Nhân nhanh cây hoa dã yên thảo (petunia hybrida) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
=====***=====

NGUYỄN THÙY VÂN

NHÂN NHANH CÂY HOA DÃ YÊN THẢO
(PETUNIA HYBRIDA
NG
THU T
NU I CẤY M T
ÀO TH C V T
HÓA LU N TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
Th.s La Việt Hồng

HÀ NỘI - 2015


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Th.s La Việt Hồng – Khoa Sinh
KTNN Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi
trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin cảm ơn tới các Ban Giám hiệu trƣờng ĐHSP Hà Nội 2, Ban
Chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN trƣờng ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện
để tôi hoàn thành khóa luận này.
Trong thời gian thực hiện đề tài tôi cũng nhận đƣợc sự giúp đỡ tận tình
của cô Mai Thị Hồng – Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật, thầy Ong Xuân
Phong - Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học và Chuyển giao Công nghệ
đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến để tôi hoàn thành đề tài khóa luận, nhân đây tôi

cũng xin gửi lời cảm ơn.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Trung tâm Hỗ trợ
Nghiên cứu Khoa học và Chuyển giao Công nghệ, Phòng thí nghiệm Sinh lí
thực vật, Phòng thí nghiệm Thực vật- trƣờng ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo điều
kiện thuận lợi về thiết bị, phƣơng tiện để tôi có thể hoàn thành khóa luận này.
Cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, góp ý cho tôi trong qua
trình học tập và hoàn thành đề tài.
Hà Nội, ngày 10 tháng 04 năm 2015
Sinh viên

NGUYỄN THÙY VÂN


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số
liệu, kết quả nghiên cứu trong khóa luận là trung thực và chƣa đƣợc ai công
bố.
Hà Nội,10 tháng 04 năm 2015
Sinh viên

NGUYỄN THÙY VÂN


DANH MỤC CÁC CHỮ VI T TẮT
NAA:

Napthlacetic acid

BAP:

6-Benzyl amino purin

MS:

Murashige và Skoog

Tp.HCM:

Thành phố Hồ Chí Minh

Nxb:

Nhà xuất bản

Ctv

Cộng tác viên


DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Các công thức thí nghiệm xác định hiệu quả của chất khử trùng .. 18
Bảng 2.2. nh hƣởng của

P và Kinetin đến khả năng tạo cụm chồi cây Dã

yên thảo ........................................................................................................... 19
Bảng 2.3. nh hƣởng của -N

và nƣớc d a đến tạo rễ cây Dã yên thảo in

vitro ................................................................................................................. 20
ảng 2.4. nh hƣởng của giá thể tới t lệ sống của ã yên thảo ................... 21
Bảng 3.1. Hiệu quả chất khử trùng đối với chồi cây hoa Dã yên thảo ........... 23
Bảng 3.2.

nh hƣởng của nồng độ

P và Kinetin đến hệ số nhân chồi cây

Dã yên thảo...................................................................................................... 29
Bảng 3.3

nh hƣởng của -N

và nƣớc d a đến sự hình thành rễ ở cây ã

yên thảo ........................................................................................................... 31
ảng 3.4: nh hƣởng của giá thể tới rèn luyện cây ngoài tự nhiên ............... 33


DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1 Hiệu quả chất khử trùng trên mẫu đỉnh sinh trƣởng ........................ 23
cây Dã yên thảo ............................................................................................... 23
Hình 3.2. hồi cây hoa Dã yên thảo. (Trái) mẫu in vitro vô trùng sau 5 ngày
nuôi cấy, (Phải) mẫu in vitro bị nhiễm sau 5 ngày nuôi cấy........................... 24
Hình 3.3. ác bƣớc đơn giản tạo vật liệu in vitro t đỉnh sinh trƣởng của cây
Dã yên thảo...................................................................................................... 25
Hình 3.4. Quá trình phát sinh phôi ở cây 2 lá mầm (Arabidopsis) ................. 27

Hình 3.5. Quá trình phát sinh phôi soma của cây Dã yên thảo....................... 28
Hình 3.6

nh hƣởng của nồng độ

P và Kinetin đến hệ số nhân nhanh t

chồi cây hoa Dã yên thảo ................................................................................ 29
Hình 3.7. Cụm chồi Dã yên thảo sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trƣờng có bổ
sung BAP......................................................................................................... 30
Hình 3.8. Tạo rễ cây ã yên thảo in vitro ....................................................... 32
Hình 3.9. ã yên thảo trong giai đoạn rèn luyện ............................................ 34
Hình 3.10. ã yên thảo in vitro đã ra hoa ngoài tự nhiên ............................... 34
Hình 3.11. Nhân nhanh cây hoa Dã yên thảo in vitro ..................................... 35


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu ..................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 2
4. Ý nghĩa của đề tài .......................................................................................... 2
N I UNG ....................................................................................................... 3
HƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3
1.1. Giới thiệu về cây Dã yên thảo (petunia hybrida)....................................... 3
1.1.1. Vị trí, phân loại ....................................................................................... 3
1.1.2. Mô tả ....................................................................................................... 3
1.1.3. Nguồn gốc, phân bố ................................................................................ 4
1.1.4. Một số đặc điểm của cây hoa Dã yên thảo.............................................. 5
1.1.5. K thuật chăm sóc hoa ã yên thảo........................................................ 7

