Xác định kiểu cách cư trú và gen độc lực của staphylococcus aureus ở nhóm người làm việc tại vài cơ sở dịch vụ ăn uống

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

LÊ KHÁNH TRÂM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

Hà Nội - 2013

BỘ Y TẾ


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

LÊ KHÁNH TRÂM

Chuyên ngành: Vi sinh y học
Mã số: 62720115

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
PGS. TS. ĐINH HỮU DUNG
PGS. TS. NGUYỄN VŨ TRUNG

Hà Nội - 2013

Lời cám ơn
Để hoàn thành luận án này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của các
thày cô giáo, bạn bè, đồng nghiệp và gia đình.
Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Đinh Hữu
Dung, PGS.TS. Nguyễn Vũ Trung, những người thày đã trực tiếp hướng dẫn và
tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS. Lê Văn Phủng, Trưởng Bộ môn Vi sinh
Trường Đại học Y Hà Nội, PGS.TS. Nguyễn Thị Vinh, TS. Phạm Hồng Nhung,
TS. Lê Văn Duyệt, ThS. Văn Đình Tráng hướng dẫn và đóng góp cho tôi những ý
kiến quý báu trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn
CN. Nguyễn Thị Minh Thư, CN. Vũ Thị Hồ Vân, KTV. Lê Thị Hải, KTV. Phạm Thị
Vinh, những người đã giúp đỡ tận tình trong quá trình thực hiện nghiên cứu.
Tôi xin trân trọng cám ơn Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau đại học, các
thày cô giáo Bộ môn Vi sinh, Trường Đại học Y Hà Nội đã trang bị kiến thức, tạo
điều kiện, giúp đỡ cho tôi trong thời gian học tập tại trường. Tôi xin bày tỏ lòng
biết ơn tới Ban Giám đốc Bệnh viện Bạch Mai, Ban Lãnh đạo và tập thể Khoa Vi
sinh Bệnh viện Bạch Mai đã tạo điều kiện và động viên tôi học tập tốt.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc và Tập thể khoa xét nghiệm Bệnh
viện Nhiệt đới Trung ương, Trung tâm Y tế Dự phòng Hà Nội, Trung tâm Y tế
Quận Đống Đa, các nhân viên của các cơ sở dịch vụ ăn uống tham gia nghiên
cứu, đã giúp đỡ tôi thực hiện nghiên cứu, thu thập số liệu phục vụ luận án này.
Tôi vô cùng biết ơn những người thân trong gia đình và bạn bè thân thiết
đã động viên, hỗ trợ tôi cả về tinh thần và vật chất trong suốt quá trình học tập,
nghiên cứu.

Hà Nội, tháng 8 năm 2013
Lê Khánh Trâm

CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan, đây là công trình nghiên cứu do
tôi chủ trì thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Đinh
Hữu Dung và PGS.TS Nguyễn Vũ Trung. Các số liệu
trong luận án là trung thực và kết quả nghiên cứu chưa
từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả

Lê Khánh Trâm


MỤC LỤC
Lời cam đoan
Mục lục
Chữ viết tắt
Danh mục bảng
Danh mục biểu đồ
Danh mục hình
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................ 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ..................................................................... 3
1.1. VI HỆ Ở NGƢỜI BÌNH THƢỜNG ............................................................3
1.1.1. Khái niệm về vi hệ ............................................................................ 3
1.1.2. Các vi hệ ở ngƣời .............................................................................. 3
1.1.3. Vai trò của vi hệ với sức khỏe .......................................................... 4
1.2. ĐẶC ĐIỂM CỦA S. AUREUS .....................................................................5
1.2.1. Lịch sử phát hiện và phân loại .......................................................... 5
1.2.2. Tính chất sinh học của S. aureus ...................................................... 6
1.2.3. Đặc điểm di truyền của S. aureus ..................................................... 7

1.3. TỶ LỆ MANG VÀ KIỂU CÁCH CƢ TRÚ CỦA S. AUREUS ...............7
1.3.1. Tỷ lệ mang ........................................................................................ 7
1.3.2. Đặc điểm và kiểu cách cƣ trú............................................................ 8
1.4. CÁC YẾU TỐ ĐỘC LỰC CỦA S. AUREUS ..........................................11
1.4.1. Các yếu tố độc lực là thành phần cấu trúc tế bào ........................... 11
1.4.2. Các yếu tố độc lực là sản phẩm ngoại tiết ...................................... 12
1.4.3. Các yếu tố độc lực khác .................................................................. 15
1.5. CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA S. AUREUS .................................................16
1.5.1. Gen mã hoá coagulase của S. aureus .............................................. 17


1.5.2. Các gen mã hoá cho độc tố ruột của S. aureus ............................... 19
1.6. CÁC BỆNH DO S. AUREUS GÂY RA....................................................21
1.6.1. Nhiễm khuẩn ngoài da và các mô mềm .......................................... 21
1.6.2. Hội chứng da phồng rộp ................................................................. 21
1.6.3. Viêm tủy xƣơng .............................................................................. 21
1.6.4. Viêm khớp....................................................................................... 22
1.6.5. Viêm nội tâm mạc ........................................................................... 22
1.6.6. Nhiễm khuẩn huyết ......................................................................... 22
1.6.7. Viêm phổi........................................................................................ 22
1.6.8. Ngộ độc thực phẩm và viêm ruột cấp ............................................. 23
1.6.9. Hội chứng sốc nhiễm độc ............................................................... 24
1.6.10. Nhiễm trùng bệnh viện do S. aureus ............................................ 24
1.7. CÁC KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH S. AUREUS TRONG PHÒNG XÉT
NGHIỆM .......................................................................................................24
1.7.1 Các kỹ thuật thông thƣờng xác định S. aureus ................................ 24
1.7.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử ......................................................... 26
1.8. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ KIỂU CÁCH CƢ TRÚ VÀ GEN ĐỘC LỰC
CỦA S. AUREUS .........................................................................................32
1.8.1. Các nghiên cứu trên thế giới ........................................................... 32

