phân lập nấm gây bệnh thán thư trên cây ớt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

PHÂN LẬP NẤM GÂY BỆNH THÁN THƢ TRÊN CÂY ỚT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN:
NGUYỄN THỊ LIÊN

SINH VIÊN THỰC HIỆN:
NGUYỄN THỊ THẢO NGUYÊN
MSSV: 3103971
LỚP : VSVH K36

Cần Thơ, tháng 12/2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN NẤM COLLETOTRICHUM SP.
GÂY BỆNH THÁN THƢ TRÊN CÂY ỚT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN:

NGUYỄN THỊ LIÊN

SINH VIÊN THỰC HIỆN:
NGUYỄN THỊ THẢO NGUYÊN
MSSV: 3103971
LỚP : VSVH K36


PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƢỚNG DẪN

SINH VIÊN THỰC HIỆN

Nguyễn Thị Liên

Nguyễn Thị Thảo Nguyên

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………

Cần Thơ, ngày

tháng

năm 2013

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(Kí tên)


LỜI CẢM TẠ
Để hoàn thành luận văn không chỉ có sự nổ lực và cố gắng của bản thân mà còn
có sự động viên và giúp đở rất nhiệt tình và chân thành của quý thầy cô, gia đình, bạn
bè. Tôi xin gửi lời tri ân sâu sắc đến:
Quý thầy cô Giảng viên viện NC và PT Công nghệ Sinh học của trường Đại học
Cần Thơ đã truyền dạy cho tôi nhiều kiến thức và kinh nghiệm quý báo trong quá trình
học tập và nghiên cứu tại viện.
Tôi xin cảm ơn cố vấn học tập cô Nguyễn Thị Pha, thầy Võ Văn Song Toàn và
tập thể lớp Vi sinh vật học khóa 36 đã động viên, chia sẽ và hỗ trợ nhiệt tình trong suốt
quá trình học vừ qua. Đồng thời tôi xin cảm ơn các thầy cô phụ trách các phòng thí
nghiệm của Viện đã tạo điều kiện cho tôi sử dụng trang thiết bị để hoàn thành luận
văn.
Thành kính cảm ơn cô Nguyễn Thị Liên đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo
điều kiện thuận lợi trong suốt tiến trình làm thí nghiệm để tôi hoàn thành luận văn này.
Cuối cùng tôi xin gửi lời tri ân chân thành đến những người thân trong gia đình
đã nuôi dưỡng, dạy dỗ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi học tập.
Xin chân thành cảm ơn tất cả!

Cần Thơ, ngày 28 tháng 11 năm 2013

Nguyễn Thị Thảo Nguyên

TÓM LƢỢC
Hai mươi tám dòng nấm Colletotrichum sp. đã được phân lập và tuyển chọn từ
các mẫu bệnh thán thư trên ớt với 4 dòng được phân lập từ lá và 24 dòng phân lập từ
trái ở các địa điểm ở huyện Phong Điền thuộc thành phố Cần Thơ; huyện Long Mỹ,
huyện Châu Thành, huyện Châu Thành A tỉnh Hậu Giang; Tân Bình và Tân Quới
thuộc huyện Bình Tân tỉnh Vĩnh Long. Kết quả quan sát đặc điểm khuẩn lạc trên môi
trường PDA đặc cho thấy: Nhóm 1 (chiếm 68%) có tốc độ mọc vừa và nhanh. Hầu hết
mặt trên khuẩn lạc có màu trắng, từ tâm lan ra màu vàng hoa cau, tím hoặc xám
trắng; mặt dưới có màu vàng hoa cau, hồng nhạt, đen hoặc tím;bề mặt khuẩn lạc dạng
nhung mượt len xốp với độ nổi mô; bìa sợi, phẳng mỏng hoặc dày mô. Nhóm 2 (chiếm
32%) có tốc độ mọc chậm. Bề mặt các khuẩn lạc có dạng bột mịn, độ nổi mô và dạng
bìa sợi. Mặt trên khuẩn lạc có màu xám trắng; mặt dưới khuẩn lạc có màu cam hoặc
màu xám đen.
Ngoài ra, các khuẩn lạc còn có các sắc tố hòa tan như màu vàng hoa cau
(7.2%), hồng (3.6%), cam (21.4%), tím (3.6%) hay xám đen (3.6%). Về hình dạng bào
tử: có dạng hình thoi, liềm hay hình trụ.

Từ khóa: Colletotrichum sp., ITS1 và ITS4, ớt, thán thư.

i


MỤC LỤC
Trang
PHẦN KÝ DUYỆT ..........................................................................................................
LỜI CẢM TẠ...................................................................................................................
TÓM LƢỢC .................................................................................................................... i
MỤC LỤC ......................................................................................................................ii
DANH MỤC BẢNG ..................................................................................................... iv
DANH MỤC HÌNH ....................................................................................................... v

