phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây diếp cá (houttuynia cordata t.) trồng ở tỉnh hậu giang
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (4.75 MB, 106 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC
PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH TRONG CÂY DIẾP CÁ
(HOUTTUYNIA CORDATA T.) TRỒNG Ở TỈNH HẬU GIANG
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
PGS.TS NGUYỄN HỮU HIỆP
SINH VIÊN THỰC HIỆN
NGUYỄN HỮU THIÊN PHÚC
MSSV: 3108499
Lớp: VSV K36
Cần Thơ, tháng 12 / 2013
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC
PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH TRONG CÂY DIẾP CÁ
(HOUTTUYNIA CORDATA T.) TRỒNG Ở TỈNH HẬU GIANG
Cần Thơ, tháng 12 / 2013
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường Đại học Cần Thơ
PHẦN KÝ DUYỆT
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
SINH VIÊN THỰC HIỆN
PGS.TS Nguyễn Hữu Hiệp
Nguyễn Hữu Thiên Phúc
DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………
Cần Thơ, ngày …… tháng …… năm 2013
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường Đại học Cần Thơ
LỜI CẢM TẠ
Trong suốt quá trình thực hiện đề tài Luận văn tốt nghiệp ở Trường Đại học Cần
Thơ, bên cạnh những thuận lợi còn có nhiều khó khăn, thất bại. Không những bản thân
cố gắng, tìm tòi nghiên cứu mà còn nhờ vào sự động viên, khích lệ của gia đình, sự
hướng dẫn và giúp đỡ của thầy cô, bạn bè đó là nguồn động lực rất lớn giúp tôi hoàn
thành đề tài nghiên cứu này.
Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:
Quý Thầy Cô Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại
học Cần Thơ đã truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực
hiện luận văn.
Phó Giáo sư- Tiến sĩ Nguyễn Hữu Hiệp, Phó Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh
học Vi sinh vật, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học
Cần Thơ, Thầy hướng dẫn đề tài, đã tận tình truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm học tập
và nghiên cứu khoa học.
Các bạn cùng lớp Vi Sinh Vật Học K36, cán bộ phòng thí nghiệm, các anh chị
cao học và các em sinh viên thực tập tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật đã giúp đỡ,
động viên và chia sẻ những khó khăn giúp tôi hoàn thành tốt luận văn này.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình và người thân đã động
viên, khích lệ và luôn ủng hộ tôi về mặt vật chất cũng như tinh thần trong suốt thời
gian qua để tôi vững tin thực hiện đề tài nghiên cứu này.
Kính chúc quý vị nhiều sức khỏe, hạnh phúc và thành đạt.
Xin trân trọng cảm ơn!
Cần Thơ, ngày 26 tháng 11 năm 2013
Nguyễn Hữu Thiên Phúc
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường Đại học Cần Thơ
TÓM LƯỢC
Mười sáu dòng vi khuẩn nội sinh đã được tách ròng từ cây Diếp cá thu được ở
Huyện Châu Thành và Huyện Phụng Hiệp thuộc tỉnh Hậu Giang. Hầu hết các dòng vi
khuẩn này đều có dạng hình que, một số khác có dạng hình cầu, 14 dòng gram âm và
2 dòng gram dương, đa số vi khuẩn đều có khả năng chuyển động. Kết quả khảo sát
khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA của vi khuẩn cho thấy, các dòng vi khuẩn này
có thể tổng hợp được một lượng IAA và ammonium nhất định sau 2 ngày chủng.
Lượng ammonium và IAA này tăng cao nhất vào ngày thứ 4 và giảm dần sau sáu
ngày. Trong đó R5 dòng tổng hợp đạm cao nhất với 0,459µg/ml, lượng IAA cao nhất
do dòng L4 tổng hợp. T3 là dòng có hiệu suất hòa tan lân cao nhất. Đối với khả năng
kháng vi khuẩn gây bệnh thì R1 là dòng kháng Escherichia coli mạnh nhất, R7 và T2
là dòng kháng mạnh Aeromonas hydrophila. R1, T5 và L1 là 3 dòng có khả năng
kháng cả 2 loại vi khuẩn gây bệnh được tuyển chọn tiến hành định danh, theo kết quả
giải trình tự DNA và mức độ tương đồng của DNA trên ngân hàng gen xác định 3
dòng vi khuẩn đó là Bacillus subtilis, Enterobacter cloacae và Bacillus
amyloliquefaciens với độ tương đồng 99%.
Từ khóa: ammonium, cố định ammonium, diếp cá, IAA, kháng khuẩn, vi khuẩn nội
sinh.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
i
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học
Trường Đại học Cần Thơ
MỤC LỤC
PHẦN KÝ DUYỆT ......................................................................................................
LỜI CẢM TẠ...............................................................................................................
TÓM LƯỢC................................................................................................................i
MỤC LỤC..................................................................................................................ii
DANH SÁCH BẢNG .................................................................................................v
DANH SÁCH HÌNH .................................................................................................vi
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT...................................................................................vii
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU.......................................................................................1
1.1
Đặt vấn đề ......................................................................................................1
1.2
Mục tiêu đề tài................................................................................................2
CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU...................................................................3
2.1
Sơ lược về Hậu Giang.....................................................................................3
2.1.1
2.1.2
2.1.3
a.
b.
c.
2.2
Sơ lược về cây Diếp cá ...................................................................................5
2.2.1
2.2.2
2.3
Vị trí địa lý: .................................................................................................... 3
Điều kiện tự nhiên........................................................................................... 3
Tổng quan về Huyện Phụng Hiệp.................................................................... 4
Đặc điểm địa hình: ........................................................................................... 4
Khí hậu: ........................................................................................................... 4
Sông ngòi: ........................................................................................................ 5
Đặc điểm chung .............................................................................................. 5
Tác dụng y học của cây Diếp cá ...................................................................... 6
Vi khuẩn nội sinh............................................................................................7
2.3.1
2.3.2
a.
b.
c.
d.
e.
f.
g.
2.2.3
a.
b.
c.
2.2.4
a.
b.
c.
Sơ lược về vi khuẩn nội sinh ........................................................................... 7
Sự xâm nhập và nội sinh trong mô thực vật của vi khuẩn nội sinh ................... 8
Nguồn gốc........................................................................................................ 8
Di chuyển......................................................................................................... 9
Tiếp cận ........................................................................................................... 9
Xâm nhập hay xuyên thấu ................................................................................ 9
Sinh sản.......................................................................................................... 10
Xâm nhập....................................................................................................... 10
Định cư .......................................................................................................... 11
Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh ........................................................... 11
Khả năng cố định đạm.................................................................................... 11
Khả năng hòa tan lân khó tan.......................................................................... 13
Đối kháng sinh học......................................................................................... 13
Các nhóm vi khuẩn nội sinh thường gặp........................................................ 14
Vi khuẩn Bacillus........................................................................................... 14
Vi khuẩn Pseudomonas .................................................................................. 18
Vi khuẩn Azospirillum.................................................................................... 20
Chuyên ngành Vi sinh vật học
ii
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học
d.
e.
f.
g.