1.2. Sơ lƣợc về nhân giống in vitro ................................................................... 8
1.2.1. ơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật.................................... 8
1.2.2. Hiện trạng nuôi cấy mô ở Việt Nam ....................................................... 9
1.2.3. Thành phần môi trƣờng dinh dƣỡng trong nuôi cấy mô ........................ 9
1.3. Các nghiên cứu về nhân giống in vitro cây Dã yên thảo. ........................ 13
HƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ............................................ 15
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu............................................................ 15
2.2. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu ................................................................. 15


2.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu............................................................................ 15
2.2.2. Thiết bị và dụng cụ................................................................................ 15
2.2.3. Môi trƣờng nuôi cấy. ............................................................................. 16
2.2.4. Điều kiện nuôi cấy in vitro .................................................................... 17
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu.......................................................................... 17
2.3.1. Bố trí thí nghiệm ................................................................................... 17
2.3.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................. 17
2.3.3. Phƣơng pháp phân tích số liệu .............................................................. 21
HƢƠNG 3: KẾT QU VÀ TH O LUẬN .................................................. 22
3.1. Tạo vật liệu khởi đầu in vitro t chồi cây hoa Dã yên thảo ..................... 22
3.2. Nhân nhanh cây Dã yên thảo bằng phƣơng pháp tạo cụm chồi in vitro .. 26
3.2.1. Quan sát sự phát sinh hình thái trong quá trình tạo mô sẹo Dã yên thảo
in vitro ............................................................................................................. 26
3.2.2. nh hƣởng của

P và Kinetin đến khả năng tạo cụm chồi cây Dã yên

thảo .................................................................................................................. 28
3.3. Tạo rễ cây Dã yên thảo in vitro ( nh hƣởng của -N

và nƣớc d a đến

khả năng tạo rễ) ............................................................................................... 30
3.4. Rèn luyện cây Dã yên thảo in vitro ngoài môi trƣờng tự nhiên............... 32
HƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................. 36
4.1. Kết luận .................................................................................................... 36
4.2. Kiến nghị .................................................................................................. 36
TÀI LIỆU THAM KH O ............................................................................... 37


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Sau những phút giây bận bịu với công việc, mỗi ngƣời có thể tìm
cho mình những thú chơi tao nhã giúp xả stress. ó ngƣời đến trung tâm
thể dục thể thao, bơi lội để rèn luyện sức khỏe, có ngƣời lại tìm tới các
lớp nấu ăn, làm đẹp, cũng có ngƣời lại ở nhà xem tivi, máy tình hay chơi
điện tử… ên cạnh đó, có không ít ngƣời tìm đến thú vui trồng hoa để có
khoảng không gian thoáng đảng với những chậu hoa rực rỡ sắc màu [13].
Xã hội đô thị hóa đất chật ngƣời đông với những ngƣời yêu thích
cây xanh thì việc có một mảnh vƣờn trồng cây thì thật khó. Vì vậy việc
tận dụng ban công để trồng hoa quả là ý kiến sáng suốt. Hiện nay việc
trồng hoa trang trí ban công đang rất thịnh hành và đƣợc ƣa chuộng đặc
biệt là các khu đô thị. Mỗi sớm thức dậy bạn có thể ra đứng hít thở khí
trời, ngắm nhìn ánh bình minh hay ngắm cảnh mặt trời mọc, làm nhƣ thế
nào để ngôi nhà nhỏ xinh của bạn trông quyến rũ, phong cách mà không
cần ban công quá cầu kì. Xu hƣớng tận dụng ban công để làm đẹp cho
ngôi nhà của mình ngày càng trở nên ƣa chuộng, đặc biệt đối với những
ngôi nhà có diện tích không lớn, không thể đủ để thiết kế một sân vƣờn,
hay một không gian thoáng rộng nơi mặt đất. Kết hợp ban công sắt với
họa tiết trang trí đơn giản điểm tô một vài chậu hoa là ý kiến sáng tạo cho

trang trí ngôi nhà bạn. Chỉ cần chút khéo léo kết hợp ban công sắt với cây
cảnh, cỏ cây hoa lá, bạn sẽ sở hữu một không gian độc đáo ấn tƣợng [14].
Nhƣng giá thành của một số loài hoa, cây cảnh vẫn khá cao trong
đó có hoa

ã yên thảo – “nữ hoàng hoa ban công”. Hoa Dã yên thảo

đƣợc du nhập vào nƣớc ta hiện nay chủ yếu là nhân giống t hạt. Tuy
nhiên theo Verdork (2005) cây hoa Dã yên thảo có hạt nhỏ và rất chậm để
xử lý nhân giống bằng hạt. Đối với nhân giống bằng cành thì hệ số nhân