1.8.2. Các nghiên cứu ở Việt Nam............................................................ 35
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ...................................................................... 38
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ....................................................................38
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu tỷ lệ mang và kiểu cách cƣ trú
của S. aureus ................................................................................... 38
2.1.2. Đối tƣợng nghiên cứu sự phân bố gen độc lực của S. aureus ........ 38


2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................................................38
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu ........................................................................ 38
2.2.2. Cỡ mẫu và cách chọn mẫu .............................................................. 38
2.2.3. Phƣơng pháp thu thập số liệu.......................................................... 40
2.3. VẬT LIỆU ....................................................................................................40
2.3.1. Thiết bị ............................................................................................ 40
2.3.2. Hóa chất .......................................................................................... 41
2.4. CÁC KỸ THUẬT NGHIÊN CỨU ............................................................42
2.4.1. Lấy mẫu .......................................................................................... 42
2.4.2. Phân lập, xác định S. aureus ........................................................... 43
2.4.3. Lƣu giữ các chủng .......................................................................... 46
2.4.4. Quy trình PCR xác định gen độc lực .............................................. 46
2.4.5. Kỹ thuật sequencing xác nhận kết quả của phản ứng PCR ............ 53
2.5. CÁCH KHỐNG CHẾ SAI SỐ ...................................................................55
2.6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ KIỂU CÁCH MANG S. AUREUS ...........56
2.7. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU .........................................56
2.8. PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU ..........................56
2.9. ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU ........................................................................57
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................... 58
3.1. TỶ LỆ MANG, KIỂU CÁCH CƢ TRÚ CỦA S. AUREUS ...................58
3.1.1. Một số đặc điểm của đối tƣợng nghiên cứu.................................... 58

3.1.2. Tỷ lệ mang S. aureus và một số yếu tố liên quan ........................... 60
3.1.3. Tỷ lệ mang, kiểu cách cƣ trú S. aureus ở mũi và một số
yếu tố liên quan ............................................................................. 66
3.1.4. Tỷ lệ mang S. aureus ở tay và một số yếu tố liên quan. ................ 69
3.1.5. Tỷ lệ mang S. aureus ở mũi và tay ................................................. 72
3.1.6. Tỷ lệ mang S. aureus ở mũi hoặc tay ............................................. 73


3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA S. AUREUS... 74
3.2.1. Kết quả nghiên cứu gen mã hóa coagulase của S. aureus .............. 75
3.2.2. Kết quả nghiên cứu gen mã hóa độc tố ruột của S. aureus............. 79
CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN ....................................................................... 85
4.1. TỶ LỆ MANG VÀ KIỂU CÁCH CƢ TRÚ CỦA S. AUREUS .............85
4.1.1. Một số đặc điểm của đối tƣợng nghiên cứu.................................... 85
4.1.2. Tỷ lệ mang S. aureus chung và một số yếu tố liên quan ................ 86
4.1.3. Tỷ lệ mang, kiểu cách cƣ trú S. aureus ở mũi và một số yếu tố
liên quan ......................................................................................... 90
4.1.4. Tỷ lệ mang S. aureus ở tay và một số yếu tố liên quan .................. 96
4.1.5. Tỷ lệ mang S. aureus ở cả mũi và cả tay ...................................... 100
4.1.6. Tỷ lệ mang S. aureus ở mũi hoặc tay ........................................... 101
4.2. CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA S. AUREUS .............................................. 102
4.2.1. Gen mã hóa coagulase .................................................................. 103
4.2.2. Gen mã hóa độc tố ruột của S. aureus .......................................... 107
KẾT LUẬN ............................................................................................ 115
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ....................................... 116
ĐỀ XUẤT……………............................................................................ 117
CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA NGHIÊN CỨU SINH
ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

CHỮ VIẾT TẮT

A:

Adenine

bp:

Base pair (cặp bazơ)

C:

Cytosine

DNA:

Deoxyribonucleic acid

dNTP:

Deoxyribonucleotid triphosphate

ELISA:

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
(Phản ứng miễn dịch gắn enzyme)

EFT:

Exfoliatin toxin

G

Guanine

MLST:

Multi-locus sequence typing
(Giải trình tự gen nhiều locus)

MRSA:

Methicillin resistant Staphylococcus aureus
(Tụ cầu vàng kháng methicillin)

PCR:

Polymerase Chain Reaction
(Phản ứng trùng hợp chuỗi)

RFLP:

Restriction fragment length polymorphism
(Kỹ thuật xác định tính đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn)

SE:

Staphyloccocal enterotoxin

(Độc tố ruột của tụ cầu)

T:

Thymine

TNF:

Tumor necrosis factor
(Yếu tố hoại tử u)

TSST:

Toxic shock syndrome toxin
(Độc tố gây hội chứng shock nhiễm độc)


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1:

Đặc điểm các các loại dung huyết tố của S. aureus ................ 14

Bảng 1.2:

Vị trí di truyền của một số gen sinh độc tố ruột của S. aureus ..... 20

Bảng 2.1:

Trình tự các mồi của các gen se ............................................. 51

Bảng 2.2:

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR dùng cho các cặp mồi
SEA, SEB, SEC, SED, SEE, SIE, SEJ ................................... 52

Bảng 2.3:

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR dùng cho các cặp mồi SEG .... 52

Bảng 2.4:

Thành phần phản ứng đối với ống chuẩn ................................ 53

Bảng 2.5:

Thành phần phản ứng đối với các ống chứa mẫu .................... 54

Bảng 2.6:

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR sequence .......................... 55

Bảng 2.7:

Tiêu chuẩn xác định kiểu cách cƣ trú của S. aureus ............... 56

Bảng 3.1:

Phân bố đối tƣợng nghiên cứu theo giới ................................. 58

Bảng 3.2:

Phân bố đối tƣợng nghiên cứu theo nhóm tuổi ....................... 58

Bảng 3.3:

Phân bố đối tƣợng nghiên cứu theo vị trí làm việc ................. 59

Bảng 3.4:

Phân bố đối tƣợng nghiên cứu theo thâm niên công tác .......... 59

Bảng 3.5.