2.4
Vi khuẩn Klebsiella ........................................................................................ 20
Vi khuẩn Azotobacter..................................................................................... 20
Vi khuẩn Enterobacter ................................................................................... 21
Vi khuẩn Burkholderia ................................................................................... 21
Một số vi khuẩn gây bệnh thường gặp. .........................................................22
2.4.1
a.
b.
c.
d.
2.4.2
2.5
Trường Đại học Cần Thơ
Vi khuẩn Escherichia coli ( E. coli). ............................................................. 22
Sơ lược về E. coli ........................................................................................... 22
Đặc điểm:....................................................................................................... 23
Cơ chế gây bệnh:............................................................................................ 23
Triệu chứng:................................................................................................... 23
Vi khuẩn Aeromonas hydrophila (A. hydrophila). ......................................... 23
Tình hình nghiên cứu Diếp cá trong và ngoài nước.......................................26
2.5.1
2.5.2
Trong nước ................................................................................................... 26
Ngoài nước ................................................................................................... 26
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................28
3.1
Phương tiện nghiên cứu ................................................................................28
3.1.1
3.1.2
3.1.3
3.1.4
3.1.5
a.
b.
3.2
Thời gian ...................................................................................................... 28
Địa điểm ....................................................................................................... 28
Vật liệu ......................................................................................................... 28
Dụng cụ và thiết bị........................................................................................ 28
Hóa chất và môi trường................................................................................. 29
Hóa chất dùng để khử trùng mẫu .................................................................... 29
Hóa chất thí nghiệm ....................................................................................... 29
Phương pháp nghiên cứu ..............................................................................32
3.2.1
a.
b.
c.
3.2.2
a.
b.
c.
d.
e.
f.
3.2.3
3.2.4
Phương pháp phân lập vi khuẩn nội sinh ....................................................... 32
Xử lý mẫu ...................................................................................................... 32
Pha loãng mẫu................................................................................................ 32
Phân lập vi khuẩn ........................................................................................... 32
Xác định các đặc tính của vi khuẩn nội sinh .................................................. 33
Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn ............................ 33
Nhuộm Gram vi khuẩn nội sinh...................................................................... 34
Xác định khả năng tổng hợp NH4+ .................................................................. 35
Xác định khả năng hòa tan lân khó tan............................................................ 37
Khảo sát khả năng tổng hợp IAA của một số dòng vi khuẩn phân lập. ............ 37
Khảo sát khả năng kháng khuẩn ..................................................................... 38
Sử dụng kỹ thuật PCR để nhận diện một số dòng vi khuẩn triển vọng. .......... 39
Xử lý kết quả ................................................................................................ 40
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...........................................................41
4.1
Phân lập vi khuẩn .........................................................................................41
4.2
Đặc tính vi khuẩn phân lập được trên môi trường PDA.................................41
4.3
Khả năng cố định đạm ..................................................................................45
4.4
Hoạt tính hòa tan lân khó tan. .......................................................................50
4.5
Khả năng tổng hợp IAA................................................................................52
Chuyên ngành Vi sinh vật học
iii
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học
4.6
Khả năng kháng khuẩn. ................................................................................57
4.6.1
4.6.2
4.7
Trường Đại học Cần Thơ
Khả năng kháng vi khuẩn Escherichia coli.................................................... 57
Khả năng kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila. ........................................ 59
Kết quả PCR và định danh những dòng vi khuẩn triển vọng. ........................61
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...............................................................65
5.1
Kết luận ........................................................................................................65
5.2
Đề nghị.........................................................................................................65
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................66
PHỤ LỤC
Chuyên ngành Vi sinh vật học
iv
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học
Trường Đại học Cần Thơ
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1: Thành phần môi trường PDA........................................................................29
Bảng 2: Thành phần môi trường NBRIP ....................................................................29
Bảng 3: Công thức môi trường đặc NFb (g/l).............................................................30
Bảng 4: Công thức dung dịch vi lượng.......................................................................30
Bảng 5: Công thức dung dịch Vitamin .......................................................................31
Bảng 6: Thành phần môi trường LB ( Luria Betani)...................................................31
Bảng 7. Thành phần các chất trong phản ứng PCR.....................................................31
Bảng 9. Chu kỳ phản ứng PCR ..................................................................................40
Bảng 10. Nguồn gốc các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường PDA.....................42
Bảng 11. Đặc tính khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập trên môi trường PDA .................43
Bảng 12. Đặc tính vi khuẩn phân lập được trên môi trường PDA...............................44
Bảng 13: Khả năng tổng hợp Amonium của các dòng vi khuẩn phân lập từ Rễ..........46
Bảng 14: Khả năng tổng hợp Amonium của các dòng vi khuẩn phân lập từ Thân. .....47
Bảng 15: Khả năng tổng hợp Amonium của các dòng vi khuẩn phân lập từ Lá. .........48
Bảng 16: Khả năng tổng hợp Amonium của các dòng vi khuẩn triển vọng.................49
Bảng 17: Khả năng hòa tan lân khó tan của 16 dòng vi khuẩn phân lập được.............51
Bảng 18: Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phân lập từ rễ....................53
Bảng 19: Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phân lập từ thân. ...............54
Bảng 20: Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phân lập từ lá. ...................55
Bảng 21: Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn triển vọng. ........................55
Bảng 22 : Hiệu quả kháng E. coli của 3 dòng vi khuẩn triển vọng..............................57
Chuyên ngành Vi sinh vật học
v
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học
Trường Đại học Cần Thơ
DANH SÁCH HÌNH
Hình 1: Cây Diếp cá ....................................................................................................6
Hình 2: Bacillus amyloliquefaciens............................................................................16
Hình 3: Bacillus cereus..............................................................................................17
Hình 4: Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens...............................................................19
Hình 5: Vi khuẩn E. coli ............................................................................................22
Hình 6: Cá bị nhiễm A.hydrophila .............................................................................25
Hình 7: Một số hình ảnh về Aeromonas hydrophila ...................................................25
Hình 8: A: Cây Diếp cá tiến hành phân lập vi khuẩn.................................................41
B: Vòng pellicle xuất hiện trên môi trường Nfb ........................................................41
Hình 9: Hình dạng một số khuẩn lạc vi khuẩn phân lập. ............................................43
Hình 10: Hình dạng và đặc điểm nhuộm gram của một số dòng vi khuẩn ..................44
Hình 11: Đường chuẩn đo nồng độ NH4+ ..................................................................45
Hình 12: Hiệu quả hòa tan lân của một số dòng vi khuẩn phân lập.............................51
Hình 13: Đường chuẩn đo nồng độ IAA ....................................................................52
Hình 14: Hiệu quả kháng E. coli của các dòng vi khuẩn triển vọng............................58
Hình 15: Hoạt tính kháng E. coli của một số dòng vi khuẩn phân lập.........................58
Hình 16: Hiệu quả kháng A. hydrophila của các dòng vi khuẩn triển vọng.................59
Hình 17: Hoạt tính kháng A. hydrophila của một số dòng vi khuẩn phân lập.............60
Hình 18: Phổ điện di DNA các dòng vi khuẩn ...........................................................61
Chuyên ngành Vi sinh vật học
vi
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học
Trường Đại học Cần Thơ
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
A. hydrophilla
Aeromonas hydrophilla
DMSO
Dimethyl sulfoxide
DNA
Deoxyribo Nucleic Acid
ĐBSCL
Đồng bằng sông Cửu Long
E. coli
Escherichia coli
EAEC
Enteroaggregative E. coli
EHEC
Enterohemorrhagic E. coli
EPEC
Enteropacthogenic E. coli
ETEC
Enterotoxigenic E. coli
EIEC
Enteroinvasive E. coli
IAA
Indole–3–Acetic Acid
LB
Luria - Bertani
NBRIP
National Botanical Research Institute's phosphate
OD
Optical Density
PCR
Polymerase Chain Reaction
PDA
Potato dextrose agar
Chuyên ngành Vi sinh vật học
vii
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học
Trường Đại học Cần Thơ
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
1.1
Đặt vấn đề
Trong thiên nhiên, có rất nhiều cây cỏ có chất kháng sinh và nguồn dược liệu của
Việt Nam thì vô cùng phong phú, trong đó có nhiều cây thuốc có tính kháng khuẩn đã
được Y học dân tộc dùng làm thuốc từ lâu. Chúng thường là những cây cỏ rất quen
thuộc, mọc hoang dại hoặc được trồng ngay trong vườn nhà. Nhiều cây thuốc đã được
các nhà khoa học nghiên cứu và tìm thấy những chất kháng khuẩn có tác dụng diệt
nhiều loại vi khuẩn, trong đó có cây Diếp cá.
