phân lập vi khuẩn nội sinh thân cây bắp trồng trên đất xám ở tỉnh tây ninh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH THÂN CÂY BẮP
TRỒNG TRÊN ĐẤT XÁM Ở TỈNH TÂY NINH

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
Gs. Ts CAO NGỌC ĐIỆP

SINH VIÊN THỰC HIỆN
NGUYỄN MINH THƯ
MSSV: 3103992
LỚP:VI SINH VẬT HỌC K36

Cần Thơ, Tháng 11/2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH THÂN CÂY BẮP
TRỒNG TRÊN ĐẤT XÁM Ở TỈNH TÂY NINH

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
Gs. Ts CAO NGỌC ĐIỆP

SINH VIÊN THỰC HIỆN
NGUYỄN MINH THƯ
MSSV: 3103992
LỚP:VI SINH VẬT HỌC K36

Cần Thơ, Tháng 11/2013


PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

SINH VIÊN THỰC HIỆN

(ký tên)

(ký tên)

GS. Ts Cao Ngọc Điệp

Nguyễn Minh Thư

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………
Cần Thơ, ngày

tháng

năm 2013

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(ký tên)


LỜI CẢM TẠ
Đầu tiên, tôi xin chân thành cảm ơn Gs.Ts Cao Ngọc Điệp và cố vấn học tập –cô
Nguyễn Thị Pha đã tận tình hướng dẫn, góp ý và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực
hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn đến!
- Ban lãnh đạo Viện nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học cùng quý thầy
cô đã hướng dẫn và chỉ dạy tôi trong suốt quá trình học tập.
- Chị Nguyễn Thị Xuân Mỵ, Chị Trần Thị Giang cán bộ phòng thí nghiệm Vi
sinh vật đất, Vi sinh vật môi trường đã nhiệt tình giúp đỡ và hỗ trợ cho tôi thực hiện
tốt đề tài.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc đến Cha, Mẹ và những người thân
luôn luôn ủng hộ và động viên tôi, tạo điều kiện tốt để tôi học tập và là nguồn động lực
lớn lao giúp tôi vượt qua mọi khó khăn trong cuộc sống.

Tôi xin chân thành cảm ơn!


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

TÓM LƯỢC
Năm mươi mốt dòng vi khuẩn đã được phân lập trên môi trường NFb và môi
trường LGI từ thân cây bắp trồng trên đất xám ở tỉnh Tây Ninh đều có khả năng tổng
hợp đạm, hòa tan lân khó tan và tổng hợp IAA chiếm tỉ lệ 100%. Trong 51 dòng vi
khuẩn phân lập được khảo sát thì dòng TTN9 là dòng vi khuẩn vừa có khả năng cố
định đạm và hòa tan lân, vừa có khả năng tổng hợp IAA đạt hàm lượng cao. Lượng
NH4+ đạt (4,59 mg/l), P2O5 đạt (117,64 mg/l) và lượng IAA đạt (12,71 mg/l).
Từ khóa: Cây bắp, cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp IAA, vi khuẩn nội sinh.

Chuyên nghành Vi Sinh Vật học

i

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

MỤC LỤC
Trang

PHẦN KÝ DUYỆT ..........................................................................................................

LỜI CẢM TẠ ...................................................................................................................
TÓM LƯỢC ....................................................................................................................i

MỤC LỤC ..................................................................................................................... ii
DANH SÁCH BẢNG ....................................................................................................iv
DANH SÁCH HÌNH ...................................................................................................... v
CÁC TỪ VIẾT TẮT .....................................................................................................vi
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU ............................................................................................ 1
CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ........................................................................ 3
2.1 Sơ lược về cây bắp .................................................................................................3
2.2 Vi khuẩn nội sinh ...................................................................................................4
2.2.1 Vùng rễ và vi khuẩn vùng rễ ...........................................................................6
2.2.2 Vi khuẩn Azospirillum ....................................................................................6
2.2.3 Vi khuẩn Azotobacter......................................................................................7
2.2.4 Vi khuẩn Burkholderia....................................................................................7
2.2.5 Vi khuẩn Enterobacter ....................................................................................8
2.2.6 Vi khuẩn Gluconacetobacter .........................................................................8
2.2.7 Vi khuẩn Herbaspirillum ................................................................................9
2.2.8 Vi khuẩn Klebsiella ........................................................................................9
2.3 Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh .................................................................10
2.3.1 Khả năng cố định đạm ..................................................................................10
2.3.2 Khả năng hòa tan lân khó tan ........................................................................11
2.4 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn nội sinh trên thế giới và ở Việt Nam .................12
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 14
3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện ...........................................................................14
3.1.1 Địa điểm tiến hành thí nghiệm ......................................................................14
3.1.2.Thời gian thực hiện .......................................................................................14
3.2 Phương tiện nghiên cứu .......................................................................................14
3.2.1 Dụng cụ, thiết bị ............................................................................................ 14
Chuyên nghành Vi Sinh Vật học

ii

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

3.2.2 Vật liệu thí nghiệm ........................................................................................15
3.2.3 Hóa chất và môi trường .................................................................................15
3.3 Phương pháp nghiên cứu .....................................................................................19
3.3.1 Phương pháp thu thập, xử lý mẫu và phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh..19
3.3.2 Quan sát hình thái và đo kích thước khuẩn lạc .............................................20
3.3.3 Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn ........................20
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ THẢO LUẬN ...................................................................... 24
4.1 Phân lập và đặc điểm của các dòng vi khuẩn nội sinh đã phân lập .....................24
4.1.1 Phân lập vi khuẩn .......................................................................................... 24
4.1.2 Đặc điểm của các dòng vi khuẩn đã phân lập ...............................................27
4.2 Khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn đã phân lập................................ 31
4.3 Khả năng hòa tan lân của các dòng vi khuẩn phân lập ........................................35
4.4 Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn đã phân lập .............................. 38
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................... 40
5.1 Kết luận ................................................................................................................40
5.2 Đề nghị .................................................................................................................40
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 41
PHỤ LỤC ........................................................................................................................
Phụ lục. Kết quả
1. Bảng 1. Kết quả đo đạm (mg/l)

