Nghiên cứu đa dạng kiểu nhân ở tỏi cô đơn(alliumsativum) trên đảo lý sơn, tỉnh quảng ngãi

LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chưa từng được
ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả

Bùi Thị Minh Hòa

i


LỜI CÁM ƠN
Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp của mình, tôi xin chân thành cám ơn
tất cả các thầy cô giáo Khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm, Đại
học Đà Nẵng đã tận tình dạy dỗ, truyền đạt những tri thức và kinh nghiệm quý
báu cho tôi.
Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS. Trương Thị Thanh Mai đã tận tình
giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu làm luận văn.
Xin gửi lời cám ơn đến gia đình, bạn bè những người đã luôn động viên,
đóng góp những ý kiến quý báu cho tôi.
Đà Nẵng, tháng 5 năm 2013
Sinh viên

Bùi Thị Minh Hòa

ii


MỤC LỤC
Trang

MỞ ĐẦU .............................................................................................................. i
1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................... 1
2. Mục tiêu đề tài .................................................................................................. 2
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .................................................................2
3.1. Ý nghĩa khoa học ...................................................................................................2
3.2. Ý nghĩa thực tiễn ........................................................................................... 2
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................... 3
1.1. Sơ lược về cây tỏi ...................................................................................................3
1.2. Tình hình nghiên cứu .............................................................................................4
1.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ............................................................. 4
1.2.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ............................................................. 5
1.3. Một số khái niệm....................................................................................................6
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............. 8
2.1. Đối tương nghiên cứu ............................................................................................8
2.2. Thời gian nghiên cứu .............................................................................................8
2.3. Địa điểm nghiên cứu ..............................................................................................9
2.4. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................9
2.4.1. Phương pháp nghiên cứu NST ...........................................................................9
2.4.2. Phương pháp nghiên cứu hình thái ................................................................ 10
2.4.3. Phương pháp xây dựng kiểu nhân .................................................................. 11
2.4.4. Phương pháp xử lí số liệu ................................................................................ 12
CHƢƠNG 3: NỘI DUNG VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .......................... 13
3.1. Kết quả khảo sát các công thức làm tiêu bản kiểu nhân (karyotype) .............. 13
3.2. Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái tỏi cô đơn và tỏi nhiều tép Lý Sơn. .. 15
3.2.1. Tỏi cô đơn......................................................................................................... 15
3.2.2. Tỏi nhiều tép..................................................................................................... 15
3.3. Kết quả phân tích kiểu nhân ở tỏi Lý Sơn ......................................................... 17
iii

3.3.1. Kết quả phân tích kiểu nhân tỏi cô đơn .......................................................... 17
3.3.2. Kết quả phân tích kiểu nhân (karyotype) tỏi nhiều tép.............................28
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................. 31
4.1. Kết luận ................................................................................................................ 31
4.2. Kiến nghị ............................................................................................................. 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 33

