Nghiên cứu thành phần hóa học thân, rễ và tác dụng kháng nấm của cây bạch hạc

m

BỘ Y T Ế

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

NGUYỄN VÁN NHƯỢNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC THÂN, RỄ
VÀ TÁC DỤNG
KHÁNG NẤM CỦA CÂY BẠCH
HẠC
■
■
■
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP D ư ợ c s ĩ KHOÁ 1998 - 2003)

Người hướng dẫn:

ThS. NGUYỄN THẾ HÙNG
TS. CAO VĂN THƯ

Nơi thực hiện:

BỘ MÔN Dược HỌC c ổ TRUYỀN
BỘ MÔN CÔNG NGHIỆP Dược

Thỏi gian thực hiện:

02 —05 / 2003

'?■ ị . m ỵ ỹ ,
u
r iu w } ’
'

HÀ NỘI, 05 - 2003
m

íL U O

-----

N ĩỷi a


Lời cảm ơn
Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới :
ThS. Nguyễn Thế Hùng.
TS. Cao Văn Thu.
TS. Nguyễn Mạnh Cường.
những người thầy đã tận tình hướng dẫn tôi trong quá trình làm kììoá luận
tốt nghiệp này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sự giúp đỡ quí báu của các thầy cô giáo,
các cô kỹ thuật viên trong Bộ môn Dược học có truyền, phòng li sinh - kháng
sinh Bộ môn Công nghiệp dược, phòng Hoạt chất sinh học - Viện Hoá họcTrung tâm khoa học tự nhiên vù công nghệ quốc gia dã tạo diêu kiện giúp dỡ lỏi
hoàn thành khoá luận này.
Cuối cùng tôi xin được cảm ơn những người thân và bạn bè đã
giúp đỡ tôi hoàn thành kìĩoá luận này.

Hà Nội ngày 30/05/2003.

Sinh viên
Nguyễn Văn Nhượng.

CÍỘI1Ị>

viên


MỤC LỤC
Trang
ĐẶT VÂN ĐỂ

1

PHẦN I- TỔNG QUAN

2

1.1 Bệnh nấm và các thuốc điều trị

2

1.1.1 Đặc điểm của bệnh nấm

2

ỈA .2 Các thuốc thường dùng để chống nấm

3

1.2 Khảo sát sơ bô các cây thuốc có khả năng kháng nấm

4

1.3 Cây Bạch hạc

5

1.3.1 Mô tả cây

5

1.3.2 Phân bố, thu hái, chế biến

5

1.3.3 Thành phần hoá học

5

1.3.4 Tác dụng

10

PHẦN II- THỤC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ

11

2.1 Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu

11

2.1.1 Nguyên vật liệu

11

2.1.2 Phương pháp nghiên cứu

12

2.2 Kết quả và nhận xét

13

2.2.1 Đặc điểm thực vật cây Bạch hạc

13

2.2.2 Định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hoá học

14

2.2.3 Thăm dò tác dụng kháng nấm của rễ, thân, lá Bạch hạc

19

2.2.4 Nghiên cứu tác dụng kháng nấm của rễ Bạch hạc

23

2.3 Bàn luận

31

PHẦN III- KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUÂT

32

PHẨN IV- TÀI LIỆU THAM KHẢO

34


DANH MỰC CÁC CHỮVIÊT TẮT

Dd

: dung dịch

A . niger

: Aspergillus niger

c . albicans

: Candida albicans

s . cerevisiae

: Saccharomyces cerevisiae

SKLM

: Sắc ký kớp mỏng

SK

: Sắc ký

D/C

: Dịch chiết


DẶT ván DỂ
Nước ta nằm trong vùng nhiệt đỏi gió mùa, có hệ sinh thái thực vật da
dạng và phong phú. Từ lâu, nhân dân ta dã biết sử dụng nhiều loại cây cỏ để
phòng bệnh và chữa bệnh. Tuy nhiên, có IIÌIÌCLI loại cây thuốc còn dùng trong
phạm vi kinh nghiệm dân gian. Vì vậy, việc nghiên cứu các cây thuốc này một
cách khoa học nhằm làm sáng tỏ kinh nghiệm dân gian, đẩy mạnh việc khai
thác sử dụng, nâng cao tính an loàn, hiệu quả điều trị là một vấn đề cần thiết.
Bệnh nấm là một bệnh khá phố biến và hiện nay đang phát triển mạnh.
Đặc biệt điều kiện khí hậu của nước la Iiónu ấm rất lliích hợp cho sự phát triển
của nấm. Đồng thời còn do những liến bộ trong y học như: chiếu xạ, thay thế
phủ tạng, sử dụng nhiều thuốc corticoid và kháng sinh phổ rộng kéo dài, hoá
trị liệu ung thư, do HIV...D0 đó, việc tìm thuốc để điều trị bệnh này là một
vấn đổ đáng được quail (full.
Trước thực tế dỏ chúng tôi dã lựa chọn nghiên cứu một trong số các cây
thuốc nam thường được nhân dân ta sử dụntĩ để chữa nấm. Đó ]à cây Bạch
ỉ lạc, có lổn khoa học: kl)in;ic;iiill)iis Iiiisuliis (I. ) Kill'/,, họ Ổ rỏ Acanlliíiccíic

với các mục tiêu sau:
- Thăm dò thành phần hoá học (rong rễ, thân, lá.
- Thăm dò hoạt tính chống nấm của rẻ, thân, lá.
- Phân lập và nhận dạng các chất có hoạt t ính.
Qua đó góp phần làm sáng tỏ kinh nghiệm dân gian trong việc sử dụng
cây thuốc này để chữa nấm. Trên co' sở đó từng bước đưa dược liệu vào ứng
dụng rộng rãi sau này.