Diếp cá là loại rau rất quen thuộc trong các bữa ăn hàng ngày của các gia đình
Việt Nam, nhất là các tỉnh phía Nam. Thường dùng làm rau ăn sống, làm gia vị cùng
các loại rau khác. Diếp cá cũng được sử dụng làm thuốc trị một số bệnh như táo bón,
sởi, viêm cơ, đau mắt, viêm phổi, nhiễm trùng...
So sánh với kháng sinh tổng hợp, có thể thấy các chất kháng sinh từ thực vật tuy
hiệu lực kháng khuẩn không mạnh bằng nhưng cũng đủ để chữa khỏi nhiều bệnh
nhiễm khuẩn. Không những thế, chúng còn có nhiều ưu điểm mà thuốc kháng sinh
tổng hợp không có. Một trong những vấn đề đó là hiện tượng quen thuốc, kháng thuốc
và loạn khuẩn do tình hình lạm dụng kháng sinh trong điều trị ngày càng phát triển ở
nhiều nước trên thế giới. Đây là chuyện nan giải đối với kháng sinh tổng hợp hiện nay,
nhưng đối với kháng sinh thực vật người ta chưa thấy hiện tượng này. Đó là chưa kể
những tai biến nguy hiểm do nhiều loại kháng sinh gây ra, có khi dẫn đến tử vong,
trong khi ưu điểm nổi bật của kháng sinh thực vật là rất ít độc, do đó không gây ra
những tai biến nguy hiểm. Bên cạnh đó, phần lớn các kháng sinh thực vật lại rất bền
vững và dễ hoà tan trong nước, nên có thể được dùng dưới dạng thuốc sắc là dạng bào
chế đơn giản và thông dụng nhất. Chính vì vậy, gần đây người ta chú ý nhiều đến
kháng sinh thực vật và có xu hướng trở lại với các cây thuốc, sử dụng các kháng sinh
tự nhiên của cây cỏ.
Nhiều nghiên cứu sản xuất cây dược liệu có tính kháng khuẩn như cây Sài đất
(Wedelia calendulacea, Less), cây Diếp cá (Houttuynia cordata, Thunb), cây Diệp hạ
châu (Phyllanthus urinaria, Less)… đã được nghiên cứu chứng tỏ chúng có hoạt tính
kháng khuẩn nhờ chúng có chứa tinh dầu là các nhóm aldehyd và các dẫn xuất ceton
như methyl n-nonyl ceton, L-decanal, L-dodecanal. Nhóm terpen bao gồm các chất αChuyên ngành Vi sinh vật học
1
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học
Trường Đại học Cần Thơ
pinen, camphen,...có tác dụng diệt các vi khuẩn Streptococcus pneumonia,
Staphylococcus aureus, Shigella, Salmonella, E. coli (Đỗ Tất Lợi, 2004).
Nhiều nghiên cứu cho thấy trong các cây trồng không thuộc họ đậu cũng có các
nhóm vi sinh vật có ích sống trong cây hoặc ở vùng rễ cây đã kích thích cây trồng phát
triển tốt nhờ chúng có khả năng cố định nitơ, phân giải lân, tổng hợp các hormone tăng
trưởng và các hợp chất có khả năng trực tiếp ức chế một số bệnh cho cây trồng hoặc
kích thích cây trồng sản xuất các hợp chất biến dưỡng thứ cấp giúp cây chống lại các
tác nhân gây bệnh cây. Đặc biệt là có những chủng vi sinh vật nội sinh với cây dược
liệu có thể sản xuất các hợp chất kháng khuẩn khi chúng sống bên trong cây dược liệu.
Các nhóm vi sinh vật có khả năng này bao gồm các loài thuộc chi Azosprillum,
Herbaspirillum, Gluconacetobacter, Klebsiella… Đặc biệt có 2 chi có khả năng kháng
khuẩn cao là Bacillus và Pseudomonas.
1.2
Mục tiêu đề tài
Phân lập và tuyển chọn được các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá trồng ở
tỉnh Hậu Giang có khả năng tổng hợp ammonium, IAA, hòa tan lân và có khả năng
kháng khuẩn.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
2
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học
Trường Đại học Cần Thơ
CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1
Sơ lược về Hậu Giang
Hậu Giang là tỉnh thuộc khu vực nội địa của Đồng bằng Sông Cửu Long, nằm ở
trung tâm châu thổ sông MeKong. Hậu Giang là một trong những trung tâm lúa gạo
của miền Tây Nam Bộ. Tỉnh có thế mạnh về cây lúa và cây ăn quả các loại, có
nguồn thủy sản phong phú, chủ yếu tôm cá nước ngọt và chăn nuôi gia súc.
