GENETICS OF NEPHROTIC SYNDROME IN SINGAPORE PAEDIATRICS PATIENTS

GENETICS OF NEPHROTIC SYNDROME IN  
SINGAPORE PAEDIATRICS PATIENTS 

 
 
 
NG JUN LI 
(BSC), NUS 
 
 
A THESIS SUBMITTED FOR THE  
DEGREE OF MASTERS OF SCIENCE 
 
 
DEPARTMENT OF PAEDIATRICS 
NATIONAL UNIVERSITY OF SINGAPORE 
 
 
 
2012 
 

 
 
 
 

 
 

Acknowledgements 
I would like to express my thankfulness to: 
My supervisor, Professor Yap Hui Kim, for her guidance throughout these years. 
 
My co‐supervisor, Associate Professor Heng Chew Kiat, for his statistical advices. 
 
Dr Ng Kar Hui, for her continuous help and support. 
 
Dr Isaac Liu and Dr U Mya Than, for their help in collecting the clinical data of the 
patients. 
 
Dr Leow Koon Yeow, for his technical advices on the use of high resolution melting for 
screening. 
 
Chan Chang Yien, Joni, Chong, Liang Ai Wei, Lauretta Low, Sun Zijin, Seah Ching Ching 
and Toh Xue Yun, for their company and help that they provided. 
 
My family for their continuous support and encouragement. 
 
This work was supported by grants NKFRC/2007/09 from National Kidney Foundation 

 

and NMRC IRG07 May 104 from the National Medical Research Council, Singapore.

i 
 


Table of contents 

1. 

Introduction ................................................................................................................ 1 
1.1.  Nephrotic syndrome ............................................................................................ 1 
1.1.1. 

Epidemiology and histological features of childhood NS ............................. 1 

1.1.2. 

Clinical course of childhood NS ..................................................................... 3 

1.1.3. 

Pathogenesis of nephrotic syndrome ........................................................... 7 

1.2.  Podocytes: Their role in nephrotic syndrome .................................................... 11 
1.2.1. 

The slit diaphragm ...................................................................................... 12 

1.2.2. 

Cytoskeletal proteins .................................................................................. 18 

1.2.3. 

Cell matrix adhesion complexes ................................................................. 19 

1.2.4. 

Podocytes and Nephrotic syndrome .......................................................... 20 

1.3.  Genetics of nephrotic syndrome ........................................................................ 22 
1.3.1. 

NPHS1: The gene encoding for nephrin ...................................................... 28 

1.3.2. 

NPHS2: The gene encoding for podocin ..................................................... 32 

1.3.3. 

The two closely related partners: NPHS1 and NPHS2 ................................ 39 

1.4.  Gaps in current knowledge ................................................................................ 43 
1.5.  Objectives of the study ...................................................................................... 44 
2. 

Methods and Materials ............................................................................................. 46 
2.1.  Study Subjects .................................................................................................... 46 
ii 

 


2.2.  Data collection.................................................................................................... 47 
2.3.  Genomic DNA (gDNA) extraction ....................................................................... 48 
2.4.  Primer design and melting domain analysis ...................................................... 48 

2.5.  PCR amplification ............................................................................................... 53 
2.6.  High Resolution Melting ..................................................................................... 54 
2.7.  Direct Sequencing .............................................................................................. 55 
2.8.  Genotyping by tetra‐primers ARMS PCR ............................................................ 56 
2.9.  Genotyping by RFLP ........................................................................................... 60 

3. 

2.10. 

Statistical analysis ........................................................................................... 62 

2.11. 

Prediction of the effect of the genetic variants ............................................. 63 

2.12. 

Protein sequence alignment ........................................................................... 64 

Results ....................................................................................................................... 66 
3.1.  Clinical Characteristics ........................................................................................ 66 
3.2.  Genetic variants in NPHS1 .................................................................................. 69 
3.2.1. 

Screening for variants in NPHS1 using HRM ............................................... 69 

3.2.2. 

Statistical analysis of the genetic variants in NPHS1 .................................. 74 

3.2.3. 