I


PHẨN I: TỔNG QUAN
1.1. Bệnh nấm và các thuốc điều trị
1.1.1. Đặc điểm của bệnh nấm
Bệnh nấm (mycoses) là hậu quả của sự kí sinh của vi nấm ở trên da,
niêm mạc, xương khứp, thần kinh và trong các pluì lạng khác. Trong số
100.000 loài vi nấm đã được biếl đến liiộn nay thì đã có tới hàng trăm loài có
khả năng gây bệnh cho người. [71.
Các nhà vi nấm y học chia các bệnh vi nấm ra làm 3 nhóm chính
-

[7] :

Bệnh vi nấm ngoại biên (superficiel mycoses): bệnh hăm, bệnh viêm

giác mạc do nấm, bệnh viêm tai do nấm, bệnh trứng tóc, bệnh lang ben...
-Bệnh vi nấm ngoài da (clcrmarlophytoses): bệnh do Microsporum,
bệnh do Epidermophyton, bệnh do Trichophyton...
-Bệnh vi nấm nội tạng (systemic mycoses): bệnh do Candida, bệnh do

Histoplasma, bệnh do Aspergillus, bệnh do Mucor, bệnh do Cryptococcus...
Trong vòng khoảng 20 năm trỏ' lụi dây, các bệnh do vi nấm gây ra gia
tăng mạnh do mồi trường bị ô nhiễm nghiêm Irọng và do những tiến bộ trong
y học. Các bệnh này thường; eặp nhiều ở những người có hệ miễn dịch suy
yếu (do ghép CƯ quan, do lioá (rị liệu mm thư, (lo IIIV ...), người tlượe dùng
các phương pháp điều trị xâm nhập (đặt ống dẫn lưu bay những dụng cụ ngoại
lai ...) [lj. Đen nay, những bệnh vồ nam cỏ lý lộ cao và là nguyên nhân gây
lử vong quan trọng tronụ sô hộnli nhân Iiltập viện. Tíìn suât của bệnh nâm
Candida tăng lên 10 lần và trở thành một quần thề phân lập được trong máu
hay gặp thứ tư. Bệnh nấm Aspergillus xám nhập ở phối là nguyên nhân chủ
yếu gây tử vone; ỏ' bệnh nhân e,hép tuỷ [ 11. Nhiều trường hợp nhiễm nấm cơ
hội không thể chẩn đoán dirực bằiiíi pillion 12, pháp nuôi cay máu thông tỉurờng
và chỉ được điều trị theo kinh nghiệm ở những bệnh nhân suy giảm miễn dịch
nghiêm trọng.[l]


1.1.2. Các thuốc thường dùng đ ể chống nấm
Theo cấu trúc hoá học các thuốc chống nấm được phân chia thành các
nhóm trong bảng sau:
Bảng ] : Các thuốc thường dùng để chống nấm.[24],
STT Nhóm thuốc
1 Polyen

2
3
4
5

Nystatin
Amphotericin B

Piramicin
Naftitine
Allyamin
Terbinifine
Thiocarbamat Tolnaftat

Tương tự
nucleotide
Azole

7

Bcnzofuran
Grisovin
Pyrimidine

8

Diamidine

9

Antifonate

6

Tên thuốc

Cơ chế tác dụng
Huỷ hoại tính bán thấm của màng

tế bào
ức chế sự tổng hợp chất ergosterol
của màng tế bào nấm.
ức chế sự tổng hợp chất ergosterol
của màng tế bào nấm.
ức chế tổng hợp thành tế bào.

Nikkomicin
Polyoxin
Butoconazole
Clotrimazole
Econazole
Fluconazole
Itraconazole
Kctoeonazolc
Miconazole
Oxiconazole
Sulconazole
Terconazole
Tioconazole
Griscofulvin

ức chế sự tổng hợp chất ergosterol
có trong màng tế bào nấm.

ức chế quá trình phân chia nhân

5- Fluorocytosine ức chế quá trình tổng hợp
a.nucleic
Tác động lên chức năng a.nucleic

Pentamidine
Isothionate
Trimethoprim/
Sulfamethoxazol

3

ức chế sự tổng hợp a.nucleic


Hình 1: Vị trí tác dụng của một số thuốc chống nấm.[l]
Tổng hợp
thành tế bào
. Polyoxin
. Nikkomycin
Chức năng màng
. Amphotericin B
. Nystatin

Chức năng acid nucleic
. Fentamidin

\
Tổng hợp ergosterol
. Azol
. Allyamin
.Thiocarbamat

\

Phân cilia nhân.
. Griseofulvin
, Benomyl

Tổng hợp acid nucleic
. 5 Fluorocytosin
. Trimethoprim
. Sulphamethoxazol

Tổng họp Protein
. Blasticidin
. Sinefulgin

,1.2 Khảo sát so bộ các cây thuốc có khả năng kháng nấm:
Các cây thuốc có tác dụng kháng nấm tương đối phổ biến và có mặt ở
nhiều họ thực vật. Theo các tác giả Đỗ Tất Lợi [18], Phạm Hoàng Hộ [16],
Võ Văn Chi [12] và tài liệu của Viện Dược liệu, trong hệ cây thuốc Việt Nam
có khoảng 59 họ và 150 loài thực vật có khả năng kháng nấm, trong đó có
nhiều cây đã xác định được hoạt chất kháng nấm. Ba họ thực vật có số loài có
tác dụng kháng nấm nhiều nhất là:
-Họ Đậu(Fabaceae) - có 14 loài.
-Họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) - có 12 loài.
- Họ Cúc (Asteraceae) - có 9 loài.