2.1.1 Vị trí địa lý:
Tỉnh nằm ở hạ lưu sông Hậu, giữa một mạng lưới sông ngòi, kênh rạch chằng
chịt. Tỉnh nằm kề thành phố Cần Thơ, trung tâm của vùng Tây Nam Bộ. Sự phát triển
của thành phố Cần Thơ sẽ có ảnh hưởng đến sự phát triển của tỉnh Hậu Giang. Tuy
nhiên, do vị trí nằm sâu trong nội địa nên Hậu Giang gặp không ít khó khăn trong việc
khai thác các nguồn lực bên ngoài lãnh thổ, nhất là trong bối cảnh toàn cầu hoá.
2.1.2 Điều kiện tự nhiên.
Hậu Giang là tỉnh nằm ở phần cuối Đồng bằng châu thổ Sông Cửu Long, địa
hình thấp, độ cao trung bình dưới 2m so với mực nước biển. Địa hình thấp dần từ Bắc
xuống Nam và từ Đông sang Tây. Khu vực ven sông Hậu cao nhất, trung bình khoảng
1m - 1,5m, độ cao thấp dần về phía Tây. Bề mặt địa hình bị chia cắt mạnh bởi hệ thống
kênh rạch nhân tạo.
Tỉnh Hậu Giang nằm trong vòng đai nội chí tuyến Bắc bán cầu, gần xích đạo,
có khí hậu nhiệt đới gió mùa, chia thành hai mùa rõ rệt. Mùa mưa có gió Tây Nam
từ tháng 5 đến tháng 11, mùa khô có gió Đông Bắc từ tháng 12 đến tháng 4 hàng năm.
Nhiệt độ trung bình là 27oC không có sự trên lệch quá lớn qua các năm. Tháng có
nhiệt độ cao nhất (35oC) là tháng 4 và thấp nhất vào tháng 12 (20,3oC). Mùa mưa từ
tháng 5 đến tháng 11 hàng năm, chiếm từ 92 - 97% lượng mưa cả năm. Lượng mưa ở
Hậu Giang thuộc loại trung bình, khoảng 1800 mm/năm, lượng mưa cao nhất vào
khoảng tháng 9 (250,1mm). Ẩm độ tương đối trung bình trong năm phân hoá theo mùa
một cách rõ rệt, chênh lệch độ ẩm trung bình giữa tháng ẩm nhất và tháng ít ẩm nhất
khoảng 11%. Độ ẩm trung bình thấp nhất vào khoảng tháng 3 và 4 (77%) và giá trị độ
ẩm trung bình trong năm là 82%.
Tỉnh Hậu Giang có một hệ thống sông ngòi kênh rạch chằng chịt với tổng chiều
dài khoảng 2.300 km. Mật độ sông rạch khá lớn 1,5 km/km, vùng ven sông Hậu thuộc
Chuyên ngành Vi sinh vật học
3
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học
Trường Đại học Cần Thơ
huyện Châu Thành lên đến 2 km/km. Hậu Giang nằm trong vùng trũng của khu
vực Đồng bằng Sông Cửu Long. Cấu tạo của vùng có thể chia thành hai vùng cấu trúc
rõ rệt là tầng cấu trúc dưới và tầng cấu trúc bên, trong đó tầng cấu trúc dưới gồm nền
đá cổ cấu tạo bằng đá Granite và các đá kết tinh khác, bên trên là đá cứng cấu tạo bằng
đá trầm tích biển hoặc lục địa và các loại đá magma xâm nhập hoặc phun trào
( />
2.1.3 Tổng quan về Huyện Phụng Hiệp
Huyện Phụng Hiệp nằm ở phía Đông của tỉnh Hậu Giang, địa hình chạy theo
sông, kênh, rạch và các đường Quốc lộ chính như: đường tỉnh 927, đường 928, Quốc
lộ 61 tiếp giáp với các huyện, tỉnh khác như sau: Phía Bắc giáp huyện Châu Thành A,
phía Đông giáp huyện Châu Thành và thị xã Ngã Bảy, phía Nam giáp huyện Châu
Thành và huyện Mỹ Tú (Sóc Trăng), phía Tây giáp huyện Vị Thủy và huyện Long
Mỹ. Huyện chia thành 15 đơn vị hành chính gồm 03 thị trấn: Cây Dương, Kinh Cùng,
Búng Tàu và 12 xã: Phụng Hiệp, Long Thạnh, Thạnh Hòa, Tân Bình, Hòa An, Hiệp
Hưng, Tân Phước Hưng, Hòa Mỹ, Phương Bình, Phương Phú, Tân Long và Bình
Thành.
Có vị thế nằm gần với sông Hậu và nhiều kênh trục chạy qua, đồng thời quy mô
đất đai và dân số của huyện lớn là tiềm năng và lợi thế cho phát triển kinh tế - xã hội,
nhất là trong lĩnh vực nông nghiệp.
a.
Đặc điểm địa hình:
Địa hình của huyện nhìn chung khá bằng phẳng, cao độ có xu thế thấp dần theo
hướng từ Bắc xuống Nam, từ Đông sang Tây thấp dần vào giữa huyện, đã tạo thành
các khu vực có địa hình cao thấp khác nhau.
b. Khí hậu:
Huyện Phụng Hiệp nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa cận xích đạo với
những đặc trưng sau:
Nhiệt độ cao đều trong năm (trung bình 26,8oC), tháng 4 nóng nhất (nhiệt độ
trung bình 28,3oC) và tháng giêng thấp nhất (nhiệt độ trung bình 25,5 oC). Nắng nhiều
(trung bình 2.445 giờ/năm, 6,7 giờ/ngày), điều kiện khí hậu khá thuận lợi để cây trồng
sinh trưởng – phát triển tốt, cho năng suất và chất lượng sản phẩm cao.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
4
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học
Trường Đại học Cần Thơ
Lượng mưa bình quân năm đạt 1.635mm và phân hóa sâu sắc theo mùa. Mùa
mưa bắt đầu từ tháng 4 đến tháng 11 với lượng mưa chiếm 90% tổng lượng mưa trong
năm. Mùa khô bắt đầu từ tháng 12 đến tháng 3 với lượng mưa chỉ chiếm 10% tổng
lượng mưa trong năm.
c. Sông ngòi:
Phụng Hiệp có hệ thống sông ngòi chằng chịt với nhiều con sông lớn nhỏ. Sông
Hậu là nguồn cung cấp nước chủ yếu trên địa bàn huyện với nguồn nước dồi dào
quanh năm tạo điều kiện thuận lợi cho việc phát triển kinh tế -xã hội của huyện đặc
biệt là trong lĩnh vực nông nghiệp ( Vũ Trường, 2011)
2.2
Sơ lược về cây Diếp cá
2.2.1 Đặc điểm chung
Diếp cá có tên khoa học là Houttuynia cordata Thunb, thuộc họ lá Giấp
(Saururaceae), còn được gọi là Giấp cá, Dấp cá, Ngư tinh thảo.