iv


DANH MỤC BẢNG

Số
hiệu

Tên bảng

Trang

3.1

Kết quả khảo sát các cách tiền cố định bằng 8-hydroxyquinon

13

3.2

Kết quả khảo sát nồng độ dung dịch HCl thủy phân mẫu

13

3.3

Các thông số hình thái dạng tam bội tỏi cô đơn trên mẫu rễ

18

3.4

Các thông số hình thái NST dạng tứ bội tỏi cô đơn trên mẫu

20

bảng

rễ
3.5

Các thông số hình thái NST dạng tứ bội tỏi cô đơn trên callus

22

mới phát sinh
3.6

Các thông số hình thái NST dạng tứ bội tỏi cô đơn trên callus

24

qua cấy chuyển nhiều lần

3.7

Các thông số hình thái NST dạng ngũ bội tỏi cô đơn trên

25

callus qua cấy chuyển nhiều lần
3.8

Các thông số hình thái NST dạng lưỡng bội tỏi nhiều tép

v

28


DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ

Tên biểu đồ

Trang

3.1

Idiogram của dạng tam bội tỏi cô đơn trên mẫu rễ

19

3.2

Idiogram dạng tứ bội tỏi cô đơn trên mẫu rễ

20

3.3

Idiogram dạng tứ bội tỏi cô đơn trên callus mới phát sinh

22

3.4

Idiogram dạng tứ bội tỏi cô đơn trên callus qua cấy chuyển

24

nhiều lần
3.5

Idiogram dạng ngũ bội tỏi cô đơn trên callus qua cấy

26

chuyển nhiều lần
3.6

Idiogram dạng lưỡng bội tỏi nhiều tép

vi

28


DANH MỤC HÌNH ẢNH

Số
hiệu

Tên hình vẽ

hình

Trang

vẽ
2.1

Mẫu rễ tỏi cô đơn

8

2.2

Mẫu callus mới phát sinh

8

2.3

Mẫu callus cấy chuyển nhiều lần

8

3.1

Hình thái ngoài tỏi cô đơn

15

3.2

Hình thái ngoài tỏi nhiều tép

16

3.3

Rễ tỏi cô đơn

17

3.4

Rễ tỏi nhiều tép

17

3.5

Bộ NST tam bội ở mẫu rễ

18

3.6

Karyogram dạng tam bội tỏi cô đơn trên mẫu rễ

19

3.7

Bộ NST tứ bội ở mẫu rễ

19

3.8

Karyogram dạng tứ bội tỏi cô đơn trên mẫu rễ

21

3.9

Bộ NST tứ bội tỏi cô đơn trên callus mới phát sinh

22

3.10

Karyogram dạng tứ bội tỏi cô đơn trên callus mới phát sinh

23

3.11

Bộ NST tứ bội ở callus cấy chuyển nhiều lần

23

3.12

Karyogram dạng tứ bội tỏi cô đơn trên callus qua cấy chuyển

25

nhiều lần
3.13

Bộ NST ngũ bội ở callus cấy chuyển nhiều lần

25

3.14

Karyogram dạng ngũ bội tỏi cô đơn trên callus qua cấy

26

chuyển nhiều lần
3.15

Bộ NST thập bội ở callus cấy chuyển nhiều lần
vii

27


3.16

Bộ NST dạng lưỡng bội tỏi nhiều tép

27

3.17

Karyogram bộ lưỡng bội tỏi nhiều tép

29

viii


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Lý Sơn – một hòn đảo nổi tiếng của Việt Nam với điều kiện thiên nhiên
vô cùng khắc nghiệt: đất chủ yếu là đất cát biển xâm thực và đất bazan do hoạt
động của núi lửa; khí hậu thì khô hạn vào mùa nắng, giông, bão vào mùa mưa.
Tuy nhiên, chính điều đó lại tạo điều kiện thuận lợi để nông dân vận dụng trồng

tỏi. Tỏi Lý Sơn đã trở thành thương hiệu tỏi của Việt Nam, đặc biệt là tỏi cô
đơn. Theo nông dân trồng tỏi, sau khi gieo tỏi giống sẽ thu được củ tỏi với nhiều
tép. Tuy nhiên trên 1ha đất trồng tỏi có thể thu được 1 – 2 kg tỏi đặc biệt, củ tỏi
chỉ có 1 tép lớn hơn tép tỏi bình thường, gọi là tỏi cô đơn. Theo người dân đảo
cũng như các thực khách thì tỏi Lý Sơn đặc biệt là tỏi cô đơn có hương vị thơm
ngon và hoạt tính hơn hẳn các loại tỏi khác.
Tỏi có chứa nhiều hợp chất sinh học quý như allicin, ajoen, dialyl
disulfid, các saponin [12], steroid, flavonoid, axit amin, chất béo, đường khử,
polysacharid, sterol và tinh dầu [1] trong đó tỏi Lý Sơn chứa hàm lượng allicin
cao hơn so với tỏi ta và tỏi Trung Quốc [1]. Chính nhờ những hoạt chất đó nên
tỏi không chỉ được dùng làm gia vị mà còn là một loại dược liệu được hầu hết
các nước trên thế giới sử dụng để chữa một số nhóm bệnh như: bệnh thấp khớp,
tim mạch, phế quản, tiêu hóa, bệnh trĩ, bệnh đái tháo đường [10].Ngoài ra, tỏi
còn có vai trò kháng một số loại vi trùng như Staphylloccocus, thương hàn, lỵ
amip, trực khuẩn bạch hầu [6]. Ngày nay tỏi còn được chú ý đến trong khả năng
ức chế ung thư do tỏi chứa phong phú của các hợp chất hóa học được hữu ích
trong phòng và điều trị các loại ung thư khác nhau, đặc biệt, allicin - một hợp
chất có antithrombotic, chống oxy hóa, và các hoạt tính chống ung thư. Allicin
có thể thâm nhập rất nhanh vào các khoang khác nhau của tế bàovà hoàn toàn
được chuyển hóa ở gan. Nghiên cứu thực nghiệm cung cấp bằng chứng thuyết
phục rằng tỏi với thành phần chứa lưu huỳnh hữu cơ allyl là chất ức chế hiệu
quả sự tăng trưởng của khối u [5].