2. Bảng 2. Kết quả đo lân (mg/l)
3. Bảng 3. Kết quả đo IAA (mg/l)

Chuyên nghành Vi Sinh Vật học

iii

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 1. Hàm lượng dinh dưỡng trong các loại hạt ........................................................ 4
Bảng 2. Công thức môi trường LGI (Cavalcante và Döbereiner, 1988) ...................... 16
Bảng 3. Công thức môi trường NFb (Krieg và Döbereiner, 1984) .............................. 17
Bảng 4. Công thức môi trường Burk’s không đạm (Park et al., 2005) ........................ 18
Bảng 5. Công thức môi trường NBRIP (Nautiyal., 1999) ............................................ 18
Bảng 6. Nguồn gốc của các dòng vi khuẩn đã phân lập ............................................... 24
Bảng 7. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập ................. 27
Bảng 8. Tỷ lệ (%) về các đặc điểm khuẩn lạc của dòng vi khuẩn đã phân lập ............ 29
Bảng 9. Khả năng tổng hợp NH4+ (mg/l) của các dòng vi khuẩn sau 2 ngày,
4 ngày, 6 ngày và 8 ngày nuôi trong môi trường Burk’s không đạm ............. 31
Bảng 10. Khả năng hòa tan P2O5 (mg/l) của các dòng vi khuẩn sau 5 ngày,
10 ngày, 15 ngày và 20 ngày nuôi trong môi trường NBRIP lỏng ................. 35
Bảng 11. Khả năng tổng hợp IAA (mg/l) của các dòng vi khuẩn sau 2 ngày,
4ngày, 6 ngày và 8 ngày nuôi trong môi trường LGI và NFb lỏng
(không tryptophan) ......................................................................................... 38

Chuyên nghành Vi Sinh Vật học

iv

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 1. Vi khuẩn sau 24 giờ nuôi trên môi trường bán đặc……………………... ...... 26
Hình 2. Đặc điểm một số dạng khuẩn lạc ………………..………………………... .. 30
Hình 3 . Đường chuẩn đo đạm.……………………………………………..……... .. 32

Chuyên nghành Vi Sinh Vật học

v

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

CÁC TỪ VIẾT TẮT
IAA

nif
CV
Df
LSD
MS
SS
VK
DC

:
:
:
:
:
:
:
:
:

indole – 3 – acetic acid
nitrogen fixation
Coefficient of variation
degree of freedom
Least Significant Difference
Mean Square
Sum of Square
Vi khuẩn
Đối chứng

Chuyên nghành Vi Sinh Vật học

vi

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU
Nước ta là nước nông nghiệp với khoảng 2/3 dân số sống ở nông thôn vì vậy mà
sản xuất lương thực được Đảng và nhà nước ta ưu tiên hàng đầu, là nhiệm vụ quan
trọng trước mắt cũng như lâu dài trong chiến lược phát triển kinh tế-xã hội. Trong
những năm gần đây sản xuất lương thực đã có những bước phát triển đáng kể trong đó
bắp là cây màu lương thực đóng vai trò quan trọng trong nền kinh tế.

Ngày nay cây bắp (hay còn gọi là cây ngô) đứng hàng thứ ba sau lúa nước và lúa
mì, hàng năm có khỏng 139-141 triệu ha bắp được trồng trên toàn thế giới với nâng
suất bình quân khoảng 3,8-4,5 tấn/ha. Bắp rất giàu dinh dưỡng như: lipid, protein,
vitamin vì thế cây bắp được coi là nguồn năng lượng tốt. Bắp chính là cây lương thực
có năng suất cao lại chứa hàm lượng dinh dưỡng quan trọng nên cây bắp mang nhiều
giá trị sử dụng và giá trị kinh tế, có thể sử dụng bắp làm lương thực, làm nguyên liệu
cho ngành công nghiệp chế biến, hoặc làm thức ăn cho gia súc, gia cầm. Ở Việt Nam
cây bắp được trồng cách đây khoảng 300 năm, đến nay cây bắp được trồng trong tất cả
các vùng miền trong cả nước, bắp là cây lương thực đứng hàng thứ hai sau lúa nước,
giữ một vai trò quan trọng trong nền kinh tế quốc dân nói chung và nền sản xuất nông
nghiệp nói riêng.
Từ năm 1990 trở lại đây diện tích và năng suất bắp được tăng lên đáng kể do việc
đưa các giống bắp lai vào sản xuất. Năm 1990 diện tích trồng bắp lai ở nước ta là 0%,

năm 2000 diện tích trồng bắp lai là 60% sản lượng tăng từ 0,65 triệu tấn lên hơn 2
triệu tấn, nhưng với số lượng lương thực như vậy không đáp ứng nổi nhu cầu lương
thực nước ta hiện nay, năm 2001 nước ta nhập khẩu hơn 1 triệu tấn bắp, năm 2005 nhu
cầu sử dụng bắp của nước ta là 4-5 triệu tấn, dự tính đến năm 2010 là 6-8 triệu tấn
(Trần Hồng Uy, 1997).
Nhờ thành tựu của việc lai tạo giống mới đã đưa ra nhiều loại giống mới có khả
năng thích ứng rộng trên nhiều vùng sinh thái khác nhau, cho năng suất cao và có thời
gian sinh trưởng phù hợp với mọi thời vụ và địa hình. Trong đó bắp lai đã đóng góp
phần tích cực vào sự phát triển của cây bắp ở Việt Nam nói chung và tỉnh Tây Ninh
nói riêng. Đất trồng bắp ở vùng này chủ yếu là đất xám. Đất xám có nguồn gốc từ đất
phù sa cổ thành phần cơ giới nhẹ, thoát nước tốt, tuy hàm lượng mùn và dinh dưỡng

Chuyên nghành Vi Sinh Vật học

1

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

không cao nhưng độ ẩm cây héo thấp, đây cũng là loại đất thích hợp để trồng bắp
nhưng cần bón nhiều phân NPK hơn đối với đất bazan.
Vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn sống trong mô thực vật được tìm thấy ở vùng rễ,
thân, lá, quả của thực vật. Vùng rễ là nơi xuất phát nhiều vi khuẩn nội sinh chui vào rễ,
thân, lá để sống nội sinh; sau khi xâm nhập vào cây chủ có thể tập trung tại vị trí xâm
nhập hoặc di chuyển đi khắp nơi trong cây đến các hệ mạch của rễ, thân, lá, hoa
(Zinniel et al., 2002), thúc đẩy các quá trình chuyển hóa trong cây, sự phát triển lông