1


thấp, không đồng đều nên chƣa thể đáp ứng nhu cầu khi cần trồng cây với
số lƣợng lớn, đồng loạt. Trong khi đó nuôi cấy mô là một phƣơng pháp
hiệu quả trong nhân giống. Để chủ động trong việc sản xuất cây giống và
giảm giá thành chúng tôi thực hiện nghiên cứu đề tài: “Nhân nhanh cây
hoa Dã yên thảo (petunia hybrida) bằng kĩ thuật nu i

m t

o th

vật”
2. Mục đích nghiên cứu
Nhân giống cây hoa Dã yên thảo (petunia hybrida) bằng phƣơng pháp
tạo cụm chồi trong điều kiện in vitro.
3. Nội dung nghiên cứu
- Tạo vật liệu in vitro t chồi đỉnh cây Dã yên thảo (petunia hybrida)

-

nh hƣởng của

P đến khả năng tạo cụm chồi của cây Dã yên thảo

(petunia hybrida) in vitro .
-

nh hƣởng của

– N

đến khả năng ra rễ của cây Dã yên thảo

(petunia hybrida) in vitro.
4. Ý nghĩa của đề tài
-

Ý nghĩa lí luận: Góp phần bổ sung vào nguồn tài liệu nghiên cứu về
nhân giống in vitro cây Dã yên thảo (petunia hybrida).

-

Ý nghĩa thực tiễn: Góp phần sản xuất cây giống ã yên thảo có hiệu
quả cao, chất lƣợng tốt.

2

NỘI DUNG
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về cây Dã yên thảo (petunia hybrida)
1.1.1.

tr phân loại

Giới: Plantea(Thực vật)
Giới phụ: Tracheobionta
Ngành: Magnoliophyta
Ngành phụ: Spermatophyta
Lớp: Magnoliopsida
Lớp phụ: Asteridae
Bộ: Solanales
Họ: Solanaseae
H nh 1.1. Hoa D yên thảo

Giống: Petunia
Tên khoa học: Petunia hybrida

(petunia hybrida)

Tên thông thƣờng: Petunia
Tên việt nam: Dạ yên thảo, Dã yên thảo [15].
1.1.2. Mô tả
Dã yên thảo là cây sống hằng năm, cây cao 15 - 30 cm. Thân có lông
mịn bao quanh, phân nhánh t các nách lá thật, một nách lá có thể phân nhiều
nhánh. Lá đơn, mọc đối hay luân phiên, mặt trên và dƣới của lá có phủ lớp
lông mịn. Lá hình oval, mềm mại, mép nguyên không có răng cƣa.
Hoa cô độc, mọc trên một cọng dài 2 - 3 cm, đài hoa cao 1 - 2,5 cm.

Hoa lƣỡng tính gồm 5 tiểu nhụy gắn ở phần dƣới của ống vành. Nang hủy
ngăn thành hai mảnh, hạt nhiều và rất nhỏ [2]. Hoa Dã yên thảo nguyên thủy
có hình phễu, tuy nhiên sự lai tạo đã cho nhiều dạng hoa khác nhau nhƣ: hoa
cánh đơn, hoa cánh kép với mép có viền và gợn sóng, mép dúng hình cung

3


nhọn ở giữa. Màu sắc hoa có thể thay đổi t tía đến trắng, tía đến đỏ, đỏ đến
cam, tím đến tím nhạt. Đặc biệt nhiều loại Dã yên thảo trắng thuần khiết
hay xanh nhạt pha hơi đỏ (màu hoa oải hƣơng) có mùi thơm dịu dàng.
Dã yên thảo là cây nhất niên, nở hoa vào mùa hè. Dã yên thảo ƣa
sáng, sẽ trở nên mảnh khảnh và ít hoa nếu trồng trong tối. Cây thích hợp với
điều kiện độ ẩm v a phải, có thể sống trong điều kiện hơi khô nhƣng không
thích ứng với điều kiện ngập úng. Cây thích hợp với khí hậu nóng và ẩm,
không chịu đƣợc nhiệt độ quá lạnh hay quá nóng. Dã yên thảo trồng đƣợc trên
hầu hết các loại đất, nhƣng tốt nhất là đất màu mỡ, đất có pH t 6.0 – 7.0.
Bấm đọt để kích thích cây đâm nhánh tạo độ rũ cho cây, nếu cây ốm yếu hay
sau khi cho hoa rộ thì cũng nên tỉa lá bớt để cây phục hồi lại.
Dã yên thảo thƣờng bị chết vì úng nƣớc, vì vậy cần tƣới nƣớc đúng
liều lƣợng, không tƣới nƣớc lên lá và nụ tránh làm thối lá và nụ, cải thiện điều
kiện vệ sinh và duy trì ẩm độ thích hợp. Ngoài ra, Dã yên thảo thƣờng bị héo
rũ do nấm, bị thối nhũn do vi khuẩn cũng nhƣ sâu, sên, rệp cắn phá. Một số
bệnh virus cũng ảnh hƣởng nhiều đến cây nhƣ làm biến dạng lá, cây chậm
phát triển, hoa không có màu và hình dạng thay đổi, thân tàn lụi liên tục, thối
đỉnh, lá có những sọc xanh sáng, bị lốm đốm và héo, có khi kết dính thành
cụm [16].
1.1.3. Nguồn gốc phân bố
Hoa ã yên thảo thuộc chi 35 của một loài thực vật có hoa, liên quan chặt
chẽ với cây thuốc lá, cà chua, khoai tây và ớt thuộc họ cà Solanaceae) [11].