Phân bố các chủng S. aureus theo các lần và vị trí lấy
mẫu ở 53 nhân viên có mẫu dƣơng tính .................................. 60

Bảng 3.6:

Phân bố tỷ lệ mang S. aureus theo số lần lấy mẫu .................. 62

Bảng 3.7:

Phân bố tỷ lệ mang S. aureus ở các lần lấy mẫu ..................... 62

Bảng 3.8:

Tỷ lệ mang S. aureus theo giới ............................................... 63

Bảng 3.9:

Tỷ lệ mang S. aureus theo nhóm tuổi ..................................... 64

Bảng 3.10: Tỷ lệ mang S. aureus theo vị trí làm việc ............................... 64
Bảng 3.11: Tỷ lệ mang S. aureus theo thâm niên công tác ....................... 65
Bảng 3.12: Tỷ lệ mang và kiểu cách cƣ trú S. aureus ở mũi theo
nhóm tuổi ............................................................................... 67
Bảng 3.13: Tỷ lệ mang và kiểu cách cƣ trú S. aureus ở mũi theo thâm
niên công tác ......................................................................... 69


Bảng 3.14: Tỷ lệ mang S. aureus ở tay ..................................................... 69
Bảng 3.15: Tỷ lệ mang S. aureus ở tay theo giới ...................................... 70
Bảng 3.16: Tỷ lệ mang S. aureus ở tay theo nhóm tuổi ............................ 70
Bảng 3.17: Tỷ lệ mang S. aureus ở tay theo vị trí làm việc ..................... 71
Bảng 3.18: Tỷ lệ mang S. aureus ở tay theo thâm niên công tác ............... 72
Bảng 3.19: Tỷ lệ mang S. aureus ở mũi và tay ......................................... 72
Bảng 3.20: Tỷ lệ mang S. aureus ở mũi hoặc tay tính chung .................... 73
Bảng 3.21: Tỷ lệ mang S. aureus ở mũi hoặc tay theo nhóm tuổi ............. 73
Bảng 3.22: Tỷ lệ mang S. aureus ở mũi hoặc tay theo vị trí làm việc ....... 74
Bảng 3.23: Phân bố các genotype của gen mã hóa coagulase ở 101
chủng S. aureus ...................................................................... 75
Bảng 3.24: Phân bố các genotype gen mã hóa coagulase của S. aureus
ở tay và mũi ........................................................................... 78
Bảng 3.25: Phân bố nhân viên theo số lƣợng các genotype gen mã hóa
coagulase ............................................................................... 79
Bảng 3.26: Tỷ lệ chung mang gen mã hóa độc tố ruột của S. aureus ........ 79
Bảng 3.27: Phân bố các chủng S. aureus mang gen độc tố ruột ở mũi
và ở tay .................................................................................. 81
Bảng 4.1: Kết quả nghiên cứu tỷ lệ mang S. aureus ở tay nhân viên
cơ sở dịch vụ ăn uống của một số tác giả ............................... 98

Bảng 4.2: Kết quả nghiên cứu genotype gen mã hóa coagulase của
một số tác giả ....................................................................... 104
Bảng 4.3:

Kết quả nghiên cứu gen độc tố ruột ở S. aureus của một
số tác giả .............................................................................. 111

Bảng 4.4:

Sự phân bố tỷ lệ các chủng S. aureus theo số lƣợng các
gen mã hóa độc tố ruột của một số nghiên cứu. .................... 113


DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1:

Tỷ lệ mang S. aureus ......................................................... 63

Biểu đồ 3.2:

Tỷ lệ mang và kiểu cách cƣ trú S. aureus ở mũi ................. 66

Biểu đồ 3.3:

Tỷ lệ mang và kiểu cách cƣ trú S. aureus ở mũi theo
giới .................................................................................... 66

Biểu đồ 3.4:

Tỷ lệ mang và kiểu cách cƣ trú S. aureus ở mũi theo vị
trí làm việc ......................................................................... 68

Biểu đồ 3.5:

Phân bố các genotype chính của gen mã hóa coagulase
của S. aureus ...................................................................... 76

Biểu đồ 3.6:

Phân bố tỷ lệ các chủng S. aureus theo loại gen mã
hóa độc tố ruột ................................................................... 80

Biểu đồ 3.7:

Phân bố tỷ lệ các chủng S. aureus theo số lƣợng các
gen mã hóa độc tố ruột ....................................................... 83


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1:

Hình ảnh Staphylococcus aureus dƣới kính hiển vi điện tử ...... 6

Hình 1.2: Tỷ lệ mang S. aureus ở các vị trí khác nhau trên quần thể
ngƣời bình thƣờng và trên nhóm ngƣời mang S. aureus ở mũi ... 10
Hình 1.3:

Các yếu tố độc lực của Staphylococcus aureus ....................... 13

Hình 1.4:

Cấu trúc của gen mã hoá coagulase và vị trí của nó trên
nhiễm sắc thể ......................................................................... 18

Hình 1.5:

So sánh vị trí cắt của AluI giữa chủng S. aureus A và
chủng S. aureus B, vị trí gắn của các primer 1, 2, 3, 4,
trong phản ứng PCR. .............................................................. 19

Hình 1.6:

Vị trí nhiễm trùng và các bệnh do S. aureus gây ra ................ 23

Hình 2.1:

Sơ đồ phân lập, xác định S. aureus ......................................... 43

Hình 2.2:

Kết quả giải trình tự gen sec ................................................... 54

Hình 3.1:

Kết quả điện di các sản phẩm thu đƣợc sau PCR vòng 2
xác định gen coagulase ........................................................... 76

Hình 3.2:

Kết quả cắt DNA của một số chủng S. aureus bằng
enzyme AluI ........................................................................... 77

Hình 3.3:

Kết quả điện di sản phẩm PCR gen seb của một số chủng
S. aureus ................................................................................ 81

Hình 3.4:

Kết quả điện di sản phẩm PCR gen sei của một số chủng
S. aureus ................................................................................ 82

Hình 3.5:

Kết quả điện di sản phẩm PCR gen seg của một số chủng
S. aureus ................................................................................ 82

Hình 3.6:

Kết quả điện di sản phẩm PCR gen sec của một số chủng
S. aureus ................................................................................ 83


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Staphylococcus aureus là một trong những vi khuẩn hay gặp nhất trên
cơ thể ngƣời, nó cũng là căn nguyên của nhiều loại nhiễm trùng khác nhau.
S. aureus có thể gây nhiễm trùng ngoài da, ngộ độc thực phẩm, viêm tủy

xƣơng, nhiễm khuẩn huyết…Tùy vào mức độ và loại nhiễm trùng mà biểu
hiện trên lâm sàng khác nhau.
S. aureus là thành viên của hệ vi khuẩn ở ngƣời. Khoảng 30% ngƣời
khoẻ mạnh mang S. aureus. S. aureus đƣợc phát hiện thấy ở nhiều vùng của
cơ thể nhƣ da ở vùng cổ, ngực, bụng, bàn tay…và một số hốc tự nhiên trên
cơ thể. Vị trí cƣ trú hay gặp nhất của S. aureus là lỗ mũi trƣớc. S. aureus có
thể cƣ trú thƣờng xuyên, không thƣờng xuyên và không cƣ trú trên cơ thể
ngƣời. Khi có tổn thƣơng da, niêm mạc, sức đề kháng của cơ thể suy giảm
thì các nhiễm trùng do S. aureus dễ dàng xuất hiện. Sự có mặt và số lƣợng S.
aureus ở trên cơ thể phụ thuộc vào tình trạng vệ sinh, miễn dịch, và nhiều
yếu tố khác của cơ thể vật chủ cũng nhƣ của vi khuẩn [6].
Phần lớn các chủng S. aureus đều có một hoặc một số gen độc lực
liên quan đến những tình trạng nhiễm trùng và bệnh lý khác nhau. Một số
gen chịu trách nhiệm sản xuất các độc tố ruột (Staphylococcal enterotoxinsSE), gen liên quan đến hội chứng sốc nhiễm độc (Toxic shock syndrome
toxin 1-tsst1), gen mã hóa coagulase gây đông huyết tƣơng ... Ngoài ra,
nhiều gen khác chịu trách nhiệm việc S. aureus kháng lại nhiều kháng sinh
và một số kiểu gen của S. aureus cũng liên quan đến những bệnh cảnh lâm
sàng đặc thù do vi khuẩn này gây ra [57]. Trên thế giới, ngày càng có nhiều
nghiên cứu dịch tễ học phân tử của S. aureus và mối liên quan giữa các yếu
tố độc lực, các kiểu gen cũng nhƣ vai trò của các yếu tố này với tình trạng
nhiễm trùng và kháng kháng sinh của của S. aureus [9].


2

S. aureus là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây ngộ độc thực
phẩm trên toàn thế giới và cho đến nay vẫn còn là vấn đề nan giải. Ngộ độc
thực phẩm do S. aureus chiếm khoảng 25% số vụ và 10% số bệnh nhân ngộ
độc phải nhập viện điều trị, có trƣờng hợp nặng nguy hiểm đến tính mạng. Ở
Việt Nam, S. aureus là nguyên nhân chính gây ô nhiễm thực phẩm. Do khí

hậu nóng ẩm, thiếu các điều kiện bảo quản phù hợp, sự có mặt của S. aureus
với số lƣợng lớn trong thực phẩm là nguy cơ tiềm ẩn bùng phát các vụ ngộ
độc tập thể gây tổn thất nặng về kinh tế. Những ngƣời làm việc chế biến thực
phẩm, bán hàng ăn, tiếp xúc trực tiếp với thức ăn luôn là nguồn gây ô nhiễm
S. aureus trong quá trình chế biến, sản xuất, đóng gói, vận chuyển và bảo
quản thực phẩm [15]. Ở nƣớc ta đã có nhiều nghiên cứu về vai trò gây bệnh
và tính kháng thuốc của S. aureus nhƣng chƣa có nghiên cứu về kiểu cách cƣ
trú và rất ít nghiên cứu về gen độc lực của vi khuẩn này.
Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài „„Xác định kiểu cách cƣ
trú và gen độc lực của Staphylococcus aureus ở nhóm ngƣời làm việc tại
một số cơ sở dịch vụ ăn uống” với hai mục tiêu sau:
1. Xác định tỷ lệ mang, kiểu cách cư trú của S. aureus ở mũi và tay của
nhóm người làm việc tại một số cơ sở dịch vụ ăn uống tại Hà Nội.
2. Xác định sự phân bố, tính đa hình của gen mã hóa coagulase và gen
mã hóa độc tố ruột của các chủng S. aureus phân lập được.