rễ một cách mạnh mẽ và giảm sự kéo dài rễ (Harari et al ., 1988). Hiện nay các nhà
nghiên cứu quan tâm nhiều đến những loài vi khuẩn nội sinh có đặc tính tốt như vi
khuẩn có khả năng cố định nitơ trong không khí (Xu et al ., 1998), tổng hợp kích thích
tố auxin (Barbieri et al., 1986), giúp loại bỏ các chất gây ô nhiễm môi trường
(Rosenblueth và Martinez, 2006), tăng hàm lượng các chất khoáng, tăng khả năng
kháng bệnh (Fahey et al ., 1991), hòa tan lân khó tan cho cây trồng hấp thụ tốt chất
dinh dưỡng (Lăng Ngọc Dậu et al ., 2007). Đã có nhiều nghiên cứu về vi khuẩn nội
sinh trong các loài cây ở Việt Nam như Nguyễn Thị Thu Hà et al. (2008) đã phân lập
được vi khuẩn nội sinh trong một số loại cỏ chăn nuôi, Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Ái
Chi (2009), Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Thành Dũng (2010) phân lập vi khuẩn nội sinh
trong cây khóm trồng trên đất phèn huyện Bến Lức, tỉnh Long An và huyện Vĩnh
Thuận, tỉnh Kiên Giang.
Xu hướng mới trong sản xuất hiện nay là giảm lượng phân bón vô cơ, tăng cường
phân sinh học góp phần giảm giá thành sản xuất, giảm sự phụ thuộc vào nguồn vật liệu
hóa thạch, giảm ô nhiễm môi trường, giảm hàm lượng nitrate trong nông sản. Vì vậy
việc nghiên cứu về “Phân lập vi khuẩn nội sinh thân cây bắp trồng trên đất xám ở
tỉnh Tây Ninh” là cần thiết.
Mục tiêu nghiên cứu của đề tài :
 Phân lập được những dòng vi khuẩn nội sinh thân cây bắp có khả năng cố định
đạm, hòa tan lân khó tan và tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA) trồng ở các huyện
Tân Biên, Châu Thành, Gò Dầu, Trảng Bàng tỉnh Tây Ninh.

Chuyên nghành Vi Sinh Vật học

2

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Sơ lược về cây bắp
Bắp hay còn gọi là Ngô (danh pháp khoa học: Zea mays L.), thuộc họ hoà
thảo Poacea và tộc Tripsaceae, không giống những hoa hoàn chỉnh của hầu hết những
loài hoà thảo, ngô có hoa đực và hoa cái tách biệt trên cùng một cây. Hoa đực ở đỉnh
ngọn thường gọi là cờ ngô và hoa cái sinh ra ở bên trong những mầm phụ được gọi là
bắp. Cấu tạo đó được coi là hoa đơn tính cùng gốc (hay đơn tính đồng chu). Bắp là
một loại cây lương thực được thuần canh tại khu vực Trung Mỹ và sau đó lan tỏa ra
khắp châu Mỹ. Bắp được gieo trồng ở phần còn lại của thế giới sau khi có tiếp xúc của
người châu Âu với châu Mỹ vào cuối thế kỷ 15, đầu thế kỷ 16. Ở Việt Nam cây bắp
vào nước ta theo hai hướng là Trung Quốc xuống và từ Inđônêxia và Miến Điện qua.
Theo Lê Quý Đôn trong “Vân Đài loại ngữ “ hồi đầu đời Khang Hi (1662-1762), Trần
Thế Vinh, người huyện Tiên Phong (Sơn Tây, phủ Quảng Oai) đi sứ sang Trung Quốc
thấy loại cây mới này đã mang về trồng và gọi là “Bắp-ngọc mễ”. Khắp cả Sơn Tây
đã dùng bắp thay cho lúa gạo. Từ đó bắp được phổ biến và phát triển ra khắp đất nước.
Có nhiều loại bắp, thường được xếp vào các loại khác nhau về cả tính chất và
công dụng như bắp nếp (hạt màu trắng, dẻo hạt), chủ yếu để ăn, bắp tẻ (hạt màu trắng
hoặc vàng), cứng nhưng sản lượng cao nên dùng làm thức ăn cho gia súc. Hai loại là
bắp đường (hạt màu vàng không đều), vị ngọt và bắp rau (bắp nhỏ, ít tinh bột) dùng để
ăn. Bắp là cây lương thực được gieo trồng nhiều nhất tại châu Mỹ (chỉ riêng tại Hoa
Kỳ thì sản lượng đã là khoảng 270 triệu tấn mỗi năm). Các giống bắp lai ghép được
các nông dân ưa chuộng hơn so với các giống bắp thông thường do có năng suất cao vì
có ưu thế giống lai. Trong khi một vài giống bắp có thể cao tới 7m tại một số nơi, thì
các giống bắp thương phẩm đã được tạo ra với chiều cao chỉ khoảng 2,5m. Bắp ngọt
(Zea mays var. rugosa hay Zea mays var. saccharata) thông thường thấp hơn so với
các giống bắp khác. Các giống bắp nếp, bắp răng ngựa ở nước ta thì có hàm lượng tinh
bột cao, lượng đường ít. Trong khi các giống bắp ở Mỹ và châu Âu thường được lai

tạo để có lượng tinh bột rất ít, độ ngọt cao (họ vẫn gọi là sweetcorn).

Chuyên nghành Vi Sinh Vật học

3

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

Bảng 1: Hàm lượng dinh dưỡng trong các loại hạt
Đơn vị tính: Phần trăm (%)
Hàmlượng
Loại hạt
Bắp

Tinh bột

Protein

Lipit

Xenluloza

Tro

Nước

69,2

10,6

4,3

2,0

1,4

12,5

Lúa

62,4

7,9

2,2

9,9

5,7

11,9

Lúa mì

63,8

16,8

2,0

2,0

1,8

13,6

Cao lương

71,7

12,7

3,2

1,5

1,6

9,9

Kê

59,0

11,3

3,8

8,9

3,6

13,0

(Nguồn: ngày 12/06/2013)