4


1.3.

Cây Bạch hạc

Cây Bạch hạc còn có tên là Kiến cò, cây lác, chòm phón (Nùng), Nam

uy linh tiên, có tôn khoa học Rhinacantluis nasutus (L.) Kurz họ Ôrô
Acanthaceae. [12, 13, 17, 18].
1.3.1. Mô tả cây
Cây nhỏ mọc thành bụi, thân đứng cao l-2m có nhiều cành. Thân non có
lông mịn, lá đơn, nguyên, mọc đối, phiến lá hình trứng thuôn dài, phía cuống
tù, đầu nhọn, dài khoảng 2-9cm, rộng khoảng l-3cm, mặt trên nhẵn, mặt dưới
hơi có lông mịn. Hoa nhỏ màu trắng, mọc thành xim ở kẽ lá hay đầu cành,
nom dáng như đàn hạc bay, nên gọi là Bạch hạc. Lá bắc hình chỉ, có lông. Đài
5, hình chỉ, có lông, gần đều nhau, rời từ gốc. Tràng hoa màu trắng hay hoa cà
điểm hồng, ống tràng đài, phía trên xẻ hai môi khác nhau rõ rệt: môi trên hình
mác xẻ 2, môi dưới khía 3 thuỳ . Nhị 2, bao phấn 2 ô, hướng trong, không có
nhị lép, bầu trên. Quả nang dài, có lông, phía dưới dẹt lép, phía trên chứa 4
hạt, có khi chỉ có 2 hạt. Hạt hình trứng hai mặt lồi.
1.3.2. Phân bố, thu hái, chế biến
Cây Bạch hạc mọc hoang ở nhiều tỉnh miền Bắc nước ta, còn thấy mọc
ở Ấn Độ, Malayxia, Thái Lan, Đông châu Phi. Cây Bạch hạc có khi được
trồng làm cảnh, thường được trồng bàng cành, gốc, rễ vào mùa xuân.
Bộ phận sử dụng: cành, lá (thường dùng tư ơ i), rễ (tươi và khô ). Có thể
thu hái quanh năm, nhưng tốt nhất là vào mùa đông. [12,13,17,18]
1.3.3. Thành phần hóa học
1.3.3.1. Các nhóm chất đã được xác định
* Rễ chứa các nhóm chất: alkaloid [27], benzennoid [26, 27, 28],
steroid [25, 26], quinoiđ [21, 23, 25, 27, 28], triterpen [25, 26], flavonoid [27,
28], coumarin [27, 28].
* Thân và lá chứa các nhóm chất: triterpen [26], quinoicl ị20, 261,
benzenoid [26J, steroid 127].
* Hoa chứa Rutin và Quercetin [22].

5


Bảng % : Các hợp chất lioá học đuọc phân lập từ
Rhinacanthus nasutusịL.) Acanthaceae ị 19-23, 25-28]
STT

Tên chất

Nhóm chất

Bộ phận cây

Tên nước

1

Allantoin

Alkaloid

Rễ

Đài Loan

2

Amyrin, beta

Tri terpen

Lá, thân

Đài Loan

3

Daucosterol

Steroid

Rễ

Đài Loan

4

Glutinol

Triterpen

Lá, thân

Đài Loan

5

Lupeol

Tri terpen

Rễ

Đài Loan

Lá, thân

Đài Loan

Hàm lượng (%)
0,17241

0,01194

6

Oroxylin A

FI avon

Rễ

Đài Loan

0,000206

7

Praeruptorin.

