhà khoa nghiên cứu khác về khả năng
chịu hạn và sự tổng họp các chất có vai trò bảo vệ và duy áp suất thẩm thấu của tế
bào thực vật. Tuy nhiên, nhưng nghiên cứu đi sâu về vai trò và sự biến đổi của
1
5
glyxin betain và axit ascobic đến nay còn hạn chế, việc đi sâu vào nghiên cứu các
chỉ tiêu này còn nghèo nàn cần có nhưng tiến bộ vượt bậc hơn nữa.
1.4.2. ỞViêtNam.
121. Nghiên cứu chống chịu của cây trồng ở việt nam được ừồng trên
diện rộng ở các đối tượng lúa, đậu tương, lạc và thuốc là trong đó đậu tương là
122 cây trồng được chú trọng khá lớn về khả năng chịu hạn. Ở giai
đoạn mầm đậu tương, sự biến đổi sinh lí, sinh hóa : hoạt độ enzim proteaza,
amilaza, lipaza và hàm lượng axit amin prolin trong các điều kiện áp suất thẩm
thấu khác và ở điều kiện chịu mặn khác nhau được Nguyễn Văn Mã, Nguyễn Văn
Đính, La Việt Hồng của trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 nghiên cứu. [6],[7].
123. Cụ thể hơn, nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa của cây đậu
tương trong điều kiện gây hạn (Nguyễn Văn Mã, Phan Hồng Quân)[5], nghiên
cứu mối quan hệ giữa tính chịu hạn với các thành phần điện di protein
124 của hạt đậu tương
(Trần Thị Phương Liên, Nông Văn Hải ) nghiên cứu khả
125. năng chịu hạn của lạc ( Nguyễn Văn Mã) . Mặt
khác, còn một số nghiên cứu về glyxin betain tuy vậy,
các nghiên cứu về ảnh hưởng của stress muối tới tích
lũy prolin, glyxin betain và axit ascobic của đậu
tương ở giai đoạn nảy mầm còn đang ít được nghiên cứu.
126. CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
cứu
2.1. Đổi tượng nghiên cứu

127. Giống đậu tương: ĐT22.
128. Nguồn gốc: Giống ĐT22 do trung tâm Nghiên cứu và Phát triển
Đậu đỗ chọn tạo tò dòng đột biến của hạt lai (DT95 X ĐT12) và được Hội đồng
Khoa học Công nghệ (Bộ NN&PTNT) công nhận là giống mới. Quyết định số
219 QĐ/BNN-KHCN ngày 19/01/2006.
129. Cơ quan tác giả: Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm.
1
6
130. Tác giả: Tràn Đình Long, Tràn Thị Trường, Hoàng Minh Tâm,
Quách Ngọc Truyền, Nguyễn Thị mỹ Hạnh, Nguyễn Thị Chúc, Lê Tuấn phong,
Nguyễn Đạt Thuần.
131. Đặc điểm chính của giống:
132. Thời gian sinh trưởng trung bình 85 - 90 ngày. Giống đậu tương
ĐT22 có hoa màu trắng, hạt vàng, rốn nâu đậm, quả chín có màu nâu. Khối lượng
1000 hạt 155-160 g. Giống ĐT22 kháng bệnh phấn trắng. Năng suất 18-27 tạ/ha,
tuỳ thuộc vào mùa vụ và điều kiện thâm canh
* Thời vụ: ĐT22 thích hợp trong cả 3 vụ trồng đậu tương. Thời vụ cụ thể:
133. Vụ Xuân: 20/2 -10/3, Vụ Hè: 25/5 - 15/6, Vụ đông: 20/9 - 30/9.
* Mật độ: Vụ Xuân: 30 - 35 cây/m
2
; hàng cách hàng 40cm, gieo 1 hạt/hốc,
hốc cách hốc 6-8 cm.Vụ Hè: 25 - 30 cây/m
2
; hàng cách hàng 40cm, gieo 1
hạt/hốc, hốc cách hốc 8-12 cm.Vụ Đông: 40 - 45 cây/m
2
; hàng cách hàng
35cm, gieo 2hạt/hốc,hốc cách hốc 4-5 cm. Lượng hạt gieo thông thường 60
kg/ha, nếu gieo gốc rạ lượng hạt là 70 - 75kg/ha.
2.2Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
134. Đe tài được tiến hành từ tháng 10/2014 đến 5/2015.
135. Địa điểm nghiên cứu được tiến hành tại Trung tâm Hỗ trợ nghiên
cứu khoa học và Chuyển giao Công nghệ trường ĐHSP Hà Nội 2 và Phòng thí
nghiệm Sinh lý Thực vật của khoa Sinh-KTNN.
2.2.2. Cách bố trí thí nghiệm
136. Chọn hạt giống đều, khỏe, có phôi sáng, không sâu mọt, không nấm
mốc.
137. Khử trùng khay đựng (kích thước phù hợp 20x35cm, đảm bảo đủ
oxy), bình, tay bằng cồn
138. Giấy thấm phải được sấy ở 130°c trong vòng 1 giờ.
1
7
139. Hạt được khử trùng bằng dung dịch KMn0
4
1% trong 5 phút (để hạt
vào túi màn nhúng vào trong dung dịch). Sau đó rửa bằng nước sôi để nguội rồi
thấm khô bằng giấy thấm.
140. Gieo hạt ừên khay với tì lệ 50 hạt/khay, ừên các rãnh gấp nếp của
giấy thấm.
141. Hạt được gieo trong khay với nồng độ đã được đánh dấu Natri
Clorua : 0%( đối chứng), 0.3%, 0.6%, 0.9%, 1.2%, 1.5% và 1.8%, đánh dấu khay
theo thứ tự lần lượt là ĐC, M 0,3, M0,6, M0,9, Ml,2, Ml,5, Ml,8, hạt được tiếp
xúc với nước bằng ba mặt.
- Tiến hành đo sự tích lũy prolin, glyxin betain và axit ascobic sau 2 giờ, 4
giờ và 6 giờ sau khi hạt được gieo (ngày 1).
- Ngày thứ 2, 3, 4, 5, 6, tiến hành đo sự tích lũy prolin, glyxin betain và axit
ascobic 1 lần và vào 8h30 hàng ngày. Ghi lại kết quả thu được của mỗi
ngày vào bảng để theo dõi và tổng hợp.
- Hàng ngày, bổ sung lượng dung dịch muối Natri Clorua khoảng 50