TỪ VIẾT TẮT .............................................................................................................. vi
CHƢƠNG I. GIỚI THIỆU ........................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề .....................................................................................................1
1.2. Mục tiêu đề tài .............................................................................................1
CHƢƠNG II. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU..................................................................... 2
2.1. Giới thiệu về cây ớt ......................................................................................2
2.2. Bệnh thán thƣ trên cây ớt ...........................................................................3
2.2.1. Tác nhân gây bệnh...........................................................................4
2.2.2. Những yếu tố ảnh hưởng đến bệnh thán thư ...................................5
2.2.3. Triệu chứng bệnh.............................................................................5
2.2.4. Cơ chế xâm nhiễm ...........................................................................6
2.2.5. Tình hình nhiễm bệnh .....................................................................8
2.3. Tổng quan về nấm Colletotrichum sp. .......................................................9
2.3.1. Phân loại ..........................................................................................9
2.3.2. Lịch sử nghiên cứu ........................................................................10
2.3.3. Đặc điểm chung. ............................................................................12
2.4. Sơ lƣợc một số phƣơng pháp phân lập nấm ...........................................13
ii


CHƢƠNG III. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 15
3.1. Thời gian.....................................................................................................15
3.2. Địa điểm......................................................................................................15
3.3. Phƣơng tiện ................................................................................................15
3.3.1. Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm ..........................................................15
3.3.2. Vật liệu thí nghiệm ........................................................................16
3.3.3. Hóa chất .........................................................................................16
3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ..........................................................................16
3.4.1. Thu thập và xử lý mẫu ...................................................................16
3.4.2. Phân lập nấm bệnh ........................................................................17

CHƢƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 19
4.1. Nhận diện các dòng nấm bằng phƣơng pháp truyền thống ..................19
4.1.1 Quan sát đặc điểm khuẩn lạc trên môi trường đặc .........................19
4.1.2 Quan sát các đặc điểm hình thái .....................................................26
CHƢƠNG V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................ 32
5.1. Kết luận ......................................................................................................32
5.2. Kiến nghị ....................................................................................................32
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 33
PHỤ LỤC ..................................................................................................................... 37
Phụ lục 1: Thành phần môi trƣờng PDA .......................................................37
Phụ lục 2: Vị trí mẫu đƣợc phân lập của các dòng nấm Colletotrichum sp.
trên lá và trái ớt ................................................................................................38

iii


DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1. Bảng báo cáo về tác nhân gây ra bệnh thán thư trên ớt ở một số quốc gia. ...... 4
Bảng 2. Bảng báo cáo một số loài Colletotrichum sp. nhiễm trên các cây trồng nhiệt
đới. .................................................................................................................................10
Bảng 3. Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng nấm Colletotrichum sp. sau khi cấy 7 ngày
trên môi trường PDA. ....................................................................................................20
Bảng 4. Đặc điểm khuẩn ty và hình dạng bào tử của các dòng nấm Colletotrichum sp.
được phân lập. ...............................................................................................................27

iv


DANH MỤC HÌNH

Trang
Hình 1: Một số loại ớt ..................................................................................................... 3
Hình 2: Biểu hiện bệnh thán thư trên trái ớt. ................................................................... 4
Hình 3. Cơ chế xâm nhiễm của nấm Colletotrichum sp. ................................................ 7
Hình 4: Vùng và mùa mà bệnh thán thư xuất hiện thường xuyên và nghiêm trọng. ......8
Hình 5. Bào tử một số loài Colletotrichum sp............................................................... 13
Hình 6. Sơ đồ quy trình phân lập nấm .......................................................................... 17
Hình 7. Khuẩn lạc nấm Colletotrichum sp. sau khi cấy 7 ngày trên môi trường PDA. 26
Hình 8. Các dạng bào tử nấm Colletotrichum sp. ở độ phóng đại 1000 lần ................. 31

