Nghiên cứu quá trình phát sinh hình thái mô sẹo của cây đinh lăng (polyscias fruticosa (l ) harms)

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
- -  - -

HOÀNG THỊ HUYỀN

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH PHÁTSINH
HÌNH THÁI MÔ SẸO CỦACÂY ĐINH LĂNG
(Polyscias fruticosa (L.) Harms)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
TH.S LA VIỆT HỒNG

HÀ NỘI, 2015

i


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Th.s La Việt Hồng – Khoa Sinh
KTNN Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi
trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin cảm ơn tới các Ban Giám hiệu trƣờng ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủ
nhiệm khoa Sinh – KTNN trƣờng ĐHSP Hà Nội đã tạo mọi điều kiện để tôi
hoàn thành khóa luận này.
Trong thời gian thực hiện đề tài tôi cũng nhận đƣợc sự giúp đỡ tận tình
của cô Mai Thị Hồng – Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật, thầy Ong Xuân
Phong - Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học và Chuyển giao Công nghệ

đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến để tôi hoàn thành đề tài khóa luận, nhân đây tôi
cũng xin gửi lời cảm ơn.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Trung tâm Hỗ trợ
Nghiên cứu Khoa học và Chuyển giao Công nghệ, Phòng thí nghiệm Sinh lí
thực vật, Phòng thí nghiệm Thực vật- trƣờng ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo điều kiện
thuận lợi về thiết bị, phƣơng tiện để tôi có thể hoàn thành khóa luận này.
Cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, góp ý cho tôi trong qua
trình học tập và hoàn thành đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng

năm

Sinh viên

HOÀNG THỊ HUYỀN

2


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Kết quả
nghiên cứu trong khóa luận là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố dƣới sự
hƣớng dẫn củaTh.s La Việt Hồng.
Hà Nội, ngày tháng

năm

Sinh viên

HOÀNG THỊ HUYỀN

3


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1.Cây Đinh lăng –Polyscias fruticosa (L.) Harms [18] ........... 3
Hình 3.1.1. Hình thái lá Đinh lăng ở các công thức khác nhau sau 2
tuần .................................................................................................. 32
Hình 3.1.2. Hình thái lá Đinh lăng ở các công thức khác nhau sau 4
tuần .................................................................................................. 34
Hình 3.1.3. Hình thái lá Đinh lăng ở các công thức khác nhau sau 8
tuần .................................................................................................. 36
Hình 3.1.4. (a) Mô sẹo Đinh lăng ở các công thức sau 14 tuần ở các
công thức ......................................................................................... 37
Hình 3.1.4. (b) Hiệu quả các môi trƣờng tạo mô sẹo từ lá non và thân
cây Đinh lăng ................................................................................... 38
Hình 3.2. (a) giai đoạn phôi hình cầu ............................................... 40
Hình 3.2. (b) giai đoạn phôi hình tim ............................................... 41
Hình 3.2. (c) giai đoạn phôi “cá đuối” .............................................. 42
Hình 3.2. (d) giai đoạn phôi trƣởng thành ........................................ 44
Hình 3.2. Sự phát sinh hình thái từ mô sẹo lá cây Đinh lăng sau 7 tuần
ở các công thức: (e) CT T1, (f) CT T2, (g) CT T3, (h) CT T4 .......... 45
Hình 3.2. (i) hình thái chồi Đinh lăng tái sinh từ mô sẹo ở công thức
CT4 sau 14 tuần ............................................................................... 46
Hình 3.3. (a) Chồi Đinh lăng tái sinh từ mô sẹo trên môi trƣờng NAA
0,3 mg/l ............................................................................................ 48
Hình 3.3. (b) Chồi Đinh lăng tái sinh từ mô sẹo trên môi trƣờng NAA
0,5 mg/l ............................................................................................ 48

4


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Các công thức thí nghiệm xác định hiệu quả của 2,4 - D
và Kinetin đến khả năng tạo mô sẹo từ lá non và thân cây Đinh lăng
...................................................................................................... 27
Bảng 2.2. Công thức xác định ảnh hƣởng của BAP, Kinetin đến quá
trình phát sinh hình thái mô sẹo cây Đinh lăng.............................. 28
Bảng 2.3. Ảnh hƣởng của NAA đến khả năng tạo rễ ở chồi tái sinh
của cây Đinh lăng ......................................................................... 29

5


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

NAA:

Napthlacetic acid

CT:

Công thức

IBA:

Indol butyric acid

2,4 – D:

2,4-Dichlorophenoxy acetic acid

GA3:

Gibbrellin

BAP:

6-Benzyl amino purin

MS:

Murashige và Skoog

Nxb:

Nhà xuất bản

Tp.HCM:

Thành phố Hồ Chí Minh

6


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................ 1

2. Mục đích nghiên cứu .................................................................................. 2
3. Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 2
4. Ý nghĩa của đề tài ....................................................................................... 2
NỘI DUNG .................................................................................................... 3
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................... 3
1.1. Giới thiệu về cây Đinh lăng - Polyscias fruticosa (L.) Harms .................. 3
1.1.1. Vị trí ..................................................................................................... 3
1.1.2. Mô tả .................................................................................................... 3
1.1.3. Nguồn gốc, phân bố.............................................................................. 4
1.1.4. Hợp chất tự nhiên trong cây Đinh lăng Polyscias fruticosa (L.) Harms 4
1.1.4.1. Trong lá ............................................................................................. 4
1.1.4.2. Trong rễ ............................................................................................. 4
1.1.5. Tác dụng dƣợc lý của cây Đinh lăng..................................................... 5
1.2. Nhân giống cây trồng bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật ............ 5
1.2.1. Cơ sở khoa học ..................................................................................... 5
1.2.2. Mục đích .............................................................................................. 7
1.2.3. Ƣu, nhƣợc điểm của nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế
bào ................................................................................................................. 7
1.2.3.1. Ƣu điểm............................................................................................. 7

