Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài nguyệt quế ( Murraya paniculata (L..) Jack) và loài trầm bông đỏ ( Callistemon citrinus (Curtis) Skeel) ở Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ
CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

PHẠM NGỌC KHANH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT
TÍNH SINH HỌC CỦA LOÀI NGUYỆT QUẾ
(Murraya paniculata (L.) JACK) VÀ LOÀI
TRÀM BÔNG ĐỎ (Callistemon citrinus (CURTIS)
SKEELS) Ở VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC

Hà Nội, 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG
NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

PHẠM NGỌC KHANH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT
TÍNH SINH HỌC CỦA LOÀI NGUYỆT QUẾ

(Murraya paniculata (L.) JACK) VÀ LOÀI
TRÀM BÔNG ĐỎ (Callistemon citrinus (CURTIS)
SKEELS) Ở VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC
Chuyên ngành: Hóa học các hợp chất thiên nhiên
Mã số chuyên ngành: 62.44.01.17

Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Nguyễn Mạnh Cường
2. GS.TS. Young Ho Kim

Hà Nội, 2015

ii


MỤC LỤC
Trang
LỜI CAM ĐOAN
LỜI CÁM ƠN
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
MỞ ĐẦU

1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

3

1.1. KHÁI QUÁT VỀ HỌ CAM CHANH RUTACEAE VÀ CHI MURRAYA

3

1.1.1. Giới thiệu tổng quan về họ Cam chanh Rutaceae và chi Murraya

3

1.1.2. Tình hình nghiên cứu về hóa học của chi Murraya trên thế giới

5

1.1.2.1. Các hợp chất coumarin từ chi Murraya

6

1.1.2.2. Các hợp chất alkaloid

11

1.1.2.3. Các hợp chất flavonoid

14

1.1.2.4. Tinh dầu

15

1.1.2.5. Các hợp chất khác

15

1.1.3. Hoạt tính sinh học của các dịch chiết và hợp chất phân lập từ chi
Murraya
1.2. KHÁI QUÁT VỀ HỌ SIM MYRTACEAE VÀ CHI CALLISTEMON

15

1.2.1. Giới thiệu tổng quan về họ Sim Myrtaceae và chi Callistemon

20

1.2.2. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Callistemon trên thế
giới
1.2.2.1. Tinh dầu

20

1.2.2.2. Các hợp chất flavonoid

23

1.2.2.3. Các hợp chất triterpenoid

23

1.2.2.4. Các hợp chất polyphenol

24

1.2.3. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của chi Callistemon trên thế giới

25

1.3.

GIỚI THIỆU TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP THỬ
NGHIỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG LUẬN ÁN
iii

20

22

27


1.3.1. Phương pháp thử độc tế bào

27

1.3.2. Phương pháp thử nghiệm tác dụng giãn mạch

28

1.3.3. Phương pháp ức chế enzyme epoxide hydrolase hòa tan (sEH)

29

1.3.4. Phương pháp xác định hoạt tính kháng viêm qua yếu tố NO

30

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

32

2.1. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

32

2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu

33

2.1.2. Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết

33

2.1.3. Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất

33

2.2. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học

33

2.2.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào

34

2.2.2. Phương pháp thử tác dụng giãn mạch

35

2.2.3. Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme thủy phân epoxide hòa tan

36

2.2.4. Phương pháp thử hoạt tính kháng viêm

37

2.3. Xử lý mẫu thực vật và chiết tách

38

2.3.1. Cây Nguyệt quế Murraya paniculata

38

2.3.1.1. Phân lập các chất từ cặn dịch chiết chloroform

39

2.3.1.2. Phân lập các chất từ cặn dịch chiết n-hexane

40

2.3.2. Cây Tràm bông đỏ Callistemon citrinus

40

2.3.2.1. Phân lập các chất từ cặn dịch chiết DCM

41

2.3.2.2. Phân lập các chất từ cặn dịch chiết EtOAc

43

2.3.2.3. Phân lập các chất từ cặn dịch chiết n-hexane

44

2.4. THÔNG SỐ HÓA LÝ VÀ DỮ KIỆN PHỔ CÁC CHẤT

45

2.4.1. Từ loài Nguyệt quế Murraya paniculata

45

2.4.2. Từ loài Tràm bông đỏ Callistemon citrinus

46

iv

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

50

3.1. THÀNH PHẦN HÓA HỌC LOÀi NGUYỆT QUẾ Murraya paniculata

50

3.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC LOÀI TRÀM BÔNG ĐỎ Callistemon

67

citrinus
3.3. KẾT LUẬN VỀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT

140

3.4. ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC

142

3.4.1. Khảo sát hoạt tính độc tế bào của các dịch chiết cây trên dòng tế bào

142

ung thư gan HepG2
3.4.2. Tác dụng giãn mạch của các hợp chất coumarin

143

3.4.3. Tác dụng ức chế enzyme sEH của các hợp chất coumarin từ loài Nguyệt

147

quế Murraya paniculata
3.4.4. Tác dụng ức chế enzyme sEH của các hợp chất chiết tách từ loài Tràm

149

bông đỏ Callistemon citrinus
3.4.5. Tác dụng kháng viêm của các hợp chất phân lập từ loài Tràm bông đỏ

150

Callistemon citrinus
KẾT LUẬN

153

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

155

TÀI LIỆU THAM KHẢO

157

PHỤ LỤC

160

v


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu và kết quả thu được trong luận án là hoàn toàn trung thực và chưa
được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả luận án

Phạm Ngọc Khanh

vi


LỜI CẢM ƠN
Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện
Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Với sự kính trọng, lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất, tôi xin bày tỏ lòng
biết ơn tới PGS.TS. Nguyễn Mạnh Cường và GS.TS. Young Ho Kim là những người
thầy đã hướng dẫn tận tình và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện
luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ của Ban lãnh đạo Viện Hóa học
và Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi hoàn thành
luận án.