1


Đối với tỏi Lý Sơn, bên cạnh việc có hương vị thơm ngon hơn so với tỏi
ta hay tỏi Trung Quốc, hoạt tính sinh học của tỏi cũng hơn hẳn, đặc biệt là hàm
lượng allicin.
Vì vậy, tỏi trở thành một loài thực vật hữu ích cho con người. Tuy nhiên

các nghiên cứu về tỏi còn khá ít, chủ yếu là các nghiên cứu về hình thái học,
sinh thái học, kĩ thuật canh tác, các bài thuốc chữa bệnh từ tỏi… Riêng đối với
tỏi cô đơn Lý Sơn mặc dù chứa hoạt tính cao, được người tiêu dùng yêu thích,
giá thành khá đắt nhưng hầu như chưa được quan tâm nghiên cứu. Do đó, để góp
thêm nguồn tư liệu khoa học về tỏi Lý Sơn, đặc biệt là tỏi cô đơn, chúng tôi tiến
hành nghiên cứu đề tài: “ Nghiên cứu đa dạng kiểu nhân ở tỏi cô đơn (Allium
sativum) trên đảo Lý Sơn, tỉnh Quảng Ngãi ”.
2. Mục tiêu đề tài
- Khảo sát tìm ra phương pháp làm tiêu bản kiểu nhân tối ưu.
- Phân tích tổng hợp những tư liệu mô tả hình thái tỏi cô đơn và tỏi nhiều
tép của đảo Lý Sơn.
- Phân tích kiểu nhân, kiểm tra độ đa dạng kiểu nhân ở tỏi cô đơn và tỏi
nhiều tép của đảo Lý Sơn.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học
- Nghiên cứu tổng quan tài liệu về tỏi cô đơn và tỏi nhiều tép của đảo Lý
Sơn.
- Khảo sát tìm ra phương pháp làm tiêu bản kiểu nhân tối ưu.
- Nghiên cứu đặc điểm hình thái của tỏi cô đơn và tỏi nhiều tép.
- Xây dựng kiểu nhân, nhân đồ (karyogram), NST đồ (idiogram), xác định
công thức kiểu nhân và phân tích sự đa dạng kiểu nhân của tỏi cô đơn và tỏi
nhiều tép.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của đề tài góp thêm nguồn tư liệu khoa học về tỏi Lý Sơn, đặc
biệt là tỏi cô đơn.

2


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.

Sơ lƣợc về cây tỏi
Tỏi có tên khoa học là Allium sativum, thuộc chi Hành (Allium), họ Hành

(Alliacae). Tỏi là một loại địa thực vật cao khoảng 30-60 cm; hành tròn, to 2-4
cm; cầu hành có bao trắng; lá dẹp, dài 40-60 cm, rộng 1,2 cm [4].
Theo Đỗ Tất Lợi cho rằng trong thành phần của tỏi có chứa một ít iot và
tinh dầu. Tuy nhiên, thành phần chính của tỏi là một chất kháng sinh allicin
C6H10OS2 có tác dụng diệt vi khuẩn rất mạnh. Theo ông, trong tỏi không chứa
allicin mà chỉ có chất alliin, khi chất này chịu tác dụng của enzim alinaza (có
trong tỏi) và tiếp xúc với không khí thì hình thành allicin. Dung dịch allicin với
nồng độ 1/85.000-1/25.000 có thể ức chế sinh trưởng các trùng Staphylococcus,
Streptococcus, trùng thương hàn,trực trùng lỵ [6].
Trong dịch chiết tỏi có hơn 100 loại hợp chất chứa lưu huỳnh có giá trị
trong y học, tiêu biểu là N-aceryl-S-allyl cysteine, allyl mercaptan, diallyl
disulfide, diallyl sulfide, diallyl sulfoxide, diallyl sulfone, và allyl methyl
sulfide… Trong đó hợp chất allicin có vai trò quan trọng trong ức chế quá trình
nhân lên của tế bào ung thư và điều hoà apoptosis [16].
Một vài nghiên cứu cho thấy trong 3 loại tỏi: tỏi ta, tỏi Trung Quốc và tỏi
Lý Sơn đều có các nhóm hoạt chất gồm: saponin steroid, flavonoid, axit amin,
chất béo, đường khử, polysacharid, sterol và tinh dầu [1] trong đó tỏi Lý Sơn
chứa hàm lượng allicin cao hơn so với tỏi ta và tỏi Trung Quốc [1]. Có sự khác
biệt này có thể là do điều kiện thời tiết, đất đai, do quy trình và kinh nghiệm
trồng tỏi từ lâu đời của người dân Lý Sơn. Thời vụ trồng tỏi Lý Sơn hằng năm
bắt đầu từ tháng 9 đến tháng 10. Tuy nhiên, từ trước đó nhiều tháng người dân
đảo Lý Sơn đã xuống biển lấy cát san hô lên để phục vụ việc gieo trồng. Trước
tiên, lớp cát san hô cũ được cào sang một bên, sau đó buồi một lớp đất đỏ bazan
dày khoảng 1-2cm (đất đỏ này được lấy từ trên núi hoặc đào dưới hầm) đầm