Prediction of the effect of the genetic variants .......................................... 81 

3.3.  Genetic variants in NPHS2 .................................................................................. 85 
3.3.1. 

Screening of NPHS2 using direct sequencing ............................................. 85 
iii 

 


3.3.2. 

Statistical analysis of the genetic variants in NPHS2 .................................. 87 

3.3.3. 

Prediction of the effect of the genetic variants .......................................... 91 

3.4.  Phenotype‐genotype associations ..................................................................... 93 
3.5.  Analysis of composite genotypes of genetic variants in NPHS1 and NPHS2 ..... 97 
3.6.  Contribution of rare alleles to nephrotic syndrome ........................................ 101 
4. 

Discussion................................................................................................................ 112 
4.1.  Polymorphisms and their association with nephrotic syndrome .................... 114 
4.2.  Phenotype‐genotype correlations of the genetic variants .............................. 118 

4.3.  Gene‐gene interaction of NPHS1 and NPHS2 .................................................. 120 
4.4.  Contribution of rare variants to nephrotic syndrome ..................................... 122 

5. 

Conclusion ............................................................................................................... 127 

6. 

Reference ................................................................................................................ 128 

 
 

 

iv 
 


Summary  
Background 
Nephrotic syndrome (NS) is the most common glomerulonephritis in childhood, 20% of 
which  are  steroid‐resistant.  Mutations  in  podocyte‐related  genes  have  been  shown  to 
cause  idiopathic  NS  in  Caucasian  populations,  whereas  Asian  studies  are  lacking.  The 
aims  of  this  study  are  firstly  to  identify  genetic  variants  in  nephrin(NPHS1)  and 
podocin(NPHS2), two important podocyte‐associated genes, in paediatric patients with 
idiopathic NS in Singapore, secondly to determine the presence of disease associations 
with  these  genetic  variants,  and  lastly  to  investigate  if  there  are  any  gene‐gene 
interactions.  

 
Methods 
Genetic  screening  of  NPHS1  and  NPHS2  was  performed  on  121  patients  (97Chinese, 
24Malays) with disease onset at a mean age of 5.69±4.43 years. High Resolution Melting 
was used to detect genetic variants in NPHS1, and these were validated by bi‐directional 
sequencing. Direct sequencing was used to detect genetic variants in NPHS2. All genetic 
variants  identified  were  genotyped  in  cord  blood  controls  (125Chinese;  96Malays)  by 
Restriction  Fragment  Length  Polymorphism,  Tetra‐primer  Amplification  Refractory 
Mutation  System  PCR  and  sequencing.    Data  from  the  Singapore  Genome  Variation 
Project  involving  healthy  individuals  (96Chinese;  89Malays)  and  SNP  arrays  from  the 
Genome  Institute  of  Singapore  involving  1682  Chinese  controls  were  used  for  our 
analysis.  Statistical  analysis  was  performed  using  SNPstats  and  SPSS  v17.  Multiple 
v 
 


logistic  regression  analysis  (codominant,  dominant,  recessive  and  log‐additive  models) 
was done to determine the significance of genetic variants and phenotype associations. 
Computer  prediction  programs  were  used  to  predict  the  functional  effects  of  these 
genetic variants. 
 
Results 
Sixteen  genetic  variants  in  NPHS1  were  found  in  our  cohort  of  nephrotic  patients,  of 
which  5  was  novel.  c.294C>T,  and  c.2289C>T  were  significantly  associated  with  NS  in 
both  Chinese  and  Malay  patients,  whereas  c.349G>A  was  significantly  associated  with 
NS in only Chinese patients. c.349G>A resulted in an amino acid substitution of glutamic 
acid  to  lysine  at  position  117.  c.294C>T,  c.349G>A  and  c.2289C>T  have  been  found  to 
affect the ESE and/or ESS sites. 
 
We found 8 genetic variants in NPHS2, of which 1 was novel. In our Chinese patients, c.‐

51G>T was significantly associated with NS. c.288C>T was observed to have a protective 
effect  against  NS,  whereas  c.‐51G>T  and  c.1038A.G  were  associated  with  steroid 
resistance. c.1038A>G was also associated with cyclosporine resistance.   
 