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới tập thể cán bộ Phòng Hoạt chất sinh học,
Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên đã giúp đỡ tôi nhiệt tình trong suốt thời gian
thực hiện luận án. Tôi xin gửi lời cám ơn đặc biệt tới Th.S. Hồ Việt Đức cho sự giúp
đỡ quý báu của Thạc sỹ trong quá trình tôi thực hiện luận án này.
Tôi cũng cám ơn các đề tài nghiên cứu số 104.01-2010.25 do quỹ Phát triển
Khoa học và Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) và đề tài Hợp tác Nghị định thư Việt
Nam – Hàn Quốc số 52/2011/NĐT của Bộ Khoa học và Công nghệ (MOST) đã tài trợ
cho các nghiên cứu trong luận án này.
Tôi xin chân thành cảm ơn đến các đồng nghiệp, bạn bè gần xa đã cổ vũ, động
viên tôi hoàn thành tốt luận án này.
Cuối cùng, tôi xin gửi lòng kính trọng và sự biết ơn sâu sắc đến gia đình tôi,
đến bố mẹ đẻ và bố mẹ chồng tôi, đến chồng và con gái tôi, những người đã không
ngại khó khăn, vất vả, đã luôn giúp đỡ tôi, tạo điều kiện cho tôi thực hiện tốt luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm 2015
Tác giả luận án

Phạm Ngọc Khanh
vii


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
1

H-NMR

Proton Nuclear Magnetic
Resonance Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

proton

1

H-1H-COSY

1

H -1H - Correlation
Spectroscopy

Phổ tương tác proton

Carbon -13 Nuclear Magnetic
Resonance Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
cacbon 13

13

C- NMR

s

Singlet

d

Doublet

t

Triplet

q

Quartet

dd

doublet doublet

dt

doublet triplet

b (br)

Broad

m

Multiplet

J (Hz)

Hằng số tương tác tính bằng Hz

δ (ppm)

(ppm = part per million)

Độ dịch chuyển hóa học tính
bằng ppm (phần triệu)

AUDA

12-[[(tricyclo[3.3.1.13,7]dec1-ylamino)carbonyl]amino]dodecanoic acid

chất chuẩn dương cho thử
nghiệm ức chế enzyme sEH

BuOH
CC

Butanol
Column Chromatography

Sắc ký cột

CTCT

Công thức cấu tạo

CTPT

Công thức phân tử

DEPT

Distortionless Enhancement by Phổ DEPT
Polarisation Transfer

DMSO

Dimethylsulfoxide

EtOAc

CH3COOCH2CH3

Etyl axetat

ESI-MS

Electron Spray IonizationMass Spectroscopy

Phổ khối ion hóa bằng phun mù
điện tử

Hep-G2

Human hepatocellular
carcinoma

Tế bào ung thư gan người

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond

Phổ tương tác dị nhân qua nhiều

viii


liên kết (HMBC)

Correlation
HSQC

Heteronuclear Single Quantum Phổ tương tác dị nhân qua 1 liên
Coherence
kết (HSQC)
Hiệu suất so với mẫu khô

HS (%)
HR-ESI-MS

High Resolution Electron
Spray Ionization Mass
Spectroscopy

Phổ khối phân giải cao ion hóa
bằng phun mù điện tử
Hoạt tính sinh học

HTSH
IC50

Inhibitory concentration 50%

Nồng độ ức chế tối thiểu 50%

IR

Infrared Spectroscopy

Phổ hồng ngoại

KLPT

Khối lượng phân tử

KST

Ký sinh trùng

LPS

Lipopolysaccharide (LPS),
also known as lipoglycans and
endotoxin

Lipopolysaccharide hay
lipoglycans và endotoxin

Mp

Melting point

Điểm chảy

MeOH

Methanol

Metanol

MTT

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazolium
bromide

thuốc nhuộm dạng muối
tetrazolium thử hoạt tính độc tế
bào

NOESY

Nuclear Overhauser Effect
Spectroscopy

Phổ NOESY

OD

Optical density

Mật độ quang học

PHOME

Chất phát huỳnh quang

3-phenyl-cyano(6-methoxy-2naphthalenyl)methyl ester-2oxiraneacetic acid

SRB

Sulforhodamine B

TLC

Thin Layer Chromatography

Sắc ký bản mỏng

TMS

(CH3)4Si

Tetrametyl Silan

TLTK

Tài liệu tham khảo

TPHH

Thành phần hóa học

ix


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1: Danh mục của các loài thuộc chi Murraya được chính thức công

3

nhận danh pháp khoa học trên trang web (đến thời điểm
tháng 1.2015)
Bảng 1.2: Một số các hợp chất coumarin chiết tách từ cây M.exotica

6

Bảng 1.3:Các alkaloids chiết tách từ các loài thực vật chi Murraya

11

Bảng 1.4: Các PMFs chiết tách từ Murraya paniculata

14

Bảng 1.5:Hoạt tính sinh học của các dịch chiết cây và hoạt chất chiết tách

15

thuộc chi Murraya

Bảng 1.6: Hoạt tính sinh học của các coumarin chiết tách từ M. paniculata

17

Bảng 1.7: Hoạt tính sinh học của các alkaloid chiết tách từ chi Murraya.