v


TỪ VIẾT TẮT

bp

Base pair, cặp bazo

BSA

Bovine Serum Albumin

DNA

Deoxyribo nucleic acid

ĐBSCL

Đồng Bằng Sông Cửu Long

Et.Br

Ethidium Bromide

H2O2

Hydrogen peroxide

H2 S

Hydrogen sulfide

ITS

Internal transcribed spacer

Ha

Hecta

Kb

Kilobase

ng/ µl

Nanogram/microliter

PCR

Polymerase Chain Reaction

pH

hydrogen power

rpm

round per minute

TBE

Tris – Boric acid - EDTA

TE

Tris EDTA

UV

Ultra Violet

V

Voltaire

vi

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013

Trường ĐHCT

CHƢƠNG I. GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Ớt (Capsicum sp. ) là loại cây đã được con người trồng trọt và thu hái từ lâu đời.
Với nhiều người, ớt được dùng làm gia vị nhằm làm tăng cảm giác ngon miệng hay
dùng để trang trí bởi lẽ ớt cũng là loại cây cảnh đẹp. Bên cạnh đó, ớt còn có tác dụng
rất tốt trong việc điều trị bệnh. Ngày nay, ớt là loại cây gia vị trồng được ở vùng nhiệt
đới nhưng được tiêu thụ khắp thế giới do đó có giá trị cao ở thị trường trong nước và
xuất khẩu, đem lại lợi nhuận kinh tế và là mặt hàng xuất khẩu đứng vị trí số một trong
các loại cây gia vị.
Vì lí do đó mà ngày nay diện tích trồng ớt đã tăng lên rất nhiều nhưng năng xuất
thật sự chưa cao. Là loại cây dễ trồng nhưng rất tốn công chăm sóc và luôn gặp những
tổn thất lớn trong vấn đề về dịch bệnh đặc biệt là bệnh thán thư do nấm Colletotrichum
sp. gây ra. Bệnh lây lan mạnh do bào tử nấm phát tán xa và nhiều theo gió. Vì vậy, đây
là dịch bệnh nghiêm trọng và gần như bất trị dù có phun nhiều loại thuốc đặc trị. Bệnh
xuất hiện trên lá, thân và đặc biệt là trên trái làm giảm năng xuất và chất lượng nông
sản từ 28 – 35%, thiệt hại lên đến 70 – 80%. Theo Than et al. (2008) Colletotrichum
sp. là một trong những tác nhân gây bệnh quan trọng nhất trên toàn thế giới gây ra
bệnh thán thư trên một loạt các cây trồng bao gồm ngũ cốc, các loại đậu, rau, cây lâu
năm và cây ăn quả (Bailey et al., 1992).
Vì vậy, vấn đề đặt ra là phải có biện pháp phòng trừ bệnh hiệu quả nhằm nâng
cao nâng xuất cũng như chất lượng ớt nhằm cải thiện kinh tế cho người dân. Đề tài:
“Phân lập và nhận diện nấm Colletotrichum sp. gây bệnh thán thƣ trên cây ớt”
được thực hiện với mục đích là nhận diện chính xác các dòng nấm Colletotrichum sp.
để tạo ra nguồn vật liệu phục vụ cho những nghiên cứu sâu hơn về nấm Colletotrichum
sp. nhằm quản lí và kiểm soát nguồn dịch bệnh một cách hiệu quả, đồng thời có hướng
phòng trị bệnh như: trồng các giống kháng hoặc bằng các biện pháp sinh học.

1.2. Mục tiêu đề tài
Phân lập các dòng nấm Collectotrichum sp. gây bệnh thán thư trên cây ớt.

Chuyên ngành Vi sinh vật học

1

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013

Trường ĐHCT

CHƢƠNG II. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về cây ớt
Cây ớt (Capsicum ssp.) thuộc chi Capsicum của họ cà (Solanaceae) gồm 5 loài
thuần hóa (C. annuum, C. baccatum, C. Chinense, C. frutescens, C. pubescens) với
hơn 20 loài hoang dại. Là loài cây chịu nhiệt, nhiệt độ thích hợp tăng trưởng là 18 –
280C khi nhiệt độ cao trên 320C và thấp dưới 150C sẽ làm cây tăng trưởng kém và hoa
dễ rụng.
Phân loại:
Giới

Plantae

Bộ

Solanales

Họ

Solanaceae

Chi

Capsicum
(Walsh và Hoot, 2001)

Cây ớt là một cây nhỏ có thể sống vài năm, thân dưới hóa gỗ. Cây có nhiều cành,
nhẵn. Lá mọc đơn, đôi khi mọc chùm thành hình hoa thị, lá nguyên có hình trứng đến
bầu dục, phiến lá nhọn ở đầu. Hoa nhỏ, dài, hoa màu xanh có hình chén, lá đài nhỏ,
hẹp và nhọn. Trái có 2 – 4 thùy, dạng trái rất thay đổi từ hình cầu đến hình nón, bề mặt
trái có thể phẳng, gợn sóng có khía hay nhẵn; trái khi chín có màu đỏ, đen hoặc vàng.
Trái không cay hay rất cay.
Cho đến nay, ớt có rất nhiều công dụng. Với nhiều người, ớt là gia vị không thể
thiếu trong các bữa ăn hằng ngày. Nếu ăn cay vừa phải sẽ giúp tăng tiết dịch vị, giúp
tiêu hóa tốt hơn, ăn ngon miệng hơn, đồng thời tránh bị đầy hơi. Khi ăn ớt, vị cay kích
thích thần kinh vị giác để được chuyền lên não bộ. Não bộ phản ứng bằng cách tăng
nhịp tim, giãn mạch cục bộ, tăng tiết nước bọt, hắt hơi. Để giảm cảm giác đau nóng
của ớt, não bộ sẽ tiết ra chất giảm đau là endorphin. Với nồng độ cao chất này gây cảm
giác thoải mái. Theo Than et al. (2008) ớt có nhiều lợi thế ẩm thực.
( ngày 02/08/2013).
Chuyên ngành Vi sinh vật học

2

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013

Trường ĐHCT

Theo Than et al. (2008) trong trái ớt bao gồm nhiều chất hóa học bao gồm nhiều
loại dầu dễ bay hơi, dầu béo, capsaicinoid, carotenoid, vitamin, protein, chất xơ và các
chất khoáng (Bosland và Votava, 2003). Trong ớt có nhiều thành phần quan trọng có
giá trị dinh dưỡng, hương vị, mùi thơm và màu sắc. Ớt có ít natri và cholesterol, giàu
vitamin A và C và là một nguồn cung cấp kali, axit folic và vitamin E. Ớt xanh tươi
chứa nhiều vitamin C hơn trái cam quýt và ớt đỏ tươi có nhiều vitamin A hơn cà rốt
(Osuna-García et al., 1998; Marin et al., 2004). Hai nhóm hóa chất được sản xuất bởi
ớt là capsaicinoid và carotenoids. Các capsaicinoid là alkaloid làm cho ớt có vị cay.
Một số lượng lớn carotenoid cung cấp giá trị dinh dưỡng cao và màu sắc cho ớt
(Britton và Hornero-Méndez, 1997; Hornero-Méndez et al., 2002; Pérez-Gálvez et al.,
2003).
Ngoài việc dùng trong thực phẩm, trái ớt còn được dùng trong y học và là cây
cảnh đẹp với nhiều màu sắc như các loại ớt ngũ sắc.