Cây hoa Dã yên thảo có nguồn gốc t các nƣớc miền Nam châu M , hiện
nay đƣợc gây trồng rộng rãi ở các bãi cỏ, các khu đất rộng, vƣờn hoa khắp
nƣớc ta. Ở miền bắc, hoa nở vào dịp hè thu, còn ở miền nam, hoa nở vào dịp
Tết. Cây có nhiều tên gọi khác nhau, theo Phạm Hoàng Hộ (2000) cây có tên
là dã yên, theo Trần Hợp (2000) có tên là cây hoa cà.

4


Đây là một loại cây lai mà tổ tiên có t nhiều loài khác của chi petunia, ví
nhƣ P.axillaris BSP (Large White Petunia) hoa dạng ống hẹp, màu trắng,
hoặc P. violacea Lindl. (Violet-flowered Petunia) hoa dạng ống dài, thùy
rộng, màu tím. Ngày nay, các nhà vƣờn t loài lai này còn cho ra các dạng
hoa kép hay cánh hoa xòe ngón rất đẹp [3].
1.1.4. Một số đặc điểm của cây hoa Dã yên thảo
1.1.4.1. Các loại Dã yên thảo
Hoa Dã yên thảo có ba loại:
Dã yên thảo đơn: cây bụi, có rất nhiều hoa nhƣng hoa chỉ có 1 lớp cánh,
đƣờng kính của hoa lên tới 5-7,5 cm, dễ trồng và ít ảnh hƣởng đến sâu bọ.
Cánh có thể đơn lớp và đa lớp, dạng gợn sóng. Hoa có thể có sọc, đốm hoặc
viền quanh cánh với nhiều màu sắc khác nhau nhƣ đỏ tía, màu hoa cà, màu
oải hƣơng, hồng, đỏ, trắng, vàng. Khi chạm vào lá và cuống hoa thấy hơi
dính và có mùi thơm rất khác biệt.
Dã yên thảo kép: hoa lớn với nhiều cánh, đƣờng kính của hoa có thể lên
đến 13 cm.
Dã yên thảo lƣợn sóng: là cây thân leo, mùi thơm benzen đặc trƣng vì
trên

cây có rất nhiều tinh dầu [17].

5


Hoa ã yên thảo đơn

Hoa ã yên thảo kép

Hoa ã yên thảo biển sóng
H nh 1.2. C c lo i D yên thảo ngoài tự nhiên

6


1.1.4.2. Cách trồng Dã yên thảo
Có thể trồng bằng hai cách đó là giâm cành và trông t hạt, với cách
trồng hoa dã yên thảo bằng hạt thì cần làm đất k và đủ ánh nắng trƣớc khi
gieo hạt, hạt gieo 4-6 ngày sẽ cho cây con và có thể đem trồng ở vƣờn ƣơm
sau 20 ngày. Sau 20 - 25 ngày nữa thì đem trồng ở vƣờn hoa, đất trồng cần
đủ phân. Đối với cành giâm, sau 20 ngày đã có rễ và sau 1 tháng bứng
trồng ở nơi cố định.

ây chóng cho hoa, nhƣng nở rộ và chóng tàn, quả

cần thu hoạch kịp thời (1g quả có 10.000 - 12.000 hạt) [18].
ã yên thảo thƣờng đƣợc côn trùng thụ phấn, ngoại lệ với loài P.exserta
là một loài hiếm có hoa màu đỏ thì đƣợc chim ruồi thụ phấn. Hầu hết ã yên
thảo là loài lƣỡng bôi có 14 nhiễm sắc thể [9], [10]. Những bông hoa hình
ống đƣợc ƣa chuộng bởi một số loài Lepidoptera, bao gồm cả chim bƣớm
(Hummingbird) [19].
1.1.4.3. Nhượ điểm của hoa Dã yên thảo

- Là cây thân thảo, nhạy cảm đặc biệt trƣớc các thay đổi của thời tiết và nhiệt
độ cao mùa hè.
- Không chịu đƣợc mƣa nhiều, không chịu úng (Chậu hoa nên đăt nơi không
chịu mƣa trực tiếp).
- Bộ rễ rất nhạy cảm với nhiệt độ ngoại cảnh, trên 36°C dễ bị nẫu bộ rễ khi
nhiệt độ lên cao (nên che mát bồn chậu trồng khi ở nhiệt độ này).
- Bị nhiễm nấm làm nhũn thối cổ rễ, hoặc khô teo tại gốc giữa các cành kết
với thân chính do tổn thƣơng khi đóng gói vận chuyển.
- Cây sẽ bị chết ngay do mất nƣớc (Khi cây thiếu nƣớc có biểu hiện héo rũ,
bổ sung nƣớc lại cũng sẽ rất khó phục hồi do dã yên thảo có lá mỏng, hoa, lá
nhiều,thân rỗng) vì vậy cần quan tâm bổ sung đều nƣớc [18].
1.1.5.

thu t chăm sóc hoa Dã yên thảo
- Thƣờng ngắt ngọn khi cây còn nhỏ và để cây gia tăng số lƣợng mầm.