Diếp cá là loài của lục địa châu Á, phân bố từ Ấn Độ qua Trung Quốc, Nhật Bản,
Thái Lan, các nước Đông Dương. Ở nước ta, Diếp cá mọc hoang ở chỗ ẩm ướt, thường
được trồng làm rau ăn. Thu hái cành lá quanh năm, thường dùng tươi. Có thể phơi hay
sấy khô để dùng dần. Là một loại cỏ nhỏ, mọc lâu năm, có thân rễ mọc ngầm dưới đất.
Rễ nhỏ mọc ở các đốt, thân mọc đứng, hình trụ tròn hay dẹt, có lông hoặc ít lông, cao
25- 30cm, đường kính 2- 3 mm. Các mấu ở gốc thân còn vết tích của rễ, chất giòn dễ
gãy. Lá mọc cách, hình tim, đầu lá hơi nhọn hay nhọn hẳn, phiến lá gấp cuộn lại, nhàu
nát, cuống lá dài khoảng 2- 3 cm, gốc cuống lá rộng thành bẹ mỏng. Mặt trên lá màu
lục, vàng sẫm đến nâu sẫm, mặt dưới màu lục xám đến nâu xám. Cụm hoa là 1 bông
dài 1-3cm, hoa nhỏ, không có bao hoa, có 4 lá bắc màu trắng; trông toàn bộ bề ngoài
của cụm hoa và lá bắc giống như một cây hoa đơn độc. Toàn cây vò có mùi tanh như
mùi cá. Hoa nở vào mùa hạ vào các tháng 5- 8, kết quả vào tháng 7- 10. (Đỗ Tất Lợi,
2004).
Theo Đỗ Tất Lợi, (2004), trong cây có chừng 0,0049% tinh dầu và một ít
chất ancaloit gọi là cocdalin. Thành phần chủ yếu của tinh dầu là metylnonylxeton,
chất myrcen, axid caprinic và laurinaldehyt. Hoa và quả chứa chất isoquexitrin và
không chứa quexitrin. Độ tro trung bình là 11,4%, tro không tan trong HCl là 2,7%.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
5
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học
Trường Đại học Cần Thơ
Hình 1: Cây Diếp cá
(Hình chụp ngày 09/06/2013)
2.2.2 Tác dụng y học của cây Diếp cá
Theo đông y, Diếp cá có vị cay chua, mùi tanh, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt
giải độc, lợi tiểu tiêu thũng, sát trùng; còn có tác dụng ức chế thần kinh và chống viêm
loét. Người ta đã biết là cordalin có tác dụng kích thích gây phồng, quercitrin có tác
dụng lợi tiểu mạnh.
Ngoài các hoạt chất trong Diếp cá là quercetin, isoquercetin có tác dụng lợi tiểu
mạnh, làm vững bền mao mạch. Tinh dầu Diếp cá có tác dụng kháng viêm, kháng
khuẩn mạnh.
Ở Trung Quốc, người ta nhổ cây Diếp cá vào mùa hè và thu hoạch rửa sạch rồi
phơi khô. Những người nguyên khí hư, có chứng đau chân không nên dùng. Những
người không phải thấp nhiệt và sang độc cũng không nên dùng. Dùng bên ngoài trị
ung nhọt, sưng, vết thương da lở, đắp bó làm xương gãy mau lành. Nấu Diếp cá với
thịt heo uống vào mùa xuân để xổ lãi. Lá Diếp cá sắc nước rẩy để cây bông vải, lúa
kiều mạch khỏi bị dòn úa.
Diếp cá theo dân Đông Dương tin tưởng và kinh nghiệm dùng nhiều thế kỷ là có
tính dược mát, tán khí, trị kiết lị, sởi. Nghiền nhỏ lá đắp vào các chỗ bầm dập và trên
mí mắt trị đỏ mắt, lá còn trị mề đay. Hoa Diếp cá dùng để trục hài nhi chết trong bụng.
( />Chuyên ngành Vi sinh vật học
6
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học
Trường Đại học Cần Thơ
Theo nghiên cứu của y khoa hiện đại, trong cây Diếp cá có chất decanoylacetaldehyde mang tính kháng sinh. Loại rau này có tác dụng kháng khuẩn như ức chế
tụ cầu vàng, liên cầu, phế cầu, trực khuẩn bạch hầu, E.coli, trực khuẩn lỵ, xoắn khuẩn
leptospira. Nó cũng có tác dụng đối với virus sởi, herpes, cúm và cả HIV, do tác động
vào vỏ bọc protein của virus. Diếp cá còn diệt ký sinh trùng và nấm.
Cũng theo Tây y, Diếp cá giúp lợi tiểu do tác dụng của chất quercitrin, làm chắc
thành mao mạch, chữa trĩ do tác dụng của chất dioxy-flavonon. Ngoài ra, nó còn có tác
dụng lọc máu, giải độc, giải nhiệt, kháng viêm, tăng sức miễn dịch của cơ thể.
Một nghiên cứu tại Viện đại học Y dược Toyama, Nhật Bản, đã cho thấy tác
dụng chống oxy-hóa của 12 loại dược thảo và hợp chất được chiết xuất từ chúng. Diếp
cá là một trong 4 cây có tác dụng chống oxy hóa mạnh nhất.
Theo một nghiên cứu của Đại học Y khoa Koahsiung, Đài Loan, Diếp cá có tác
dụng ức chế đáng kể đối với sự sinh sản của virus Herpes simplex. Nó được xem là
dược thảo chữa trị bệnh này. Đại học Koahsiung cũng phát hiện diếp cá có tác dụng
ngăn chặn 5 dòng tế nào ung thư máu.
Một số nghiên cứu khác cho thấy Diếp cá có tác dụng chống viêm xoang kinh
niên và polyp, làm tăng tưới máu sau phẫu thuật. Chất Houttuynin bisulphat natri chiết
xuất từ nó có thể điều trị viêm tuyến vú. ( />2.3
Vi khuẩn nội sinh
2.3.1 Sơ lược về vi khuẩn nội sinh
Vi khuẩn nội sinh có mặt trong nhiều loại cây trồng và thực vật hoang dại,
chúng xâm nhập vào mô thực vật xuyên qua vùng rễ theo nhiều cách: bám ở bề mặt rễ
và tìm cách chui vào rễ chính hay rễ bên, thông qua lông hút, giữa các tế bào nhu mô
rễ hay biểu bì rễ để sống như: Azotobacter, Bacillus, Gluconacetobacter,
Pseudomonas, Azoarcus, Burkholderia, Campylobacter, Herbaspirillum, Derxia,
Paenibacillus (Elmerich, 2007). Tuy nhiên nó cũng có thể xâm nhập vào các mô
xuyên qua khí khổng hay các vị trí tổn thương của lá (Roos và Hattingh, 1983). Sau
khi xâm nhập vào cây chủ , các vi khuẩn nội sinh có thể tập trung tại vị trí xâm nhập
hay phát tán khắp nơi trong cây đến các tế bào bên trong, di vào các khoảng trống gian
bào hay vào trong hệ mạch (Zinniel et al, 2002). Mật số của quần thể vi khuẩn nội sinh
Chuyên ngành Vi sinh vật học
7
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học
Trường Đại học Cần Thơ
rất biến thiên, phụ thuộc chủ yếu vào loài vi khuẩn và kiểu di truyền của cây chủ,
nhưng cũng phụ thuộc vào giai đoạn phát triển của cây chủ và các điều kiện môi
trường (Pillay và Nowak, 1997).