7


1.2.3.2. Nhƣợc điểm ....................................................................................... 8
1.2.4. Điều kiện cần thiết của nuôi cấy in vitro ............................................... 8
1.2.4.1. Vô trùng ............................................................................................ 8
1.2.4.2. Phòng nuôi cấy mô ............................................................................ 9
1.2.4.3. Thành phần môi trƣờng dinh dƣỡng................................................... 9
1.2.5. Các giai đoạn nhân giống in vitro ....................................................... 15
1.2.5.1. Giai đoạn 1 ...................................................................................... 15

1.2.5.2. Giai đoạn 2 ...................................................................................... 16
1.2.5.3. Giai đoạn 3 ...................................................................................... 16
1.2.5.4. Giai đoạn 4 ...................................................................................... 17
1.2.5.5. Giai đoạn 5 ...................................................................................... 17
1.2.6. Các giai đoạn phát sinh phôi soma ...................................................... 18
1.2.7. Các nghiên cứu in vitro về cây Đinh lăng ........................................... 20
1.2.7.1. Tạo cây con ..................................................................................... 20
1.2.7.2. Tạo phôi soma ................................................................................. 21
1.2.7.3. Tạo mô sẹo và phát sinh phôi soma ................................................. 21
1.2.7.4. Nhân nhanh chóng phôi soma thứ cấp của cây Đinh lăng ................ 22
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .......................................... 24
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.......................................................... 24
2.2. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu ............................................................... 24
2.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ......................................................................... 24
2.2.2. Trang thiết bị và dụng cụ .................................................................... 24
2.2.3. Môi trƣờng nuôi cấy ........................................................................... 25

8


2.2.4. Điều kiện nuôi cấy in vitro ................................................................. 26
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................... 26
2.3.1. Sơ đồ nghiên cứu ................................................................................ 27
2.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................... 27
2.3.2.1. Thí nghiệm 1: Tạo mô sẹo từ lá non và thân cây Đinh lăng ............ 27
2.3.2.2. Thí nghiệm 2: Quá trình phát sinh hình thái mô sẹo ở cây Đinh lăng
từ lá non và thân cây..................................................................................... 28
2.3.2.3. Thí nghiệm 3: Tạo rễ cây Đinh lăng tái sinh (Ảnh hƣởng của NAA
đến khả năng tạo rễ ở chồi tái sinh của cây Đinh lăng) ................................. 29
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................ 30

3.1. Tạo mô sẹo từ lá non và thân cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.)
Harms) ......................................................................................................... 30
3.1.1. Quan sát sự tạo thành mô sẹo từ lá non và thân cây Đinh lăng sau 2 tuần
ở các công thức ............................................................................................ 30
3.1.2. Quan sát sự tạo thành mô sẹo từ lá non và thân cây Đinh lăng sau 4 tuần
ở các công thức ............................................................................................ 32
3.1.3. Quan sát sự tạo thành mô sẹo từ lá non và thân cây Đinh lăng sau 8 tuần
ở các công thức ............................................................................................ 35
3.1.4. Quan sát sự tạo thành mô sẹo từ lá non và thân cây Đinh lăng sau 14
tuần ở các công thức. .................................................................................... 37
3.2. Quá trình phát sinh hình thái từ mô sẹo ở cây Đinh lăng từ lá non và thân
cây................................................................................................................ 39
3.3. Tạo rễ cây Đinh lăng tái sinh (Ảnh hƣởng của NAA đến khả năng tạo rễ
ở chồi tái sinh của cây Đinh lăng) ................................................................ 47
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................ 49

9


4.1. Kết luận ................................................................................................. 49
4.2. Kiến nghị .......................................................................................................... 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 50

10


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Cùng với sự phát triển của khoa học kĩ thuật đã có nhiều nghiên cứu về
cây Đinh lăng - Polyscias fruticosa (L.)Harms thuộc họ Nhân sâm hay Ngũ