Binary  logistic  regression  showed  that  the  composite  genotypes  of  GG/CC/CT  and 
GT/CC/CT  for  NPHS2  c.‐51G>T  and  c.288C>T  and  NPHS1  c.2289C>T  were  significantly 
associated  with  NS.  The  composite  genotypes  of  GG/CC/TT  and  GT/CC/CC  were  also 
associated with steroid resistance. 
vi 
 


Additionally,  we  have  shown  a  significant  accumulation  of  rare  variants  in  nephrotic 
patients  compared  to  controls,  and  also  in  nephrotic  patients  with  poor  prognosis 
compared to those who responded well to therapy. 
 
Conclusion 
Genetic  variants  in  podocyte‐related  genes  were  present  in  paediatric  patients  with 
idiopathic  NS  in  Singapore,  and  they  occurred  at  frequencies  which  differed  from 
Caucasian populations. Phenotype association studies implicated NPHS2 polymorphisms 
with  steroid  and  cyclosporine  resistance,  whereas  rare  variants  accumulation  was 
associated  with  poor  prognosis.  Additionally,  gene‐gene  interactions  between  NPHS1 
and NPHS2 were observed in our nephrotic population. Functional studies are required 
to better understand the mechanisms of the genetic variants in the pathogenesis of NS.  
 

 

vii 
 

List of Tables 
Table 1: Summary of genetic involvement in pathogenesis of nephrotic syndrome. ...... 24 
Table 2: NPHS1 and NPHS2 genetic variants identified in familial and sporadic nephrotic 
syndrome. ................................................................................................................. 25 
Table 3: Primers used for the screening of NPHS1 using HRM. ....................................... 50 
Table 4: Primers used for the screening of NPHS2 using direct sequencing. ................... 52 
Table 5: Primers used in tetra‐ARMS PCR for the genotyping of NPHS1 SNPs. ............... 58 
Table 6: Restriction enzymes used for the genotyping of NPHS1 SNPs. .......................... 61 
Table 7: General characteristics of Chinese and Malay patients with idiopathic sporadic 
nephrotic syndrome and/or FSGS. ............................................................................ 68 
Table 8: Genetic variants identified in NPHS1 using HRM. ............................................... 70 
Table 9: Allele frequencies of NPHS1 SNPs in Chinese (n=97). ......................................... 77 
Table 10: Genotype frequency for NPHS1 SNPs in Chinese (n=97). ................................. 77 
Table 11: Association analysis of NPHS1 genotypes with nephrotic syndrome in Chinese.
 ................................................................................................................................... 78 
Table 12:Allele frequencies of NPHS1 SNPs in Malay (n=24). .......................................... 79 
Table 13: Genotype frequencies of NPHS1 SNPs in Malay (n=24). .................................. 79 
Table 14: Association analysis of NPHS1 genotypes with nephrotic syndrome in Malay 
(n=24). ....................................................................................................................... 80 
Table 15: Prediction of the effect of amino acid substitution of the various genetic 
variants on the protein using SIFT and PolyPhen2. .................................................. 82 
Table 16: Effect of the individual NPHS1 SNPs on ESE/ESS sites. ..................................... 84 
Table 17: Genetic variants identified in NPHS2 using direct sequencing. ........................ 85 
viii 
 


Table 18: Allele frequencies of NPHS2 variants in Chinese (n=97). .................................. 89 