18

Bảng 1.8: Danh mục của các loài thuộc chi Callistemon được chính thức công

21

nhận danh pháp khoa học trên trang web (đến thời điểm
tháng 1.2015)
Bảng 1.9: Các triterpenoids chiết tách từ các loài thực vật chi Callistemon

24

Bảng 1.10: Hoạt tính sinh học của các dịch chiết cây thuộc chi Callistemon

25

Bảng 3.1: Dữ kiện phổ 1D- và 2D-NMR của MP.01

54

Bảng 3.2: Dữ liệu phổ NMR của MP.02 và so sánh với TLTK

56

Bảng 3.3: Dữ liệu phổ NMRcủa MP.03 và so sánh với TLTK

58

Bảng 3.4: Dữ kiện phổ 1H- và 13C-NMR của MP.04 và so sánh với TLTK

62

Bảng 3.5: Dữ liệu phổ 1D- và 2D-NMR của chất MP.05và so với TLTK

64

Bảng 3.6: Thông số phổ NMR của hợp chất MP.06 và của TLTK

66

Bảng 3.7: Phổ NMR của hợp chất CC.01 và so sánh với TLTK

69

Bảng 3.8: Số liệu phổ NMR của hợp chất CC.02

72

Bảng 3.9.Các thông số phổ NMR của hợp chất CC.03 và so sánh với TLTK

75

Bảng 3.10: Thông số phổ của hợp chất CC.04 và so sánh với TLTK

78

Bảng 3.11: Số liệu phổ NMR của hợp chất CC.05 và so sánh với TLTK

81

Bảng 3.12: Số liệu phổ NMR của hợp chất CC.06 và so sánh với TLTK

84

Bảng 3.13: Số liệu phổ NMR của hợp chất CC.07 và so sánh với TLTK

86

x


Bảng 3.14: Số liệu phổ NMR của hợp chất CC.08 và so sánh với TLTK

90

Bảng 3.15: Số liệu phổ NMR của hợp chất CC.09 và so sánh với TLTK

94

Bảng 3.16 : Số liệu phổ NMR của hợp chất CC.12 và so sánh với TLTK

101

Bảng 3.17 : Số liệu phổ NMR của các hợp chất Callocitrinone A (CC.13), B

104

(CC.14) trong MeOD, và Gallomyrtucommulone A (CC.12) trong DMSO-d6
Bảng 3.18: Số liệu phổ NMR của hợp chất CC.15

112

Bảng 3.19: Số liệu phổ NMR của hợp chất CC.16 và so sánh với TLTK

115

Bảng 3.20: Số liệu phổ NMR của hợp chất CC.18 và so sánh với TLTK

117

Bảng 3.21: Số liệu phổ NMR của hợp chất CC.19 và so sánh với TLTK

119

Bảng 3.22: Số liệu phổ NMR của hợp chất CC.20 và so sánh với TLTK

121

Bảng 3.23: Số liệu phổ NMR của hợp chất CC.21 và so sánh với TLTK

124

Bảng 3.24: Số liệu phổ NMR của hợp chất CC.22 và so sánh với TLTK

126

Bảng 3.25: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất CC.23 và CC.24

133

Bảng 3.26: Thông số NMR của hợp chất CC.25 và so sánh với TLTK

135

Bảng 3.27: Số liệu phổ NMR của hợp chất CC.26 và so sánh với TLTK

137

Bảng 3.28: Số liệu phổ NMR của hợp chất CC.27

139

Bảng 3.29: Kết quả thử hoạt tính độc tế bào của các cây thuốc

142

Bảng 3.30: Giá trị IC50 và kiểu liên kết của các hợp chất coumarins MP.01-05

144

vào enzyme sEH
Bảng 3.31: Tác dụng ức chế sEH của các hợp chất chiết tách từ cây
Callistemon citrinus

xi

149


DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1: A. Hình vẽ cành mang quả và B. ảnh chụp cây Nguyệt quế (Murraya

5

paniculata (L.) Jack)
Hình 1.2: A. Hình vẽ mô tả đặc điểm thực vật và B. Ảnh chụp cây Tràm Bông đỏ

22

(Callistemon citrinus (Curtis) Skeels)
Hình 1.3: Cấu trúc thành động mạch (Wikipedia)

30

Hình 1.4: Lộ trình chuyển hóa từ acid arachidonic thành các eicosanoids EETs có

30

khả năng điều trị bệnh tim mạch và bệnh viêm và tác dụng thủy phân của enzyme
sEH trên phân tử PHOME phát huỳnh quang. DHETs, dihydroxyeicosatrienoic
acids
Hình 2.1: Hình tiêu bản và phiếu xác định tiêu bản