Trong hạt bắp chứa khá đầy đủ các chất dinh dưỡng cho người và gia súc. Bột
bắp chiếm 65-83% khối lượng hạt là nguyên liệu quan trọng trong công nghệ gia công
bột. Cứ 100 kg ngô hạt cho khoảng 20-21 kg gluten, 73-75 kg bột, tách mầm và ép
được 1,8-2,7 kg dầu ăn và gần 4 kg khô dầu. Phôi bắp chiếm khoảng 10% khối lượng
hạt, trong phôi có các loại khoáng, vitamin và khoảng 30-45% dầu.
2.2 Vi khuẩn nội sinh
Vi khuẩn nội sinh thực vật (Endophytic bacteria) được tìm thấy trong hầu hết ở
các loài thực vật, chúng cư trú ở trong nội mô của thực vật ký chủ và giữa chúng hình
thành một loạt các mối quan hệ khác nhau như cộng sinh tương hỗ, công sinh dinh
dưỡng, hội sinh …Hầu hết các dạng nội ký sinh này bắt đầu xuất hiện từ vùng rễ hay
bề mặt lá, tuy nhiên, một số loại có thể ký sinh trên hạt.Vi khuẩn nội sinh thúc đẩy
thực vật tăng trưởng, tăng năng suất và đóng vai trò là một tác nhân điều hòa sinh học.
Vi khuẩn nội sinh sản xuất hàng loạt các sản phẩm tự nhiên có lợi cho thực vật ký chủ
mà ta có thể khai thác những tác nhân đó để ứng dụng trong y học, nông nghiệp hay
công nghiệp. Ngoài ra nó còn có tiềm năng loại bỏ các chất gây ô nhiễm trong đất
bằng cách tăng cường khả năng khử độc trên thực vật và làm cho đất trở nên màu mỡ
thông qua chu trình photphat và cố định đạm. Ngày càng có nhiều quan tâm trong việc
phát triển các ứng dụng tiềm năng công nghệ sinh học của vi khuẩn nội sinh để phát
triển các giống cây trồng có khả năng khử độc đồng thời có khả năng sản xuất sinh

khối và nhiên liệu sinh học.
Vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn mà vòng đời của nó chiếm phần lớn trong cây trồng
(Quispel, 1992). Từ vùng rễ, chúng xâm nhập vào mô thực vật xuyên qua vùng rễ các
Chuyên nghành Vi Sinh Vật học

4

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

cách sau: bám ở bề mặt rễ và tìm cách chui vào rễ chính hay rễ bên (lateral roots),
thông qua lông hút, giữa các tế bào nhu mô rễ hay biểu bì rễ để sống nội sinh như
Azotobacter,

Bacillus,

Beijerinckia,

Derxia,

Enterobacteriaeae

(Klebsiella,

Enterobacter, Pantonae), Pseudomonas, Alcaligenes, Azoarcus, Burkholderia,
Campylobacter, Herbaspirillum Gluconacetobacter, và Paenibacillus (Elmerich,

2007).Tuy nhiên vi khuẩn nội sinh này cũng có khả năng xâm nhập qua các vị trí bị
tổn thương của lá hay các mô thông qua khí khẩu (Roos và Hattingh, 1983). Bằng
những con đường đó vi khuẩn có thể tiến vào lục lạp của rễ.
Sau khi xâm nhập vào cây chủ, các vi khuẩn nội sinh có thể thể tập trung tại vị ví
xâm nhập hay phân tán khắp nơi trong cây đến các tế bào bên trong, đi vào các khoảng
gian bào hay hệ mạch (Zinniel et al., 2002) và thúc đẩy quá trình sinh hóa trong cây.
Mật số của quần thể vi khuẩn nội sinh rất biến thiên, phụ thuộc vào chủ yếu ở loài vi
khuẩn và kiểu di truyền của cây chủ, mặc khác chúng phụ thuộc vào điều kiện môi
trường và giai đoạn phát triển của cây (Pillay và Nowak, 1997). Một số nhóm vi khuẩn
nội sinh không gây hại hay gây bệnh cho cây chủ mà chúng còn có thể thúc đẩy sự
sinh trưởng cho cây trồng bằng cách sản xuất ra chất kích thích sự sinh trưởng (auxin,
gibberellin) của thực vật và sự cố định đạm từ không khí (Sturz et al., 2000).
Vi khuẩn nội sinh cư trú trong hệ sinh thái thích hợp tương tự như các chồi mầm
ở thực vật, điều này làm cho chúng trở thành các tác nhân kiểm soát sinh học (Berg et
al., 2005). Thật vậy, nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng vi khuẩn nội sinh có khả năng kiểm
soát được mầm bệnh trên thực vật (Sturz & Matheson, 1996; Duif et al., 1997;
Krishnamurthy & Gnanamanickam, 1997). Trong một số trường hợp chúng có thể đẩy
mạnh tốc độ nảy mầm của hạt, thúc đẩy sự hình thành cây con trong điều kiện bất lợi
(Chanway,1997) và nâng cao khả năng tăng trưởng của thực vật (Bent & Chanway,
1998). Vi khuẩn nội sinh còn có thể ngăn chặn mầm bệnh phát triển bằng cách tổng
hợp các chất nội sinh trung gian, qua đó để tiếp tục tổng hợp các chất chuyển hóa và
các hợp chất hữu cơ mới. Nghiên cứu cơ chế sản sinh chất chuyển hóa mới trong sự đa
dạng sinh học của vi khuẩn nội sinh có thể phát hiện các loại thuốc mới để điều trị có
hiệu quả các bệnh ở người, thực vật và động vật (Strobel et al., 2004).

Chuyên nghành Vi Sinh Vật học

5

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

2.2.1 Vùng rễ và vi khuẩn vùng rễ
Vùng rễ là nơi tiếp giáp giữa rễ thực và đất, là nơi lắng đọng các chất hữu cơ, và
là nơi xuất phát của các môi trường sống và các nguồn sống khác nhau cho các vi sinh
vật đất. Thực vật có thể thay đổi vùng rễ của chúng nhờ sự hấp thu các chất dinh
dưỡng, độ ẩm và oxy từ vùng rễ và các chất do rễ tiết ra (El-Shatnawi và Makhadmeh,
2001). Đặc tính quan trọng của các dịch rễ là có tỉ lệ C/N cao nên có thể đẩy mạnh sự
phong phú của các vi khuẩn cố định đạm trong vùng rễ (Döbereiner, 1974). Ngược lại,
vi sinh vật vùng rễ có thể ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của cây do sự tác động
của chúng đến giá trị của các chất dinh dưỡng, sự phát triển và hình thái của rễ (Rovira
et al., 1983; Harari et al., 1988).
Vi khuẩn nốt rễ không những nội sinh ở cây họ đậu mà còn xâm nhiễm vào cả
cây bắp và cố định đạm sinh học cho cây bắp sử dụng.
2.2.2 Vi khuẩn Azospirillum
Nhóm vi khuẩn giống như xoắn khuẩn được phân lập bởi Beijerinck vào năm
1923, và được Becking (1963) phát hiện lại. Đến năm 1976, Döbereiner và Day mô tả
về sự liên hợp của những vi khuẩn này với các cây cỏ và nhiều loại ngũ cốc khác nhau.
Sau đó các vi khuẩn này được phân thành giống mới, và được gọi là Azospirillum
(Tarrand et al., 1978).
Azospirillum thuộc nhóm vi khuẩn gram âm, có khả năng chuyển động và có
dạng hình que ngắn; kích thước biến thiên trong khoảng 0,8-1,7µm chiều rộng và 1,43,7µm chiều dài (Nguyễn Hữu Hiệp et al., 2005). Các loài Azospirillum biểu hiện sự
phân bố sinh thái vô cùng rộng lớn và được gắn liền với sự đa dạng to lớn của cây
trồng (Van Berkum và Bohlool, 1980). Trong những năm 1984 – 1985, người ta đã
phát hiện nhiều loài của giống Azospirillum trong vùng rễ của cỏ Kallar (Leptochloa
fusca) (Reinhold et al., 1986), trong đó các vi khuẩn xâm nhập vào bên trong nhu mô