Table 19: Genotype frequencies of NPHS2 variants in Chinese (n=97). ........................... 89 
Table 20: Association analysis of c.‐51G>T and c.288C>T in Chinese patients (n=97). .... 90 
Table 21: Effect of the individual NPHS2 SNPs on ESE/ESS sites. ..................................... 92 
Table 22: Genotype‐phenotype association in Chinese patients for NPHS2. .................. 95 
Table 23: Allele frequencies for NPHS2 SNPs with phenotype‐genotype associations in 
Chinese patients. ....................................................................................................... 96 
Table 24: Composite genotype analysis of patients, with race as co‐variant. ................. 98 
Table 25: Composite genotype analysis for SRNS patients, with race as co‐variant...... 100 
Table 26: Rare NPHS1 and NPHS2 variants identified in NS patients and their minor allele 
frequencies in patients and controls. ..................................................................... 102 
Table 27: Non‐synonymous NPHS1 and NPHS2 rare variants identified in nephrotic 
syndrome patients and their predicted effects ...................................................... 103 
Table 28: Rare variants accumulation in nephrotic syndrome patients and controls ... 104 
Table 29: Accumulation of rare variants in patients with poor prognosis. .................... 106 
Table 30: Clinical characteristics of patients with rare variants. .................................... 107 
 

ix 
 


List of Figures 
Figure 1: Histology of the glomerulus in (A) MCNS and (B) FSGS (Periodic acid‐Shiff stain).
 ..................................................................................................................................... 2 
Figure 2: MCNS and FSGS are the most common histological patterns seen in steroid‐
resistant nephrotic syndrome. .................................................................................... 5 
Figure 3: The glomerular filtration barrier. ......................................................................... 9 
Figure 4: Distribution of the histological profile in the nephrotic patients. ..................... 69 
Figure 5:  Normalized high resolution melting curves and the corresponding difference 
plots. .......................................................................................................................... 71 

Figure 6: Electrophoretograms of the various genetic variants. ...................................... 72 
Figure 7: Genotyping results of c.2289C>T and c.3315A>G. ............................................ 73 
Figure 8: Electrophoretograms of the various genetic variants. ...................................... 86 
Figure 9: Pedigree of Patient 94. .................................................................................... 111 
 
 
 

  
 

 

x 
 


List of Abbreviations 
ACTN4  

Alpha actinin 4 

AIC 

Akaike Information 

 

ARMS   

Amplification refractory mutation system 

CD2AP  

CD2‐associated proteins 

CNF 

 

Congenital nephrotic syndrome of the Finnish type 

CNI 

 

Calcineurin inhibitors 

CNS 

 

Congenital nephrotic syndrome 

CsA 

 

Cyclosporine  

DAG   

Diacylglycerol 

DMS   

Diffuse mesangial sclerosis 

EDTA   

Ethylenediaminetetraacetic 

ESE 

 

Exon splicing enhancer 

ESRD   

End stage renal disease 

ESS 

 

Exon splicing silencer 

FGS 

 

Focal global sclerosis 

FMPGN 

Focal mesangial proliferative glomerulonephritis 

FSGS   

Focal segmental glomerulosclerosis 

GBM   

Glomerular basement membrane 

gDNA   

Genomic DNA 

HRM    

High resolution melting 

IP3 

Inositol 1,4,5‐triphosphate 

 

xi 
 


IQGAP‐1 

IQ motif–containing GTPase‐activating protein 1 

ISKDC   

International Study of Kidney Diseases in Children 

MCNS   

Minimal change nephrotic syndrome 

MPGN   

Membranoproliferative glomerulonephritis 

NS 

Nephrotic syndrome 

 

NUH   

National University Hospital of Singapore 

PCR 

 

Polymerase chain reaction 

PFS 

 

Potentially Functional SNP 

PI3K   

Phosphoinositide 3‐OH kinase 

RFLP   

Restriction fragment length polymorphism 

Rs number 

RefSNP accession ID 

SD 

Slit diaphragm 

 

SDNS   

Steroid dependent nephrotic syndrome 

SGVP   

Singapore Genome Variation Project 

SIFT 

 

Sorting intolerant from tolerant 

SNP 

 

Single nucleotide polymorphism  

SRNS   

Steroid resistant nephrotic syndrome 

SSNS   

Steroid sensitive nephrotic syndrome 

suPAR   

Serum soluble urokinase receptor 

TRP 

 

Transient receptor potential 

USF 

 

Upstream stimulatory factor 

 
xii 
 


List of Appendices 
Appendix I: Clinical characteristics and genotype profile of the patients……………………146 
Appendix II: Hardy‐Weinberg Results for NPHS1 and NPHS2 variants………………………..158 
Appendix III: Linkage disequilibrium results for NPHS1 and NPHS2 variants……………….163 
Appendix IV: Protein sequence alignment for nephrin and podocin…………………………..167 
 