3

CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. VI HỆ Ở NGƢỜI BÌNH THƢỜNG

1.1.1. Khái niệm về vi hệ
Vi hệ ở ngƣời bình thƣờng (normal microbial flora) là những quần thể
vi sinh vật sinh sống trên cơ thể ngƣời khỏe mạnh. Chúng có mặt ở trên da
và niêm mạc của hầu hết các cơ quan có tiếp xúc với môi trƣờng ngoài [32].
Thành phần của vi hệ bình thƣờng đƣợc chia làm hai nhóm: i) Các vi
sinh vật cƣ trú thƣờng xuyên (thƣờng trú - resident flora) và ii) các vi sinh
vật vãng lai (tạm trú - transient flora). Các vi sinh vật thƣờng trú có sự ổn

định tƣơng đối về chủng loại và tƣơng quan số lƣợng (mật độ) giữa chúng,
tùy thuộc vào vị trí cƣ trú và lứa tuổi của chủ thể. Các vi sinh vật tạm trú có
nguồn gốc từ môi trƣờng, chúng cƣ trú trên da và niêm mạc từ vài giờ, vài
ngày đến vài tuần, chúng không có sự ổn định về chủng loại và tƣơng quan
số lƣợng và không trở thành thƣờng trú. Bình thƣờng các vi sinh vật tạm trú
không gây bệnh nhƣng một số trong chúng có thể trở thành gây bệnh khi sự
cân bằng của các vi sinh vật thƣờng trú bị phá vỡ [48].
Thành viên của vi hệ bình thƣờng có thể thay đổi do nhiều yếu tố khác
nhau nhƣ yếu tố di truyền, tuổi tác, giới tính, dinh dƣỡng, chế độ ăn uống và
thậm chí cả yếu tố căng thẳng thần kinh của mỗi ngƣời.
1.1.2. Các vi hệ ở ngƣời
Vi khuẩn có ở nhiều cơ quan trên cơ thể ngƣời nhƣ da, hệ tiêu hóa, hô
hấp, tiết niệu, sinh dục. Trong nghiên cứu này chúng tôi đề cập chính đến vi
hệ ở da và đƣờng hô hấp.
1.1.2.1. Vi hệ ở da
Vi hệ ở da chủ yếu là các vi khuẩn Gram dƣơng, thƣờng là tụ cầu da


4

(Staphylococcus epidermidis), trực khuẩn kỵ khí (Propionibacterium acnes
gây mụn trứng cá). Ngoài ra còn có tụ cầu vàng (S. aureus), liên cầu nhóm
viridians, trực khuẩn giả bạch hầu và vi khuẩn sinh nha bào có trong không
khí. Ƣớc tính trên da ngƣời có khoảng 1010 vi khuẩn.
Các yếu tố trên da góp phần hạn chế sự cƣ trú của các vi sinh vật khác
là: pH thấp, acid béo trong các chất tiết của tuyến bã nhờn và lysozym. Nồng
độ muối cao và độ ẩm làm cho bề mặt da có tính ƣu trƣơng và có thể tiêu
diệt một số vi khuẩn. Lysozym do tuyến mồ hôi tiết ra diệt đƣợc những vi
khuẩn Gram dƣơng khác. Tuyến mồ hôi tiết ra những peptide chống lại vi
khuẩn, đƣợc gọi là cathelicidin. Lipid đƣợc phân cắt thành các acid béo

không bão hòa có khả năng diệt các vi khuẩn Gram âm và một số nấm [48].
1.1.2.2. Vi hệ ở đường hô hấp
Có nhiều loài vi khuẩn sinh sống ở hốc mũi và ở họng mũi
(nasopharynx). Đƣờng hô hấp dƣới nhƣ khí quản, phế quản, mô phổi và
trong xoang ngƣời khỏe mạnh không có vi sinh vật [12].
Vi khuẩn hay gặp nhất ở đƣờng hô hấp trên, đặc biệt ở họng là các liên
cầu tan máu anpha và không tan máu; các cầu khuẩn Gram-âm, tụ cầu, trực
khuẩn giả bạch hầu, phế cầu, Haemophilus và Bacteroides. Vi hệ ở hốc mũi
thƣờng gặp là các tụ cầu, liên cầu và Corynebacterium. Đáng lƣu ý là tụ cầu
vàng vì khả năng gây bệnh và lan truyền của nó [13].
1.1.3. Vai trò của vi hệ với sức khỏe
1.1.3.1. Lợi ích của vi hệ
Ngƣời ta đã chứng minh rằng các vi khuẩn ở ruột có nhiều ích lợi cho
cơ thể. Các enzym của chúng đã làm giáng hóa thức ăn để sản sinh ra các
vitamin nhóm B, K và các acid amin mà cơ thể cần [28].
Hệ vi khuẩn bình thƣờng của cơ thể còn có một vai trò quan trọng là


5

chống nhiễm trùng, bảo vệ cơ thể không cho vi khuẩn lạ, vi khuẩn gây bệnh
xâm nhập do cơ chế “cạnh tranh vi sinh học” [28]. Chúng cạnh tranh nơi cƣ
trú, cạnh tranh dinh dƣỡng với các vi khuẩn gây bệnh hoặc sản sinh ra các
chất chống vi sinh vật gây bệnh nhƣ bacteriocins đặc hiệu, peroxide hay một
số acid béo. Thành ruột của ngƣời có nhiều tổ chức lympho, nhiều đại thực
bào. Vi hệ bình thƣờng đã kích hoạt hệ thống miễn dịch không đặc hiệu của
cơ thể [48].
1.1.3.2. Tác hại của vi hệ
Trong một số trƣờng hợp nhất định vi sinh vật thuộc vi hệ lại có thể
trở thành tác nhân gây bệnh, đó là khi cơ thể suy giảm sức đề kháng, môi

trƣờng thay đổi và chúng xâm nhập đƣợc vào máu hay mô. Vì vậy, một số vi
sinh vật thuộc vi hệ bình thƣờng còn đƣợc coi là những kẻ “gây bệnh cơ hội”
(opportunist) [49]. Vi hệ bình thƣờng, đặc biệt ở những ngƣời thƣờng hay sử
dụng kháng sinh, mang những vi khuẩn chứa gen đề kháng kháng sinh và đó
là nguồn dự trữ, có thể sẵn sàng “chuyển giao” cho vi khuẩn gây bệnh khi có
điều kiện. Ví dụ tụ cầu kháng penicillin hoặc E. coli mang plasmid đa kháng
kháng sinh. Nhƣ vậy hệ vi khuẩn bình thƣờng cũng tham gia vào quá trình
dự trữ và lan truyền các gen đề kháng kháng sinh [28].
1.2. ĐẶC ĐIỂM CỦA S. AUREUS