Hình 1: Một số loại ớt
(*Nguồn: />ngày 02/08/2013)

2.2. Bệnh thán thƣ trên cây ớt
Theo Than et al. (2008) bệnh thán thư, xuất phát từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là
“than”, còn gọi là bệnh đốm trái hay nổ trái. Thán thư là tên gọi phổ biến dùng chung
cho cây trồng bị bệnh với triệu chứng bệnh là màu ngăm ngăm đen, tổn thương sâu và
có chứa các bào tử (Isaac, 1992). Bệnh thán thư trên ớt lần đầu tiên được báo cáo ở
New Jersey, Mỹ bởi Halsted. Trong năm 1890, Halsted đã mô tả nguyên nhân gây ra
bệnh thán thư là hai loài Gloeopsorium piperatum và Colletotrichum nigrum. Đơn vị

Chuyên ngành Vi sinh vật học

3

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013

Trường ĐHCT

phân loại sau đó được xem xét như là từ đồng nghĩa của C. gloeosporioides bởi Arx
(1957).

Hình 2: Biểu hiện bệnh thán thƣ trên trái ớt.
(*Nguồn: Jaw Fen Wang và Paul Gniffke, 2010)

2.2.1. Tác nhân gây bệnh
Bệnh thán thư chủ yếu do nấm Colletotrichum sp. gây ra.
Bảng 1. Bảng báo cáo về tác nhân gây ra bệnh thán thƣ trên ớt ở một số quốc gia.
Quốc gia và khu vực
Australia

Tác nhân gây bệnh
Colletotrichum acutatum, C.

Trích dẫn
Simmonds, 1965

atramentarium, C. dematium, C.
gloeosporioides var. minor, C.

gloeosporioides var. gloeosporioides
India

C. capsici

Maiti and Sen, 1979;
Paul and Behl, 1990

Indonesia

C. acutatum, C. capsici, C. gloeosporioides

Voorrips et al., 2004

Korea

C. acutatum, C. gloeosporioides, C.

Park and Kim, 1992

coccodes, C. dematium

Myanmar (Burma)

Gloeosporium piperatum E. and E., C.

Dastur, 1920

nigrum E. and Hals

Chuyên ngành Vi sinh vật học

4

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013

Quốc gia và khu vực

Trường ĐHCT

Tác nhân gây bệnh

Trích dẫn

Papua New Guinea

C. capsici, C. gloeosporioides

Pearson et al., 1984

New Zealand

C. coccodes

Johnston and Jones,
1997

Taiwan

C. acutatum, C. capsici, C. gloeosporioides

Manandhar et al., 1995

Thailand

C. acutatum, C. capsici, C. gloeosporioides

Than et al., 2008

UK

C. acutatum, Glomerella cingulata

Adikaram et al., 1983

USA

C. acutatum

Roberts et al., 2001

Vietnam

C. acutatum, C. capsici, C. gloeosporioides,

Don et al., 2007

C. nigrum
(*Nguồn: Than et al., 2008)

2.2.2. Những yếu tố ảnh hƣởng đến bệnh thán thƣ
Theo Than et al. (2008) yếu tố môi trường góp phần quan trọng trong việc phát
triển của dịch bệnh. Mối quan hệ giữa cường độ mưa, hình thái học cây trồng, sự phát
tán nguồn bệnh có thể dẫn đến mức độ nặng khác nhau của bệnh (Dodd et al., 1992).
Những ảnh hưởng của nhiệt độ thường tương tác với những yếu tố khác, chẳng hạn
như ướt bề mặt lá, độ ẩm, ánh sáng hoặc vi sinh vật cạnh tranh (Royle và Butler,
1986). Tuy nhiên, bề mặt lá bị ướt dường như có ảnh hưởng trực tiếp lên sự nảy mầm,
sự xâm nhiễm và tăng trưởng của các tác nhân gây bệnh trên cây chủ. Nói chung là
xâm nhiễm xảy ra trong thời tiết ấm áp, ẩm ướt. Nhiệt độ khoảng 270C và độ ẩm cao
(trung bình 80%) là tối ưu cho sự phát triển bệnh thán thư (Roberts et al., 2001).
2.2.3. Triệu chứng bệnh
Triệu chứng bệnh trên lá và thân: vết bệnh hình tròn hoặc không có hình dạng
nhất định, xếp theo chiều dài của gân lá. Lúc đầu, đốm bệnh ở mặt dưới lá có màu nâu
nhạt, sau chuyển màu nâu sậm, có viền đỏ, lan rộng và lõm sâu. Trên cuống lá và thân
cây vết bệnh cũng lõm xuống tạo thành vết dọc màu nâu đen. Cây bị bệnh kém phát
triển, lá vàng và rụng sớm.
Trên trái: Vết bệnh lúc đầu là một đốm nhỏ hơi lõm, trên bề mặt vỏ trái. Vết
bệnh, thường có hình bầu dục hoặc hình thoi, màu nâu đen hoặc màu vàng trắng, kích
thước vết bệnh có thể trên dưới 1cm tuỳ thuộc vào giống ớt. Phần ranh giới giữa mô