 
 

 
 

 

xiii 
 


List of conference abstracts and awards 
6th Congress of Asian Society for Paediatrics Research, Taipei, 2010 
Title: Comparison of NPHS2 polymorphisms and their associations with end‐stage renal 
disease in Chinese and Malay children. 
Award: Best Poster Award 
 
11th Asian Congress of Paediatrics Nephrology, Fukuoka, 2011 
Title: Nephrin gene variants may account for ethnic differences in susceptibility to 
sporadic Nephrotic Syndrome in Singapore children. 
Award: Travel grant 
 
8th Congress of Asian Society for Paediatrics Research, Seoul, 2012 
Title: Multiple Rare Alleles in Nephrin and Podocin Contribute to Poor Prognosis in 
Childhood Nephrotic Syndrome in Singapore. 
Nominated for Young Investigator Award 

xiv 
 


1. Introduction 
1.1. Nephrotic syndrome 
Nephrotic  syndrome  (NS)  is  a  common  cause  of  kidney  disease  in  children.    It  is 

characterized  by  heavy  proteinuria,  hypoalbuminaemia,  oedema  and  hyperlipidaemia 
(Yu et al., 2005). There have been various definitions used to describe nephrotic‐range 
proteinuria,  including  urinary  protein  excretion  ≥3  g/day/1.73m2  or  a  spot  urinary 
protein:creatinine ratio ≥0.2 g/mmol (Yap and Lau, 2008). 
 
NS in children can be congenital, which is presented at birth or during first 3 months of 
life,  or  presented  in  later  part  of  their  life.  Childhood  NS  is  due  to  either  primary  or 
secondary causes. Some examples of primary causes are genetic disorders or defects in 
the  glomerular  filtration  barrier.  Infections,  drug  usage  and  immunological  or  allergic 
disorders are some of the secondary causes of childhood NS (Eddy and Symons, 2003). 
In this literature review, the main focus would be primary NS in children. 
 
1.1.1. Epidemiology and histological features of childhood NS 
The  reported  incidence  of  idiopathic  NS  is  2  to  7  cases  per  100  000  children.  It  has  a 
prevalence of approximately 16 cases per 100 000 (Eddy and Symons, 2003).  The two 
distinct  histological  features  of  primary  idiopathic  NS  in  children  are  minimal  change 
nephrotic syndrome (MCNS), and focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) (Figure 1).  
 
 
1 
 


 
Fiigure 1: Histtology of the
e glomerulus in (A) MCN
NS and (B) FFSGS (Period
dic acid‐Shifff 
sttain). 
 

MCNS, 
M
which
h  is  characte
erized  by  minor 
m
morphhological  alteration  in  p
podocytes,  is  the 
most 
m
commo
on  pathologiical  type  in  childhood  nnephrotic  syyndrome.    (Zhu  et  al.,  2
2009, 
Laahdenkari  et  al.,  2005).  On  light  microscopy, 
m
tthe  glomeru
ulus  for  MCN
NS  looks  no
ormal, 
whereas 
w
elecctron  microscopy  show
ws  the  preseence  of  efffacement  off  the  glomeerular 
epithelial foo
ot processes during relap
pses of the ddisease (Kum
mar et al., 20
003) 
 
FSSGS  is  characterized  byy  a  commo

on  pattern  oof  glomerulaar  injury  that  is  defineed  by 
se
egmental sclerotic lesions invading  a populatioon of glomerruli (Tsukagu
uchi et al., 2
2002). 
This  is  often  associated  with  tubulaar  scarring  aand  interstittial  fibrosis.  Five  varian
nts  of 
FSSGS  have  been  defined
d  according  to  their  paathology:  co
ollapsing,  ceellular,  tip  leesion, 
perihilar and  not‐otherw
wise‐specified
d (Thomas eet al., 2006)).  FSGS is also an impo
ortant 
mary nephrottic syndrome in adults. FFSGS carriess a poor proggnosis with more 
caause of prim
th
han 25% of cchildren and
d adults proggressing to eend stage reenal diseasee (ESRD) in w
within 
five years of  onset of NSS (McKenzie  et al., 20077). It has beeen observed
d that there  is an 

2 
 


increased incidence of FSGS in both children and adults, especially in black individuals in 
the United States (Eddy and Symons, 2003, Mollet et al., 2009).  
 