Một số nhóm vi khuẩn nội sinh không gây hại hay gây bệnh đối với cây chủ mà
nhiều loài còn có khả năng tổng hợp IAA, cố định đạm từ không khí và hòa tan lân
khó tan, kích thích cây tăng trưởng và làm tăng năng suất cây trồng
(Muthukumarasamy et al, 2002). Một số dòng đã mang lại hiệu quả cao trong kiểm
soát bệnh của cây, nhất là hạn chế nguồn bệnh trong đất như Fusarium oxysporum,
Gaeumannomyces graminis, Pythium spp.,
Vùng rễ là nơi tiếp giáp giữa rễ thực vật và đất, là nơi lắng động của các chất hữu
cơ, và là nơi xuất phát của các môi trường sống và các nguồn sống khác nhau cho các
vi sinh vật đất. Thực vật có thể thay đổi vùng rễ của chúng nhờ sự hấp thụ các chất
dinh dưỡng, độ ẩm và oxy từ vùng rễ; và các chất do rễ tiết ra. Đặc tính quan trọng của
các dịch rễ có tỉ lệ C/N cao nên có thể đẩy mạnh sự phong phú của các vi khuẩn cố
định đạm trong vùng rễ. Ngược lại, vi sinh vật vùng rễ có thể ảnh hưởng đến quá trình
sinh trưởng của cây do sự tác động của chúng đến giá trị của các chất dinh dưỡng, sự
phát triển và hình thái của rễ (Rovira et al, 1983; Harari et al, 1988). Các vi khuẩn
vùng rễ làm tăng sự hấp thu dinh dưỡng và sự chuyển hóa các chất trong các cây còn
non.
2.3.2 Sự xâm nhập và nội sinh trong mô thực vật của vi khuẩn nội sinh
Vi khuẩn nội sinh xâm nhập vào bên trong cơ thể (mô) thực vật có thể sống sót
và phát triển bên ngoài môi trường và có thể có nguồn gốc từ những hạt giống và cây
con khi chúng ta phân phối hạt giống từ vùng này sang vùng khác. Chúng nhanh
chóng phát triển trong đất vùng rễ hay bề mặt rễ (Hallmann, 2001), từ đây chúng nhân
mật số và di chuyển vào trong mô thực vật bằng nhiều con đường. Trước hết, vi khuẩn
nội sinh xuất phát từ nguồn nhất định.
a. Nguồn gốc
Qua những kết quả thu được từ thân, lá, hạt, rễ, Mano và Morisaki (2008) cho
rằng nguồn gốc của vi khuẩn nội sinh là đất vùng rễ. Kết hợp nhiều kết quả phân lập vi
khuẩn nội sinh từ rễ cây lúa mì, bông vải, bắp ngọt, bắp đá và cải canola đều kết luận
Chuyên ngành Vi sinh vật học
8
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học
Trường Đại học Cần Thơ
vi khuẩn nội sinh xuất phát từ đất. Vai trò của hạt như là một nguồn của vi khuẩn nội
sinh vẫn là một điều còn tranh cãi (Hallmann et al, 2001).
b. Di chuyển
Theo Hallmann (2001), thường vi khuẩn nội sinh được thu hút hay di chuyển từ
môi trường bên ngoài đến cây chủ bằng cơ chế hóa hướng động hay ngẫu nhiên hoặc
cả hai cơ chế.
Rễ cây tiết ra bên ngoài một số hợp chất như là dưỡng chất để vi khuẩn nội sinh
tìm đến và quần tụ trên bề mặt rễ, ví dụ: vi khuẩn có ích Pseudomonas fluorescens và
Azospirillum brasilense hướng đến rễ lúa mì do rễ lúa mì tổng hợp và phóng thích chất
kích thích tổng hợp (Bashan, 1986). Ngoài ra, sự tiếp xúc ngẫu nhiên với rễ cây do rễ
phát triển để tìm nguồn nước hay dưỡng chất cũng là cơ hội quan trọng để vi khuẩn có
thể tiếp xúc với lông hút của rễ non.
c. Tiếp cận
Một hợp chất trung gian để gắn chặt vi khuẩn nội sinh vào bề mặt rễ là lectins.
Đây là hợp chất rất đặc biệt thường gặp trong các trường hợp vi khuẩn cộng sinh và
giả thiết này cũng được các nhà khoa học đề cập đến. Duijff et al (1997) đã chứng
minh vi khuẩn Pseudomonas fluorescens dòng WCS417r đến bề mặt rễ do một hợp
chất lipo-polysaccharide.
d. Xâm nhập hay xuyên thấu
Theo Hallmann ( 2001), có nhiều con đường chính để vi khuẩn nội sinh xâm
nhập vào bên trong mô thực vật như:
Các lỗ tự nhiên như thủy khổng (Hydathodes), lỗ khí khổng (stomata), lỗ rễ
(lenticels).
Lỗ từ sự ma sát với đất hay vết bệnh, vị trí hình thành rễ ngang (lateral roots).
Vi lỗ (micropores).
Vết thương do tác động vật lý (wounds).
Tuy nhiên con đường quan trọng và có khả năng nhất là vi khuẩn nội sinh xâm
nhập vào bên trong mô thực vật là vết thương và vi lỗ hiện diện khi bắt đầu sự hình
thành lông hút, chính đây là lớp tế bào non rất dễ xâm nhập.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
9
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học
Trường Đại học Cần Thơ
Thêm vào đó, vết bệnh cũng có thể là cửa ngõ cho vi khuẩn xâm nhập vào bên
trong ví dụ như trường hợp vết bệnh từ tuyến trùng và vết nấm bệnh do Rhizotonia
solani
Ngoài ra vi khuẩn có thể tiết ra enzyme cellulase để phá hủy lớp tế bào biểu bì
của rễ non để xâm nhập vào bên trong thực vật như trường hợp vi khuẩn
Gluconacetobacter diazotrophicus. Vi khuẩn xâm nhập vào thẳng bên trong nhu mô rễ
non và chúng vào thẳng những tế bào rễ.