32

Hình 3.1: Phổ HR-MS của hợp chất MP.01

51

Hình 3.2: Phổ hồng ngoại IR của hợp chất MP.01

51

Hình 3.3: Phổ proton 1H-NMR của hợp chất MP.01

51

Hình 3.4: Phổ proton 1H-NMR giãn của hợp chất MP.01

51

Hình 3.5:Phổ carbon 13C-DEPT của hợp chất MP.01

52

Hình 3.6: Phổ HMBC của hợp chất MP.01

53

Hình 3.7: Phổ NOESY và COSY của hợp chất MP.01

53

Hình 3.8: Phổ 1H-NMR của hợp chất MP.02

55

13

Hình 3.9: Phổ C-DEPT của hợp chất MP.02

55

Hình 3.10: Phổ ROESY của hợp chất MP.02

56

Hình 3.11: phổ 1H (thường và giãn) của hợp chất MP.03

57

Hình 3.12: Phổ 13C-DEPT-NMR của hợp chất MP.03

58

Hình 3.13:Phổ khối ESI-MS của hợp chất MP.04

59

Hình 3.14: Phổ HR-ESI-MS phân giải cao của hợp chất MP.04

59

Hình 3.15: Phổ proton 1H-NMR của hợp chất MP.04

60

Hình 3.16: Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất MP.04

61

Hình 3.17: Phổ HMBC của hợp chất MP.04

61

xii


Hình 3.18: Phổ NOESY của hợp chất MP.04

61

Hình 3.19: Phổ 1H-NMR chi tiết của hợp chất MP.05

63

Hình 3.20:Phổ 13C-DEPT-NMR của hợp chất MP.05

63

Hình 3.21: Phổ HMBC và COSY và các tương tác trong phân tử MP.05

64

Hình 3.22:Phổ 1H-NMR của hợp chất MP.06

66

Hình 3.23: Phổ 1H-NMR của hợp chất MP.07

67

Hình 3.24:Phổ khối HR-MS của hợp chất CC.01

68

Hình 3.25: Phổ 1H-NMR của hợp chất CC.01

68

Hình 3.26: Phổ 13C-DEPT-NMR của hợp chất CC.01

69

Hình 3.27: Phổ HR-MS của hợp chất CC.02

70

1

Hình 3.28: Phổ H-NMR của hợp chất CC.02

71

Hình 3.29: Phổ 13C-DEPT NMR của hợp chất CC.02

71

Hình 3.30: Phổ HMBC và các tương tác HMBC trong phân tử CC.02

72

Hình 3.31: Phổ khối ESI-MS của hợp chất CC.03

73

Hình 3.32: Phổ 1H-NMR của hợp chất CC.03

74

Hình 3.33: Phổ 13C-DEPT-NMR của hợp chất CC.03

74

Hình 3.34: Phổ HMBC và các tương tác HMBC trong phân tử CC.03

75

Hình 3.35: Phổ khối ESI-MS của hợp chất CC.04

77

Hình 3.36: Phổ 1H-NMR của hợp chất CC.04

77

Hình 3.37: Phổ 13C-NMR của hợp chất CC.04

78

Hình 3.38: Phổ HMBC và các tín hiệu tương tác HMBC trong phân tử CC.04

78

Hình 3.39:Phổ khối ESI-MS của hợp chất CC.05

80

Hình 3.40:Phổ giãn 1H-NMR của hợp chất CC.05

80

Hình 3.41: Phổ 3C-DEPT-NMR của hợp chất CC.05

80

Hình 3.42: Phổ HMBC và các tương tác HMBC của hợp chất CC.05

81

Hình 3.43: Phổ NOESY và các tương tác NOESY của hợp chất CC.05

81

Hình 3.44: Phổ khối ESI-MS của hợp chất CC.06

83

Hình 3.45: Phổ 1H-NMR của hợp chất CC.06

83

Hình 3.46: Phổ 13C-DEPT-NMR của hợp chất CC.06

84

Hình 3.47: Phổ khối ESI-MS của hợp chất CC.07

85

Hình 3.48: Phổ 1H-NMR của hợp chất CC.07

86

xiii


Hình 3.49: Phổ DEPT của hợp chất CC.07

86

Hình 3.50: Phổ khối của các hợp chất CC.08

88

Hình 3.51: Phổ 1H-NMR của hợp chất CC.08

88

Hình 3.52: Phổ 1H-NMR chi tiết của hợp chất CC.08

88

Hình 3.53: Phổ 13C-và DEPT-NMR của hợp chất CC.08

89

Hình 3.54: Phổ HMBC của hợp chất CC.08

89

Hình 3.55: Phổ NOESY và các tương tác NOESY của hợp chất CC.08

90

Hình 3.56: Phổ khối của hợp chất CC.09

92

Hình 3.57: Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất CC.09

92

Hình 3.58: Phổ 13C-DEPT-NMR giãn của hợp chất CC.09

92

Hình 3.59:Phổ HMBC và tương tác HMBC trong hợp chất CC.09

93

Hình 3.60: Phổ NOESY và các tương tác NOESY trong hợp chất CC.09

93

Hình 3.61: Cấu trúc dạng hỗ biến của các phân tử hợp chất CC.08 và CC.09

94

Hình 3.62: Phổ 1H- và 13C-NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất CC.10

96

Hình 3.63: Phổ 1H- và 13C-NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất CC.11

97

Hình 3.64: Phổ HR-MS của hợp chất CC.12

98

Hình 3.65: phổ 1H-NMR của hợp chất CC.12

98

Hình 3.66 : phổ 13C-NMR của hợp chất CC.12

99

Hình 3.67: Các tương tác NOESY trong phân tử hợp chất CC.12

99

Hình 3.68: Phổ khối HR-MS của hợp chất CC.13

102

Hình 3.69: Phổ 1H-NMR của hợp chất CC.13

103

1

Hình 3.70: Phổ H-NMR giãn của hợp chất CC.13

103

Hình3.71: Phổ 13C-DEPT- NMR của hợp chất CC.13

106

Hình 3.72: Phổ HMBC,NOESY và các tương tác trong hợp chất CC.13

107

Hình 3.73: Phổ khối HR-MS của hợp chất CC.14

109

1

Hình 3.74: Phổ H- NMR (giãn) của hợp chất CC.14

109

Hình 3.75: Phổ 13C-DEPT-NMR của hợp chất CC.14

110

Hình 3.76: Phổ HMBC và NOESY các tương tác trong phân tử CC.14

110

1

Hình 3.77: Phổ H-NMR của hợp chất CC.15

111

Hình 3.78: Phổ khối ESI-MS của hợp chất CC.15

112

Hình 3.79: Phổ 1H-NMR (giãn) của hợp chất CC.16

113

xiv


Hình 3.80: Phổ 13C-DEPT-NMR của hợp chất CC.16

113

Hình 3.81: Phổ HMBC vàcác tương tác HMBC chính của hợp chất CC.16

114

Hình 3.82: Phổ COSY và NOESY trong phân tử CC.16

115

Hình 3.83: Phổ khối lượng ESI-MS của hợp chất CC.18

116

Hình 3.84: Phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chấtCC.18

116

Hình 3.85: Phổ 1H- và 13C-NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất CC.19