rễ có khả năng cố định đạm, hòa tan lân ở dạng khoáng khó tan và các chất dinh dưỡng
khác (Seshadri et al., 2000; Richardson, 2003), sản xuất kích thích tố thực vật (Vande
Broek et al., 1999), hay kiểm soát các vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng (Rangarajan
et al., 2003).

Chuyên nghành Vi Sinh Vật học

6

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

2.2.3 Vi khuẩn Azotobacter
Năm 1966, loài Azotobacter paspali được Döbereiner phân lập từ các cây cỏ
đang sinh trưởng trước phòng thí nghiệm của bà (Döbereiner, 1974). Sự khám phá ra
vi khuẩn A. paspali là một bước quan trọng trong sự cố định đạm cộng sinh. Đây là
loài đặc hiệu cho Paspalum notatum và khoai lang. Tuy nhiên khi Brown (1976) theo
dõi sự khử acetylene thì nhận thấy không phải lúc nào Paspalum notatum cũng được
cộng sinh với sự có mặt của A. paspali cải thiện sự sinh trưởng của Paspalum notatum
chủ yếu là bằng việc tạo ra các auxin hơn là bằng sự cố định đạm.
2.2.4 Vi khuẩn Burkholderia
Vi khuẩn Burkholderia được Yabuuchi et al. tìm ra vào năm 1992, đến năm
2009, Spilker et al. đã phân loại được hơn 40 loài Burkholderia, chúng có mặt khắp
nơi trong tự nhiên, trong đó có Burkholderia cepacia complex (Bcc), với 17 loài phụ.
Trong số hơn 40 loài Burkholderia, có nhiều loài được xác nhận có khả năng cố định
đạm gồm: Burkholderia vietnamiensis, Burkholderia brasilensis (dòng 130),

Burkholderia

kururiensis,

Burkholderia

tuberum,

Burkholderia

phymatum,

Burkholderia unamae, Burkholderia tropica/tropicalis, Burkholderia xenovorans,
Burkholderia phytofirmans, và Burkholderia terrae (Goris et al, 2004; CaballeroMellado et al., 2004; Reis et al., 2004; Sessitsch et al., 2005). Người ta tìm thấy nhiều
dòng Burkholderia từ nốt sần cây họ đậu, loài Burkholderia tropicalis được tìm thấy
trong cây mía, bắp, khóm (Cruz et al., 2001; Reis, 2004). Ở Việt Nam, Burkholderia
tropica/tropicalis cũng đã được tìm thấy nội sinh trong cây khóm (Cao Ngọc Điệp và
Nguyễn Ái Chi, 2009, Cao Ngọc Điệp et al., 2009). Estrada-De Los Santos et al.
(2002) cho rằng, cố định đạm là đặc tính của giống Burkholderia và những dòng
Burkholderia là những ứng viên đầy hứa hẹn cho ứng dụng trong ngành công nghệ
sinh học (Caballero – Mellado et al., 2007). Một số vi khuẩn nội sinh còn phân giải
lân và các nguyên tố dinh dưỡng khác trong đất (Rodriguez và Fraga, 1999), ngăn
chặn mầm bệnh, tạo kháng sinh, phân hủy sinh học.
Vi khuẩn Burkholderia thuộc nhóm vi khuẩn gram âm có hình dạng xoắn, đường
kính khoảng 1µm, chúng có thể di chuyển nhờ các chiên mao ở đầu, có khả năng cố
định đạm. Chúng sinh trưởng và phát triển trong điều kiện kỵ khí hoặc hiếu khí, nhưng
Chuyên nghành Vi Sinh Vật học

7

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

trong môi trường ít khí oxy thì sẽ phát triển tốt nhất. Đa số các dòng Burkholderia có
khuẩn lạc màu trắng đục, dạng tròn, có độ nổi mô, bìa nguyên, mốt số khuẩn lạc có
màu vàng, bìa răng cưa, kích thước khuẩn lạc từ 0,5-1,5mm (Nguyễn Thị Minh Thư,
2010).
2.2.5 Vi khuẩn Enterobacter
Vi khuẩn Enterobacter cũng thuộc nhóm  – Proteobacteria, hầu hết là vi khuẩn
gram âm có dạng hình que, sống kỵ khí không bắt buộc. Một số loài của vi khuẩn này
sống ở vùng rễ hay nội sinh bên trong các mô thực vật có khả năng cố định đạm, là vi
khuẩn kích thích sự sinh trưởng của thực vật.
Hwangbo et al. (2003) đã phân lập được loài Enterobacter intermedium từ vùng
rễ của một số cây cỏ ở Triều Tiên, chúng có khả năng hòa tan các phosphate khó tan
để cung cấp cho cây theo cơ chế acid hóa bằng cách sản xuất hợp chất 2-ketogluconic
acid.
2.2.6 Vi khuẩn Gluconacetobacter
Từ khi Cavalcante và Dobereiner (1988) phân lập một loài vi khuẩn có khả năng
cố đị nh N mới ở bên trong rễ và trong thân nhiều giống mía đường trồng ở nhiều nơi
khác nhau ở Brasil, đặt tên là Acetobacter diazotrophicus và sau đó đổi tên là
Gluconacetobacter diazotrophicus. Điểm đặc biệt là vi khuẩn này có thể cố định N
trong sự hiện diện của nitrat mà điều này chính là sự giới hạn của vi khuẩn nốt rễ
cộng sinh với cây đậu và nó trở nên quan trọng về kinh tế hơn so với những vi khuẩn
khác sống bên trong (nội sinh) cây mía. Vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus
có sản xuất ra acid hữu cơ như acid oxalic, citric, gluconic… và nhờ đó chúng có thể
hòa tan lân khó tan (Maheskkumar et al ., 1999).