Chuyên ngành Vi sinh vật học

5

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013

Trường ĐHCT

bệnh và mô khoẻ thường có một đường vạch màu đen chạy dọc theo vết bệnh. Trên bề
mặt mô bệnh có những chấm nhỏ màu đen đó là đĩa cành của nấm.
2.2.4. Cơ chế xâm nhiễm
Theo Than et al. (2008) các loài Colletotrichum sp. sử dụng các cách khác nhau
cho sự xâm chiếm các mô chủ, mà thay đổi từ bán ký sinh nội bào đến hoại dưỡng ở
vách dưới biểu bì (Bailey et al., 1992). Loài Colletotrichum sp. sản xuất một loạt các
cấu trúc xâm nhiễm chuyên hóa như đĩa áp và vòi xâm nhiễm, khuẩn ty nấm sơ cấp và
khuẩn ty nấm hoại dưỡng thứ cấp (Perfect và et al., 1999). Giai đoạn trước xâm nhiễm
của cả hai rất giống nhau, trong đó bào tử bám chặt vào và nảy mầm trên bề mặt cây
trồng, sản xuất đĩa áp và hình thành vòi xâm nhiễm sau đó thâm nhập vào các lớp biểu
bì (Bailey et al., 1992). Sau khi xâm nhập, các mầm bệnh ở trong vùng vách bên dưới
lớp biểu bì sống một cách hoại dưỡng và nhanh chóng lan rộng khắp các mô
(O'Connell et al., 1985). Không có giai đoạn ký sinh phát hiện trong hình thức hoại
sinh. Ngược lại, các mầm bệnh thán thư cho thấy sự nhiễm dinh dưỡng hoại sinh vào
hình thức ký sinh bằng cách sống ở các màng sinh chất và thành tế bào trong tế bào.
Sau khi ký sinh, khuẩn ty nấm trong tế bào sống ở trong một hoặc hai tế bào và sau đó
sản sinh khuẩn ty nấm hoại dưỡng thứ cấp (Bailey et al., 1992). Do đó các tác nhân
gây bệnh được coi là bán ký sinh hoặc hoại dưỡng (Kim et al, 2004). Ví dụ, C.
gloeosporioides trên bơ, ớt và chanh có thể sản xuất cả hai loại của sự xâm chiếm: ký
sinh trong tế bào ở giai đoạn đầu và hoại dưỡng (O'Connell et al., 2000).
Chỉ có một vài nghiên cứu chi tiết về cơ chế xâm nhiễm của nhiều loài
Colletotrichum sp. trên ớt. Kim et al. (2004) nhận thấy rằng nhiễm hoại sinh được tìm
thấy trong quá trình lây nhiễm của C. gloeosporioides trong ớt (C. annuum cv.
jejujaerae). Biểu bì tế bào chất của cây chủ trở nên cô đặc và nhỏ, không bào tăng lên
và phá hủy tế bào đến các tế bào dưới biểu bì của thực vật, trong đó có thể bị phá hủy
bởi các enzyme của mầm bệnh. Ở các giai đoạn sau của bệnh, các mô đã bị xâm chiếm

giữa và trong tế bào bởi các mầm bệnh. Đặc điểm cấu trúc này chỉ ra rằng xâm nhiễm
bị chi phối bởi sự tăng trưởng nấm hoại sinh.

Chuyên ngành Vi sinh vật học

6

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013

Trường ĐHCT

Hình 3. Cơ chế xâm nhiễm của nấm Colletotrichum sp.
(*Nguồn: Wharton và Diéguez-Uribeondo, 2004)

C: Bào tử

E: Mô biểu bì

A: Đĩa áp

M: Tế bào thịt lá

Cu: Biểu bì

N: Hoại sinh

PP: Hình thành vòi xâm nhiễm

SH: Sợi nấm thứ cấp

ILS: Đốm sáng (Internal Light Spot)

ScH: Dưới lớp biểu bì

PH: Sợi nấm sơ cấp.
Bào tử (C) mọc mầm và hình thành đĩa áp (A), đĩa áp hình thành vòi xâm
nhiễm (PP) xâm nhập qua lớp biểu bì (Cu) của tế bào chủ và trên đĩa áp xuất hiện đốm
màu sáng (ILS). Ở hình A, với cách xâm nhiễm bán kí sinh, vòi xâm nhiễm xuyên qua
tế bào biểu bì của tế bào chủ và phòng to lên tạo ra khoang xâm nhiễm với sợi nấm có
kích thước lớn, được gọi là sợi nấm thứ cấp (PH). Sợi nấm này có thể định vị lan sang
các mô biểu bì (E) và tế bào thịt lá (M) kế bên. Trong giai đoạn đầu của sự xâm nhiễm
này, sự tương tác giũa kí chủ và mầm bệnh là kí sinh bắt buộc. Tiếp theo là giai đoạn
hoại sinh (N), sự tương tác được thể hiện qua sự hình thành sợi mầm thứ cấp (SH).
Các sợi nấm thứ cấp này đâm xuyên vào trong tế bào và len lõi vào các ngã gian bào
đồng thời tiết enzyme phân hủy vách tế bào và giết chết tế bào chủ. Ở hình B, là cách
xâm nhiễm hoại sinh, sự định cư bên dưới tế bào kí chủ bắt đầu ở bên dưới biểu bì
(ScH) và thường không có giai đoạn kí sinh của sợi nấm bên trong vách hoặc nếu có