7


- Không trồng trong chậu quá nhỏ. Đất thịt, đất mịn quá là không thích
hợp, không bền cây.
- Khi cây quá già thực hiện cắt bớt thân ngọn, giữ gìn các phần thân
(Thực hiện vào ngày mát) có thể thay đất hoặc chậu to hơn vào mùa xuân),
bổ xung dinh dƣỡng cây sẽ bật mầm lộc dày và trong thời gian ngắn lại tiếp
tục cho Hoa nhiều vì cây đƣợc trẻ hóa, lƣu ý đây là loài cây ƣa ẩm, háu ăn
nhƣng chúng ta phải trồng bằng những giá thể thật xốp thoáng giàu chất hữu
cơ.
- Tránh đặt chậu cây nơi có gió lớn, cây hoa dễ bị tổn thƣơng.
Khi cây già cỗi có biểu hiện lá nhỏ,cành gầy, sắc hoa không thắm, cần bổ
xung thêm phân giàu đạm (có thể dùng nƣớc giải pha loãng) và tổng hợp

dinh dƣỡng vi lƣợng
- Tƣới nƣớc thƣờng xuyên, v a đủ. Trời ẩm không tƣới hoặc tƣới ít,
trời hanh khô tƣới nhiều hơn:
Kiểm tra độ ẩm bằng cách:
Dùng que tre nhỏ cắm sâu vào giữa bầu đất:
Que ƣớt: Th a nƣớc
Que se ẩm: Đủ nƣớc
Que sáng màu: Thiếu nƣớc [18].
1.2. Sơ lƣợc về nhân giống in vitro
1.2.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực v t
ơ sở khoa học của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào in vitro là học
thuyết về tính toàn năng totipotence) của tế bào. Theo Haberlandt G. (1902),
nhà thực vật học ngƣời Đức, tất cả các tế bào của cây đều mang toàn bộ lƣợng
thông tin di truyền của cơ thể, khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có
khả năng tái sinh và phát triển thành cá thể hoàn chỉnh [8].

8


Thực tế đã chứng minh đƣợc khả năng tái sinh của một cơ thể thực vật
hoàn chỉnh t một tế bào riêng rẽ. Hàng trăm loài cây trồng đã đƣợc nhân
giống trên quy mô thƣơng mại bằng cách nuôi cấy trong môi trƣờng nhân tạo
vô trùng và tái sinh chúng thành cây với hệ số nhân giống vô cùng lớn [12]
Nhƣ vậy, kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật xét cho cùng là kĩ
thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách
rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng) [4], [6].
1.2.2. Hiện trạng nuôi cấy mô ở iệt Nam
Ở Việt Nam, công việc nuôi cấy mô tế bào bắt đầu thực hiện trong
khoảng năm 1977 ở Phân Viện Khoa học Thành phố Hồ Chí Minh. Hiện nay
có rất nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô ở các Trƣờng Đại học, các Viện

nghiên cứu, các Sở khoa học và Công nghệ ở các Tỉnh, Thành phố. Đà Lạt là
nơi có nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô của tƣ nhân phục vụ cho
công tác nhân giống hoa cảnh và rau củ [7].
1.2.3. Thành phần môi trường dinh dưỡng trong nuôi cấy mô
Đến nay có hàng trăm loại môi trƣờng dinh dƣỡng nhân tạo đã đƣợc xây
dựng và thử nghiệm có kết quả. Hầu hết các loại môi trƣờng đều bào gồm
những nhóm chất chính sau đây:
1. Các loại muối khoáng
2. Nguồn carbon
3. Vitamin
4. Các chất điều khiển sinh trƣởng
5. Các nhóm chất bổ sung
6. Chất độn [1].
Thành phần của môi trƣờng nuôi cấy mô tế bào thay đổi tùy theo loài
thực vật, loại tế bào, mô và cơ quan đƣợc nuôi cấy. Đối với cùng một loại
mô, cơ quan nhƣng mục đích nuôi cấy không giống nhau, môi trƣờng sử

9


dụng cũng khác nhau khá cơ bản. Môi trƣờng nuôi cấy còn thay đổi theo
giai đoạn sinh trƣởng và phát triển của mẫu cấy [3].
1.2.3.1. Các loại muối khoáng
Các nguyên tố khoáng dung trong môi trƣờng dinh dƣỡng nuôi cấy mô
và tế bào thực vật đƣợc phân chia thành 2 nhóm theo hàm lƣợng sử dụng:
nhóm đa lƣợng và nhóm vi lƣợng.


Các nguyên tố khoáng đa lƣợng.