ml/khay, giảm số lượng để đạt mức độ đủ ẩm, không ứng ngập.
2.2.3. Phương pháp phân tích các chỉ liêu
* Xác định tỷ lệ nảy mầm.
142. Những hạt nảy mầm là những hạt có chiều dài rễ mầm đạt từ 3mm
trở lên, tỷ lệ nảy mầm được tính theo công thức sau:
143. p = — xioo b
144. Trong đó:
145. P: Khả năng nảy mầm của hạt (%).
146. a: Số hạt nảy mầm
147. b: Tổng số hạt đem gieo
148. Tỉ lệ nảy mầm xác định vào các ngày 2, 4, 6 kể từ ngày 1 sau khi
gieo.
1
8
* Xác định hàm lưọng axỉt amỉn prolin.
149. (Theo Bates và cs, theo mô tả của tác giả Nguyễn Văn Mã và cs,
2013) [9].
150. Prolin có vai trò điều hòa thẩm thấu, bảo vệ trao đổi chất và chống
lại điều kiện sừess của môi trường, điều hòa PH tế bào chất, lưu trữ cacbon và
nitơ, chức năng chống oxi hóa.
151. Nguyên tắc thí nghiệm:
152. Dựa trên phản ứng của prolin và dung dịch ninhydrin ừong axit tạo
hợp chất màu vàng, hấp thụ bước sóng đặc trưng 520nm. Công thức tính hàm
lượng prolin xác định trên cơ sở tham khảo reigosa M J.
153. Thiết bị và vật liệu:
- axit sulphosalicylic 3% (w/v).
- axit photphoric 6M.
- axit axetic.
- dung dịch ninhydrin trong axit (được chuẩn bị bằng cách ủ nóng 1.25g
ninhydrin trong 30ml axit axetic, và thêm 20ml axit photphoric 6M). Lưu