gia bì (Araliaceae) [4], các kết quả nghiên cứu cho thấy cây Đinh lăng có
nhiều tác dụng dƣợc lí giống Nhân sâm, và Tam thất nhƣ chứa saponin đƣợc
coi là một trong những thành phần hóa học có tác dụng chính của dƣợc liệu,
đồng thời ở cây Đinh lăng, rễ là nơi có hàm lƣợng saponin cao nhất và cũng
thể hiện các tác dụng dƣợc lý mạnh hơn so với các bộ phận khác (lá, thân) [8],
[1], [19]. Ngoài ra trong Đinh lăng chứa alkaloid, acid amin, vitamin,... đặc
biệt dƣợc liệu từ cây Đinh lăng có tác dụng tăng cƣờng thể lực, tăng sức đề
kháng và tăng khả năng thích nghi [3].
Đinh lăng có nhiều loại khác nhau nhƣ: Đinh lăng lá nhỏ (Polyscias
fruticosa (L.) Harms), Đinh lăng lá tròn (Polyscias balfouriana), Đinh lăng
trổ (Polyscias guilfoylei)... [4]. Mặc dù dễ trồng, dễ sử dụng nhƣng sự khác
biệt về điều kiện dinh dƣỡng và địa lí có thể làm thay đổi hình thái và chất
lƣợng của Đinh lăng mặt khác việc sử dụng dƣợc liệu hiện nay còn hạn chế
do chƣa đƣợc chú ý trồng trọt, khai thác, bào chế.Để góp phần việc đẩy mạnh
việc sử dụng có hiệu quả nguồn dƣợc liệu trong nƣớc, khai thác vốn quý của y
học dân tộc, cụ thể là đối với cây Đinh lăng nói riêng và các cây trong họ
Nhân sâm nói chung. Một hƣớng nghiên cứu mới đã và đang đƣợc quan tâm
đó là áp dụng công nghệ sinh học thực vật để tạo nguồn giống đồng nhất,
năng suất cao, thời gian thu hoạch ngắn hơn so với trồng ngoài tự nhiên.
Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:“Nghiên cứu quá trình
phát sinh hình thái mô sẹo của cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.)
Harms)” là cần thiết để ứng dụng vào phục vụ cho nhu cầu trồng trọt, sản

1


xuất cây giống có hiệu quả cao, chất lƣợng tốt, góp phần nâng cao hiệu quả
nghiên cứu khai thác, bào chế các sản phẩm từ Đinh lăng.
2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu hình thái đƣợc phát sinh từ mô sẹo của cây Đinh

lăng(Polyscias fruticosa (L.)Harms) đƣợc nuôi cấy in vitro.
3. Nội dung nghiên cứu
- Tạo mô sẹo từ lá non và thân cây Đinh lăng.
- Quá trình phát sinh hình thái từ mô sẹo cây Đinh lăng.
- Ảnh hƣởng của α – NAA đến khả năng ra rễ tạo cây Đinh lăng in vitro
hoàn chỉnh.
4. Ý nghĩa của đề tài
- Ý nghĩa lí luận: Nhằm góp phần bổ sung vào nguồn tài liệu nghiên
cứu in vitro về cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.)Harms).
- Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả của đề tài có thể đƣợc sử dụng để ứng
dụng vào sản xuất cây giống có hiệu quả cao, chất lƣợng tốt, góp phần nâng
cao hiệu quả nghiên cứu khai thác, bào chế các sản phẩm từ Đinh lăng.

2


NỘI DUNG
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về cây Đinh lăng - Polyscias fruticosa (L.) Harms
1.1.1. Vị trí
Ngành: Magnoliophyta (Ngọc lan)
Lớp: Magnolyopsida (Ngọc lan)
Bộ: Araliales(Nhân sâm)
Họ: Araliaceae (Nhân sâm hay Ngũ gia bì)
Loài: Polyscias fruticosa (L.) Harms (Đinh lăng, cây gỏi cá, Nam dƣơng
lâm,...) [4].
1.1.2. Mô tả
Cây Đinh lăng - Polyscias
fruticosa (L.) Harms là cây bụi cao
0,5 – 2 m. Thân tròn sần sùi, không

có gai. Rễ phù nhƣ củ. Lá kép mọc
cách, có bẹ, phiến lá xẻ lông chim 2
– 3 lần, dài 20 – 40 cm. Lá chét có
cuống gầy dài 3 -10 mm, phiến lá
chét có răng cƣa không đều, chóp
nhọn các đoạn đều có cuống, lá có
mùi thơm. Cuống lá dài, tròn, màu
xanh sậm, đáy cuống phình to thành
bẹ lá. Cụm hoa hình thùy ngắn 7 -

Hình 1.1.Cây Đinh lăng –

18 mm ở ngọn, gồm nhiều tán mang

Polyscias fruticosa (L.) Harms [18]

nhiều hoa nhỏ, màu trắng xám. Tràng 5, nhị 5, bầu hạ 2 ngăn có dìa trắng
nhạt. Quả hình trứng, dẹt, dài 3 -4 mm, màu trắng bạc [4].

3


1.1.3. Nguồn gốc, phân bố
Cây Đinh lăng có nguồn gốc từ các đảo Thái Bình Dƣơng. Cây phân bố
ở Malayxia, Indonexia, Lào, miền Nam Trung Quốc,... Ở Việt Nam, hiện có
hơn 10 loài Đinh lăng [4], đƣợc trồng làm cảnh ở khắp nơi hoặc trồng làm
thuốc ở quy mô nhỏ theo từng hộ gia đình, loài Đinh lăng đƣợc sử dụng làm
thuốc phổ biến nhất là Polyscias fruticosa (L.) Harms. Đây là loài có nhiều
tác dụng dƣợc lý giống Nhân sâm [8].
1.1.4. Hợp chất tự nhiên trong cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa(L).