chặt rồi bón phân lót. Lớp đất san hô mới được lấy lên từ dưới biển sẽ được phơi
khô rồi phủ lên bề mặt lớp đất và phân lón vừa xử lý. Sau đó, người dân tiến
3


hành găm đứng tép tỏi, phủ nhẹ một lớp cát mỏng, tránh tép tỏi tiếp xúc với
phân bón lót. Mât độ trồng: Hàng x hàng: 14-15 cm; Cây x Cây: 6 - 7 cm.
1.2. Tình hình nghiên cứu
1.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Trên thế giới có khá nhiều các nghiên cứu về hoạt chất và tác dụng của
tỏi: Năm 2008, một kết quả nghiên cứu được công bố cho rằng tỏi có tác dụng
làm giảm nguy cơ xơ vữa động mạch do các hợp chất có chứa lưu huỳnh của tỏi
có tác dụng phân giải cholesterol, triglyceride trong huyết thanh làm giảm lipit
máu [24].
Năm 2009, một bài tổng hợp khoa học đã cho rằng tỏi là một tác nhân hiệu quả
trong chống ung thư, chống oxi hóa, chống vi khuẩn, kích thích miễn dịch cơ thể
[17].
Trong thành phần của tỏi chứa ~ 2% protein trên trọng lượng tươi, các
protein chính hiện diện trong củ là agglutinins (25 kD; ASA25) và alliinase (110
kD) [21]. Ngoài các protein này, trong tỏi còn hiện diện các protein khác như
cao phân tử agglutinin glycoprotein (110 kD; ASA110) [20], protein kháng nấm,
allivin (13 kD) [27], và protein chống vi khuẩn, alliumin (13 kD) [28]. Hiệu quả
của toàn bộ các chất chiết xuất từ tỏi và ASA110 đã được nghiên cứu trên tế bào
lympho T [19].
Năm 2011, một nghiên cứu khác chứng minh được rằng: Sử dụng tỏi bổ
sung với thuốc trị đái tháo đường giúp cải thiện kiểm soát đường huyết ở bệnh
nhân tiểu đường type 2 [25].
Năm 2009, các nhà khoa học Hàn Quốc đã nghiên cứu nhân giống vô tính
thông qua tái sinh in vitro cây tỏi thành công [26].
Đối với nghiên cứu kiểu nhân của các loại thực vật thuộc chi Hành tỏi

trên thế giới đã có nhiều công trình như:
+ Nghiên cứu của Konvicka. O và Albert Levan năm 1972 về bộ NST ở
tỏi (Allium sativum): nghiên cứu về bộ NST của 4 chủng tỏi thuộc 2 dạng hình
thái khác nhau trong đó có 3 chủng loại H và 1 chủng loại U. Mục tiêu của
4


nghiên cứu này là xác định cách li di truyền đã gây nên sự tích lũy các NST
khác biệt giữa các dòng vô tính [22].
+ Nghiên cứu của Deniz Yuzbasioglu và Fatma Unal về kiểu nhân ở tỏi
(Allium sativum.L) được trồng phổ biến tại Thổ Nhĩ Kỳ: nghiên cứu này sử dụng
tế bào mô phân sinh ở đỉnh rễ trong nguyên phân để phân tích số lượng NST,
chiều dài thực tế của từng NST, tỉ lệ cánh…thông qua đó thiết lập bộ kiểu nhân
cho tế bào [17].
+ Một nghiên cứu khác của R Paknia và G Karimzadeh về đa dạng kiểu
nhân của một số quần thể hành bản địa ở Iran: Dựa vào các tế bào mô phân sinh
đang tiến hành nguyên phân để đo tổng chiều dài NST (TL), cánh dài (L), cánh
ngắn (S), chiều dài tương đối NST (RL), tỉ lệ cánh (AR). Hiển thị các công thức
nhiễm sắc thể 8m (hai quần thể), 7m1sm (tám quần thể) và 6m2sm (hai quần
thể) [18].
1.2.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Năm 2010, nghiên cứu của hai tác giả Phạm Thị Minh Phương và
Yosuke Tashiro cho thấy tỏi có số lượng NST là 2n=16 [9].
Riêng đối với tỏi Lý Sơn, theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Minh
Chính cho thấy: trong 3 loại tỏi (tỏi Lý Sơn, tỏi ta và tỏi Trung Quốc) đều có
các nhóm hoạt chất gồm: saponin steroid, flavonoid, axit amin, chất béo, đường
khử, polysacharid, sterol và tinh dầu. Bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao (HPLC) với detector PDA đã xác định được hàm lượng allicin trong tỏi Lý
Sơn, tỏi ta và tỏi Trung Quốc lần lượt là 0,767%, 0,712% và 0,670% [10].
Trong lĩnh vực y dược kết quả nghiên cứu của Nguyễn Lĩnh Toàn (2011)