Chuyên ngành Vi sinh vật học

7

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013

Trường ĐHCT

thì giai đoạn này rất ngắn. Nấm lây lan nhanh chóng qua các mô, đi vào trong tế bào
và qua các gian bào (Wharton và Diéguez-Uribeondo, 2004).
2.2.5. Tình hình nhiễm bệnh
Bệnh thường phát triển trong thời tiết mưa nhiều và ẩm độ cao. Ở miền Nam,
những tháng 7, 8 và tháng 9 trong năm là thời điểm bệnh thán thư phát triển mạnh nhất
do ẩm độ không khí rất cao kết hợp với lượng mưa lớn.
Trên thế giới bệnh thán thư gây hại mạnh ở các nước vùng nhiệt đới. Trong đó,
Thái Lan, Ấn Độ, Việt Nam, Indonesia và cả Trung Quốc là những nước chịu thiệt hại
nặng nề, thất thoát về sản lượng có thể lên đến 80%. Bệnh không chỉ nhiễm trên trái
chín mà còn có cả trên trái non hay trái sau khi thu hoạch được vận chuyển đi nơi khác
vẫn bị nhiễm bệnh. Một số khu vực và mùa mà bệnh thán thư xuất hiện được thể hiện
trong hình 4.

Hình 4: Vùng và mùa mà bệnh thán thƣ xuất hiện thƣờng xuyên và nghiêm
trọng.
(*Nguồn: Jaw-Fen Wang và Paul Gniffke, 2010)

Chuyên ngành Vi sinh vật học

8

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013

Trường ĐHCT

2.3. Tổng quan về nấm Colletotrichum sp.
2.3.1. Phân loại
Giai đoạn vô tính :
Giới

Nấm

Ngành

Deuteromycotina

Lớp

Coelomycetes

Bộ

Melanconiales

Họ

Melaconiaceae

Chi

Colletotrichum

Giới

Nấm

Ngành

Ascomycota

Lớp

Sordariomycetes

Bộ

Glomerelalles

Họ

Glomerellaceae

Chi

Glomerella

Giai đoạn hữu tính:

(*Nguồn : Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Văn Thành, 2010; Phoulivong, 2011)

Giai đoạn hữu tính thường hiếm khi xuất hiện và không có ngoài tự nhiên nên
tên Coletotrichum sp. vẫn được duy trì và thường sử dụng trong chi này.

Chuyên ngành Vi sinh vật học

9

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013

Trường ĐHCT

2.3.2. Lịch sử nghiên cứu
Theo Phoulivong (2001) Colletotrichum lần đầu tiên được báo cáo bởi Tode
(1790) đặc tên là Vermicularia, nhưng sau đó đã được mô tả lại là Colletotrichum
(Corda, 1837) trong họ Melanconiales; lớp Coelomycetes; ngành Deuteromycotina.
Loài Colletotrichum sp. có đơn vị phân loại bao gồm chưa hoàn chỉnh hoặc nhóm vô
tính trong đó có một giai đoạn hữu tính Glomerella (Sutton, 1992). Colletotrichum sp.
bao gồm số lượng các loài gây bệnh sống trong mô thực vật, sống trên mô thực vật đã
chết, gần đây bệnh xuất hiện phổ biến trên một loạt các cây trồng có giá trị kinh tế cao,
cây cảnh (Cai et al., 2009; Hyde et al., 2009a; Prihastuti et al., 2009; Yang et al., 2009;
Phoulivong et al., 2010).
Bảng 2. Bảng báo cáo một số loài Colletotrichum sp. nhiễm trên các cây
trồng nhiệt đới.
Trái cây

Một số loài Colletotrichum

Tài liệu trích dẫn

Lê tàu (avocado)

C. acutatum,

Hindorf et al., 2000; Peres et al.,

(Persea americana)

C. gloeosporioides

2002; Everett, 2003; Giblin et al.,
2010.

Chuối

C. musae

Postmaster et al., 1997; Peres et al.,

(Musa spp.)

2002; Photita el al., 2004;
Nuangmek et al., 2008.

Ớt

C. acutatum,

Kanchana-udomkarn et al., 2004;

(Capsicum annuum)

C. capsici,

Than et al., 2008a; Kim et al., 2009;

C. gloeosporioides

Ratanacherdchai et al., 2010.

C. acutatum,

Hindorf et al., 2000 ; Chen et al.,

C. gloeosporioides

2005 ; Fischer et al., 2009 ;

Coffee

C. acutatum,

Nguyen et al., 2009; Prihastuti et

(Coffea arabica)

C. asianum,

al., 2009; Van der Vossen &

C. boninense,

Walyaro 2009.