ý:axit ninhydrin sẽ giữ ổn định chỉ trong 24h, tại 4°c.
- Toluen.
154. Cách tiến hành:
155. ở đây chúng tôi mô tả các phương pháp định lượng prolin tự do
trong các mô lá, bao gồm 4 bước chính:
1) Cân 0,5g/mẫu nghiền kĩ, thêm 10ml dung dich axit sulfosalicylic 3%, ly
tâm 7000 vòng/phút trong thời gian 20 phút, lọc lấy dịch lọc.
2) Lấy 2ml dịch chiết cho vào bình, thêm 2ml axit axetic và 2ml dung dịch
niiứiydrin, ủ trong nước nóng 100°c trong thời gian lh sau đó ủ nước đá 5
phút.
1
9
3) Bổ sung vào bình phản ứng 4ml toluen, lắc đều. Lấy phàn dịch màu hồng ở
trên đem đo OD
5
20nm bằng máy đo quang phổ.
4) Hàm lượng prolin được xác định dựa vào đường chuẩn và tính toán theo
công thức:
156. Prolin (|ig/g) = X.V(ml).df / w(g)
157. Trong đó:
158. X: giá trị OD520 của mẫu; V: thể tích dịch chiết (= số ml toluen);
df: hệ số pha loãng (ừong trường hợp này là 5); w: khối lượng mẫu.
159. Xây dựng đường chuẩn prolin
* xác định hàm lượng gỉyxin betain
160. (Theo Grieve và Grattan, 1983, theo mô tả của tác giả Nguyễn Văn
Mã và cs, 2013)[9].
161. Thiết bị và vật liệu:
- dung dịch kali tri iot: lấy 15.7 iot và 20g kali iot hòa tan ừong 100ml nước
cất và bảo quản ở tủ 4°c.
- dung dịch H2SO4 2N.

162. Cách tiến hành:
- lấy mẫu lá nghiền nhỏ thành dạng bột bằng cối chày sứ với nitơ. Cân 0.5g
bột nghiền nhỏ hòa tan vào 200ml nước đề ion, đặt vào máy lắc ừong vòng 24 giờ
ở nhiệt độ 25°c.
- lọc thu dịch, bảo quản trong tủ đá để phân tích.
- pha loãng dịch lọc bằng H2SO4 2N với tỉ lệ 1:1.
- lấy 0.5ml dịch pha loãng cho vào ống nghiệm eppendorf 2ml đặt vào hộp
đá trong 60 phút.
- sau đó bổ sung 0.2ml dung dịch kali tri-iot, đặt hốn hợp phản ứng này vào
nhiệt đọ 0-4°C ừong 16 giờ.
- sau đó ly tâm ở 10000 vòng/ phút trong 15 phút ở 0°c.
2
0
- hút phần dịch nổi (chú ý thao tác nhẹ nhàng) cho vào ống nghiệm, bổ sung
9ml 1.2-diclometan ( đã làm mát ở -10°C), đảo đều trong khoảng 1-2 phút (luôn
giữ hỗn hợp phản ứng ở 4°c ).
- sau 2-2.5 giờ, bỏ lớp nước phía trên và xác định mật độ quang học của lớp
chất hữu cơ phía dưới ở bước sóng 365nm.
- hàm lượng của glyxin betain được tính toán từ đường chuẩn.
163. Y= 0,865. X - 0,348 (R
2
=0,97)
164. Trong đó : Y - nồng độ glyxin betain (|ig/ml ), X - сю
365шп
.
165. Glyxin betain (mg/g)= Y(|jg/ml).V(mI ).df/ 1000.w(g).
166. Trong đó :
167. X : giá trị OD
365nm
của mẫu.

168. V: thể tích dịch chiết (=số mi 1,2- diclometan).
169. df: hệ số pha loãng (trong trường họp này là 80=40 ml dịch chiết đã
pha loãng bằng H2SO4 2N/0,5ml phân tích)
170. w : khối lượng mẫu (=0,5g).
171. 1000 :hệ số chuyển đổi đơn vị |ig/g sang mg/g mẫu).
172. Nồng độ glyxin betain được chuẩn bị ở 50-200 ng/ml trong axit
H2SO4 IN để dựng đường chuẩn.
* xác định hàm lượng axỉt ascorbic
173. (theo Nguyễn Văn Mùi) [ 10]
• Cách tiến hành
Nguyên tắc:
174. Vitamin c có thể khử dung dịch iot. Dựa vào lượng iot bị khử bởi
Vitamin c có trong mẫu, suy ra hàm lượng Vitamin c.
175. Hóa chất:
176. Dung dịch HC15 %
2
1
177. Dung dịch iot
0.01N Dung dịch iot
1%
178. Tiến hành:
179. cân 5g mẫu tươi, nghiền nhỏ trong cối sứ với 5ml HC1 5%, nghiền
kỹ, cho vào ống đong (hoặc bình định mức), dẫn tới vạch 50ml bằng nước cất,
khuấy đều, lấy 20ml dịch nghiền cho vào bình nón dung dịch lOOml, chuẩn độ
bằng dung dịch iot có tinh bột làm chỉ thị màu cho đến màu xanh, d, Tính kết quả:
180. Hàm lượng Vitamin c được tính theo công thức sau:
181. _ V.V1.0.0008&100* . 07
182 x % = 3- đơnvị:%
183. V2.w
184. Trong đó:

185. V - Số ml dung dịch iot 0.0IN dùng chuẩn độ.
186. VI- Thể tích dung dịch thí nghiệm (50ml).
187. V2- Thể tích dịch mẫu để thí nghiệm
(lOml). w - Khối lượng mẫu (g).
188. 0.00088 - số gam Vitamin c tương ứng với lml dung dịch iot 0.01N.
2
2
189. 2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu.
- Kết quả thí nghiệm được tổng họp và xử lý bằng phần mềm thống kê Microsoft
Excel theo các tham số: giá trị trung bình ( X ), độ lệch chuẩn ( ổ ), sai số trung
bình (m), hệ số biến động (Cv), sai số của hiệu các trung bình số học (ĩĩid), độ
chính xác của thí nghiệm( m%), độ tin cậy của hai số trung bình (td) được tính
theo các công
thức:
2
3
n
Trong đó: Xi - giá trị đo được qua mỗi lần đo. n - số
lần nhắc lại.
190. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN cứu VÀ THẢO LUẬN
3.1. Ảnh hưởng của muối NaCl tới sự biến đổi hàm lượng prolin
của mầm đậu tưoug.
191. Prolin là một amino axit được tạo ra trong thực vật và tích lũy cao
khi thực vật phản ứng với stress mặn.
192. Prolin đóng vai trò như chất điều hòa thẩm thấu ở dạng trung bình
để làm ổn định protein và màng tế bào cũng như bảo tồn năng lượng khi thực
vật tiếp xúc với sừess. Kết quả nghiên cứu sự ảnh hưởng của stress muối đối với
mầm đậu tương ở các nồng độ khác nhau được chúng tôi theo dõi trong 6 giờ ở
ngày ngâm hạt đầu tiên và sau đó theo dõi hằng ngày vào lúc 8h30 trong 6 ngày
nảy mầm, kết quả thu được như sau:

193. Bảng 4. Ảnh hưởng của muối NaCl tới hàm lưọng prolỉn
194. trong 6 giờ ngâm hạt.
195. ĐV:mg/g
196. Mâu TN
197. Sau 2 giờ
( X ± m )
198. Sau 4 giờ (X
+ m)
199. Sau 6 giờ (X
+ m)
200. ĐC 201. 0,894+0,010 202. 0,927+0,010 203. 0,918+0,030
204. M0,3 205. 0,982+0,040 206. 1,021+0,010 207. 0,946+0,060
208. MO,6 209. 1,118+0,010 210. 1,123+0,010 211. 1,026+0,015
212. MO,9 213. 1,117+0,010 214. 1,069+0,060 215. 1,041+0,010
216. Ml, 2 217. 1,103+0,030 218. 1,028+0,010 219. 1,102+0,010
220. Ml, 5 221. 1,053+0,050 222. 1,106+0,010 223. 1,114+0,060
224. Ml,8 225. 0,991+0,030 226. 1,102+0,010 227. 1,100+0,020
228.
2
4
229. Ở ngày đầu tiên, đây là thời kì mà hạt có quá trình hút nước mạnh
nhất để đáp ứng lượng nước cho hạt trương lên và cung cấp nước cho các quá
trình chuyển hóa các chất dự trữ trong hạt để tổng hợp nên các chất mới để hạt
bước vào giai đoạn nảy mầm. Ngày đàu tiên, tôi tiến hành đo hàm lượng prolin
trong 3 lần: sau 2 giờ, sau 4 giờ và sau 6 giờ, nhằm mục đính đánh giá sự tác động
của muối NaCl đến đậu tương ở thời kì khởi đầu. Từ kết quả thu được sau 3 lần
đo ở 6 giờ ta thấy: hàm lượng prolin ở đây đã có nhưng ít ở tất cả các nồng độ (từ
M0,3 đến Ml,8). Hàm lượng prolin được tích lũy tăng khi nồng độ muối NaCl
trong môi trường tăng tuy nhiên sự tăng này hầu như không đáng kể (tăng ở mức
0,001 đến 0,1), sự biến động ở đây khá nhỏ ( ở MO,6 và MO,9 chỉ biến động là

0,001). Mặt khác ta cũng thấy sự biến động hàm lượng prolin theo thời gian sau 2
giờ, sau 4 giờ và sau 6 giờ cũng không đang kể.
230. *
231.
1
232.
233.
234.
1
235.
236.
237.
1
238.
239.
240.
1
241.
242.
243.
1
244.
2
5