Bao gồm các nguyên tố khoáng đƣợc sử dụng ở nồng độ trên 30 ppm, tức là
trên 30mg/l. Những nguyên tố đó là: N, S, P, K, Mg, Ca.
- Nito N): Đƣợc sử dụng ở hai dạng NO3 và NH4 riêng rẽ hoặc phối hợp
với nhau.
- Lƣu huỳnh (S): Chủ yếu và tốt nhất là muối SO4. Các dạng ion khác
nhƣ SO3 hoặc SO2 thƣờng kém tác dụng, thậm chí còn độc.
- Phospho (P): Mô và tế bào thực vật nuôi cấy cso nhu cầu về phospho
rất cao. Phospho là một trong thành phần cấu trúc phân tử acid nucleic.
Ngoài ra khi phosphor ở dạng H2PO4- và HPO42- còn tác dụng nhƣ một hệ
thống đệm (buffer) làm ổn định pH của môi trƣờng trong quá trình nuôi cấy.


Các nguyên tố khoáng vi lƣợng.
Là những nguyên tố đƣợc sử dụng ở nồng độ thấp hơn 30ppm. Đó là

Fe, B, Mn, I, Mo, Cu, Zn, Ni, Co
- Sắt (Fe): Thiếu sắt, tế bào mất khả năng phân chia. Fe thƣờng tạo phức
hợp với các thành phần khác và khi pH môi trƣờng thay đổi phức hợp này
thƣờng mất khả năng giải phóng Fe cho các nhu cầu trao đổi chất trong tế
bào. Tốt nhất là nên sử dụng Fe ở dạng phức chelat với citrate hoặc với
EDTA (Ethylen Diamin Tetraacetic Acid). T các phức chất này, Fe đƣợc
giải phóng ra trong một phạm vi pH khá rộng.
- Mangan (Mn): Thiếu Mn cũng làm cho hàm lƣợng các amino acid tự
do và

N

tăng lên, nhƣng lƣợng RNA và sinh tổng hợp protein giảm dẫn

đến kém phân bào.

10


- Bo (B): Thiếu

trong môi trƣờng gây nên biểu hiện nhƣ th a auxin vì

thực tế B làm cho các chất ức chế auxin oxydase trong tế bào giảm. Mô nuôi
cấy có biểu hiện hóa mô sẹo mạnh, nhƣng thƣờng là loại mô sẹo xốp, mọng
nƣớc, kém tái sinh.
- Molypden Mo): là ion đóng vai trò co-factor trong hệ thống nitrat
reductase, nhƣ vậy Mo tác động trực tiếp lên quá trình trao đổi đạm trong tế
bào thực vật [1].
1.2.3.2. Nguồn cacbon
Mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phƣơng thức dị
dƣỡng, mặc dù ở nhiều trƣờng hợp chúng có thể sống bán dị dƣỡng nhờ điều
kiện ánh sang nhân tạo và lục lạp có khả năng quang hợp. Vì vậy việc đƣa
vào môi trƣờng nuôi cấy nguồn cacbon hữu cơ là điều bắt buộc. Nguồn
cacbon thông dụng nhất đã đƣợc kiểm chứng là saccharose. Nồng độ thích
hợp phổ biến là 2-3%.
Tiếp đến là glucose và maltose cũng hay đƣợc đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy.
Các loại đƣờng khác nhƣ fructose, raffinose, lactose, galactose…cũng đã
đƣợc thử nghiệm, nhƣng tỏ ra kém hiệu quả và chỉ đƣợc dùng trong những
trƣờng hợp đặc biệt [1].
1.2.3.3. Vitamin
Mặc dù tất cả các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro có khả năng
tự tổng hợp đƣợc hầu hết các loại vitamin, nhƣng thƣờng không đủ về lƣợng,
do đó phải bổ sung thêm t bên ngoài vào, đặc biệt là các vitamin thuộc
nhóm B [1].

Vitamin thƣờng đƣợc sử dụng nhất là Nicotinic acid, Pyridoxin (B6),
Thiamin (B1), Myo- inositol [7].

11


1.2.3.4. Các hỗn hợp ch t t nhiên


Nƣớc d a: kết quả phân tích thành phần của nƣớc d a t non đến già

của tulecke và ctv (1961) cho thấy, trong nƣớc d a có: amino acid tự do,
amino acid dạng liên kết, axit hữu cơ, đƣờng, RNA và DNA


Dịch chiết mầm lúa mỳ (mạch nha): thành phần hóa học chƣa đƣợc

phân tích k , chủ yếu chứa một số đƣờng, vitamin và một số chất có hoạt
tính điều khiển sinh trƣởng [1].
1.2.3.5. Các ch t điều khiển sinh trưởng


Auxin : Đƣợc gọi là hooc môn sinh trƣởng do Went và Thimann (1937)

phát hiện, chủ yếu kích thích sinh trƣởng của tế bào, nhƣng cũng làm tăng
phân bào. Có 4 loại auxin thƣờng đƣợc sử dụng trong nuôi cấy mô là:
-

Indolylacetic acid (IAA) tồn tại tự nhiên

-

Naphthylacetic acid (NAA)

-

2,4-Dichlorphenoxyacetic acid (2,4-D)

-

Indolylbutyric acid (IBA)

Riêng IAA là auxin tự nhiên, còn lại NAA, IBA và 2,4-D là các auxin nhân
tạo. Thƣờng thì các enzyme nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn do đặc điểm
phân tử của chúng nên các enzyme oxy hóa auxin (auxinoxidase) không có
tác dụng.