Coumarin

Rễ

Đài Loan

0,00013

8

Rlỉinacanlhin A

Quinoitl

RỒ

Đài Loan

0,00333

9

Rhinacanthin B

Quinoid

Rễ

Đài Loan

0,01724

10

Rhinacanthin c

Quinoid

Thân

Thái Lan

0,005

RỖ

Đài Loan

0,11379

Thân

Thái Lan

0,0007

RỖ

Đài Loan

0,00255

11

Rhinacanthin D

Quinoid

12

Rhinacanthin E

Lignan

Thân, lá

Thái Lan

0,00079

13

Rhinacanthin F

Lignan

Thân, lá

Thái Lan

0,00048

14

Rhinacanthin G

Quinoid

Rễ

Đài Loan

0,00462

15

Rhinacanthin H

Quinoid

Rễ

Đài Loan

0,00275

16

Rhinacanthin I

Quinoid

Rễ

Đài Loan

0,00372

6


17

Rhinacanthin J

Quinoid

Re

Đài Loan

0,00151

18

Rhinacanthin K

Quinoid

Rễ

Đài Loan

0.00172

19

Rhinacanthin L

Quinoicl

RỖ

Đài Loan

0.000206

20

Rhinacanthin M

Quinoid

Rễ

Đài Loan

0.00365

21

Rhinacanthin N

Quinoid

Rễ

Đài Loan

0,00117

22

Rhinacanthin 0

Quinoid

Rễ

Đài Loan

0,00034

23

Rhinacanthin p

Quinoid

Rễ

Đài Loan

0,00006

24

Rhinacanthin Q

Quinoid

Rễ

Đài Loan

0,000206

25

Rhinacanthon

Quinoid

Thân, lá

Ấn Độ

0,00933

Rẽ

Đài Loan

0,00020
0,04

26

Rutin

Flavonol

Hoa

Ấn Độ

27

Sitoaterol, beta

Steroid

Rễ

Đài Loan

Lá, thân

Đài Loan

RỖ

Đài Loan

Lá, thân

Đài Loan

28

29

Stigmasteron

Syringaldehyd

Steroid

Benzenoid Rễ

Đài Loan

0,00013

Rễ

Đài Loan

0,00013

30

Syringic acid

Benzenoid Lá, thân

Đài Loan

31

Umbelliferon

Benzenoid Lá, thân

Đài Loan

32

Vanillic acid

Benzenoid Lá, thân

Đài Loan

33

Wogonin

FI avon

Rễ

Đài Loan

0,000345

Rễ

Đài Loan

0,00034

7


I J .3.2.Cấn trúc lióa liọc did mội sô hợp cIkÍI
a. Nhóm Naphtopyran:

/O J
Ị^ j
'
ị,
u
o
K illin ’’ kh iiiin iinlhin

A, B,

í hức (R)

Ti ll c hill

-OH

Rhinacanlhin A
_ > °
_ v °

o

Rhinacanthin 0

/
Ó

Rhinacanthin p

1 ò

h °

/
Ọ
/

Rliinacanlhin B

OH

b. Nhóm Naphtoquinon

o

Khung chung

8

o,

p.


'{ ^ ° y ' L
()

As./

Rhinacnnthin D

Rhiiiacaiilliin 11

Rliiiiacaiilhii) ( ì

o

Rhinacnnthin c

Nhóm thế R

Ten chất

Nhóm thế R

/

Tên chất

II

011

0

Rliinacanlliiii J

Khinacanthin 1
0

-. Y(..

OH

1

Ỵ L^ / U- L If0
0

OH

Rhinacanthin L

Rhinacanthin K
0

0

OH

0H
OMe

Rhinacanthin M

Rhinacanthin N

0

X

H2OOC

JốO
0H

OMe

Rhinacanthin Q

CII,,OCX'. r

Ị

o

OMe

c. Nhóm Lignan

9


1.3.4. Tác dụng
ì .3.4.1. Tác dụng dược lý
Các nghiên cứu với dịch chiết toàn phần cũng như các phân đoạn và các
chất chiết được từ Bạch hạc cho thấy nó có những tác dụng sau:
- Kháng nấm [12, 13, 17-19, 27, 28]
- Kháng virus [19, 27, 28]
- Kháng vi khuẩn [4]
- Chống ung thư [27, 28]
- Chống tăng huyếl áp [12, 13, 17, 18]
1.3.4.2. Công dụng và cách dùng theo y học cổ truyền
a.

Rề

Vị đắng, tính ấm. Qui kinh can, phế, tỳ. Tác dụng thông kinh lạc, trừ
phong thấp, sát trùng ngoài da. 1111
*1* Dùng trong: Ngâm rượu đê uống có tác dụng tiêu thũng thống, chữa khí hư,
bạch đới, phong thấp tê bại, đau lưng, nhức gân xương. Có thể dùng
6-12g/ngày dưới dạng thuốc sắc. [11]

♦> Dùng ngoài: Chữa hắc lào và một số bệnh ngoài da nhu' chốc, lở, mụn rộp
(herpes), eczema mãn tính. Đem rễ thái nhỏ, ngâm rượu hoặc dấm, sau 7 ngày
lấy dịch bôi lên chỗ bị bệnh. Bôi liên tục 10-15 ngày. Có thể thêm bột long
não và dịch quả chanh ( tỉ lệ lOg rễ bạch hạc với lg bột long não và nửa thìa
chanh) tác dụng càng tốt hơn. [12, 13, 17, 18]
b. Thân, lá [12, 13, 18]
Thường dùng trị:
*1* Lao phổi khởi phát, viêm phế quản cấp và mạn Cách dùng: thân và lá bạch
hạc 20g sắc nước cho thêm đường uống.
♦♦♦ Huyết áp cao: Liều dùng 9-15 g dạng thuốc sắc.
*1* Dùng ngoài trị hắc lào, lở ngứa, eczema. Lấy lá cây tươi đắp hoặc nấu
nước rửa, giã một lượng vừa đủ lá cây tươi, them cồn 70° hoặc dầu hỏa ngâm
7 ngày rồi đem dùng ngoài.