Harms)
Cây Đinh lăng chứa alkaloid, glycosid và các vitamin tan trong nƣớc
nhƣ: B1, B2, B6 và các phytosterin. Vỏ và lá Đinh lăng chứa saponin [1].
1.1.4.1. Trong lá
Lá Đinh lăng chứa sapoin triterpen chiếm 1,65%, sapoin triterpen trong
lá là một genin dạng acid olenolic, đây là một hợp chất thứ cấp có tác dụng
dƣợc liệu.
Trung tâm Sâm và Dƣợc liệu thành phố Hồ Chí Minh đã phân lập đƣợc
5 hợp chất polyacetylen từ lá Đinh lăng là: Panaxynol, Panoxydol, Heptadeca
– 1,8 (E)- dien-4,6 diyn- 3,10 diol, Heptadeca – 1,8 (E)- dien-4,6 diyn- 3ol10on và Heptadeca – 1,8 (Z)- dien-4,6 diyn- 3ol- 10on [1].
1.1.4.2. Trong rễ
Trong rễ Đinh lăng có glycosid, alkaloid, vitamin (B 1, B2, B6, C), các
phytosterin và 20 acid amin, trong đó có các acid amin không thể thay thế
(lysin, methionin, trytophan, cystein) [3]. Và trong rễ Đinh lăng mới chỉ thấy
5 hợp chất polyacetylen trong đó có Panaxynol, Panoxydol, Heptadeca – 1,8
(E)- dien-4,6 diyn- 3,10 diol là 3 hợp chất giống trong lá. Các hợp chất này có
tác dụng kháng khuẩn mạnh và chống một số dạng ung thƣ [1].

4


1.1.5. Tác dụng dược lý của cây Đinh lăng
Qua nghiên cứu và thử nghiệm, Viện Y học quân sự đã tìm đƣợc từ cây
Đinh lăng những tính chất của Nhân sâm: Rễ Đinh lăng có tác dụng làm tăng
cƣờng sức dẻo dai và sức đề kháng của cơ thể, chống hiện tƣợng mệt mỏi,
giúp ăn ngủ ngon, tăng khả năng lao động, lên cân và chống độc. Ngoài ra,
theo Y học cổ truyền, Hải Thƣợng Lãn Ông đã dùng rễ Đinh lăng sao vàng,
sắc cho phụ nữ uống sau khi đẻ để chống bệnh đau dạ con và làm tăng tiết
sữa. Đinh lăng còn đƣợc dùng chữa ban sởi, ho ra máu, kiết lỵ. Phối hợp với
sữa ong chúa là thuốc bổ rất tốt [19].

1.2. Nhân giống cây trồng bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.2.1. Cơ sở khoa học
Haberlandt G. (1902) là ngƣời đầu tiên đề xƣớng ra phƣơng pháp nuôi
cấy tế bào thực vật để chứng minh cho tính toàn thế của tế bào. Theo ông mỗi
một tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để
phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh[13]. Nhƣ vậy mỗi tế bào riêng rẽ của
một cơ thể đa bào đều chứa đầy đủ toàn bộ lƣợng thông tin di truyền cần thiết
của cả sinh vật đó và nếu gặp điều kiện thích hợp thì mỗi tế bào có thể phát
triển thành một cơ thể sinh vật hoàn chỉnh.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật (in vitro)đƣợc thực hiện dựa trên tính toàn
năng của tế bào, đƣợc thể hiện khi nuôi cấy mô và các tế bào cách li trong
môi trƣờng thích hợp thì có khả năng phát triển thành cây hoàn chỉnh đặc
trƣng cho loài và ra hoa tạo quả bình thƣờng, do trong nhân tế bào có chứa bộ
AND(NST) hoàn chỉnh chứa toàn bộ thông tin di truyền cho một chu kì sống
hoàn chỉnh.
ADN→ARN→Protein→Tính trạng
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào in vitro là kết
quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào. Trong đó:

5


Tính phân hóa của tế bào là sự biến đổi của các tế bào phôi sinh thành
các tế bào của các mô chuyên hóa đảm nhận các chức năng khác nhau. Trong
cơ thể thực vật có khoảng 15 loại mô khác nhau đảm nhận các chức năng
khác nhau (mô giậu, mô dẫn, mô bì, mô khuyết,…) nhƣng chúng đều có
nguồn gốc từ tế bào phôi sinh đã trải qua giai đoạn phân hóa để hình thành
các mô riêng biệt.
Tính phản phân hóa của tế bào: các tế bào khi đã đƣợc phân hóa thành
các mô có chức năng riêng biệt, nhƣng trong những điều kiện nhất định chúng

vẫn có thể quay lại trạng thái phôi sinh và phân chia tế bào mạnh mẽ.
Trên thực tế đã chứng minh khả năng tái sinh của một cơ thể thực vật
hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ. Hàng trăm loài cây trồng đã đƣợc nhân
giống trên quy mô thƣơng mại bằng cách nuôi cấy trong môi trƣờng nhân tạo
vô trùng và tái sinh chúng thành cây với hệ số nhân giống vô cùng lớn [15].
Trong kỹ thuật nuôi cấy các cơ quan dinh dƣỡng của cây nhƣ thân, rễ,
lá,… thì giai đoạn tạo mô sẹo (callus) chính là những tế bào đã quay trở lại
trạng thái phôi sinh có khả năng phân chia liên tục mà mất hẳn chức năng của
cơ quan dinh dƣỡng.
Tùy vào từng tế bào, từng mô, từng thời kỳ sinh trƣởng, phát triển mà
các gen phù hợp hoạt động, các gen không cùng hoạt động nhƣ nhau trong
các giai đoạn phát triển của cơ thể (do cơ chế điều hòa hoạt động của gen).
Về bản chất sự phân hóa và phản phân hóa là quá trình hoạt hóa gen.
Do thông tin về vị trí của tế bào, tƣơng quan dinh dƣỡng và tƣơng quan
hormon quy định. Trong đó quan trọng nhất là thông tin về vị trí của tế bào,
khi nằm trong một cơ thể các tế bào có sự ức chế lẫn nhau, khi đƣợc tách rời
và trong những điều kiện nhất định thì các gen đƣợc hoạt hóa dễ dàng hơn,
chúng có khả năng “mở” các gen để hình thành một các thể mới. Điều này
xảy ra theo một chƣơng trình đã đƣợc mã hóa trong cấu trúc phân tử AND