119

Hình 3.86: Phổ ESI-MS của hợp chất CC.20

121

Hình 3.87: Phổ 13C- và DEPT NMR của hợp chất CC.20

121

Hình 3.88: Phổ ESI-MS của hợp chất CC.21

123

Hình 3.89: Phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất CC.21

123

Hình 3.90: Phổ HMBC và các tương tác HMBC của hợp chất CC.21

124

Hình 3.91: Phổ ESI-MS của hợp chất CC.22

126

Hình 3.92: Phổ 1H và 13C -NMR của hợp chất CC.22

126

Hình 3.93: Phổ 1H-NMR thường của hợp chất CC.23

128

Hình 3.94: Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất CC.23

129

Hình 3.95. Phổ DEPT của hợp chất CC.23

129

Hình 3.96: Phổ HMBC và NOESY và các tương tác trong hợp chất CC.23

130

Hình 3.97: Phổ 1H-và DEPT-NMR của hợp chất CC.24

131

Hình 3.98: Phổ ESI-MS vcủa hợp chất CC.26

135

Hình 3.99: Phổ HR-ESI-MS của hợp chất CC.26

136

Hình 3.100: Phổ 1H-và 13C-NMR của hợp chất CC.26

136

Hình 3.101: Phổ HMBC và các tương tác HMBC trong phân tử CC.26

137

Hình 3.102: Phổ ESI-MS của hợp chất CC.27

138

Hình 3.103: Phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất CC.27

138

Hình 3.104:Ảnh hưởng của dịch chiết metanol lên vòng động mạch chuột đã bị

144

gây co thắt trước bằng phenylephrine (Phe)- hoặc dung dịch muối K+ 60 mM
Hình 3.105: Ảnh hưởng của các hợp chất MP-01 và MP-02 đến sự giãn mạch

144

của vòng động mạch chuột gây co trước bằng dung dịch muối K+ 60 mM (n=4-8)
Hình 3.106: Tác động ức chế enzyme sEH của các hợp chất coumarins (MP.01-

145

05) xác định bằng phương pháp huỳnh quang.
Hình 3.107: Ảnh hưởng của các hợp chất coumarins MP.04, 03 và 01 đến hoạt
xv

149


độ enzyme sEH trong phản ứng thủy phân cơ chất PHOME
Hình 3.108: Cấu trúc thành mạch máu với 3 lớp tế bào

147

Hình 3.109: Mô phỏng tương tác của các coumarin với phân tử enzyme sEH

148

Hình 3.109: Tính toán năng lượng liên kết của các coumarin với các acid amin

148

cấu thành phân tử enzyme sEH
Hình 3.111: Tác dụng ức chế NO của các flavonoid

151

Hình 3.112: Tác dụng ức chế NO của các triterpenoid

151

xvi


DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Trang
Sơ đồ 1: Qui trình chiết và phân lập sơ bộ các chất trong lá và cành cây Nguyệt

38

quế (Murraya paniculata)
Sơ đồ 2: Qui trình phân lập các hợp chất từ dịch chiết chloroform từ lá và cành

42

cây Nguyệt quế (M. paniculata)
Sơ đồ 3: Qui trình phân lập các hợp chất từ dịch chiết n-hexane từ lá và cành cây

40

Nguyệt quế (Murraya paniculata)
Sơ đồ 4: Quy trình chiết và phân lập sơ bộ các chất trong lá và cành cây Tràm

41

bông đỏ
Sơ đồ 5:Quy trình chiết và phân lập các chất từ cặn dịch chiết DCM

42

Sơ đồ 6:Quy trình phân lập các chất từ cặn dịch chiết EtOAc

43

Sơ đồ 7: Quy trình phân lập các chất từ cặn dịch chiết n-hexane

44

xvii


MỞ ĐẦU
Đất nước Việt Nam chúng ta có diện tích khoảng 330000 km 2, trải dài 1650 km
qua 15o vĩ, có khí hậu nhiệt đới gió mùa, hai mùa nóng ẩm, với hệ động thực vật đa
dạng phong phú về chủng loại, quanh năm xanh tốt, và có nhiều công dụng phục vụ
cuộc sống con người như là lương thực, chế biến đồ dùng nội ngoại thất, làm cảnh,
làm thuốc,…Theo số liệu thống kê, hệ thực vật Việt Nam có trên 10000 loài, trong đó
có khoảng 3200 loài cây được sử dụng trong y học dân tộc. Việc sử dụng các hợp chất
thiên nhiên và các sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên làm thuốc chữa bệnh đang ngày
càng hút sự quan tâm của các nhà khoa học cũng như của những nhà sản xuất dược
phẩm. Thuốc có nguồn gốc thiên nhiên thường có ưu điểm là độc tính thấp, ít tác dụng
phụ, dễ hấp thu và chuyển hóa trong cơ thể hơn các sản phẩm tổng hợp.
Cho đến ngày nay dân số thế giới đã đạt được bảy tỷ người, một con số rất lớn
và nhu cầu về chăm sóc sức khỏe, khám chữa bệnh vì thế cũng tăng theo. Sự gia tăng
số người mắc bệnh, đặc biệt ở các nước nghèo, nơi nền y tế chưa phát triển nhưng lại
cần các loại thuốc chữa bệnh hiệu quả, giá thành rẻ là những đòi hỏi cấp bách đối với
các nhà khoa học.
Hiện nay, được sự đầu tư của nhà nước, các phòng thí nghiệm đã được trang bị
nhiều thiết bị hiện đại, phục vụ cho việc nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính
sinh học của các loại cây thuốc thực vật, đóng góp cho việc định hướng sử dụng và
phát triển nguồn tài nguyên thực vật trong đời sống dân sinh. Sự phát triển vượt bậc
của ngành sinh học phân tử cũng giúp cho việc sàng lọc, khảo sát các hoạt tính sinh
học quý từ các cây thuốc và từ các hợp chất hóa học quen biết.
Trong luận án, này, nhiệm vụ đặt ra là nghiên cứu thành phần hóa học các loại
cây ở nước ta mà chưa được nghiên cứu ở Việt nam, đồng thời đánh giá hoạt tính sinh

học của những chất thành phần được tách ra đó. Trên cơ sở chọn lọc các loại cây
thuốc đang được sử dụng trongy học dân gian để chữa bệnh; chọn lọc các loài cây
trong các chi chứa nhiều hoạt chất có hoạt tính sinh học tốt đã được phân lập; và chủ
yếu là dựa trên kết quả sàng lọc hoạt tính sinh học các dịch chiết thể hiện tác dụng
sinh họctiềm năng, hai loài cây Nguyệt quế và Tràm bông đỏ đã được lựa chọn làm
đối tượng nghiên cứu của luận án.