10


PHẨN II: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1 Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu.
2.1.1 Nguyên vật liệu.
2.1.1.1 Nguyên liêu.
Nguycn liệu nghiên cứu là cây hạch hạc thu hái ở trung tâm trồng và
chế biến cây thuốc của Viện Dược liệu. Cây đã được giáo sư Vũ Văn Chuyên
xác định tên khoa học là Rhinacanthus nasutus (L.) Kurz Acanthaceae. Thu
hái cây vào tháng 2 lúc cây dang ra hoa và tlưực 2 năm sau khi Irổng.
Cây sau khi thu hái tách riêng rễ, thân, lá. Sau đó rửa sạch, hong khô.
Sấy ở 110°c trong 10 phút để diệt men. Sấy khô dược liệu ở 60°c. Tán dược
liệu thành bội, bảo quản hột dược liệu trong, bình Ill'll Ảm dể làm thí nghiệm.
2.1.1.2 Hoá chất và dung cu thí nghiêm.
Các dung môi, hoá chất và thuốc thử dùng trong ngiên cứu đạt tiêu

chuẩn của Dược điển Việt Nam.
- Máy xác định độ ẩm dược liệu Precisa HA60 (Thụy Sỹ)
- Nồi hấp tiệt trùng Hyrayama (Nhật).
- SKLM dùng ban mỏng tráng san Ỉ \ V( của Merck (Đức).
- SK cột dùng chất hấp phụ silicagel cỡ hạt 5-40 |Limcủa Viện Kiểm nghiệm.
2.1.1.3. Vi nấm kiểm đinh và mồi trường dinh dưỡng.
*Vi nấm kiểm định.
- Candida albicans CIDV 216.
- Saccharomyccs ccrcvisiae DĨPC I 12.
- Aspergillus niger DIPC 109.
♦ Môi trường dinh dưỡng.
♦ Môi trường Sabouraud lỏng (MT1)
Pepton 10, Og.
Glucose: 20,Og

Nước cất vđ 1000ml.
pH = 5,8 ± 0,2

♦ Môi trường Sabouraud đặc (MT2)
Nước cất vđ: 1000ml
Pepton 10, Og.
pH = 5,8 ± 0,2
Glucose: 20,Og.
Thạch 16,0g.
Các môi trường được hấp tiệt trùng ở 0.9alm/ 30 phút.


2.1.2. Phương pháp nghiên cứu
2.1.2.1. Phương pháp đinh tính các nhổm chất hữu cơ trong dươc liêu
Tiến hành theo phương pháp của các tài liệu: [2, 3, 14]

2.1.2.2. Phương pháp khuếch tán trên thach
Nguyền tắc: Các khoanh giấy có tẩm dịch chiết được đặt trên mặt đĩa
thạch dinh dưỡng đã cấy vi nấm chỉ thị. Các hoạt chất có trong dịch chiết sẽ
khuếch tán vào mỏi trường, tiêu diộl hoặc ức chế vi nấm pliát triển tạo thành
vòng vô nấm có đường kính tỷ lệ thuận với logarit nồng độ của các hoạt chất.
Khả năng kháng iiAìn của (lịch cliicí được thổ liiỌn bằng đường kính vòng vỏ nấm.
Các phần dịch chiết của rễ, thân, lá được thử định tính kháng nấm bằng
phương pháp này.
2.1.2.3. Phương pháp phủ thach trưc tiếp lẽn bản sác ký lớp mòng
Phương pháp này được áp dụng để tìm các vết có hoạt tính kháng nấm.
Tiến hành: đưa dịch chiết lên bản mỏng và khai triển bằng hệ dung môi
n-hexan : EtOAc [7:3], bản mỏng để khô tự nhiên, soi u v để đánh dấu các
vết. Phủ thạch đã trộn vi nấm chỉ thị (C. albicans). Đánh giá hoạt tính kháng
nấm của các vết thông qua vòng vô nấm xuất hiện ở các vết.
2.1.3.4. Phương pháp phân lâp chất cổ hoat tính
* Sắc ký cột: được áp dụng để tách các chất ở phần dịch chiết ether dầu
của rễ. Dùng silicagel cỡ hạt 5-40 |»im làm chất hấp phụ và dung môi rửa giải
là hệ n-hexan : EtOAc (10:0 -» 0:10).
* Dùng SKLM để kiểm tra độ tinh khiết của chất phân lập được và đối
chiếu với các vết có hoạt tính .
2.1.3.5. Xác đinh cấu trúc của chất phân lâp dươc
Dựa trên các phổ: ‘H - NMR, l3C - NMR, có tham khảo phổ của các
chất đã được phân lập.

12


2.2. Kết quả thực nghiệm và nhận xét
2.2.1. Đặc điểm thực vật cây Bạch hạc Rhinacanthus nasutus(L.)
Kurz Acanthaceae.

Đã tiến hành quan sát hình thái thực vật cây Bạch hạc được trổng làm
thuốc ở trung tâm trồng và chế biến cây thuốc ở Văn Điển của Viện Dược liệu.
Cây nhỡ, cao khoảng l-2m, thường mọc thành bụi. Lá đơn, nguyên,
mọc đối, phiến lá hình ti ứng dài khoảng 2-9cm, rộng khoảng l-3cm.
Hoa nhỏ mẩu trắng, mọc thành xim ở kẽ lá. Hoa không đều, lưỡng tính.
Lá bấc hình chỉ,có lông. Đài 5, hình chỉ, có lông, gần đều nhau, rời từ gốc.
Tràng hoa màu trắng, ống tràng dài, phía trcn xỏ 2 môi khác nhau rõ rệt: môi
trên hình mác xẻ 2, môi dưới khía 3 thuỳ. Nhị 2, bao phấn 2 ô, hương trong,
nhị dính vào ống iràng, không có nhị lép, báu trên. Quan sát cây ở hình 2.
Ảnh 1: Cành mang hoa của cây Bạch hạc