6


của mỗi tế bào, khiến quá trình sinh trƣởng của cơ thể thực vật luôn đƣợc hài
hòa. Đó là cơ sở nền tảng cho việc nuôi cấy mô, tế bào.
1.2.2. Mục đích
- Nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm làm vật liệu cho công tác chọn
giống.
- Nhân nhanh kết hợp làm sạch virus.
- Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp cây giống

của các loại cây trồng khác nhau.
- Bảo quản các tập đoàn gen, đặc biệt với các loài cây dễ bị nhiễm bệnh
trong điều kiện tự nhiên.
1.2.3. Ưu, nhược điểm của nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế
bào
1.2.3.1. Ưu điểm
Theo E.F.Gerge (1993) cho biết ƣu điểm của nhân giống in vitro
- Phƣơng pháp nhân giống in vitrocó khả năng hình thành một số lƣợng
lớn cây giống từ một mô, cơ quan với kích thƣớc nhỏ 0,1-10 mm.
- Hoàn toàn tiến hành trong điều kiện vô trùng nên cây giống tạo đƣợc
hoàn toàn sạch bệnh.
- Sử dụng vật liệu sạch virus và có khả năng nhân nhanh các giống sạch
bệnh.
- Hoàn toàn có khả năng điều chỉnh các tác nhân điều chỉnh khả năng tái
sinh của cây nhƣ thành phần ding dƣỡng, nhiệt độ, các chất điều tiết sinh
trƣởng,… theo ý muốn.
- Hệ số nhân giống cao, có khả năng sản xuất số lƣợng lớn cây giống
trong một thời gian ngắn. Hệ số nhân giống trong khoảng 36 đến 1012 cây
giống/năm.
- Có thể tiến hành quanh năm không chịu sự chi phối của các nhân tố
môi trƣờng.
7


- Cây giống in vitro nếu chua có nhu cầu sử dụng có thể bảo quản trong
một thời gian dài trong điều kiện in vitro.
1.2.3.2. Nhược điểm
- Mặc dù có hệ số nhân giống cao nhƣng cây giống có kích thƣớc nhỏ
khó trồng trong điều kiện tự nhiên, đôi khi xuất hiện các cây không mong
muốn (do biến dị, mọng nƣớc).

- Do cây giống đƣợc cung cấp nguồn hydratcacbon nhân tạo nên khả
năng tự tổng hợp các hợp chất hữu cơ kém. Cây giống in vitro đƣợc nuôi
trong các bình thủy tinh hoặc bình nhựa có độ ẩm tƣơng đối bão hòa. Do đó,
khi trồng ngoài điều kiện tự nhiên thƣờng bị mất cân bằng nƣớc, gây hiện
tƣợng bị héo cây và chết. Vì vậy, trƣớc khi chuyển cây từ điều kiện in vitro ra
điều kiện tự nhiên, cần trải qua giai đoạn “huấn luyện” để quen dần với điều
kiện tự nhiên.
- Cần thiết bị hiện đại, kĩ thuật viên có trình độ cao.
1.2.4. Điều kiện cần thiết của nuôi cấy in vitro
1.2.4.1. Vô trùng
Sự thành công hay thất bại của công việc nuôi cấy mô đều phụ thuộc
vào việc vô trùng. Vì vậy, trong nuôi cấy in vitro tất cả các khâu đều phải
đƣợc thanh trùng: dụng cụ nuôi cây, mẫu vật nuôi cấy, môi trƣờng nuôi cấy
và các thao tác nuôi cấy. Nếu khâu nào đó trong kĩ thuật nuôi cấy không đƣợc
thanh trùng thì mẫu nuôi cấy bị nhiễm vi sinh vật hoặc nấm và sẽ chết.
Khử trùng đƣợc thực hiện bằng các phƣơng tiện sau:
- Nồi hấp: khử trùng bằng hơi nƣớc có nhiệt độ và áp suất cao, thƣờng áp
dụng tiệt trùng cho môi trƣờng nuôi cấy, dụng cụ thí nghiệm, với áp suất 1
atm tƣơng đƣơng 121 0 C trong khoảng thời gian từ 20 đến 30 phút đảm bảo
khử trùng tốt.
- Tủ sấy: Khử trùng bằng nhiệt độ cao nên chỉ ấp dụng cho các dụng cụ
bằng thủy tinh và kim loại.
8


- Phễu lọc vô trùng: Khử trùng bằng phễu lọc có màng lọc kích thƣớc 0,2
μm, chỉ áp dụng cho các chất dễ phân hủy trong điều kiện nhiệt độ và ,áp suất
cao nhƣ vitamin B2, bibberelin,…
- Hóa chất khử trùng: Áp dụng để vô trùng bề mặt cấy hoặc dụng cụ, hóa
chất thƣờng nhƣ Ca-hypocloride, clorua thủy ngân, nƣớc brom, oxy già, cồn.