Trong y học dân gian, loài Nguyệt quế (Murraya paniculata (L.) Jack) (lá) dùng
để hạ nhiệt, làm thuốc bổ, trị bệnh đi ngoài, trị đau người, trị bệnh kiết lỵ, làm hạ sốt...
Loài Tràm bông đỏ (Callistemon citrinus (Curtis) Skeels, rễ và lá thường được dùng để
trị cảm lạnh,cảm sốt, ho, có tác dụng khử đờm, tiêu viêm. Nhờ sự đa dạng về thành
phần hóa học và tác dụng sinh học mà các loài cây này đã được nhận được sự quan tâm
nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Tuy nhiên, tính đến thời điểm luận án
được công bố, chưa có công trình nào nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính
sinh học của các loài trên ở Việt Nam.
Nhằm mục đích đi sâu nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của
hai loài cây này, chúng tôi đã lựa chọn đề tài:
“Nghiên cứu Thành phần Hóa học và Hoạt tính Sinh học của loài Nguyệt quế
(Murraya paniculata (L.) Jack) và loài Tràm bông đỏ (Callistemon citrinus
(Curtis) Skeels) ở Việt Nam''
được thực hiện nhờ có sự định hướng dẫn đường của các kết quả nghiên cứu tác dụng
sinh học dịch chiết ban đầu, có nội dung nghiên cứu như sau:
1. Thu mẫu của hai loài nghiên cứu; điều chế cặn chiết và phân đoạn của hai loài nghiên cứu.
2. Nghiên cứu thành phần hóa học của hai loài trên; phân lập và tinh chế các hợp
chất thành phần từ cặn chiết.
3. Xác định cấu trúc hóa học của các hoạt chất phân lập được.
4. Đánh giá hoạt tính sinh học (độc tế bào, tác dụng tim mạch, kháng viêm) của
một số hợp chất phân lập được.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. KHÁI QUÁT VỀ HỌ CAM CHANH RUTACEAE VÀ CHI MURRAYA
1.1.1. Khái quát về họ Cam chanh Rutaceae và chi Murraya
Họ Cam chanh (Rutaceae) là một họ thực vật trong bộ Bồ hòn (Sapindales). Các
loài của họ này nói chung có hoa thường có mùi thơm, lá thường có tuyến tinh dầu,
thân cây có kích thước từ cây thân thảo tới cây bụi và cây thân gỗ nhỏ. Họ này trên thế
giới có khoảng 161 chi và 2.070 loài, phân bố ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới.
Theo tác giả Nguyễn Tiến Bân, họ Rutaceae ở Việt Nam bao gồm khoảng 30 chi, 110
loài [1]. Các chi như Clausena, Glycosmis, Micromelum, Zanthoxylum, và Murraya
phân bố khá phổ biến khắp cả ba miền Việt Nam [2] và có nhiều công dụng trong
cuộc sống: về mặt kinh tế và thương mại (quả ăn được), công dụng trong mỹ phẩm và
làm thuốc (tinh dầu, thành phần cây).
Các loài thuộc chi Murraya là loài cây bụi thấp, thân hóa gỗ, trồng làm cảnh vì
cây lá xanh quanh năm và hoa có mùi thơm ngát, thường nở thành chùm. Cây được
trồng và mọc hoang chủ yếu ở châu Á, từ Trung Quốc và Nam Ấn cho đến New
Caledonia và châu Úc [3] và các đảo ở Thái Bình Dương, ở miền nam Trung Quốc và
vùng Đông Nam Á [4, 5]. Theo tác giả Waterman & cs., trên thế giới, chi Murraya có
khoảng 13 loài [3]. Bên cạnh đó, trung tâm dữ liệu thực vật Tropicos đã liệt kê 23 loài
Murraya, trong đó một số loài giống nhau về danh pháp khoa học nhưng khác nhau về
tên tác giả xác định. Còn trang web đã liệt kê có tới 34 loài
thuộc chi Murraya, tuy nhiên chỉ có 8/34 loài này được chính thức công nhận danh
pháp khoa học (bảng 1.1).
Bảng 1.1. Danh mục của 8/34 loài thuộc chi Murraya được chính thức công nhận trên
trang web (đến thời điểm tháng 1.2015)
1
2
3

4
5

Tên khoa học
Murraya alata
Murraya crenulata
Murraya euchrestifolia
Murraya koenigii
Murraya kwangsiensis