13


2. 2 . 2. Đ ịn h tín h c á c I1Ỉ1ÓI11 cliấl h ữ u cơ

pliiỉn II'IIJH lioíí học

* Định tính alkaloid.
Cho khoảng 3g bột dược liệu vào bình nón dung tích 100ml, thấm ẩm
dược liệu bằng dung dịch NH4OH 6 N. Sau 30 phút cho 15 ml chloroform vào,
đậy kín. Ngâm 12h, gạn dịch chloroform vào bình gạn. Sau đó lắc kỹ với dd
H2S041N, gạn lấy dịch chiết acid, chia đều vào các ống nghiệm nhỏ, mỗi ống
lml.Tiến hành các phản ứng với thuốc thử tạo tủa chung của alkaloid: TT
Mayer, TT Bouchardat, TT Dragendorff. Dịch chiết rễ cho kết quả dương tính,
dịch chiết thân và lá cho kết quả âm tính.
Kết luận: rễ có alkaloid, thân và lá không có alkaloid.
* Định tính anthranoỉd.
- Phản ứng Bornlracgcr
Lấy 3 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100ml. Thêm 40 ml

dung dịch H2S04 2 N, đun sôi cách thuỷ trong vòng 15 phút. Đổ nguội, lọc lấy
dịch lọc vào bình gạn. Lắc với 5ml ether ethylic, gạn lấy lớp ether ethylic.
Tiến hành phản ứng Borntraeger với dd NaOH 10%. Nhận thấy lớp nước của
3 dịch chiết có màu đỏ sim.
Kết luận: rễ, thân, lá có anthranoid.
* Định tính saponin.
- Phản ứng tao bot
Cho vào ống nghiệm to lml dịch chiết ethanol của bột dược liệu. Thêm
5ml nước cất, lắc mạnh trong 5 phút, để yên trong 15 phút. Nhận thấy cột bọt
của cả 3 dịch chiết đẻu cao và bền vững. Phản ứng dương tính với cả ba dịch
chiết rễ, thân, lá.
- Phản ứng Liebermann- Burchardt
Cho lml dịch chiết ethanol vào ống nghiệm. Bốc hơi tới cắn. Hoà tan
cắn bằng chloroform. Thêm hỗn hợp để lạnh ở 0°c (lml anhydric acetic + lml
chloroform + 1 giọt H2S04 đặc), nhận thấy xuất hiện màu hổng ở cả ba mẫu
thử. Phản ứng dương tính với cả ba dịch chiết rễ, thân, lá.

14


- Phản ứng Salkowski
Cho lml dịch chiết ethanol vào ống nghiệm. Bốc hơi tới cắn. Hoà tan
cắn bằng 1till chloroform. Thôm từ lừ Iml acid II2S 04 đặc llieo (hành ống
nghiệm. Nhận thấy xuất hiện vòng màu hồng ở cả ba mẫu thử. Phản ứng
dương tính với cả ba dịch chiết rễ, thân, lá.
Kết luận: rễ, thân, lá có saponin.
* Định tính Tanin.
Cho vào bình nón dung tích 100ml khoảng 5g bột dược liệu, thêm 20ml
nước cất đun sôi trên bếp qua lưới amiăng trong thời gian khoảng 5 phút, lọc
nóng, dịch lọc được làm các phản ứng:

- Phán ứng với dd FcCU 5%
Lấy Iml dịch chiết cho vào ống nghiệm, thêm vài giọl dd FeCl3 5%.
Thấy xuất hiện màu xanh ở cả ba mẫu thử.
- Phản ứng với dd gelatin 1%
Lấy lml dịch chiết cho vào ống nghiệm, them vài giọt dd gelatin ỉ %.
Thấy xuất hiện tủa bông trắng ở cả ba mẫu thử.
Kết luận: rễ, thân, lá có tanin.
* Định tính Flavonoid.
- Phản ứng Cvanidin
Cho lml địch chiết ethanol vào ống nghiệm, thêm một ít bột Magie kim
loại và vài giọt acid HC1 đặc, đun nóng trên nồi cách Ihuỷ. Nhận thấy mẫu thử
thân có màu vàng, phản ứng âm tính. Mãu thử rễ, lá xuất hiện màu hồng đỏ,
phản ứng dương tính.
- Phản ứng vứi kiém
Cho lml dịch chiết ethanol vào ống nghiệm thêm vài giọt dd NaOH
10%. Nhận thấy mẫu thử rễ cho màu đỏ, mẫu thử lá có màu vàng đậm, mẫu
thử thân không phản ứng.

15


- Phản ứng với dd FeCU 5%
Cho Iml dịch chiết ethanol vào ống nghiệm, thêm vài giọt dd FeCl3 5%.
Mẫu thử rễ, lá xuất hiện tủa xanh đen. Mẫu thử thân không thấy phản ứng xảy ra.
Kết luận: rễ, lá có ílavonoid, thân không có flavonoid.
* Định tính Coumơrin.
Chiết nóng khoảng 5g bột dược liệu bằng cồn 90°, lấy dịch chiết cồn
làm các phản ứng định tính.
- Phản ứng mở đổng vòng lacton
+ Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống lml dịch chiết.