1.2.4.2. Phòng nuôi cấy mô
Các thiết bị quan trọng nhất của phòng nuôi cấy mô gồm nồi hấp vô
trùng, dụng cụ nuôi cấy, máy cấy vô trùng, phòng nuôi cấy đủ ánh sáng nhân
tạo, điều hòa nhiệt độ, tủ sấy, tủ ấm, máy đo pH, các loại cân phân tích,…
Trƣớc khi cấy, thí nghiệm viên cần rửa tay bằng xà phòng và lau kỹ đến
khuỷu tay bằng cồn 90%. Để đảm bảo mức độ vô trùng cao cần có một đèn tử
ngoại treo trên trần. Phòng cấy lớn đƣợc khử trùng tiện nhất là bằng đèn cực
tím.Thời gian khử trùng tùy theo kích thƣớc của phòng và đèn cực tím chỉ
đƣợc sử dụng khi không có ngƣời. Phòng cũng có thể đƣợc khử trùng bằng
cách lau rửa hai lần/tháng với các dung dịch chống nấm. Phòng nhỏ hơn và tủ
cấy cũng đƣợc khử trùng bằng tia cực tím hay các dung dịch khử trùng. Tủ
cấy thổi gió đƣợc khử trùng bằng cách mở quạt gió và lau tất cả các bề mặt
bằng cồn 95% trong 15 phút trƣớc khi bắt đầu làm việc. Phòng nuôi cũng
đƣợc khử trùng trƣớc hết là bằng xà bông bột. Sau đó lau bằng dung dịch
hypoclorit sodium 2% hoặc bằng cồn 95%. Tất cả sàn, trần đều đƣợc lau nhƣ
vậy mỗi tuần. Cẩn thận không nên khuấy động những nơi bị nhiễm để tránh
phát tán bào tử.Cần giảm sự chuyển động của không khí trong buồng cấy đến
mức tối thiểu vì vậy tất cả các dụng cụ phục vụ việc cấy đều phải chuẩn bị
đầy đủ để trong khi cấy tránh đi lại ra vào buồng cấy nhiều lần.
1.2.4.3. Thành phần môi trường dinh dưỡng
Đến nay có hàng trăm môi trƣờng dinh dƣỡng nhân tạo đã đƣợc xây
dựng và thử nghiệm có kết quả. Hầu hết các môi trƣờng nuôi cấy đều bao
gồm các nhóm chất sau:
9


- Các loại muối khoáng.
- Nguồn cacbon hữu cơ.
- Vitamin.
- Chất điều hòa sinh trƣởng.

- Nhóm chất tự nhiên.
- Chất làm đông môi trƣờng.
Các nhà khoa học sử dụng các môi trƣờng nuôi cấy rất khác nhau. Việc
lựa chọn môi trƣờng nuôi cấy với thành phần hoá học đặc trƣng phụ thuộc
vào một số yếu tố:
- Đối tƣợng cây trồng hoặc mô nuôi cấy khác nhau có nhu cầu khác
nhau về thành phần môi trƣờng.
- Mục đích nghiên cứu hoặc phƣơng thức nuôi cấy khác nhau (nuôi cấy
tạo mô sẹo phôi hoá hoặc phôi vô tính, nuôi cấy tế bào trần hoặc dịch lỏng tế
bào, vi nhân giống,…).
- Trạng thái môi trƣờng khác nhau (đặc, lỏng, bán lỏng…).
 Các loại muối khoáng
Các nguyên tố khoáng đa lƣợng: Gồm các nguyên tố khoáng đƣợc sử
dụng ở nồng độ trên 30 ppm, tức là trên 30 mg/l. Những nguyên tố đó là: N,
S, P, K, Mg, Ca. Riêng Na và Cl cũng đƣợc sử dụng trong một vài loại môi
trƣờng, nhƣng chƣa rõ vai trò của chúng.
- Các nguyên tố khoáng vi lƣợng: Là những nguyên tố đƣợc sử dụng ở
nồng độ thấp hơn 30 ppm. Đó là Fe, B, Mn, I, Mo, Cu, Zn, Ni, Co.
 Nguồn cacbon hữu cơ
Phƣơng thức sống chủ yếu của mô và các tế bào thực vật trong môi
trƣờng nuôi cấy là dị dƣỡng, cũng có thể sống theo phƣơng thức bán dị
dƣỡng dựa vào khả năng quang hợp trong điều kiện ánh sáng nhân tạo. Vì
vậy, trong môi trƣờng nuôi cấy cần sử dụng nguồn cacbon hữu cơ thƣờng