Tác giả
Drake
(Turcz.) Oliv.
Hayata
(L.) Spreng.
C.C. Huang
3

Năm xác định
1892
1861
1916
1817
1978


6 Murraya microphylla
7 Murraya paniculata
8 Murraya tetramera

(Merr. & Chun) Swingle
(L.) Jack
C.C. Huang

1942
1820
1959

Trong số các loài thuộc chi Murraya, loài Nguyệt quế M. paniculata là loài phân
bố rộng rãi nhất, cả ở khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ngoài tác dụng làm cảnh,
các loài Murraya còn có tác dụng làm thuốc chữa bệnh, làm gia vị nấu ăn. Lá cây M.
koenigii còn là nguồn nguyên liệu để sản xuất cà ri, một loại gia vị phổ biến tại các
nước Nam Á như Ấn độ, Pakistan, Bangladesh, Srilanka...
Ở Việt nam, theo Phạm Hoàng Hộ, có 4 loài Nguyệt quế gồm:1. Murraya
paniculata (L.) Jack.: Nguyệt quế. Cây gỗ nhỏ, cao 2-4m, lá kép mang 7 lá phụ, hoa
trắng, chùm, thơm ngát về đêm;(2). Murraya alata Drake.: Nguyệt quế cánh; (3).
Murraya glabra (Guill.) Sw.: Nguyệt quế nhẵn (Vương tùng); và (4). Murraya
koenigii (L.) Spreng.: Nguyệt quế koenig, lá cà ri [6]. Các loài thuộc chi Murraya
phân bố khá rộng rãi khắp đất nước. Tất cả các thành phần của cây: lá, hoa, quả, thân
cành, rễ đều được sử dụng cho các mục đích khác nhau như làm thuốc chữa bệnh, làm
gia vị thức ăn, phục vụ cho các nghi lễ tôn giáo, vv. Lá nguyệt quế cánh M. alata và
glabra dùng để nấu canh, trái ăn được. Lá cây cà ri M. koenigii dùng làm gia vị cà ri
để tăng hương vị của món ăn, vỏ làm thuốc bổ, lá quả trị bệnh kiết lỵ, hạ nhiệt.
Murraya paniculata
Loài Murraya paniculata còn có tên là Nguyệt quế hay Nguyệt quới, Nguyệt
quý, Nhâm hôi. Cây có tên trong tiếng Anh là Orange jasmine, Chinese myrtle.
Mô tả: Cây nhỏ hay cây nhỡ, cao 3-8m. Thân và cành hình trụ, có vỏ mỏng màu
vàng nhạt. Lá kép lông chim lẻ, dài 8-14 cm, gồm 5-9 lá chét mọc so le, hình trái
xoan hoặc gần tròn, dài 2-8cm, rộng 1.2-3.5 cm, gốc hình nêm, đầu tù, mép nguyên,
hai mặt nhẵn, gân thường mờ, chỉ gân chính rõ. Cụm hoa mọc ở kẽ lá và đầu cành

thành xim; Hoa màu trắng, hơi vàng, rất thơm; tương đối giống hoa chanh; đài có 5
răng nhỏ, có lông, tuyến; tràng có 5 cánh mỏng rời nhau, mọc cong xuống; nhị 10;
chỉ nhị hình sợi, phình ở gốc, bao phấn nhỏ có 4 ngăn xếp chéo chữ thập; bầu thuôn,
2 ô. Quả thịt, hình cầu hoặc hình trứng, có chấm nhỏ là những tuyến, có đài, khi chín
màu đỏ; 1-2 hạt. Mùa quả từ tháng 11 đến tháng 1 (hình 1.1).

4


A.
B.
Hình 1.1: A. Hình vẽ cành mang quả và B. ảnh chụp cây Nguyệt quế (Murraya
paniculata (L.) Jack) (nguồn ảnh: Wikipedia)
Sinh thái: Cây ưa sáng và hơi chịu bóng. Cây ra hoa quả nhiều hàng năm, tái
sinh tự nhiên chủ yếu từ hạt. Sau khi chặt, phần thân và cành còn lại tái sinh chồi
khỏe. Cây trồng được bằng cành chiết hay giâm cành.
Phân bố: chủ yếu ở các vùng nhiệt đới và á nhiệt đới Nam Á đến các nước ở
vùng Đông và Đông Nam châu Á và xuống đến Australia. Ở Việt Nam, M. paniculata
mọc tự nhiên rải rác ở rừng cây bụi thấp vùng ven biển miền Trung. Cây được trồng ở
khắp mọi nơi với nhiều mục đích sử dụng khác nhau: làm thuốc, làm cảnh, làm hàng
rào, uốn theo các thế chim thú tại các vườn cảnh.
Sử dụng:Theo kinh nghiệm dân gian Việt nam, lá dùng để hạ nhiệt, trị đi ngoài,
chống thụ thai, trị đau nhức, chống bầm máu, làm thuốc trị đau răng [7]. Trong nông
nghiệp cây được sử dụng để bảo vệ cây trồng do có khả năng dẫn dụ loài rầy chổng
cánh (Diaphorina citri kuwayama) gây hại cây trồng.
1.2.2. Tình hình nghiên cứu về hóa học của chi Murraya trên thế giới
Cho đến nay đã có các nghiên cứu hóa học của 13 loài chi Murraya, bao gồm M.
paniculata, M. alata, M. glabra, M. gleinei, M. koenigii, M. exotica, M. siamensis, M.
euchrestifolia, M. crenulata, M. microphylla, M. ovatifoliolata, M. stenocarpa, M.
omphalocarpa, vv. Những loài trên được thu hái ở các nước như Srilanka, Thái lan,

Ấn độ, Đài loan, Malaysia, Nhật và Việt Nam. Nghiên cứu thành phần hóa học của
loài Murraya đã cho thấy trong cây gồm có indol akaloid [8], flavonoid [9], tinh dầu
[10], và một số lượng lớn các coumarin [11-13]. Cho tới nay đã có hơn 200 chất được
5


tách từ các loài thuộc chi Murraya, trong đó có hơn 94 chất lần đầu được phát hiện
trong tự nhiên. Hầu hết các chất được phân lập từ lá, vỏ rễ, thân rễ và hoa.
1.2.2.1.