ống 1 thêm 0,5rnl dd NaOH 10%.
ống 2 để nguyên.
+ Đun cả 2 ống nghiệm đến sôi- để nguội.
Nhận thấy: ống 1 của 3 mẫu thử đều đục vàng,
ống 2 của 3 mẫu thử đều trong
+ Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2ml nước cất. Lắc đều.
Nhộn thấy: ống I: của 3 mẫu thử đều írong suốt.
ống 2: của 3 mẫu thử đều có tủa đục.
+ Acid hoá ống 1 bằng 2 giọt HC1 đặc thấy ống 1 trở lại đục như ống 2 ở cả ba
mẫu thử.
Phản ứng dương tính với cả ba dịch chiết rễ, thân, lá.
- Soi huỳnh quang dưới ánh sáng u v
Nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc, nhỏ tiếp lên trên giọt đó 1 giọt dđ
NaOH 10%. Để khô rồi soi dưới ánh sáng đèn tử ngoại thấy có huỳnh quang ở
cả 3 mẫu thử. Phản ứng dương tính với cả ba dịch chiết rễ, thân, lá.
Kết luận: rễ, thân, lá có coumarin.
* Định tính acid hữu cơ.
Cho lg dược liệu vào ống nghiệm, thêm 10ml nước cất. Đun sôi trực
tiếp 10 phút, để nguội, lọc. Thêm vào dịch lọc một ít tinh thể Na2C 03. Không
thấy có bọt C 0 2bay lên ở cả 3 mẫu thử.
Kết luận: rễ, thân, lá không có acid hữu cơ.

16


* Định tính đường khử.
Lấy 2g bột dược liệu cho vào ống nghiệm to, thêm 10mlcồn. Đun

cách

thuỷ 10 phút, lọc. Cho lml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ,thêm3 giọt thuốc
thử Feling A và 3 giọt thuốc thử Feling B, đun cách thuỷ trong 10 phút, thấy
có tủa đỏ gạch ở cả 3 mẫu thử.
Phản ứng dương tính với cả ha dịch chiết rễ, thân, lá.
Kết luận: rễ, thân, lá có đường khử tự do.
* Định tính chất béo.
Chiết bằng dụng cụ Soxhlct trên nồi cách thuỷ khoảng 5g bộl dược liệu
với dung môi ether dầu hoả, cất thu hồi bớt dung môi, dịch chiết đậm đặc
được dùng làm phản ứng định tính.
Chấm 3 giọt dịch chiết đậm đặc trôn giấy bóng mờ, hơ trên bếp điện đến
khô, không thấy để lại vết mờ ở cả 3 mẫu thử.
Kết luận: rễ, thân, lá không có chất béo.
* Định tính Carotenoid.
Cho vào ống nghiệm lml dịch chiết ether dầu hoả. Đun cách Ihuỷ cho
bay hơi hết dung môi. Thêm 2 giọt H2S04 đặc, không thấy xuất hiện màu
xanh lá ở 3 mẫu thử.
Kết luận: rễ, thân, lá không có carotenoid.
* Đinh tính phytosterol
Cho vào ống nghiệm lml dịch chiết ether dầu hoả. Bốc hơi dung môi
đến khô, cho vào ống nghiệm lml anhydric acetic, lắc kỹ, thêm 1ml H2S04 đặc
theo thành ống nghiệm. Thấy ở mặt phân cách giữa 2 lớp chất lỏng của mẫu
thử thân và lá xuất hiện một vòng tím đỏ, lắc nhẹ, lớp chất lỏng trên có màu
xanh. Mẫu thử rễ không xảy ra phản ứng.
Kết luận: lá, thân có phytosterol; rễ không có phytosterol.
Kết quả định tính các thành phần hoá học bằng phản ứng trong ống
nghiệm được tóm tắt ở bảng 3.

17

Bảng 3: Kết quả định tính các nhóm chất có trong cây

TT

1

Anthranoid

3

Saponin

4

5

6

thuốc thử

Tanin

Flavonoid

Coumarin

Rễ

Thân

Lá

- Phán ứng với thuốc thử Maycr

+

- Phản ứng với thuốc thử Bouchardat

+

_

_

- Phản ứng với thuốc thử Dragendorff

+

—

—

+++

++

++

- Phản ứng tạo bọt

++

++

+++

- Phản ứng Liebermann-Burchard

H—h

++

+++

- Phản ứng Salkowski

++

++

+++

- Phản ứng với dung dịch FeCỈ3 5%

++

++

++

- Phản úng với dung dịch Gelatin 1%

++

++

++

- Phản ứng Cyan id in

++

- Phản ứng với NaOH 10%

+

_

++

- Phản ứng với FeCl3 5%

++

—

++

- Phản ứng mở đóng vòng lacton

++

++

++

- Soi huỳnh quang ƯV

++

++

++

--

—

—

++

++

++

--

—

—

Alkaloid

2

Kết quả

Phản ứng định tính với các

Nhóm chất

Phản ứng Borntraeger

_

++

7

Acid hữu cơ

-

Phản ứng với Na2C 0 3

8

Đường khử

-

Thuốc thử Fehling (A+B)

9

Chất béo

-

Để lại vết mơ trên giấy bóng

10

Carotenoid

- Phản ứng với H2S04 đặc

--

—

—

11

Phytosterol

-

Phản ứng Liebermann

—

++

+++

Ghi chú:
- (+)

: Phản ứng dương tính.