cho thấy dịch chiết tỏi Lý Sơn ở nồng độ 5-10mg/l ức chế phát triển tế bào ung
thư tuyến tiền liệt người dòng PC-3 trên in vitro [15].
Hiện nay, ở Việt Nam, vấn đề nghiên cứu kiểu nhân và sự đa dạng kiểu
nhân cũng được thực hiện trên một vài đối tượng động, thực vật và người.
Ở đối tượng động vật có nghiên cứu của Ngô Giang Liên (ĐH KHTN,
ĐH QGHN) và Phạm Thị Khoa (Viện sốt rét, Ký sinh trùng, Côn trùng Hà Nội)
về đặc điểm kiểu nhân của loài Anopheles. dirus ở đảo Hải Nam, Trung Quốc
bằng cách sử dụng phương pháp phân tích NST trong kì giữa nguyên phân của
5


Baimai (1984), tiêu bản NST sau khi giữ ấm 370C trong 24h được nhuộm bằng
Giêm sa [5]. Nghiên cứu của Tô Cao Ly và Dương Thu Hương (2004) về kiểu
nhân của 2 đối tượng lợn Đại Mạch, lợn Móng Cái và con lai F1 của 2 giống này
bằng phương pháp nhuộm Band G để xác định cơ sở di truyền tế bào trong lai
tạo giống vật nuôi [7].
Ở Việt Nam kĩ thuật karyotype còn đang được nghiên cứu và bước đầu
ứng dụng để chuẩn đoán cho thai nhi. Điển hình có: nghiên cứu của Phùng Như
Toàn (2004), “ Khảo sát Karyotype thai nhi qua nuôi cấy tế bào ối trong chẩn
đoán trước sinh” [14], cùng với nghiên cứu của Đặng Thị Nhâm (2011), “ Phân
tích bộ nhiễm sắt thể (Karyotype) ở những cặp vợ chồng sẩy thai liên tiếp và con
bị dị tật bẩm sinh ” bằng cách phối hợp nhiều phương pháp khác nhau như: nuôi
cấy tế bào bạch cầu lympho máu ngoại vi của Hungerford D.A. (1965), phương
pháp nhuộm băng theo Seabright M (1971), phương pháp phân tích nhiễm sắc
thể và lập karyotype: theo tiêu chuẩn ISCN (2005) [8].
Trên đối tượng thực vật có nghiên cứu của Vũ Thị Hạnh (2001) về kiểu
nhân của một số loài trong chi Ráy (Alocasia) và chi Khoai môn (Colocasia),
nghiên cứu của Võ Thị Kim Diệp (2007) “ Đa dạng kiểu nhân của một số loài
trong chi Hành ” [2].
Tuy nhiên, cho đến nay tại Việt Nam vẫn chưa có một nghiên cứu nào về

mặt di truyền đối với tỏi Lý Sơn.
1.3. Một số khái niệm
Với vấn đề nghiên cứu kiểu nhân (karyotype) thì ở nước ta các khái niệm
về kiểu nhân, nhân đồ, NST đồ cũng đã được định nghĩa trong một số tài liệu
như: Di truyền học, Phân loại thực vật học…
Theo định nghĩa của Di truyền học thì kiểu nhân (karyotype) là tập hợp tất
cả các thể nhiễm sắc ở trung kỳ (kì giữa) phân chia của một tế bào và ở hầu hết
các sinh vật các tế bào có cùng một kiểu nhân [3].
Trong Phân loại thực vật học kiểu nhân (karyotype) là tập hợp tất cả các
đặc tính số lượng, chất lượng của bộ NST (Số lượng, kích thước, hình thái và
6


cấu trúc NST). Nhân đồ (karyogram) là hình ảnh cụ thể của chính bộ NST được
sắp xếp theo một thứ tự nhất định từng đôi tương đồng một từ NST tâm giữa,
tâm lệch đến tâm mút. Nhiễm sắc thể đồ (idiogram) là dựa vào nhân đồ rồi mô
hình hóa lên bằng các đường thẳng có chiều dài, chiều rộng cũng như vị trí tâm
động tương ứng với NST thực như trên nhân đồ [13].

7


CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣơng nghiên cứu
Tỏi Lý Sơn (Allium sativum) tại đảo Lý Sơn, tỉnh Quảng Ngãi thuộc chi
Hành (Allium), họ Hành (Alliaceae).
Trong nghiên cứu sử dụng 2 dạng tỏi Lý Sơn bao gồm: Tỏi cô đơn và tỏi
nhiều tép.
Riêng đối với tỏi cô đơn sử dụng trong phân tích bao gồm 2 loại mẫu:
mẫu rễ thu được trong điều kiện trồng tự nhiên và mẫu callus đang nuôi cấy tại

phòng Công nghệ sinh học, trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng.