Các hợp chất coumarin từ chi Murraya

Các hợp chất coumarin phân lập từ chi Murraya chủ yếu từ các loài như M. gleinei,
M. paniculata. M. omphalocarpa, M. exotica, vv. khá phong phú. Tác giả Ito và
Furukawa trong bài công bố năm 1987 [14, 15] đã phân lập và xác định cấu trúc của
17 coumarin trong đó có 8 chất mới từ lá loài M. exotica (dịch chiết aceton), phân tách
trên cột silicagel với các dung môi rửa giải khác nhau như benzene (8 chất), benzene –
i-Pr2O (2:1 và 1:1) (7 chất và 8 chất) và benzene-acetone (3:1) (3 chất) (bảng 1.2).
Bảng 1.2: Một số các hợp chất coumarin chiết tách từ cây M.exotica
Dung môi chiết
benzene

benzene – i-Pr2O (2:1)

benzene – i-Pr2O (1:1)

benzene-acetone (3:1)

casegravol (2)
osthol (30)

trans-dehydroosthol
(31)
cis-dehydroosthol (32)
osthenon (33)
peroxyauraptenol (38)
7-methoxyformyl
coumarin (42)

isomurranganon
senecioate (8)
isomurralonginol
acetate (9)
isomeranzin (10)
meranzin (11)
phebalosin (39)
umbelliferone (66)
sibiricol (68)

chloticol (7)
murralongin (20)
murrangatin acetate (22)
murranganon (24)
murrayatin (26)
murraol (28)
7-methoxy-8-(1’-acetoxy2’-oxo-3’-methylbutyl)
coumarin (43)
scopoletin (69)

meranzin hydrate
(12)

minumicrolin (13)
murrangatin (21)

Còn từ lá, hoa và rễ của loài Murraya paniculata có tới 59 coumarin đã được phân
lập.
Từ lá M. paniculata: Auraptenol (1), coumurrin (3), epimurpaniculol senecioate
(5), hainanmurpanin (6), isomurralonginol isovalerate (7), isomeranzin (10), meranzin
(11),

meranzin hydrate (12), minumicrolin (13), minumicrolin acetonide (14),

microminulin (15), murpanidin (16), murpaniculol (17), murpaniculol senecioate (18),
murracarpin (19), murralongin (20), murrangatin (21), murrangatin acetate (22),
murrangatin isovalerate (23), murranganon (24), murrangonone (25), murrayatin (26),
murrayacarpin A (27), murraol (28), omphalopinol (29), osthol (30), paniculatin (34),
paniculin (35), panicunolol isovalerate (36), peroxymurraol (37), phebalosin (alosin)
(39), yuehgesin A (40), yuehgesin B (40a), 2'-O-ethyl murrangatin (41), 7-methoxy-8formylcoumarin (42), 7-methoxy-8-oxo-3'-methyl butoxy coumarin (44), 7-methoxy-

6


8-(1’-ethoxy-2’-hydroxy-3’-methyl-butenyl)

coumarin

(45),

7-methoxy-8-(2-

hydroxy-1-methoxy-3-methyl-3-butyl) coumarin (46), 7-methoxy-8-(2-formyl-2methylpropyl) coumarin (47); Các coumarin bị thế hai lần: mexoticin (48),

coumurrayin (49),

isomexoticin (50), murraculatin (51), murrayacarpin B (52),

omphalocarpin (53), omphalocarpin acetate (54), omphamurin isovalerate (55), 5methoxy- murrayatin (56), 5,7-dimethoxy-8-(3’-methyl-2’-oxobutyl) coumarin (57),
omphamurrayone (58), omphamurrayin (59), omphamurin (Sibirinol) (60), sibiricin
(Isoaculeatin) (61), 8-formyllimettin (62), toddalenone (63); braylin (64), auraptene
(65), umbelliferone (66), ayapanin (Hernierin) (67), sibiricol (68), scopoletin (69),
murragleinin (70), murrayanone (71) [11, 16-20].
Từ hoa: Murrangatin (21), Murracarpin (19), omphalocarpin (53), scopolin (69a),
scopoletin (69), 5,7-dimethoxy-8-(3-methyl-2-oxobutyl)coumarin (57), murpanidin
(16) [21].
Từ vỏ rễ: chiết tách được meranzin hydrate (12), meranzin (11), murrangatin
isovalerate (23), coumurrayin (49), omphamurin isovalerate (55), omphalocarpin (53),
murragleinin (70) [8].

Auraptenol (1)

casegravol (2)

coumurrin (3)

chloticol (4)

epimurpaniculol
senecioate (5)

isomurralongino
l acetate (9)

isomeranzin
(10)

minumicrolin
acetonide (14)

microminulin
(15)

O

O
O

hainanmurpanin
(6)

isomurralonginol
isovalerate (7)

isomurranganon
senecioate (8)
OH

OH

meranzin (11)

meranzin hydrate
(12)

minumicrolin (13)

7


murpanidin (16)

murpaniculol (17)

murpaniculol
senecioate (18)

murracarpin
(19)

murralongin
(20)

murrangatin
(21)

murrangatin
acetate (22)

murrangatin
isovalerate (23)

murranganon
(24)

murrangonone
(25)

-CH2OH
murrayatin (26)

murrayacarpin A
(27)

murraol (28)

omphalopinol
(29)

osthol (30)

transdehydroosthol
(31)

cis-dehydroosthol
(32)

osthenon (33)

paniculatin (34)

paniculin (35)

panicunolol

isovalerate (36)

peroxymurraol
(37)

peroxyauraptenol
(38)

phebalosin
(alosin) (39)

yuehgesin A
(40)

7-methoxy-8(1’-acetoxy-2’oxo-3’-methyl
butyl)coumarin
(43)

7-methoxy-8oxo-3'-methyl
butoxy
coumarin (44)

Braylin (64)

R=OH,
Umbelliferone
(66), R=OMe,
Ayapanin (67)

- CHO

yuehgesin B
(40a)

2'-O-ethyl
murrangatin (41)

7-methoxy-8formylcoumarin
(42)

7-methoxy-8(1’-ethoxy-2’hydroxy-3’methyl-butenyl)
coumarin (45)

7-methoxy-8-(2hydroxy-1methoxy-3methyl-3-butyl)
coumarin (46)

7-methoxy-8-(2formyl-2methylpropyl)
coumarin (47)

8