1.1.2. Clinical course of childhood NS 
Steroids are the mainstay of therapy for children with NS. The initial steroid treatment is 
prednisone 60 mg/m2 per day for 4 weeks, with the maximum dosage to be 80mg. This 
is followed by prednisone 40 mg/m2 on alternate days for 4 weeks, with a steroid taper 
over  3  to  6  months  (Eddy  and  Symons,  2003).  Steroid  sensitive  nephrotic  syndrome 
(SSNS) is defined as patients being able to enter remission in response to corticosteroid 
treatment alone. Steroid resistant nephrotic syndrome (SRNS) is the inability to induce 
remission  after  8  weeks  of  corticosteroid  treatment.    Steroid  dependent  nephrotic 
syndrome  (SDNS)  is  the  initial  response  to  corticosteroid  treatment  by  entering 
complete remission but the development of relapse either while still receiving steroids 
or  within  2  weeks  of  discontinuation  of  treatment  following  a  steroid  taper.  Patients 
with  SDNS  require  the  continued  low‐dose  treatment  with  steroids  to  prevent 
development of relapse (Gbadegesin and Smoyer, 2008).  
 
A  multicenter  International  Study  of  Kidney  Diseases  in  Children  (ISKDC)  study  was 
performed on more than 521 children with idiopathic NS in the late 70s and early 80s.  
The  study  revealed  that  approximately  80%  of  children  with  idiopathic  NS  respond  to 
steroid therapy. Steroid responsiveness was observed in 93% of the children with MCNS, 
compared to only 30% of children with FSGS (Gbadegesin and Smoyer, 2008).  
3 
 


Twenty percent of children with NS are resistant to steroid therapy. They fail to respond 
to  corticosteroids  (Schwaderer  et  al.,  2008).  According  to  the  study  by  ISKDC,  for  the 
103  children  who  were  steroid‐resistant,  MCNS,  FSGS  and  membranoproliferative 
glomerulonephritis  (MPGN)  were  the  most  prevalent  lesions  present,  each  accounting 
for approximately 25% of the histological findings (ISKDC, 1981) (Figure 2). In Singapore, 
renal biopsies of 47 children with SRNS showed that MCNS (30%) and FSGS (49%) were 
the  two  main  causes  of  SRNS  (Yap,  2005)  (Figure  2).  The  prognosis  for  children  with 

SRNS is often poor. They usually rapidly progress to end stage renal disease within 10 
years from diagnosis (Kitamura et al., 2006, Schultheiss et al., 2004).  These children are 
also more prone to more complicated clinical and therapeutic course, which will result 
in ESRD in 30 to 40% (Schwaderer et al., 2008) . 
 
 
 

4 
 


 
Fiigure 2: MC
CNS and FSG
GS are the m
most commo
on histologiccal patternss seen in steeroid‐
re
esistant nep
phrotic syndrome.  
CGN:  Chronicc  glomerulonephritis.  DMH: 
D
Diffusee  mesangial  hypercellullarity.  FGS:  Focal 
global  glome
erulosclerosis.  FSGS:  Focal  segmenttal  glomeru
ulonephritis.  MCNS:  Min
nimal 
ch
hange  neph

hrotic  syndrrome.  Mem
mbGN:  Mem
mbranous  glomerulonep
phritis.  MessPGN: 
Mesangial 
M
proliferativve  glomerulonephritiis.  MPGN
N:  Membranoproliferrative 
glomerulonep
phritis.  
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 