Vi khuẩn có thể xâm nhập vào rễ lúa bằng các rãnh trong các rễ ngang của giống
Sprice, chúng tập trung vào bên ngoài và bên trong vùng nhu mô rễ và các mạch gỗ rồi
từ đây chúng khuếch tán vào thân lúa, chúng được tìm thấy trong các tế bào nhu mô lá.
e. Sinh sản
Mặc dù vi khuẩn nội sinh tập trung hay tiếp cận các địa điểm mà chúng có khả
năng xâm nhập vào bên trong mô thực vật nhưng mật số tương đối thấp chỉ từ 1.000
đến 1.000.000 tế bào/g mô thực vật (Hallmann, 2001), chúng bắt buộc phải sinh sản
một số lượng tương đối lớn trước khi xâm nhập vào bên trong mô thực vật. Sự phân
cắt hay sinh sản vi khuẩn Azoarcus sp. được tìm thấy bên ngoài và cả bên trong nhu
mô rễ lúa và cỏ Kallar (Hurek et al, 1994)
f.
Xâm nhập
Hallmann (2001) tóm tắt sự xâm nhập của vi khuẩn nội sinh vào bên trong mô
thực vật bằng 7 con đường như sau:
- Vi khuẩn nội sinh tập trung và xâm nhập ngẫu nhiên trên bề mặt rễ non.
- Chúng cũng có thể tập trung và xâm nhập bên dưới lớp biểu bì rễ.
- Chúng có thể tập trung và xâm nhập ngay vết thương ở rễ do sự ma sát.
- Vi khuẩn nội sinh có thể tập trung và xâm nhập ngay lỗ mọc các lông hút.
- Chúng tiếp cận đầu lông hút của rễ non để di chuyển vào trong.
- Chúng len lỏi khoảng hở giữa các tế bào rễ.
- Chúng có thể đi theo trong quá trình hấp thu chất dinh dưỡng vào rễ qua con
đường các mạch gỗ.
Nhìn chung, vi khuẩn nội sinh có khả năng tập trung ở những vị trí đã trình bày ở
phần trên là do rễ cây tiết ra những chất dinh dưỡng cần thiết cho vi khuẩn sinh sản.
Beattie và Lindow (1995) cho rằng vi khuẩn nội sinh có thể xâm nhập vào bên trong
Chuyên ngành Vi sinh vật học
10
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học
Trường Đại học Cần Thơ
mô lá nhờ các khẩu của lục lạp, qua con đường này vi khuẩn có đủ khoảng không
thích hợp có đủ oxy cần thiết cho sự sinh trưởng trong điều kiện vi hiếu khí như
khoảng trống chứa khí ở nhu mô rễ lúa mà Rheinold et al (1987) đã phát hiện các vi
khuẩn nội sinh sống tốt.
g. Định cư
Sau khi xâm nhập vào trong nhu mô thực vật, vi khuẩn nội sinh di chuyển đến
các bó mạch gỗ để theo nước từ rễ lên các phần khác trên không của cây. Vi khuẩn nội
sinh cũng có thể tập trung sinh sống và phát triển trong các tế bào nhu mô lá, tế bào
diệp lục. Ở đây chúng có thể phát triển lâu dài hay có thể tiếp tục sinh sản và di
chuyển đến các bộ phận khác của cây.
2.2.3 Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh
Vi khuẩn nội sinh là nhóm vi khuẩn tiền nhân được liên kết với thực vật, một số
nhóm vi khuẩn nội sinh không gây hại cho cây chủ, mà ngược lại còn thúc đẩy sự phát
triển của cây trồng bằng cách sản xuất các chất kích thích sự sinh trưởng của thực vật
và sự cố định đạm từ không khí. Hơn nữa, một số dòng vi khuẩn nội sinh có thể cải
thiện sự phát triển của bệnh và kích thích sự chống chịu của cây trồng đối với sự tác
động của các nhân tố vô sinh và hữu sinh (Hallmann et al, 2001).
a. Khả năng cố định đạm
Các nguồn nitơ có ý nghĩa rất quan trọng đối với sự phát triển của vi sinh vật, nó
là thành phần chính của tất cả các amino acid, cũng như liên kết với protein, cả trong
DNA và RNA. Trong thực vật, hầu hết nitơ hiện diện trong các phân tử chlorophyll –
chất cần thiết cho quá trình quang hợp. Trong không khí có khoảng 78% thể tích là khí
nitơ, tuy nhiên vì đây là khí trơ nên có rất ít loài sinh vật có khả năng sử dụng nguồn
chất dinh dưỡng này. Trong tự nhiên chỉ có nhóm vi sinh vật sơ hạch là vi khuẩn mới
có khả năng sử dụng nitơ. Thông qua hoạt động của các vi sinh vật này, nitơ được
chuyển hóa thành dạng dễ tiêu mà cây trồng cố thể sử dụng được. Hằng năm, cây
trồng lấy đi từ đất hàng trăm triệu tấn nitơ. Bằng cách bón phân con người đã trả lại
cho đất khoảng 40% lượng nitơ, phần còn lại được bổ sung do hoạt động của các vi
sinh vật. Vì vậy việc nghiên cứu, sử dụng nguồn đạm này đóng vai trò rất quan trọng
trong nền nông nghiệp nước ta, đặc biệt là trong tình hình môi trường đang bị ô nhiễm
như hiện nay. Con người và cây trồng không có khả năng đồng hóa nguồn N2 tự nhiên
Chuyên ngành Vi sinh vật học
11
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học
Trường Đại học Cần Thơ
này. Hơn nữa, liên kết N≡N rất bền vững, muốn tạo thành các hợp chất vô cơ cần phải
sử dụng nguồn năng lượng rất lớn. Tuy nhiên, trong tự nhiên tồn tại một số vi sinh vật
có khả năng biến N2 thành NH3 hữu ích cho cây mà cần rất ít năng lượng (3 – 5
kcal/M). Quá trình cố định đạm bằng con đường sinh học này có ý nghĩa rất to lớn đối
với cân bằng lượng N2 trên trái đất và duy trì độ phì nhiêu của đất.
Các quá trình cố định nitơ tự do thường cần nhiệt độ và áp suất cao. Tuy nhiên,
trong công nghiệp, nhờ các chất xúc tác nên năng lượng dùng cho quá trình cố định
nitơ được giảm nhiều, còn khoảng 16 – 20 Kcalo/M.
Trong tự nhiên, cố định đạm sinh học xảy ra trong khí quyển được chuyển thành
NH3 nhờ enzyme nitrogenase và thường tiêu tốn năng lượng:
N2 + 8H+ + 8e- + 16ATP 2NH3 + H2 + 16ADP + 16Pi
Enzyme nitrogenase thường gồm 2 thành phần: một thành phần gọi là Mo –
protein có trọng lượng phân tử khoảng 60.000 và một thành phần khác gọi là Mo – Fe
– protein có trọng lượng phân tử khoảng 220.000 và gồm 2 tiểu phần đã được kết tinh
tinh khiết.
Các vi sinh vật cố định đạm trong tế bào vi khuẩn hay vi khuẩn lam đều nhờ đến
hệ thống gen nif, điều khiển quá trình tổng hợp enzyme nitrogenase. Enzyme này dễ bị
phá hủy bởi oxy. Nhiều vi khuẩn ngừng sản xuất enzyme này trong sự hiện diện của
oxy. Nhiều vi sinh vật cố định đạm chỉ tồn tại trong điều kiện kỵ khí, vi hiếu khí hoặc
ràng buộc oxy với một protein như leghemoglobin.