Hình 2.1. Mẫu rễ tỏi cô đơn

Hình 2.2. Mẫu callus mới phát sinh

Hình 2.3. Mẫu callus cấy chuyển nhiều lần

2.2. Thời gian nghiên cứu
Đề tài được tiến hành từ tháng 11/2012 đến 5/2013.

8


2.3. Địa điểm nghiên cứu
Phân tích NST được tiến hành tại phòng thí nghiệm bộ môn Di truyền
Khoa Sinh – Môi Trường, trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp nghiên cứu NST
a. Cách xử lý mẫu
- Mẫu rễ
+ Thu rễ: Trồng trên đất cát ẩm khoảng 2-3 ngày đến khi rễ ra dài khoảng
2 cm, cắt lấy đoạn đầu rễ dài 1-1,5 cm, rửa sạch, thấm khô, chuyển vào dung
dịch tiền cố định.
+ Tiền cố định: Tiền cố định bằng 8-hydroxyquinoline 0,002M theo các
cách:
 Cách 1: 2h ở nhiệt độ phòng và chuyển vào tủ lạnh trong 3h.
 Cách 2: 3h ở nhiệt độ phòng và chuyển vào tủ lạnh trong 2h.
 Cách 3: 5h ở nhiệt độ phòng
 Cách 4: 3h ở nhiệt độ phòng

 Cách 5: 5h trong tủ lạnh
 Cách 6: 3h trong tủ lạnh
+ Cố định:
 Lấy rễ từ dung dịch tiền cố định, rửa sạch bằng nước cất thấm khô.
 Chuyển vào dung dịch cố định Carnua (3:1), để qua ít nhất 1 đêm mới
sử dụng.
+ Làm mềm rễ
 Rễ đem ra rửa sạch trong nước cất, ngâm trong vài phút, sau đó thấm
khô, làm mềm trong dung dịch HCl trong 10 phút ở 60oC trong nồi
cách thủy. Dung dịch HCl được thử nghiệm với các nồng độ 1N; 1,5N;
2N.
+ Nhuộm NST
9


 Rễ đã làm mềm rửa nhanh qua nước cất, thấm khô và nhuộm trong
dung dịch Schiff trong 30-40 phút.
 Nhuộm phụ rễ trong dung dịch Carmin acetic từ 5-10 phút.
- Mẫu callus
Xử lí mẫu callus cũng được tiến hành tương tự như trong xử lí mẫu rễ
b. Làm tiêu bản NST
- Mẫu rễ
+ Dùng panh lấy rễ đã nhuộm đặt lên lam kính sạch, dung dao lam cắt lấy
phần chóp rễ bắt màu đậm.
+ Nhỏ một giọt dung dịch acetic 45% lên lát cắt mẫu và đậy lamen.
+ Hơ nóng nhẹ lam kính lên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi mẫu chuyển
sang màu đỏ.
+ Đặt lam kính lên trên mặt phẳng dùng đầu bút chì gõ nhẹ và thẳng đứng
lên trên lamen để dàn mỏng mẫu.
- Mẫu callus

+ Dùng kim mũi mác lấy nhẹ một ít phần callus bên ngoài bắt màu đậm
đặt lên lam kính sạch rồi nhỏ một giọt dung dịch acetic 45% lên lát cắt
mẫu và đậy lamen. Hơ nóng nhẹ lam kính lên ngọn lửa đèn cồn cho đến
khi mẫu chuyển sang màu đỏ, dàn mỏng mẫu và tiến hành quan sát.
c. Quan sát và đếm số lượng NST
Tiêu bản được quan sát trên kính hiển vi ở độ bội giác x100
d. Chụp ảnh tiêu bản NST
- Các tế bào phân chia kì giữa có hình thái NST rõ ràng, tách rời nhau sẽ
được dùng để chụp ảnh phân tích kiểu nhân.
- Sử dụng máy ảnh Olympus 16.0 và máy ảnh Canon 14.0 với độ phóng đại
5.0 kết hợp với kính hiển vi tại phòng thí nghiệm Di truyền ĐHSP ĐN.
2.4.2. Phương pháp nghiên cứu hình thái
- Kích thước căn (cm)
+ Đo đường kính căn
10