10


dùng là saccarozo với liều lƣợng 2-3%, nhƣng cũng tùy thuộc vào mục đích
nuôi cấy mà thay đổi, có khi xuống tới 0,2% và tăng lên đến 12%.
Trong một số trƣờng hợp nhƣ nuôi cấy hạt phấn, nuôi cấy tế bào trần,… có

thể sử dụng đƣờng glucozo, maltozo, galactozo,…
 Vitamin
Mặc dù tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro đều có khả năng tự tổng
hợp các loại vitamin cần thiết, nhƣng thƣờng không đủ lƣợng. Do đó, phải bổ
sung từ môi trƣờng ngoài, đặc biệt là vitamin thuộc nhóm B với nồng độ 1
ppm.
 Nhóm chất tự nhiên
Các nhà nuôi cấy mô và tế bào đã khẳng định môi trƣờng chỉ bao gồm
muối khoáng và đƣờng chƣa đủ cho tế bào sinh trƣởng tốt. Vì vậy, ngƣời ta
bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy một số nhóm chất tự nhiên nhƣ: Nƣớc dừa,
dịch chiết nấm men, dịch chiết mần lúa mì, một số dịch chiết rau, quả tƣơi,...
nhằm làm tăng thành phần dinh dƣỡng và cũng có các chất hoạt tính sinh học
giúp kích thích sự sinh trƣởng, phát triển của cây in vitro.
 Chất làm đông môi trƣờng
Thạch Agar – là một loại polysacarit của tảo (chủ yếu là tảo hồng
Rhodophyta), trong đó có rau câu mọc ở vùng đầm phá Việt Nam. Agar khi
ngâm nƣớc ở 80oC sẽ chuyển sang dạng sol và ở 40oC thì trở lại trạng thái gel.
Khả năng ngậm nƣớc của agar cao khoảng 6 – 12 g/l nƣớc. Tuy ở trạng thái
gel nhƣng agar vẫn đảm bảo cho các ion vận chuyển dễ dàng.
 Chất điều hòa sinh trƣởng
Các chất điều hòa sinh trƣởng có vai trò quan trọng nhất quyết định đến
kết quả nuôi cấy in vitro. Những chất điều hòa sinh trƣởng đó thuộc các nhóm
sau:

11


Nhóm các Auxin
Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trƣởng thực vật đƣợc sử dụng thƣờng
xuyên trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt chẽ với các

thành phần khác của môi trƣờng dinh dƣỡng để kích thích sự tăng trƣởng của
mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó
đƣợc phối hợp sử dụng với các cytokinin. Sự áp dụng loại và nồng độ auxin
trong môi trƣờng nuôi cấy phụ thuộc vào:
- Kiểu tăng trƣởng hoặc phát triển cần nghiên cứu
- Hàm lƣợng auxin nội sinh của mẫu cấy
- Khả năng tổng hợp auxin tự nhiên của mẫu cấy
- Sự tác động qua lại giữa auxin ngoại sinh và auxin nội sinh
- Đặc tính của auxin: Auxin có vai trò kích thích sự tăng trƣởng và kéo
dài tế bào. Auxin có khả năng khởi đầu sự phân chia tế bào. Đặc điểm chung
của

các

auxin

là tính

chất

phân

chia tế

bào.

2,4-D

(2,4-D-

Dichlorophenoxyaxetic axid) rất có hiệu quả đối với môi trƣờng tạo và phát
triển callus. NAA chủ yếu sử dụng cho môi trƣờng ra rễ và phối hợp với
cytokinin sử dụng cho môi trƣờng ra chồi.
Nhóm các cytokinin
Các cytokinin là dẫn xuất của adenine, đây là những hormone liên quan
chủ yếu đến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ƣu thế ngọn và phân hóa chồi
trong nuôi cấy mô. Các cytokinin đƣợc sử dụng thƣờng xuyên nhất là
6-benzylaminopurine (BAP) hoặc 6- benzyladenin (BA), 6-γ-γ-dimethylaminopurine (2-iP), N-(2-furfurylamino)-1-H-purine-6- amine (kinetin), và 6(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butanylamino)purine (zeatin).
Cytokinin liên quan tới sự phân chia tế bào, phân hóa chồi v.v… Trong môi
trƣờng nuôi cấy mô, cytokinin cần cho sự phân chia tế bào và phân hóa chồi
từ mô sẹo hoặc từ các cơ quan, gây tạo phôi vô tính, tăng cƣờng phát sinh
chồi phụ. Chức năng chủ yếu của các cytokinin đƣợc khái quát nhƣ sau:
12


- Kích thích phân chia tế bào
- Tạo và nhân callus
- Kích thích phát sinh chồi trong nuôi cấy mô
- Kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hƣởng ƣu thế của chồi
đỉnh
- Làm tăng diện tích phiến lá do kích thích sự lớn lên của tế bào
- Có thể làm tăng sự mở của khí khổng ở một số loài
- Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao)
- Ức chế sự hình thành rễ
- Ức chế sự kéo dài chồi
- Ức chế quá trình già (hoá vàng và rụng) ở lá, kích thích tạo diệp lục
Gibberellin
Nhƣng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật tác dụng của gibberellic
acid chƣa thật rõ ràng. Nhiều tác giả có sử dụng và coi đó là thành phần
không thể thiếu của một loại môi trƣờng chuyên dụng nào đó. Trong số hơn

20 chất thuộc nhóm gibberellin, GA3 là chất đƣợc sử dụng nhiều hơn cả trong
thực tiễn. GA3 kích thích kéo dài chồi và nảy mầm của phôi vô tính. So với
auxin và cytokinin, gibberellin hiếm khi đƣợc dùng. GA3 có tính hoà tan
trong nƣớc. Gibberellin có các chức năng cơ bản sau:
- Các mô phân sinh trẻ, đang sinh trƣởng, các phôi non, tế bào đầu rễ,
quả non, hạt chƣa chín hoặc đang nảy mầm đều có chứa nhiều gibberellic
axit.
- Kích thích kéo dài chồi do tăng cƣờng phân bào và kéo dài tế bào, ví dụ
kéo dài thân và đòng lúa sau khi phun GA3, kéo dài đốt thân. Các cây lùn
thƣờng bị thiếu gibberellin.
- Phá ngủ hạt giống hoặc củ giống, ví dụ phá ngủ khoai tây sau thu
hoạch.