Citrus spp.

C. capsici,
C. fructicola,
C. kahawae,
C. gloeosporioides,
C. siamense

Chuyên ngành Vi sinh vật học

10

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013

Trường ĐHCT

Trái cây

Một số loài Colletotrichum

Tài liệu trích dẫn

Dragon fruit

C. gloeosporioides

Masyahit et al., 2009.

C. gloeosporioides

Alahakoon & Brown 1994;

(Hylocereus undatus)
Sầu riêng
(Durio zibethinus)

Pongpisutta and Sangchote 1994;
Freeman et al., 1996.

Cây ổi

C. acutatum,

Hindorf et al., 2000 ; Alahakoon &

(Psidium guajava)

C. gloeosporioides

Brown 1994, Peres et al., 2002;
Amusa et al., 2006; Soares et al.,
2008.

Xoài

C. acutatum,

Peres et al., 2002; Alahakoon &

(Mangifera indica)

C. gloeosporioides

Brown 1994., Kefialew & Ayalew
2008; Nelson 2008; Giblin et al.,
2010.

Măng cụt

C. gloeosporioides

Alahakoon & Brown 1994.

Passion fruit

C. acutatum,

Hindorf et al., 2000; Peres et al.,

(Passiflora spp.)

C. gloeosporioides

2002.

Đu đủ (Carica papaya)

C. acutatum,

Peres et al., 2002; Rahman et al.,

C. capsici và

2008.

(Garcinia mangostana)

C. gloeosporioides
Rose apple

C. gloeosporioides

Alahakoon & Brown 1994.

C. gloeosporioides

Farungsang et al., 1994; Sivakumar

(Syzygium jambos)
Chôm chôm
(Nephelium lappaceum)

et al., 1997; Wijeratnam et al.,
2008.

Dâu tây

C. acutatum,

Schiller et al., 2006; Jelev et al.,

(Fragria frageriae)

C. gloeosporioides,

2008; Hyde et al., 2009a;

C. fragariae

MacKenzie et al., 2009.

Therbroma cacao,

Colletotrichum ignotum

Rojas et al., 2010.

Tetragastri panamensis

Colletotrichum tropicale

Rojas et al., 2010.

(*Nguồn : Phoulivong, 2011)

Chuyên ngành Vi sinh vật học

11

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013

Trường ĐHCT

2.3.3. Đặc điểm chung.
Colletotrichum sp. là một trong những chi nấm gây bệnh thán thư trên nhiều loại
cây trồng quan trọng, đặc biệt là các cây trồng nhiệt đới và cận nhiệt đới ảnh hưởng
đến nền kinh tế (Phoulivong, 2011).
Theo Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Văn Thành (2010) hiện nay nấm
Colletotrichum sp. được mô tả có 11 loài (Arx, 1957; Sutton, 1962). Nhưng
Alexopoulos và Mins (1979) thì đề xuất trên 1000 loài hình thức trong giống này đã
được mô tả trước đây, phần lớn chúng trùng tên. Theo ý kiến gần đây nhất của Baxter
et al., (1985), Colletotrichum được giới thiệu có 11 loài: C. coccodes, C.
gloeosprioides, C. graminicola, C. capsici… là những loài thường gây bệnh thán thư.
Khuẩn ty: Hệ khuẩn ty có gian bào và nội bào và ở mỗi tế bào chứa nhiều nhân.
Nhiều hạt dầu được sản xuất trong hệ khuẩn ty; khi chín khuẩn ty trở nên nhạt màu và
xoắn lại thành dạng chất nền nhỏ lớp ngoài cùng. Khuẩn ty già đôi khi hình thành vách
dày, màu nâu sậm, hình cầu hoặc không đều gọi là hậu bào tử (Chlamydospore), nó có
thể ở tận cùng hoặc chen giữa khuẩn ty nấm và tồn tại trong thời gian dài và khi tách
ra chúng cũng mọc mầm để hình thành khuẩn ty mới. Nấm Colletotrichum sp. có hệ
khuẩn ty thật, gồm có sự phát triển của khuẩn ty mảnh phân nhánh, không màu và có
vách ngăn (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Văn Thành, 2010).
Sinh sản: Collectotrichum sp. nội sinh, sinh sản vô tính bằng bào tử đính, bào tử
đính phát triển trên cuống bào tử; cụm cuống bào tử có dạng đĩa phẳng, mặt sau có cấu

trúc phấn mịn, mỗi cụm cuống bào tử gồm lớp chất nền, bề mặt sản sinh cuống bào tử
trong suốt. Cùng với bào tử và cuống bào tử là các lông cứng trên mỗi cụm cuống bào
tử, lông dài cứng, thuôn nhọn, không phân nhánh và đa bào cấu trúc như tơ cứng. Frost
(1964) mô tả một vài loài của Colletotrichum sp. có hoặc không có tơ cứng có thể
được kiểm soát bởi sự thay đổi độ ẩm (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Văn Thành, 2010).
Đặc điểm hình thái học được sử dụng để xác định các loài Colletotrichum sp. là
hình dạng và kích thước của đĩa cành, bào tử, cuống bào tử đính, tơ cứng, giác bám và
tơ cứng trong nuôi cấy (Sutton, 1992; Cai et al., 2009, Than et al., 2008). Các bào tử
của Colletotrichum gloeosporioides có hình thuôn dài với đầu hơi nhọn và nói chung
là rộng hơn so với bào tử của C. fragariae và C. acutatum (Gunell & Gubler, 1992).
Nhìn chung, các bào tử của C. acutatum là hình elip đến hình thoi, trong khi bào tử của