- Kích thước lá
+ Đo chiều dài thân và lá (cm)
- Số lượng căn và dạng căn
+ Đếm số lượng căn
+ Dạng căn: hình cầu, hình chóp,…
2.4.3. Phương pháp xây dựng kiểu nhân
a. Đo NST để thu thập số liệu về hình thái NST
- Các NST được đo trực tiếp bằng compa kĩ thuật trên ảnh chụp NST đã
phóng đại, các phép đo đối với mỗi NST về chiều dài cánh: cánh dài (p),
cánh ngắn (q) và thể kèm (Ls) được minh họa theo hình vẽ dưới.
Tâm động

q

p

Ls

- Chiều dài trung bình của mỗi NST được xác định như là số liệu trung bình
đối với tất cả tế bào đã phân tích.
- Chiều dài thể kèm được xác định không bao gồm khoảng cách giữa đầu
mút cánh đến thể kèm.
- Tỉ lệ cánh được xác định theo công thức sau:
Chiều dài cánh dài NST
Tỉ lệ cánh (R) =

p
=

Chiều dài cánh ngắn NST

q

b. Phân loại NST
Phân loại hình thái dựa vào vị trí tâm động và tỉ lệ cánh (R)
Phân loại NST được tiến hành theo Levan (1964), cho trên bảng sau:
Vị trí tâm động

Tỉ lệ cánh (R)

Phân loại NST

Vùng chính giữa

1

M: Tâm cân

Vùng giữa

1,1 – 1,7

m: Tâm cân
11


Vùng gần giữa

1,7 – 3

Sm: Tâm lệch giữa

Vùng gần tận

3,1 – 7

St: Tâm lệch mút

Vùng tận

>7

T: Tâm mút

c. Thiết lập Nhân đồ (Karyogram) và NST đồ (Idiogram)
Nhân đồ và NST đồ được xây dựng trên số lượng, hình thái NST và số đo
chiều dài tương đối, tỉ lệ cánh. Các cặp NST trong Karyogram và Idiogram được
sắp xếp theo giá trị tăng dần về chiều dài trung bình NST.
2.4.4. Phương pháp xử lí số liệu
Xử lí các số liệu hình thái NST được tính toán thống kê và vẽ biểu đồ
bằng chương trình Excel 2007, phần mềm Photoshop CS 5.0 thực hiện trên máy
vi tính.

12


CHƢƠNG 3: NỘI DUNG VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Kết quả khảo sát các công thức làm tiêu bản kiểu nhân (karyotype)
Kết quả khảo sát các cách tiền cố định bằng dung dịch 8-hydroxyquinon
và kết quả khảo sát các nồng độ HCl giai đoạn thủy phân mẫu thể hiện lần lượt
trên 2 bảng 3.1 và 3.2.
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát các cách tiền cố định bằng 8-hydroxyquinon
Cách

Tiền cố định

Kết quả khảo sát

bằng 8-hydroxyquinon 0,002M

Đánh giá
kết quả

1

2h nhiệt độ phòng + 3h trong tủ
lạnh

NST bắt màu tốt, hình
thái NST rõ rang

++

2

3h nhiệt độ phòng + 2h trong tủ
lạnh

NST bắt màu tốt, hình
thái NST rõ rang

+++

3

5h nhiệt độ phòng

NST bắt màu kém, hình
thái NST không rõ rang

4

5h trong tủ lạnh

NST bắt màu tốt, hình
thái NST rõ ràng

5

3h nhiệt độ phòng

NST bắt màu kém, hình
thái NST không rõ

-

6

3h trong tủ lạnh

NST bắt màu kém, hình
thái NST không rõ

-

++

Bảng 3.2. Kết quả khảo sát nồng độ dung dịch HCl thủy phân mẫu
Cách
1

Thủy phân mẫu

Kết quả khảo sát

bằng dung dịch HCl
HCl 1N

Bắt màu tốt
NST tách rời tốt, tiêu bản tốt, khi
dàn mỏng các tế bào nằm trên 1 mặt
phẳng  dễ quan sát

13

Đánh giá
kết quả
+++


2

HCl 1,5N

Bắt màu tốt hơn ở HCl 1N

++

NST tách rời tốt hơn ở HCl 1N
Tiêu bản không tốt, khi dàn mỏng
các tế bào bị biến dạng, kết dính
hoặc chồng lớp lên nhau  khó

quan sát
3

HCl 2N

Bắt màu tốt hơn ở HCl 1N

+

Tiêu bản không tốt, khi dàn mỏng
các tế bào bị biến dạng, kết dính
hoặc chồng lớp lên nhau  khó
quan sát