- (+++): Phản ứng lên rất rõ.

- (++) : Phản ứng lên rõ.

- (-):Phảnứngâmtín


Nhân xét: kết quả thu được từ các phản ứng định tính sơ bộ trong ống
nghiệm cho thấy:
Rễ có chứa alkaloid, anthranoid, saponin, tanin, flavonoid, coumarin,
đường khử.
ThAn có chứa anlliraiioid, saponin, lanin, coumarin, dường khử,
phytosterol.
Lá có chứa anthranoid, saponin, lanin, riavonoid, coumarin, đường khử,
phytosterol.

2.2.3. Thăm dò tác dụng kháng nấm của rễ, thân, lá Bạch hạc.

2.2.3.1. Chuẩn bị.
Tiến hành chiết xuất dược liệu với các dung môi ether dầu hoả,
methanol 80%, nước cất. Các dịch chiết lọc qua bông và được cô đặc đến tỷ lệ
1:1 theo sơ đồ 1:
Sơ đổ 1: Sư dồ cliiêi xiiâl cltrực liệu

R|, T|, L,: dịch chiết ether dầu của rễ, thân, lá.
R2, T2, L2: dịch chiết Methanol của rễ, thân, lá.
R„ T„ L,: dịch chiết nước của rỗ, Ihân, lá.

19


* Chuẩn bị khoanh giấy lọc.
Dùng khoanh giấy có đường kính khoảng 6mm. Mỗi khoanh thấm được
khoảng 0,1 ml dịch chiết. Khoanh giấy được sấy tiệt trùng ở 118°c trong 30
phút trước khi tẩm dịch chiết. Tẩm với dịch chiết 3 lần, sau mỗi lần sấy khô
khoanh giấy ở 40-45°C.
* Môi trường dinh dưỡng.
- Môi trường Sabouraud lỏng (MT1).
- Môi trường Sabouraud đặc (MT2).
- Dung dịch tween 0.5%
- Dung dịch NaCl 0.9%
Các môi trường và dung dịch được hấp tiệt trùng ở 0,9 atm / 30 phút
* Chuẩn bị nhũ dịch vi nấm
Các chủng vi nấm c. albicans và s. cerevisiae trước khi thử được cấy
vào môi trường dinh dưỡng Sabouroud lỏng. Sau 18 - 24h nuôi cấy, pha trong
dung lỉịcli nước muối sinh lý NaCI 0,9% (lổ (lược các nhũ (lịch vi nấm vó nồng
độ khoảng 107- 108tếbào/ml.
Dùng dd tween 0.5% lấy bào tử vi nấm A. niger trong môi trường dinh

dưỡng thạch tạo nhũ dịch bào tử vi nấm có nồng độ khoảng 107-108 bào tử/ml.
2.2.3.2. Tiến hành.
Trên các hộp petri có đường kính như nhau. Cho vào mỗi hộp petri
20ml môi trường Sabouroud có trộn nhũ dịch vi nấm kiểm định với tỷ lệ 2,5%
so với môi trường.
Sau khi thạch nguội, các khoanh giấy đã tẩm dịch chiết được đặt lên bề
mặt thạch theo một sơ đồ đã qui định, ủ các hộp petri trong tủ ấm ở 28°c. Sau
18- 24h đối với nấm men và sau 24-48h đối với nấm mốc, kết quả được đọc
bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn với độ chính xác đến 0,1 mill.
Song song tiến hành trong cùng điều kiện với mẫu so sánh là nipazil với
nồng độ 40mg/ml ( ký hiệu: N0).

20


T iến hành 3 Kill, IAy kết

C ]iiả

trung bình. Kốl quả dược Ihd hiện (Vbảng 4.

Bảng 4: Kết quả thử tác dụng kháng nấm của các (lịch chiết toàn phần.
Đường kính vòng vô khuẩn (ìnm)
TT

Mẫu thử

C.albicans

Saccharoniyces

A.niger

cerevisiae
1

R|

18,3

19,4

16,5

2

r2

20,4

22,6

19,3

3

r3

17,2

18,5

9,1

4

T,

12,4

14,3

7,4

5

t2

14,8

15,4

9,3

6

t3

8,6

9,7

7,1

7

L.

13,1

15,3

8,5

8

L2

15,2

17,4

10,6

9

L3

10,5

11,2

7,8

10

N0

9,7

9,5

9,2

Nhận xét: các dịch chiết của rễ, thân, lá đều có tác dụng kháng nấm. Trong
các dịch chiết thì dịch chiết cồn 80% ở cả ba bộ phận của cây là có tác dụng
cao nhất. Trong ba bộ phận của cây thì các dịch chiết của rễ cho kết quả cao
hơn các dịch chiết tương ứng của thân và lá. Như vậy rễ có tác dụng kháng
nấm cao nhất. Vì vậy, tiếp tục tạp trung nghiên cứu sâu hơn tác dụng kháng
nấm của rễ.

21