Quá trình cố định nitơ được tiến hành theo 2 con đường: con đường khử và con
đường oxy hóa:
- Con đường khử:
N2
HN=NH
H2N-NH2
NH3
NH4OH
- Con đường oxy hóa:
N2
N2 O
(HNO)2
NH4OH
Qua đó ta nhận thấy được:
- Nếu nồng độ oxy cao sẽ ức chế quá trình cố định nitơ.
- Hiệu suất cố định nitơ của các vi sinh vật kỵ khí thường cao hơn các vi sinh
vật hiếu khí.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
12
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học
Trường Đại học Cần Thơ
b. Khả năng hòa tan lân khó tan
Lân (P) là một trong những chất dinh dưỡng đa lượng thiết yếu nhất cần cho sự
sinh trưởng và phát triển của cây trồng (Illmer và Schinner, 1992). Nhìn chung, lân sẵn
có trong đất cần cho sự sinh trưởng thực vật thấp, hàm lượng lân trung bình trong đất
khoảng 0,05% (w/w) nhưng chỉ có 0,1% hàm lượng lân tổng số là có giá trị cho cây
(Zou et al, 1992).
Việc thiếu lân ở đất là một trong những nhân tố quan trọng nhất ở đất hạn chế sự
sinh trưởng của thực vật, vì vậy để đạt năng suất thực vật tối đa người ta thường dùng
các dạng phân lân dễ tan để bón cho cây . Tuy nhiên, các dạng có thể hòa tan của phân
lân khi bón vào đất lại dễ dàng bị kết tủa thành các dạng không hòa tan được như là:
CaHPO4, Ca3(PO4)2 nên cây khó hấp thụ (Omar, 1998) và dẫn đến việc bón phân lân
vượt quá mức đối với cây trồng. Việc bón phân lân vượt quá giới hạn cho phép là một
trong những nguyên nhân gây ra ô nhiễm môi trường, làm đất bị hoang hóa hay xói
mòn, đồng thời cũng gây ra các vấn đề về kinh tế.
Cơ chế của quá trình phân giải phosphate đến nay vẫn chưa được hiểu đầy đủ và
còn nhiều tranh cãi. Sản sinh acid hữu cơ có thể là nguyên nhân chủ yếu, song CO2,
H2S, acid, kiềm cũng là các yếu tố được nhiều nhà nghiên cứu đề cập đến. Các vi sinh
vật phân giải hợp chất phospho khó tan được biết đến nay là các loại: Pseudomonas,
Micrococus, Bacillus, Flavobacterrium, Penicilium, Sclelotium, Aspergillus. Các sinh
vật này không chỉ phân giải phosphate canxi mà cả phosphate nhôm, sắt, mangan và
các dạng khác, kể cả quặng. Vi sinh vật không chỉ chuyển hóa phosphate vô cơ, mà
còn có khả năng khoáng hóa các hợp chất lân hữu cơ tạo ra sản phẩm mà cây trồng có
thể hấp thu được.
c. Đối kháng sinh học
Vi khuẩn nội sinh có thể có khả năng làm yếu đi hay ngăn cản tác hại của các vi
sinh vât gây hại; điều này có thể dân đến hiện tượng gia tăng kháng bệnh hay kích
kháng. Nhiều thí nghiệm đã chứng minh vai trò của vi khuẩn nội sinh trong việc ngăn
chặn sự tác hại của nấm Fusarium oxysporum f. sp. Vasinfectum trên bông vải (Chen
et al, 1995); Fusarium oxysporum f. sp. pisi trên đậu pea (Benhamou et al, 1996); nấm
Verticillium albo-atrum và Rhizoctonia solani trên khoai tây (Nowak et al, 1995);
Chuyên ngành Vi sinh vật học
13
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học
Trường Đại học Cần Thơ
Rhizoctonia solani trên khoai tây (Pleban et al, 1995) và lúa (Krishnamurthy và
Gnanamnickam, 1997)… Chất kháng sinh đã được tìm thấy trên vi khuẩn nội sinh
phân lập từ khoai tây chống lại nấm Fusarium sambucinum, F. avenaceum, F.
oxysporum, Rhizotonia solani và từ bắp chống lai nấm Fusarium miniliformis (Hinton
và Bacon, 1995).
2.2.4 Các nhóm vi khuẩn nội sinh thường gặp
Theo nghiên cứu khoa học của các nhà khoa học Trung Quốc, hiện nay người ta
đã phân lập được trên dưới 200 dòng vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá như
Azospirillum, Klebsiella…nhưng trong đó phải kể đến 2 chi có khả năng kháng khuẩn
đó là Bacillus và Pseudomonas.
a. Vi khuẩn Bacillus
Vi khuẩn Bacillus là những vi khuẩn Gram dương, có nội bào tử hình ovan có
khuynh hướng phình ra ở một đầu. Bacillus được phân biệt với các loài vi khuẩn sinh
nội bào tử khác bằng hình dạng tế bào hình que, sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí
hoặc kỵ khí không bắt buộc. Tế bào Bacillus có thể đơn hoặc chuỗi và chuyển động
bằng tiêm mao. Nhờ khả năng sinh bào tử nên vi khuẩn Bacillus có thể tồn tại trong
thời gian rất dài dưới các điều kiện khác nhau và rất phổ biến trong tự nhiên nên có thể
phân lập từ rất nhiều nguồn khác nhau như đất, nước, trầm tích biển, thức ăn, sữa,...
nhưng chủ yếu là từ đất nơi mà đóng vai trò quan trọng trong chu kỳ C và N.
Tất cả các loài thuộc chi Bacillus đều có khả năng dị dưỡng và hoại sinh nhờ sử
dụng các hợp chất hữu cơ đa dạng như đường, acid amin, acid hữu cơ,... Một vài loài
có thể lên men carbohydrat tạo thành glycerol và butanediol; một vài loài như
Bacillus megaterium thì không cần chất hữu cơ để sinh trưởng, một vài loài khác thì
cần acid amin, vitamin B. Hầu hết đều là loài ưa nhiệt trung bình với nhiệt độ tối ưu là
30 -45oC, nhưng cũng có nhiều loài ưa nhiệt với nhiệt độ tối ưu là 65oC .
Đa số Bacillus sinh trưởng ở pH = 7, một số phù hợp với pH = 9-10 như
Bacillus alcalophillus, hay có loại phù hợp với pH = 2-6 như Bacillus acidocaldrius.
Bacillus có khả năng sản sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulase…),
do đó chúng được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp, trong bảo vệ môi trường, …
Sau đây là một số loài Bacillus thường gặp trong tự nhiên:
Chuyên ngành Vi sinh vật học
14
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