Chú thích: (-): Xấu

(+): Trung bình

(++): Tốt

(+++): Rất tốt

Trong giai đoạn tiền cố định, kết quả khảo sát cho thấy xử lý bằng dung
dịch 8 – hydroxyquinon 0,002M trong 3h nhiệt độ phòng và 2h tiếp theo trong tủ
lạnh cho mẫu tiêu bản kiểu nhân tốt nhất (hình thái NST rõ và bắt màu tốt nhất).
Như vậy, trong giai đoạn này thời gian ngâm mẫu trong dung dịch tiền cố
định và nhiệt độ xử lý có ảnh hưởng khá rõ rệt đến độ bắt màu và hình thái NST.
Trong giai đoạn thủy phân mẫu, kết quả khảo sát cho thấy khi xử lý mẫu
bằng dung dịch HCl ở 3 nồng độ 1N, 1,5N, 2N thì tại nồng độ HCl 1N cho tiêu
bản kiểu nhân tốt nhất (các chiếc NST tách rời tốt nhất). Kết quả này đúng với

phương pháp làm tiêu bản kiểu nhân được trình bày trong quyển Thực hành tế
bào thực vật của Pause Z. P. (1974) [23]. Kết quả này cho thấy nồng độ dung
dịch HCl có ảnh hưởng quan trọng đến khả năng tách rời các chiếc NST và độ
bền của tế bào thực vật.

14


3.2. Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái tỏi cô đơn và tỏi nhiều tép Lý
Sơn.
3.2.1. Tỏi cô đơn
Tỏi cô đơn thuộc dạng cây thân thảo, kích thước trung bình từ 24 – 35 cm,
lá dẹt màu xanh nhạt, chiều dài lá trung bình từ 20 – 30 cm. Căn bình dạng cầu
chóp nhọn đường kính khoảng từ 0,8 – 1,5 cm, màu trắng đục và chỉ có 1 tép.
Phần bẹ lá màu xanh nhạt. Hiếm khi có hoa.

Hình 3.1. Hình thái ngoài tỏi cô đơn
3.2.2. Tỏi nhiều tép
Tỏi nhiều tép thuộc dạng cây thân thảo, kích thước trung bình từ 20 – 30
cm, lá dẹt màu xanh nhạt, chiều dài lá trung bình từ 16 – 25 cm. Căn chia làm
nhiều tép trung bình từ 6 – 15 tép màu trắng đục, đường kính trung bình từ 1,5 –
2,5 cm, các tép có hình dạng và kích thước khá đồng nhất, dạng tép suông thẳng
đường kính trung bình của mỗi tép từ 0,3 – 0,6 cm. Phần bẹ lá màu xanh nhạt.
Hiếm khi có hoa.

15


Hình 3.2. Hình thái ngoài tỏi nhiều tép
Kết quả phân tích hình thái ngoài 2 dạng tỏi Lý Sơn: tỏi cô đơn và tỏi

nhiều tép cùng 1 giống phát sinh nhưng lại có một số sai khác về hình thái như:
dạng căn, số lượng tép, kích thước căn, kích thước thân và lá. Trong đó cho thấy
tỏi cô đơn vượt trội hơn tỏi nhiều tép về tất cả các thông số hình thái phân tích.
Đồng thời, trong quá trình trồng 2 dạng tỏi này phát hiện thấy tỏi cô đơn có khả
năng sinh trưởng, sức sống tốt hơn so với tỏi nhiều tép thể hiện qua thời gian ra
rễ, đường kính rễ, thời gian lên mầm, thời gian sinh trưởng đạt kích thước tối đa,
dạng lá.
Như vậy, tuy cùng một giống phát sinh nhưng ở 2 dạng tỏi này đã thể hiện
sự khác biệt rõ rệt về hình thái ngoài và khả năng sinh trưởng.

16


Hình 3.3. Rễ tỏi cô đơn

Hình 3.4. Rễ tỏi nhiều tép

3.3. Kết quả phân tích kiểu nhân ở tỏi Lý Sơn
3.3.1. Kết quả phân tích kiểu nhân tỏi cô đơn
a. Mẫu rễ
Phân tích hình thái NST được tiến hành trên ảnh chụp hiển vi tiêu bản
NST kì giữa tế bào đỉnh rễ đã phóng đại lớn. Ảnh chụp phóng đại của ít nhất 3 tế
bào đang phân chia ở kì giữa với hình thái NST rõ được dùng để phân tích NST
để xác định công thức kiểu nhân.Số liệu về chiều dài tương đối của cánh dài,
cánh ngắn, chiều dài trung bình NST, tỉ lệ cánh được trình bày trong bảng 3.3,
3.4. Nhân đồ (Karyogram) và NST đồ (Idiogram) của NST được vẽ dựa trên số
liệu trung bình chiều dài tương đối của mỗi NST thể trên hình 3.5, 3.6 và biểu
đồ 3.1, 3.2. Các NST được sắp xếp và đánh số theo sự tăng dần của chiều dài
trung bình NST.
Kết quả phân tích trên mẫu rễ cho thấy ở tỏi cô đơn tồn tại bộ NST gồm

dạng tam bội và dạng tứ bội
- Dạng tam bội:

17