1.2.1. Lịch sử phát hiện và phân loại
Tụ cầu (Staphylococci) là một trong những vi khuẩn gây bệnh ở ngƣời đƣợc
biết đến từ rất sớm. Năm 1878, Robert Koch phát hiện đƣợc Staphylococci trong
mủ của một bệnh nhân. Hai năm sau - 1880, Louis Pasteur đã nuôi cấy đƣợc vi
khuẩn này trên môi trƣờng lỏng nhân tạo. Sau đó, năm 1881, Ogston chứng minh
vai trò gây bệnh thực nghiệm cho chuột và đặt tên cho những cầu khuẩn này là
Staphylococcus [5]. Chi Staphylococcus bao gồm ít nhất 20 loài, trong đó S.
aureus là loài gây bệnh hay gặp nhất ở ngƣời [56].


6

1.2.2. Tính chất sinh học của S. aureus
S. aureus là những cầu khuẩn Gram dƣơng, có đƣờng kính 0,8-1m,
xếp thành hình chùm nho, không có lông, không sinh nha bào và thƣờng
không có vỏ. Tụ cầu vàng thuộc loại dễ nuôi cấy, phát triển đƣợc ở nhiệt độ
100C-450C và nồng độ muối cao tới 10%, thích hợp ở cả điều kiện hiếu và kỵ
khí.
Trên môi trƣờng thạch thƣờng, tụ cầu vàng tạo thành khuẩn lạc S,
đƣờng kính 1-2mm sau 24h ở 370C, thƣờng có màu vàng chanh. Trên môi

trƣờng thạch máu tụ cầu vàng phát triển nhanh, tạo tan máu hoàn toàn. Tụ
cầu vàng tiết ra 5 loại hemolysin: α, β, δ, ε, γ. Trên môi trƣờng canh thang:
tụ cầu vàng làm đục môi trƣờng, để lâu, có thể lắng cặn.
Tụ cầu có hệ thống enzyme phong phú. Những enzyme đƣợc dùng
trong chẩn đoán nhƣ coagulase có khả năng làm đông huyết tƣơng ngƣời và
động vật khi đã đƣợc chống đông. Vi khuẩn sinh catalase nên có khả năng
chuyển hoá H2O2 thành nƣớc và oxy [5].

Hình 1.1: Hình ảnh Staphylococcus aureus dưới kính hiển vi điện tử [116]


7

Tụ cầu vàng có khả năng đề kháng với nhiệt độ và hóa chất cao hơn
các vi khuẩn không có nha bào khác. Nó bị diệt ở 800C trong một giờ (các vi
khuẩn khác thƣờng bị diệt ở 600C trong 30 phút). Khả năng đề kháng với
nhiệt độ thƣờng phụ thuộc vào khả năng thích ứng nhiệt độ tối đa (45 0C) mà
vi khuẩn có thể phát triển.
1.2.3. Đặc điểm di truyền của S. aureus
Trong những năm gần đây, toàn bộ trình tự gen của một số chủng S.
aureus đã đƣợc giải trình tự hoàn toàn. Các nhà khoa học đã tiến hành
nghiên cứu sâu thêm về cấu trúc cũng nhƣ chức năng của vật liệu di truyền
của S. aureus.
Trình tự bộ gen đầu tiên của S. aureus đƣợc công bố năm 2001 là của
chủng Mu50 và N315 (Kuroda và cộng sự). Cho tới nay đã có hơn 10 chủng
đƣợc giải trình tự gen. Khi so sánh các trình tự gen nói trên, các nhà khoa học
nhận thấy, có những gen có mặt ở tất cả các chủng S. aureus nhƣng cũng có
những gen chỉ có ở chủng này mà không có ở những chủng khác. Kết quả
nghiên cứu cũng cho thấy 22% bộ gen của S. aureus chứa những vùng hay thay
đổi. Bộ gen của 5 chủng S. aureus đƣợc giải trình tự hoàn toàn có kích cỡ từ

2820 đến 2903 bp với G+C chứa khoảng 33% và có từ 2592 đến 2748 trình tự
mã hoá cho các protein. Trong đó, 75% các trình tự là rất ít thay đổi giữa các
chủng S. aureus. Tập hợp toàn bộ các trình tự này gọi là vùng gen gốc [102].
1.3. TỶ LỆ MANG VÀ KIỂU CÁCH CƢ TRÖ CỦA S. AUREUS

1.3.1. Tỷ lệ mang
Sự phối hợp giữa việc mang S. aureus và các nhiễm trùng do vi khuẩn
này gây ra đã đƣợc Danbolt đề cập từ năm 1931. Kể từ năm 1947 trở đi, khi tỷ
lệ S. aureus kháng penicilin đã trở thành vấn đề đáng lo ngại, việc hiểu rõ hơn
về cơ chế bệnh sinh của các bệnh do S. aureus ngày càng trở nên cần thiết [70].