Cytokinin: lần đầu tiên đƣợc Skoog (khoảng 1950) phát hiện trong một

thí nghiệm chiết xuất acid nucleic bị sơ suất. 3 loại cytokynin chính thƣờng
đƣợc dùng trong nuôi cấy mô là: kinetin, zeatin, BAP
Trong thực tiễn nuôi cấy mô, ngƣời ta chỉ dùng zeatin trong những trƣờng
hợp đặc biệt vì quá đắt, mà thƣờng sử dụng kinetin hoặc một sản phẩm tổng
hợp nhân tạo là BAP. Hoạt lực của

P cao hơn nhiều so với kinetin và bản

thân BAP bền vững hơn zeatin dƣới tác động của nhiệt độ cao [1].

12


1.2.3.6. Chất độn – th ch (Agar)
Là một loại polysaccharide thu đƣợc t một số loại tảo (chủ yếu là tảo
hồng Rhodophyta), trong đó có rau câu mọc ở vùng đầm phá Việt Nam
(Glacia spp.)
Đƣợc sử dụng làm chất đệm cho môi trƣờng dinh dƣỡng rắn lại. ở 80C
thạch ngậm nƣớc chuyển sang trạng thái sol và ở 40C trở về trạng thái gel.
Khả năng ngậm nƣớc của thạch là 6-12 thạch/1 lít nƣớc [1].
1.2.3.7. Nước
Nƣớc pha môi trƣờng cấy phải là loại nƣớc hoàn toàn sạch ion. Thông
thƣờng ngƣời ta sử dụng nƣớc cất 2 lần và tốt nhất là sử dụng hệ thống cất
nƣớc thủy tinh [1].
1.2.3.8. Độ pH của m i trường
Độ pH của môi trƣờng dinh dƣỡng ảnh hƣởng trực tiếp tới quá trình thu
nhận các chất dinh dƣỡng t môi trƣờng vào tế bào. Vì vậy đối với mỗi loại
môi trƣờng nhất định và đối với t ng trƣờng hợp cụ thể của loài cây phải
chỉnh độ pH của môi trƣờng về mức ổn định ban đầu.
Đối với mô sẹo của nhiều loài cây, pH ban đầu thƣờng là 5,5-6,0. Sau 4
tuần nuôi cấy đạt đƣợc 6,0-6,5.
Những thí nghiệm nuối cấy tế bào đơn hay tế bào trần trọng lƣợng môi
trƣờng nhỏ thì việc chỉnh độ ph bắt buộc [1].
1.3. C c nghiên cứu về nhân giống in vitro cây D yên thảo.
- Kết quả nghiên cứu của Trần Nguyên Vũ và ctv. 1999) cho thấy các
đoạn thân và lá của chồi non đang tăng trƣởng trong điều kiện in vitro đƣợc
nuôi cấy trên môi trƣờng MS có BA hoặc BA và NAA. Kết quả đƣợc ghi
nhận trên giống hoa kép và hoa đơn sau 10 ngày nuôi cấy. T lệ (%) thành
lập chồi cao nhất t mẫu cấy lá đƣợc ghi nhận trên môi trƣờng MS có 0,5
µM

đối với giống hoa kép và 2 µM

13

đối với hoa đơn. hồi đƣợc tái


tạo t lóng thân của cả hai giống trên môi trƣờng MS bổ sung 0,5 µM BA và
0,05 µM NAA. Việc bổ sung nƣớc d a 5% kích thích cho sự kéo dài chồi
non. Cây con có bộ rễ khỏe mạnh đƣợc trồng thủy canh trong ½ MS trong 710 ngày trƣớc khi ra vƣờn ƣơm.
- Theo Kedong 2001) môi trƣờng MS có bổ sung

1 mg/l cũng rất

thích hợp cho sự tái sinh chồi t lá của cây hoa dã yên thảo.
- Kết quả nghiên cứu của Huỳnh Ngọc Minh Tâm 2005) đã cho thấy
môi trƣờng tốt nhất để nhân giống dã yên thảo gồm có: nƣớc cá, nồng độ
đƣờng 50 g/l và auxin đƣợc chọn là N

. Điều kiện thuần dƣỡng có tỉ lệ

sống cao nhất là trùm bọc nilon kín trong vòng 1 tuần.
- Theo kết quả nghiên cứu của Hassan và ctv.(2010) trong thí nghiệm
nhân chồi thì số chồi dã yên thảo trung bình cao nhất với môi trƣờng bổ sung
0,8mg/l và N

0,1 mg/l. Đối với thí nghiệm tái sinh chồi t mẫu cấy lá

của hoa dã yến thảo thì t lệ chồi đƣợc tái sinh là 45% đã đƣợc quan sát

trong môi trƣờng MS có bổ sung BA 2 mg/l.
- Theo Trần Quốc

ƣờng (2011), môi trƣờng MS có bổ sung BA 2,0

mg/l NAA 0,5 mg/l cho t lệ chồi tái sinh t lá tốt là 88,9% và cho số chồi
cao (4 chồi). Môi trƣờng MS có bổ sung TDZ 0,2 mg/l cho t lệ chồi tái sinh
t lá đạt 100%, số chồi tái sinh cao nhất với 9,9 chồi, chiều cao chồi cao nhất
là 2,3 cm.