Chuyên ngành Vi sinh vật học

12

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013

Trường ĐHCT

C. gloeosporioides thuôn dài với đầu hơi nhọn (Freeman et al., 1998). Tuy nhiên đặc
điểm hình thái giữa các loài thì chồng lên nhau và chỉ riêng hình thái học không cung
cấp đầy đủ thông tin cho một nhận dạng chính xác, đặc biệt là đối với những loài trong
phức hệ các loài C. gloeosporioides và C. dematium.

Hình 5. Bào tử một số loài Colletotrichum sp.
(*Nguồn: Jaw-Fen Wang và Paul Gniffke, 2010)

2.4. Sơ lƣợc một số phƣơng pháp phân lập nấm
Kỹ thuật phân lập để tìm ra loài nấm mới hay nấm hữu ích là rất quan trọng trong
quá trình nghiên cứu. Không có một quy luật chung nào dùng cho phân lập vi sinh vật.
Phương pháp phân lập tốt nhất sẽ là phương pháp mà ta lựa chọn để phân lập vi sinh
vật mà ta cần. Tùy điều kiện mà chúng ta chọn cách phân lập sao cho phù hợp.
Có nhiều cách phân lập nấm như: Sử dụng kim nhọn nhặt bào tử, phân lập bào tử
đơn độc, phương pháp pha loãng; phân lập từ bào tử đảm…
Phƣơng pháp dùng kim nhọn:
Sử dụng phương pháp này để phân lập tất cả mọi loại nấm phát triển trên bất kỳ
một cơ chất nào.
Cách thực hiện:

Chuyên ngành Vi sinh vật học

13

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013

Trường ĐHCT

 Đặt cơ chất cần phân lập (lá, cành cây mục,...) lên kính hiển vi vật kính X10 (độ
phóng đại 10 lần) hoặc lên kính lúp.
 Chỉnh tiêu cự để quan sát được bào tử, cuống sinh bào tử từ cơ chất.
 Khử trùng que nhọn trên ngọn lửa đèn cồn.
 Đưa que nhọn vào khoảng giữa vật kính và cơ chất, nhặt bào tử chuyển sang
môi trường phân lập.

 Nuôi cấy bào tử ở nhiệt độ 250C ngày đến khi hình thành khuẩn lạc thì chuyển
sang môi trường thạch nghiêng.
Phƣơng pháp phân lập bào tử đơn độc:
Sử dụng phương pháp này để phân lập nấm gây bệnh thực vật.
Cách thực hiện:
 Chuẩn bị dịch huyền phù bào tử:
 Dùng kim nhọn đánh bẹt 1 đầu, gắn vào một cái tay cầm chắc chắn, dùng que
đó cào vào chỗ trên lá cây bệnh có xuất hiện đốm nấm, đặt sang lam kính đã có
sẵn một giọt nước vô trùng, khuấy đều.
 Dùng đầu kim lấy một giọt nước có hoà tan bào tử đó vẽ một hình tam giác lên
môi trường thạch nước (Water agar). Ủ 200C.
 Quan sát bằng kính hiển vi, tìm bào tử nảy mầm trên môi trường thạch đĩa theo
đường viền tam giác trên. Đánh dấu điểm có bào tử nẩy mầm bằng bút viết kính
ở mặt dưới đĩa thạch.
 Chuyển đĩa môi trường thạch có nuôi cấy các bào tử trên sang kính lúp. Quan
sát vị trí đánh dấu bào tử nẩy mầm. Thanh trùng que cấy, dùng que cấy lấy bào
tử nảy mầm ra, chuyển sang ống nghiệm môi trường thạch nghiêng để nuôi cấy.
(Nguồn: Burgess et al., 2009)

Chuyên ngành Vi sinh vật học

14

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013

Trường ĐHCT

CHƢƠNG III. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian
Từ tháng 6 đến tháng 12 năm 2013.
3.2. Địa điểm
Phòng Công nghệ gen thực vật và phòng Sinh học phân tử, Viện Nghiên cứu và
Phát triển Công nghệ Sinh học trường Đại học Cần Thơ.
3.3. Phƣơng tiện
3.3.1. Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm


Ống nghiệm



Eppendorf 1,5 ml, 2.2ml.



Đĩa petri



Kim cấy



Que trải thủy tinh



Lam



Lamelle



Bộ micropipet



Đèn cồn



Đầu côn các loại



Kéo



Bông gòn thấm nước



Kính hiển vi Olympus (Nhật)



Tủ cấy vô trùng Esco



Tủ ủ Binder



Nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi-international (Đức)



Máy ly tâm Eppendorf



Máy ly tâm chân không Eppendorf



Máy trộn mẫu (votex)

Chuyên ngành Vi sinh vật học

15

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học