8

S. aureus là thành viên của hệ vi khuẩn ở ngƣời. Khoảng 20 - 30%
ngƣời khoẻ mạnh mang S. aureus. S. aureus đƣợc phát hiện thấy ở nhiều
vùng của cơ thể nhƣ da ở vùng cổ, ngực, bụng, bàn tay…và một số hốc tự
nhiên trên cơ thể. Vị trí cƣ trú hay gặp nhất của S. aureus là lỗ mũi trƣớc [5].
Các công trình nghiên cứu sau này cho thấy, các chủng S. aureus cƣ
trú ở mũi và các chủng S. aureus gây nhiễm trùng trên bệnh nhân đó đều có
chung týp phage và kiểu gen [118]. Mang vi khuẩn ở mũi cũng là yếu tố
nguy cơ cao của nhiễm khuẩn huyết trong nhiễm trùng bệnh viện. Thậm chí,
những ngƣời nằm viện lâu ngày đƣợc coi là nguồn chứa S. aureus [16].
S. aureus là một trong những căn nguyên hàng đầu gây ngộ độc thực
phẩm. Từ lâu, mối liên quan mật thiết giữa ngƣời mang vi khuẩn và ngộ độc
thực phẩm do S. aureus đã đƣợc đề cập và quan tâm nghiên cứu [95]. Đặc
biệt những ngƣời trực tiếp tiếp xúc với thực phẩm trong quá trình sản xuất,
chế biến, vận chuyển, phân phát và bảo quản thực phẩm [76].
Tỷ lệ mang và đặc điểm cƣ trú của S. aureus khác nhau ở các cá thể
phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau ở cả vật chủ và vi khuẩn.

1.3.2. Đặc điểm và kiểu cách cƣ trú
S. aureus có mặt ở nhiều nơi trên cơ thể nhƣ lỗ mũi, da và các hốc tự
nhiên khác. Tuy nhiên, vi khuẩn này có thể tồn tại thƣờng xuyên hoặc không
thƣờng xuyên trên cơ thể vật chủ, ở một số cá thể, ngƣời ta không thấy có sự
tồn tại của vi khuẩn này [36].
Các cơ chế liên quan đến khả năng và đặc điểm cƣ trú của S. aureus
rất phức tạp. Một nghiên cứu gần đây trên ngƣời tình nguyện đƣợc gây
nhiễm với S. aureus cho thấy, ở những ngƣời không có S. aureus trên cơ thể,
S. aureus gây nhiễm bị loại trừ rất nhanh khỏi cơ thể. Ở những ngƣời mà S.
aureus có kiểu cách cƣ trú thƣờng xuyên, chỉ có chủng S. aureus đƣợc phân


9

lập từ chính họ có khả năng tồn tại trên cơ thể trong khi các chủng khác gây
nhiễm bị loại trừ [88].
Có bốn yếu tố quyết định đến sự cƣ trú ở mũi của S. aureus: cần có sự
tiếp xúc của mũi với vi khuẩn, S. aureus phải bám đƣợc vào thụ thể ở
niêm mạc mũi, S. aureus phải vƣợt qua đƣợc cơ chế bảo vệ của vật chủ,
cuối cùng S. aureus phải có khả năng nhân lên ở mũi [31]. Mũi là vị trí
thích hợp để S. aureus cƣ trú nhờ sự gắn kết giữa carbohydrat của màng
nhày mũi và protein của vi khuẩn. Mặt khác, cơ chế đề kháng tại chỗ cũng
tác động đến sự mang vi khuẩn ở vị trí này. Dịch tiết của mũi đóng vai trò
quan trọng trong hệ thống bảo vệ của vật chủ. Trong dịch tiết có chứa
IgA, IgG, lysozyme, lactoferrin và các peptid bảo vệ. Những ngƣời mang
S. aureus thƣờng là những ngƣời bị kích ứng mũi và hay có thói quen xì
mũi. Điều này có thể dẫn đến những tổn thƣơng và thay đổi ở niêm mạc và
màng nhày ở mũi. Hàng rào bảo vệ ở niêm mạc mũi suy yếu dẫn đến vi
khuẩn dễ xâm nhập [57].
Tỷ lệ mang S. aureus liên quan đến số lần tay tiếp xúc với mũi nhƣ khi xì

mũi, ngoáy mũi. Cũng có thể tay mang vi khuẩn ở ngoài môi trƣờng đến
mũi. Khả năng mang vi khuẩn phụ thuộc vào thời gian, tần xuất và cƣờng độ
của xì mũi. Tổn thƣơng ở mũi không phải là nguyên nhân duy nhất dẫn đến
tỷ lệ mang vi khuẩn cao ở mũi. Hầu hết các trƣờng hợp mang vi khuẩn này ở
mũi là nguyên nhân nội sinh. Lỗ mũi là nguồn dự trữ vi khuẩn cho nên biện
pháp tốt nhất để phòng tránh bệnh do vi khuẩn này gây nên là giảm tỷ lệ
mang chúng ở mũi. Hầu hết các trƣờng hợp khi giảm đƣợc tỷ lệ mang vi
khuẩn ở mũi thì cũng đồng thời cũng giảm đƣợc nguy cơ nhiễm trùng. Có
nghiên cứu cho thấy 100% các chủng phân lập đƣợc trong nhiễm trùng do S.
aureus là thuộc vi hệ cơ thể và có đặc tính di truyền giống với các chủng
phân lập đƣợc ở mũi [99].


10

Hình 1.2: Tỷ lệ mang S. aureus ở các vị trí khác nhau trên quần thể
người bình thường và trên nhóm người mang S. aureus ở mũi [57]
Nhiều biện pháp ngắt quãng lƣu hành vi khuẩn làm giảm tỷ lệ mang vi
khuẩn nhƣ điều trị kháng sinh tại chỗ, sử dụng hóa chất diệt khuẩn, kháng sinh
hệ thống, globulin miễn dịch [64]. Ngƣời ta cũng ứng dụng biện pháp phổ biến
nhƣ dùng mupirocin (pseudomonic acid) để làm giảm tỷ lệ mang S. aureus ở
mũi cho những đối tƣợng có nguy cơ nhiễm trùng hoặc với mục đích phòng
bệnh. Hiệu quả điều trị đạt đến 97%, tuy nhiên có hiện tƣợng kháng lại thuốc
khi dùng trong thời gian dài và trên diện rộng [99]. Ngày nay probiotics ví dụ
nhƣ hỗn dịch gồm các vi khuẩn Bifidobacterium sp B420, Lactobacillus CG
(ATCC 53103), Lactobacillus acidophilus 145 và Streptococcus thermophilus
đƣợc ứng dụng phối hợp trong điều trị với mục tiêu làm giảm khả năng cƣ trú
của những vi khuẩn có khả năng gây bệnh cƣ trú ở mũi nhƣ S. aureus, S.
pneumoniae, Streptococcus tan máu beta, H. influenzae [49].