Vi khuẩn Gluconacetobacter thuộc họ Acetobacteraceae. Đây là vi khuẩn gram
âm sinh trưởng tốt nhất ở môi trường hiếu khí, ở nhiệt độ 25 – 300C và pH từ 5,5 – 6,0.
Có nhiều loài khác nhau, bằng cặp mồi AC – DI chuyên biệt, người ta đã phát hiện
loài Gluconacetobacter diazotrophicus hiện diện rất nhiều trong mía và các loài cây
hòa bản khác nhau (Nguồn: Rosenblueth và Matínez – Romero (2006), trang 828) như
bắp, lúa hoang, cỏ voi, cà rốt, khóm, củ cải đường, cải bắp và cây cà phê với đặc tính

Chuyên nghành Vi Sinh Vật học

8

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

ưu việt như có khả năng cố định đạm, tổng hợp auxin và gibberellins, hòa tan kẽm và
lân khó tan (Muthukumarasamy et al ., 2002; Madhaiyan et al., 2004).
2.2.7 Vi khuẩn Herbaspirillum
Vi khuẩn Herbaspirillum thuộc nhóm  – Proteobacteria, là vi khuẩn cố định
đạm sống trong rễ của nhiều cây không phải là họ đậu, bao gồm các loại cây họ lúa có
giá trị kinh tế.
Các loài Herbaspirillum seropedicae và Herbaspirillum rubrisubalbicans đã
được tìm thấy ở cây bắp, mía đường, cỏ, lúa hoang và lúa trồng (Baldani et al., 1986;
Olivares et al., 1996); vi khuẩn này cũng được tìm thấy ở cây cỏ chăn nuôi và các cây
trồng ở vùng nhiệt đới như khóm và chuối (Cruz et al., 2001).
Gần đây, các nhà nghiên cứu đã phát hiện được loài Herbaspirillum frisingense
mới được phân lập từ các cây cho sợi (Kirchhof et al., 2001).

Herbaspirillum hầu hết các loài của chúng thuộc nhóm vi khuẩn nội sinh bắt
buộc trong mô thực vật. Trong rễ chúng có khả năng cố định đạm mạnh mẽ (Baldani et
al., 1986). Ngoài ra chúng còn phát tán đến cả những vùng thân và lá (Barraquio et al.,
1997).
2.2.8 Vi khuẩn Klebsiella
Vi khuẩn Klebsiella thuộc nhóm  – Proteobacteria, là vi khuẩn gram âm, có
dạng hình que, không hay ít chuyển động, kết nang, sống kỵ khí không bắt buộc. Có 2
loài quan trọng là Klebsiella pneumoniae và Klebsiella oxytoca.Vi khuẩn Klebsiella
thường xuất hiện tự nhiên trong đất, một số xâm nhập vào cây trồng và sống nội sinh
trong cây. Có khoảng 30% các dòng của 2 loài này có thể cố định đạm trong điều kiện
kỵ khí.Theo ZX Lu (2000), vi khuẩn Klebsiella oxytoca dòng SG-11 được phân lập từ
rễ lúa là vi khuẩn kích thích sự sinh trưởng của thực vật nhờ vào khả năng cố định đạm
từ nitơ trong không khí và khả năng tổng hợp IAA từ tryptophan theo lộ trình indole –
3 – pyruvic acid của chúng. Ở Ấn Độ, Jha và Kumar (2007) nghiên cứu vi khuẩn K.
oxytoca dòng GR-3 được phân lập từ rễ và thân của cây cỏ đuôi mèo (Typha australis)
thì nhận thấy chúng có mật số ở rễ là 6x106 CFUxg-1, khả năng tổng hợp IAA từ tiền
chất tryptophan là 30 μg/mg trọng lượng khô, khả năng hòa tan lân khó tan là 31,5
μg/mg trọng lượng khô, và mức độ biểu hiện hoạt tính của phức hệ nitrogenase qua
Chuyên nghành Vi Sinh Vật học

9

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

phản ứng khử acetylene là khá cao (1.25 μmol C2H4/mg protein h-1). Sau đó, các nhà

nghiên cứu sử dụng vi khuẩn K.oxytoca dòng GR-3 chủng cho giống lúa Malviya
dhan-36 thì nhận thấy vi khuẩn này giúp gia tăng toàn bộ chiều dài cây và tăng hàm
lượng chlorophyll-a có hiệu quả; đồng thời chúng còn kích thích sự thành lập rễ bên và
rễ bất định cho cây.
2.3 Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh
Vi khuẩn nội sinh là nhóm vi khuẩn tiền nhân được liên kết với thực vật, chúng
hình thành sự liên hợp với cây chủ của chúng bằng cách hình thành tập đoàn của các
mô bên trong. Đối với nông nghiệp, phần lớn vi khuẩn nội sinh không gây hại cho sinh
vật chủ mà ngược lại chúng còn được xem là công cụ để cải tiến năng suất cây trồng
nhờ vào các đặc tính sinh học của chúng (Muthukumarasamy et al., 2002)
2.3.1 Khả năng cố định đạm
Đạm là chất căn bản của sự sống mọi tế bào. Đạm là chất dinh dưỡng có vai trò
quan trọng hàng đầu đối với cây trồng. Hàm lượng của chúng trong đất rất ít, vì vậy
cây trồng thường thiếu đạm. Một trong những phương pháp tăng cường lượng đạm
cho đất được nhiều người quan tâm là sử dụng các loại vi sinh vật cố định nitơ từ
không khí.
Sự cố định đạm sinh học chỉ giới hạn ở sinh vật sơ hạch, chủ yếu là ở vi khuẩn và
Archaea. Nhóm vi sinh vật này có thể sống tự dưỡng hay dị dưỡng và quá trình cố
định đạm của chúng cần nguồn năng lượng, chủ yếu là nguồn carbohydrate do cây chủ
cung cấp, do đó nguồn năng lượng càng dồi dào thì sản lượng đạm cố định càng cao.
Trong quá trình cố đạm sinh học, khâu then chốt của toàn bộ chu trình nitơ là sự khử
liên kết của N2 thành NH3 nhờ vào nguồn năng lượng ATP, sự hoạt động của phức hợp
enzyme nitrogenase và enzyme hydrogenase.
Phức hợp enzyme nitrogenase và enzyme hydrogenase biến đổi N2 thành NH3
theo công thức sau:
N2 + 8H+ + 8e- + 16ATP + 16H2O