14


CHƢƠNG 2: V T LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thí nghiệm đƣợc tiến hành t tháng 7/2014 đến tháng 4/2015 tại Phòng
thí nghiệm Sinh lí thực vật, Phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật - Trung tâm
Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học và Chuyển giao Công nghệ và Phòng thực vật
học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2.
2.2. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu
Mẫu cây Dã yên thảo (petunia hybrida) thu ngoài tự nhiên, khi đỉnh sinh
trƣởng cao khoảng 6-8cm tiến hành thu mẫu cho nghiên cứu nuôi cấy mô tại
phòng Sinh lí thực vật - Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2.
2.2.2. Thiết b và dụng cụ
Các thiết bị:
Tên thiết bị
ân kĩ thuật

Model & h ng sản xuất

GM612, Đức

Máy đo pH

HM30G/TO , Đức

Nồi hấp khử trùng

HV – 110/HIR Y M , Nhật

Tủ lạnh Hitachi

31AG5D, Thái lan

Máy cất nƣớc hai lần

Trung Quốc

uồng cấy vô trùng

AV – 110/TELSTAR

Cân phân tích

P224S, Đức

Micropipet Jinson

Pháp

ác loại 200 - 1000µl)
Tủ ấm
Máy khuấy t gia nhiệt

UNIVERS L 320R/ HETTI H, Đức
ARE/VELP, Italia

15


Dụng cụ: Các loại bình tam giác, cốc thủy tinh, ống falcon (loại 50 ml,
15 ml,...), nút bông, giấy báo, giấy thấm, giấy bạc, túi nilon, dao, khay cấy,
panh, kéo,...
2.2.3. Môi trƣờng nuôi cấy.
Môi trƣờng sử dụng nuôi cấy là MS cải tiến (Murashige và Skoog,
1962):
Khoáng đa lƣợng

Khoáng vi lƣợng

Sắt EDTA

Vitamin

Thành phần

Nồng độ (mg/l)

NH4NO3

1650

KNO3

1900

CaCl2.2H2O

440

MgSO4.7H2O

370

KH2PO4

170

MnSO4.4H2O

23,3

ZnSO4.7H2O

8,6

H3PO3

6,2

KI

0,83

Na2MoO4.2H2O

0,25

CuSO4.5H2O

0,025

CoCl2.6H2O

0,025

Na2.EDTA

37,3

FeSO4.7H2O

27,8

Myo-Inositol

100

Thiamin (B1)

0,5

Nicotinic acid

0,5

Pyridoxine (B6)

0,5

Glycine

2

16


Các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật đƣợc sử dụng: BAP, NAA
(mg/l).
Các thành phần khác:
Đƣờng saccarose: 30 g/l
Agar: 8 g/l
Môi trƣờng đƣợc điều chỉnh về pH=5,8 ± 0,05 (bằng NaOH 1N và HCl
1N) trƣớc khi hấp khử trùng bằng nồi hấp khử trùng ở 117oC, 1atm trong 15
phút đối với các dụng cụ thí nghiệm, dụng cụ thủy tinh không chứa môi
trƣờng thì khử trùng ở 121oC, 1atm trong 15 phút).
2.2.4. Điều kiện nuôi cấy in vitro
Thời gian chiếu sáng: 16 giờ sáng/ 8 giờ tối
Nhiệt độ: 25 ± 2o C
Độ ẩm: 50 – 60 %

ƣờng độ ánh sáng: 2000 lux.
2.3. Phƣơng ph p nghiên cứu
2.3.1. Bố tr th nghiệm
Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi công thức đƣợc nhắc
lại 3 lần, 50 mẫu/công thức.
2.3.2. Nội dung nghiên cứu
2.3.2.1. Thí nghiệm 1: T o vật liệu in vitro t chồi cây hoa D yên thảo.
Chồi cây hoa Dã yên thảo đƣợc cắt dài khoảng 3 - 4 cm, cắt bỏ lá non,
xử lý sơ bộ bằng cách: Rửa sạch nhiều lần dƣới vòi nƣớc máy, sau đó rửa
trong dung dịch nƣớc xà phòng và đƣợc rửa lại bằng nƣớc cất 2-3 lần, đƣa
mẫu vào trong tủ cấy vô trùng.
Trong tủ cấy vô trùng:
- Rửa chồi bằng nƣớc cất vô trùng.
- Lắc etanol 70% (v/v) trong 2 phút.
- Rửa lại 3 lần bằng nƣớc cất vô trùng.

17