13


- Kiểm soát sự ra hoa của các cây 2 năm tuổi. Năm đầu thân mầm nằm
in, sau mùa đông mầm hoa kéo dài đốt rất nhanh và phân hoá hoa.
- Ức chế sự hình thành rễ bất định.
- Kích thích sinh tổng hợp của α-amylase ở hạt cây ngũ cốc nảy mầm,
giúp tiêu hoá các chất dự trữ trong nội nhũ để nuôi mầm cây.
- Các chất ức chế tổng hợp kích thích quá trình tạo củ (thân củ, thân
hành và củ).
- Kích thích sự nảy mầm của phấn hoa và sinh trƣởng của ống phấn.
- Có thể gây tạo quả không hạt hoặc làm tăng kích thƣớc quả nho không
hạt.
- Có thể làm chậm sự hoá già ở lá và quả cây có múi.
Ảnh hưởng của than hoạt tính
Nồng độ sử dụng thƣờng là từ 0,2 – 3%. Than hoạt tính có những tác dụng
sau:

- Hấp thụ độc tố nâu/đen (hợp chất phenol và melanin) và các độc tố
không màu khác.
- Hấp thụ các hợp chất hữu cơ khác (auxin, cytokinin, ethylene, vitamin,
chelate Fe và Zn,…).
- Thúc đẩy sự tạo phôi soma.
- Ổn định độ pH.
 Độ pH của môi trƣờng
Độ pH của môi trƣờng dinh dƣỡng ảnh hƣởng trực tiếp tới quá trình thu
nhận các chất dinh dƣỡng từ môi trƣờng vào tế bào.
Độ pH của môi trƣờng cấy hầu hết đƣợc chỉnh ở 5,5 ± 0,1 trƣớc khi hấp
khử trùng. Độ pH ảnh hƣởng đến khả năng hòa tan của các ion trong môi
trƣờng khoáng, khả năng đông tụ agar và sự tăng trƣởng của tế bào. Vì vậy
xác định chính xác độ pH là cần thiết. Murashige và Shoog nhận thấy rằng pH
5,7-5,8 thích hợp để duy trì sự hòa tan các chất khoáng trong môi trƣờng MS.
14


Nếu môi trƣờng MS đƣợc sử dụng ở dạng lỏng thì có thể chỉnh pH ở 5, môi
trƣờng cấy huyền phù có pH thấp phần nào giảm bớt tính trạng nhiễm. Độ pH
của môi trƣờng thƣờng đƣợc điều chỉnh bằng NaOH hoặc HCl sau khi đã pha
xong môi trƣờng và chuẩn bị đƣa và hấp khử trùng. Có thể chỉnh pH bằng pH
kế để bàn, pH kế cầm tay hoặc giây đo pH. Thƣờng thì nhiệt độ cao sẽ làm
tăng tính axit của môi trƣờng. Mann và cộng sự nhận thấy rằng nếu trƣớc khi
hấp pH=5,7 thì sau khi hấp pH = 5, nếu muốn pH =5,7-5,9 thì trƣớc khi hấp
khử trùng cần điều chỉnh pH đến 7.
Ngoài ra môi trƣờng cần có nƣớc hoàn toàn sạch ion, thƣờng sử dụng
nƣớc cất 2 lần.
1.2.5. Các giai đoạn nhân giống in vitro
1.2.5.1. Giai đoạn 1:Tạo vật liệu khởi đầu in vitro (Khử trùng mô cấy)
Lựa chọn mẫu và đƣa mẫu vào nuôi cấy cần đảm bảo các yêu cầu sau:

+ Tỷ lệ mẫu nhiễm bệnh thấp
+ Tỷ lệ sống cao
+ Tốc độ sinh trƣởng nhanh
Giai đoạn này rất quan trọng, thậm chí quyết định toàn bộ quy trình
nhân giống in vitro. Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc rất nhiều vào việc
lấy mẫu, vì vậy tùy thuộc vào mục đích khác nhau, loại cây trồng khác nhau
mà lấy mẫu cho phù hợp.
Khử trùng mẫu trƣớc khi đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy bằng hóa chất
khử trùng để loại bỏ các tác nhân gây bệnh (nấm, vi khuẩn). Chọn đúng
phƣơng pháp khử trùng sẽ đƣa lại hiểu quả kinh tế cao. Thông thƣờng các
chất thƣờng dùng để khử trùng là: HgCl2 1%; Ca(OCl)2 từ 5 – 7%; H2O2 hoặc
dung dịch brôm khoảng 3%.
Mẫu sau khi đƣợc khử trùng sẽ đƣợc đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy, môi
trƣờng nuôi cấy tùy thuộc vào loại cây trồng nhƣng phổ biến là:
+ Muối khoáng theo Murashige & Skoog (1962)
15