5 
 


Despite  the  fact  that  most  patients  with  MCNS  are  steroid  sensitive,  the  treatment  of 
MCNS  remains  a  great  challenge  to  nephrologists  as  up  to  70%  of  them  experienced 
frequent  relapses.  Furthermore,  some  patients  could  not  achieve  complete  remission 
with steroid treatment (steroid‐resistant) (Koskimies et al., 1982, Tarshish et al., 1997) 

and  therefore  have  to  be  treated  with  immunosuppressive  drugs  such  as  tacrolimus, 
cyclophoshamide and cyclosporine (Li et al., 2009, Hino et al., 1998, Gulati et al., 2008). 
Nevertheless, the prolonged use of corticosteroids results in adverse side effects such as 
growth  retardation,  obesity,  infections,  hypertension,  osteoporosis  and  cataracts.  In 
addition,  use  of  alternative  drugs  such  as  alkylating  agents  and  calcinuerin  inhibitors 
carry  with  it  the  potential  risk  of  infections,  infertility,  malignancy  and  nephrotoxicity. 
This indicated a need for better therapeutic approaches (Kyrieleis et al., 2009, Hodson 
et al., 2004, Gipson et al., 2009). 
 
Interestingly, there is a small group of patients who responded well to steroids initially 
but later became resistant to steroids in their clinical course. This late steroid resistance 
is a rare phenomenon, and its pathophysiology is still not well studied. Patients with late 
steroid resistance have clinical findings quite similar to that of SSNS rather than SRNS.  
They  also  respond  to  cytostatic  drugs  with  good  prognosis  of  stable  maintenance  of 
renal function (Schwaderer et al., 2008).   
 

6 
 


1.1.3. Pathogenesis of nephrotic syndrome 
The cause of idiopathic NS is usually due to either structural defects or immunological 
imbalance.  
 
Immunology and nephrotic syndrome 
Idiopathic NS was histologically thought to be an immunological disorder. Infections and 
immunological disorders, such as Epstein‐Barr virus infection (Blowey, 1996, Araya et al., 
2006) and Hodgkins’ lymphoma (Peces et al., 1991) which causes lymphadenopathy and 
lymphoproliferation,  were  found  to  be  associated  with  NS.  Efficacy  using 

immunosuppressants to alleviate proteinuria and induce remission further suggested an 
immunologic basis in the pathogenesis of NS.  
 
MCNS  is  hypothesized  to  be  caused  by  immunological  imbalance  as  MCNS  patients 
responded  robustly  to  immunosuppression  and  their  relapse  is  usually  due  to 
immunological events such as infection and allergic reaction (Shono et al., 2009). The T‐
cell  mediated  immunity  is  hypothesized  to  be  involved  in  the  pathogenesis  of  MCNS. 
The  imbalance  of  T‐helper  cells  in  MCNS  patients  leads  to  an  increase  in  cytokine 
secretions.  These  cytokines  serve  as  circulating  factors  that  alter  the  glomerular 
permeability of the glomerular capillary wall (Shono et al., 2009, Lahdenkari et al., 2004). 
However, the molecular identification of these humoral factors and the mechanisms by 
which they compromise the filtration barrier remain unknown (Shono et al., 2009).  
 

7 
 


Recurrence  of  proteinuria  occurs  in  approximately  30  to  40%  of  FSGS  patients  after 
renal transplantation. Proteinuria can recur immediately after transplantation or can be 
delayed  for  days  to  weeks.  Plasmapheresis  or  immunoadsorption  reduces  proteinuria 
and  may  also  stabilize  renal  function  in  recurrent  FSGS.  Plasma  from  these  recurrent 
FSGS  patients,  when  injected  into  experimental  animals  can  induce  proteinuria  or 
albuminuria. All these suggested the presence of plasma circulating factor that may be 
involved in glomerular damage and the initiation of glomerular events which contribute 
to the development of proteinuria in FSGS (Sharma et al., 1999, Sharma et al., 2004) . 
Cardiotrophin  like  cytokine‐1  has  been  identified  as  a  possible  candidate  for  the  FSGS 
permeability  factor(McCarthy  et  al.,  2010).  More  recently,  serum  soluble  urokinase 
receptor (suPAR) was identified as a circulating factor as a cause for both primary and 
recurrent  FSGS.  Elevated  suPAR  was  observed  in  patients  with  FSGS  and  this  elevated 

suPAR  concentration  was  associated  with  an  increased  risk  of  recurrent  FSGS  after 
transplantation (Wei et al., 2011). 
 