11

1.4. CÁC YẾU TỐ ĐỘC LỰC CỦA S. AUREUS

S. aureus có nhiều yếu tố tham gia tạo độc lực. Có thể chia thành ba
nhóm: thành phần cấu trúc tế bào, sản phẩm ngoại tiết và các yếu tố khác.
1.4.1. Các yếu tố độc lực là thành phần cấu trúc tế bào
1.4.1.1. Peptidoglycan
Peptidoglycan là một trong những thành phần chính cấu tạo nên vách
tế bào S. aureus. Đây là polymer của N-acetylglucosamine và Nacetylmuramic acid. Các chuỗi đƣợc nối với nhau bởi các cầu peptide
(interpeptide bridge). Nhờ vậy mạng lƣới ba chiều tạo thành bộ khung vững
chắc và đóng vai trò là kháng nguyên thân đặc hiệu [108]. Peptidoglycan đã
đƣợc xác định có một số tính chất giống nhƣ nội độc tố, có khả năng hoạt
hóa bổ thể. Sự hoạt hóa bổ thể có vai trò rất lớn trong cơ chế sinh bệnh của
sốc và ngƣng tập tiểu cầu tự phát trong đông máu nội quản rải rác [107].
1.4.1.2. Acid teichoic
Acid teichoic đƣợc xác định có mặt ở vách và màng nguyên tƣơng của
S. aureus. Acid này liên kết đồng hóa trị với các lớp peptidoglycan. Acid
teichoic là kháng nguyên ngƣng kết chủ yếu của S. aureus. Đây còn là chất
bám dính của tụ cầu vào niêm mạc mũi. Acid này gắn vào polysaccharide
vách S. aureus. Đây là thành phần đặc hiệu của kháng nguyên O. Acid
teichoic đóng vai trò quan trọng trong quá trình hoạt hóa bổ thể, kích thích
sản xuất kháng thể [71].
1.4.1.3. Protein A
Protein A đƣợc mô tả lần đầu tiên năm 1958 bởi Klaus Jensen qua việc
phát hiện kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên này trong toàn bộ 500 mẫu
huyết thanh ngƣời [65]. Năm 1983, đã giải mã đƣợc một phần gen protein A ở
S. aureus. Đây là kháng nguyên bề mặt đặc trƣng cho S. aureus, có trọng lƣợng
phân tử khoảng 42 kDa. Tất cả các chủng S. aureus có protein này nên nó là

một tiêu chuẩn để xác định S. aureus. Protein A có khả năng gắn với phần Fc


12

của IgG dẫn tới làm mất tác dụng của IgG, chủ yếu do là mất sự opsonin hoá,
nên làm giảm thực bào, giúp cho vi khuẩn thoát khỏi sự kiểm soát của hệ thống
miễn dịch của vật chủ. Sự gắn Fc của IgG vào protein A là cơ sở của phản ứng
đồng ngƣng kết đƣợc ứng dụng trong chẩn đoán nhiều bệnh nhiễm trùng.
Protein A cũng có khả năng hoạt hóa các bổ thể [7].
1.4.1.4. Vỏ
Chỉ có một số ít chủng S. aureus có vỏ và có thể quan sát đƣợc bằng
phƣơng pháp nhuộm vỏ. Vỏ S. aureus có bản chất là polysaccharid. Đặc
trƣng cho vỏ của S. aureus là sự có mặt của axid uron. Polysaccharide của vỏ
S. aureus có ít nhất 11 serotype. S. aureus gây bệnh cho ngƣời thƣờng là
những chủng có vỏ mỏng, thuộc serotype 5 hoặc 8. Vỏ có có tác dụng chống
thực bào bởi che phủ lớp peptidoglycan của vách làm cho bổ thể không có
chỗ bám để hoạt hóa theo con đƣờng tắt [7].
1.4.1.5. Yếu tố bám (adhesin)
Giống nhƣ nhiều vi khuẩn khác, tụ cầu có protein bề mặt đặc hiệu, có tác
dụng bám vào thụ thể đặc hiệu tế bào. Adhesin có thể là các protein: laminin,
fibronectin, collagen (fibronectin binding Protein A and B FnBPA, FnBPB;
Clumping factor A and B, ClfA, ClfB; Collagen Binding Proteins, Bone
sialprotein binding proteins, Bbp; Plasmid-sensitive Protein, Pls; Elastin
binding Protein, EbpS; Extracellular matrix-binding Proteins, Ehb) [5].
1.4.2. Các yếu tố độc lực là sản phẩm ngoại tiết
1.4.2.1. Độc tố ruột (Enterotoxin)
Ngộ độc thức ăn do Staphyloccocus đƣợc phát hiện lần đầu tiên năm
1884 (Vaughn). Đến năm 1930, Dack và cộng sự mới xác định đƣợc nhiễm
trùng nhiễm độc do tụ cầu có thể gây ra bởi nƣớc lọc môi trƣờng nuôi cấy tụ

cầu vàng và đó chính là độc tố ruột. Độc tố ruột có thể đƣợc hình thành trong
thực phẩm, trong môi trƣờng nuôi cấy và trong cơ thể ngƣời. Độc tố ruột là
những protein có trọng lƣợng phân tử từ 28000-30000 dalton, có một hàm