2NH3 + H2 + 16ADP +16Pi

Ammonia (NH3) được tạo ra trong chu trình tiếp tục kết hợp với chuỗi carbon để

đồng hóa thành những acid amin đầu tiên cung cấp trực tiếp cho cây trồng. Việc đánh

Chuyên nghành Vi Sinh Vật học

10

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

giá khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn được phân lập cũng là một khâu
quan trọng để phân loại chúng.
Theo Klucas (1991) để sự cố định đạm nội sinh có hiệu quả thì cần phải cung cấp
đầy đủ các chất cần thiết từ cây chủ và các điều kiện môi trường thích hợp cho sự cố
định đạm liên kết. Do đó, sự chứng minh phân tử về sự có mặt của hệ thống gen nif
trong bộ gen của vi khuẩn điều khiển quá trình tổng hợp enzyme nitrogenase.
Nitrogenase là hệ enzyme xúc tác cho phản ứng khử N2 thành NH3. Như vậy, hệ
thống gen nif được xem là hệ thống gen điều khiển cho quá trình cố định đạm sinh
học thường được xem là vật chỉ thị đáng tin cậy để phân loại vi khuẩn (Elmerich,
2007).
Trong nhiều trường hợp, sự phát triển của vi khuẩn ở các môi trường nuôi cấy
đặc, bán đặc hay môi trường lỏng không đạm thì không đủ bằng chứng cho hoạt tính
cố định đạm của vi khuẩn. Các điều kiện sinh lý tương thích với hoạt tính nitrogenase
và sự phát hiện về hoạt tính này bằng các thử nghiệm khử acetylene cũng có thể không
đem lại kết quả như mong muốn hay thuyết phục (Postage, 1981).
2.3.2 Khả năng hòa tan lân khó tan
Lân rất quan trọng đối với cây trồng. Tuy nhiên hiệu suất sử dụng lân bởi cây

trồng không quá 25%, trong khi đó một lượng lớn bị cố định trong đất và chuyển thành
dạng khó hấp thụ. Lượng dự trữ lân trong đất xấp xỉ 0,025 – 0,3% P2O5 nhưng chúng
tồn tại trong đất ở dạng không tan trong nước cây khó hấp thụ. Thành phần lân dễ tan
và khó tan trong đất được quyết định bởi tính chất đá mẹ , thành phần cơ giới và hàm
lượng chất hữu cơ quyết định.Theo Sepfe-Satsaben (1960) thì hàm lượng phosphate
trung bình ở nhiều loại đất thường từ 0,02 – 0,08%. Do quá trình tích lũy sinh học,
hàm lượng phosphate trong lớp đất mặt cao hơn ở lớp dưới. Trong các loại đất khoáng,
tỉ lệ lân hữu cơ thường từ 25 – 65%. Quá trình phân giải xác bã động thực vật cung
cấp cho đất một nguồn phosphate quan trọng. Như vậy việc bổ sung chất hữu cơ vào
đất giúp làm tăng cường hàm lượng lân cho đất.
Vòng tuần hoàn của lân không giống như vòng tuần hoàn của nitơ. Trong khi
nitơ luôn khan hiếm trong đất thì lân tồn tại nhiều trong đất ở dạng khó phân giải. Nitơ
được đưa vào đất nhờ vi sinh vật cố định đạm từ không khí, còn đối với lân, chúng
được các vi sinh vật phân giải từ các nguồn lân vô cơ và hữu cơ khác nhau.
Chuyên nghành Vi Sinh Vật học

11

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

Theo nghiên cứu của Đặng Thị Huỳnh Mai (2001) có nhiều vi sinh vật được
phân lập từ các loại đất ở đồng bằng sông Cửu Long có khả năng hòa tan lân như là
các nhóm vi khuẩn và nấm. Trong đó nhóm vi khuẩn nhiều hơn nấm nhưng nấm có độ
hữu hiệu cao hơn.
Các vi sinh vật hòa tan phosphate làm cho phosphate khó tan có thể thành dạng

hòa tan bằng quá trình acid hóa và làm giảm pH do các acid hữu cơ do vi khuẩn tiết ra
tạo ra nhiều ion H+ (Lin et al.,2006). Các acid hữu cơ được sản xuất từ vi khuẩn và
nấm trong quá trình hòa tan lân khó tan chủ yếu là: citric, lactic, gluconic, oxalic,
tartaric, acetic và 2-ketogluconic acid (Sperber, 1985; Duff, 1963).
Theo nghiên cứu của Moghimi và Tate (1978) thì ngoài cơ chế acid hóa, các vi
khuẩn còn có thể hòa tan lân khó tan bằng sự tạo phức và các phản ứng trao đổi ion.
Trong đó phức cation có thể là cơ chế quan trọng trong các trường hợp hòa tan lân khó
tan khi có cấu trúc acid hữu cơ thích hợp để tạo ra phức.
2.4 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn nội sinh trên thế giới và ở Việt Nam
Hiện nay, người ta đã tìm được nhiều giống vi khuẩn nội sinh như: Azoarcus,
Enterobacter, Rhizobium, Agrobacterium, Bacillus, Pseudomonas, Clavibacter,
Brudyrhizobium,

Azospirillum,

Gluconacetobacter,

Cellulomonas,

Klebsiella,

Corynebacterium, Burkholderia, Herbaspirillum...ở các cây lương thực, cây hoa màu,
cây họ đậu và cây cỏ chăn nuôi...
Năm 1958, các nhà khoa học đã tìm thấy Beijerinckia spp. ở vùng rễ cây mía.
Sau đó Berg et al. (1980) đã nghiên cứu đặc tính sinh học của Azospirillum cộng sinh
ở cây mía đã làm tăng cường hoạt tính của enzim nitrogenase từ đó làm tăng tỉ lệ tổng
hợp đạm của cây.
Năm 1988, Cavalcante và Döbereine đã phân lập được vi khuẩn cố đinh đạm
trong rễ và thân cây mía trồng ở Brazil và đặt tên là Acetobacter diazotrophicus. Gần
đây, các nhà nghiên cứu đã phát hiện loài vi khuẩn này có một số đặc tính: tổng hợp

hormone tăng trưởng, tổng hợp auxin và gibberellin, làm giảm pH môi trường để hòa
tan lân (Muthukumarasamy et al., 2002). Hiện nay người ta đã nghiên cứu và tìm thấy
vi khuẩn này còn hiện diện ở cây cà phê, gari, khóm, lúa (Loganathan và Nair, 2003).