Glomerular filtration barrier and nephrotic syndrome 
The glomerular filtration barrier is the principle structure within the glomerulus, which 
mediates  the  filtration  of  proteins.  A  dysfunction  in  the  glomerular  filtration  barrier 
results in the increased permeability to plasma proteins to the glomerular capillary wall. 
This eventually leads to proteinuria, a hallmark of NS.   
 

8 
 


The glomerullar filtration barrier is m
made up of thhree layers,  the glomeru
ular endotheelium 
ce
ells, the glom
merular basement mem
mbrane (GBM
M) and visceeral epitheliaal cells which are 
also known as podocytess (Figure 3). 
 

 
Fiigure 3: The glomerularr filtration baarrier.  
The glomerullar filtration barrier is m
made up of tthe capillaryy endotheliaal cells, GBM
M and 

w
their  fo
oot  processses.  The  sliit  diaphragm
m  connectss  the  podo
ocytes 
podocytes  with 
ogether.  The
e  slit  diaphragm‐associiated  moleccules  includee  nephrin,  podocin,  CD
D2AP, 
to
TRPC6 and NEPH.  The G
GBM is comp
posed of thee collagen tyype IV, lamiinin and hep
paran 
su
ulphate  pro
oteoglycan  agrin. 
a
Integrrins  are  hetterodimeric  transmemb
brance  receptors 
which specifi
w
cally connecct the TVP co
omplex (talinn, vinculin and paxillin) tto laminin. TThe α 
and β dystrogglycans conn
nect utrophiin to agrin. ((Adapted fro
om: Kriz, W.. 2005. TRPC
C6 ‐ a 
new podocyte gene invollved in focal segmental gglomeruloscclerosis. Tren
nds Mol Med

d, 11, 
527‐30 (Kriz, 2005)) 
 
 
 
9 
 


The  glomerular  endothelial  cells  are  flattened  and  highly  fenestrated.  They  form  the 
interface  between  blood  and  tissue  components.  They  are  also  responsible  for  the 
regulation  of  vasotone,  homeostasis  and  trafficking  of  leucocytes.  Their  role  in  the 
selective  filtration  seem  to  be  insignificant  as  they  are  highly  fenestrated  and  highly 
permeable  to  water  and  small  solutes  (Ballermann,  2005).  All  of  the  filtration  barrier 
structures  (endothelium  cell  glycocalyx,  GBM  and  podocyte  glycocalyx)  demonstrate 
anionic charges, indicating that all structures act together for the total selectivity of the 
barrier.  This  means  that  the  glomerular  endothelium  could  have  a  function  for 
glomerular  permeability.  Previous  studies  done  by  Jeansson  and  Haraldsson  indicated 
that  digestion  with  chondroitinase  decreased  the  thickness  of  the  glomerular 
endothelium glycocalyx. This resulted in increased fractional clearance for albumin due 
to the change in the charge selectivity (Jeansson and Haraldsson, 2006).  
 
The  layer  surrounding  the  endothelium  is  the  glomerular  basement  membrane.    The 
GBM  is  thicker  compared  to  other  basement  membranes  because  of  the  dense 
structure  of  the  extracellular  matrix  components.  This  is  to  provide  structural  support 
for  the  capillary  wall  that  is  necessary  for  the  maintenance  of  the  local  high  blood 
pressure.  The  GBM  is  made  up  of  mainly  collagen  type  IV,  laminins,  nidogen,  and 
proteoglycans  that  contribute  to  the  selective  permeability  of  the  GBM  based  on  size 
and  charge  (Levidiotis  and  Power,  2005).  Initially  the  GBM  was  thought  to  be  the 
important  structure  of  the  glomerular  filtration  barrier.  Hence,  many  studies  were 

focused on its structure. Structural abnormalities of the GBM may result in proteinuria 
10