Chuyên nghành Vi Sinh Vật học

12

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

Ớ Thụy Điển, các nhà nghiên cứu đã tìm thấy ở vùng rễ của các loài ngũ cốc và
cỏ chăn nuôi các vi khuẩn Enterobacter và Bacillus (Lindberg và Granhall, 1984).
Ở Nhật, các nhà nghiên cứu đã xác định được các vi khuẩn nội sinh
Herbaspirillum có khả năng cố định đạm ở các loài lúa hoang (Elbeltagy et al.,2001).
Người ta cũng đã tiến hành thí nghiệm chủng vi khuẩn Herbaspirillum seropedicae và
giống Burkholderia vào cây lúa, kết quả các vi khuẩn có thể cố định đạm khoảng 19%
tổng số đạm cần thiết cho cây (Verma et al.,2001).
Ở Mỹ, mất hơn 6 năm nghiên cứu ở 4 loài cây nông nghiệp (bắp, lúa miến, đậu
tương và lúa mì) và 27 loài cỏ tự nhiên khác nhau người ta đã xác định được 15 giống
vi khuẩn nội sinh: Agrobacterium, Bacillus, Bradirhizobium, Erwinia, Cellulomonas,
Clavibacter,

Corynebacterium,

Enterobacterium,

Escherichia,

Klebsiella,

Microbacterium, Micrococcus, Pseudomonas, Rothia và Xanthomonas (Zinniel et
al.,2002), trong đó số vi khuẩn gram dương xấp xỉ bằng số vi khuẩn gram âm.
Ở Ấn Độ, khi nghiên cứu ở 4 loài lúa trồng khác nhau, người ta đã xác định được
vi khuẩn nội sinh Gluconacetobacter diazotrophicus cũng có khả năng cố định đạm
nhờ vào gen nif (Muthukumarasamy et al., 2005).
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu các vi khuẩn nội sinh có khả năng cố định đạm, hòa
tan lân, tổng hợp kích thích tố IAA ở các cây nông nghiệp đã tiến hành khá nhiều
trong những năm gần đây. Tại Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh học –
Đại học Cần Thơ, Cao Ngọc Điệp et al. (2007) đã phân lập và nhận diện các dòng
Azospirillum bằng kỹ thuật PCR từ rễ và thân lúa trồng; Cao Ngọc Điệp (2005) cũng
đã nghiên cứu ảnh hưởng của các vi khuẩn nốt rễ (Sinorhizobium fredii) và vi khuẩn
Pseudomonas sp. Trên cây đậu nành đã làm gia tăng số trái và giảm số trái lép trên
cây. Gần đây, Nguyễn Hữu Hiệp et al. (2008) đã phân lập được một số dòng vi khuẩn
Gluconacetobacter diazotrophicus nội sinh ở rễ, thân và lá của các giống mía trồng ở
huyện Cù Lao Dung và huyện Mỹ Tú, tỉnh Sóc Trăng.

Chuyên nghành Vi Sinh Vật học

13

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện
3.1.1 Địa điểm tiến hành thí nghiệm
Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật đất và Vi sinh vật
môi trường thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Đại học Cần
Thơ.
3.1.2.Thời gian thực hiện
Từ tháng 8/2013 đến tháng 11/2013
3.2 Phương tiện nghiên cứu
3.2.1 Dụng cụ, thiết bị
Sử dụng những thiết bị, phương tiện có tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công
nghệ Sinh học – Đại học Cần Thơ.
a) Thiết bị, dụng cụ để phân lập và khảo sát đặc tính của vi khuẩn
- Đĩa Petri, ống nghiệm, ống đong, ống Falcon
- Bình Erlenmeyer 50ml,100 ml
- Que cấy, đèn cồn, lame và lammen
- Kính hiển vi Olympus CHT (Nhật)
- Cân điện tử Sartorius (Đức )
- Nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi – international (Đức)
- Tủ cấy vi sinh vật ( Pháp)
- Tủ ủ vi sinh vật Inccucell 111 (Đức)
- Tủ sấy EHRET (Đức)
- Máy lắc mẫu GFL 3005 (Đức), máy Vortex
- pH kế Orion 420A (Hoa Kì)
- Lò vi sóng Panasonic (Thái Lan)
- Bộ micropipette Gibson P10, P20, P50, P200, P1000

Chuyên nghành Vi Sinh Vật học

14

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

b) Thiết bị và dụng cụ khác dùng để phân lập và nhận diện vi khuẩn
- Tủ lạnh Electrolux Confor Plus (Thụy Điển)
- Tủ lạnh Akira (Việt Nam)
- Máy chụp ảnh kỹ thuật số Olympus 7,1 megapixel
- Máy vi tính phân tích và lưu trữ số liệu
3.2.2 Vật liệu thí nghiệm
Bảy mẫu thân cây bắp lai được lấy ở các địa điểm: xã Gia Bình-Trảng Bàng-Tây
Ninh; xã Đồng Khởi-Châu Thành-Tây Ninh; xã Cẩm Giang-Gò Dầu-Tây Ninh; Phạm
Văn Mạnh ấp 4 xã Trà Vong và xã Thạnh Đông thuộc huyện Tân Biên tỉnh Tây Ninh.
Chọn các bộ phận thân không có dấu hiệu bệnh. Cắt mẫu thành từng đoạn ngắn (3 - 4
cm); rửa thật sạch dưới vòi nước mạnh để loại bỏ đất, bụi bẩn; để ráo tự nhiên. Để
riêng từng loại mẫu trong bọc nylon sạch có ghi nhãn, bảo quản trong tủ lạnh (4-5oC).
3.2.3 Hóa chất và môi trường
a) Hóa chất dùng để khử trùng mẫu
- Nước cất vô trùng
- Ethanol (cồn) 96%
- Hydrogen peroxide (H2O2) 10%

Chuyên nghành Vi Sinh Vật học

15

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học