Thử nghiệm thủy phân sụn cá mập tạo chondroitin sulphat bằng phương pháp sử dụng enzyme neutrase

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
----o0o----

NGUYỄN THỊ THU THẢO

THỬ NGHIỆM THỦY PHÂN SỤN CÁ MẬP TẠO
CHONDROITIN SULPHAT BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SỬ DỤNG ENZYME NEUTRASE

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Nha Trang, tháng 06 năm 2015


BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
----o0o----

NGUYỄN THỊ THU THẢO

THỬ NGHIỆM THỦY PHÂN SỤN CÁ MẬP TẠO
CHONDROITIN SULPHAT BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SỬ DỤNG ENZYME NEUTRASE

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

GVHD: TS. VŨ NGỌC BỘI
TS. NGUYỄN DUY NHỨT

Nha Trang, tháng 06 năm 2015


i

LỜI CẢM ƠN
Ðể hoàn thành đề tài tốt nghiệp này,
Em xin gửi tới Ban Giám hiệu Truờng Ðại học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm
Khoa Công nghệ Thực phẩm sự kính trọng, niềm tự hào được học tập và nghiên cứu
tại Truờng trong những năm qua.
Em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy TS. Vũ Ngọc Bội –
Trưởng khoa Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Nha Trang và TS. Nguyễn
Duy Nhứt – Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang: Số 2 Hùng Vương
– Nha Trang – Khánh Hòa, đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình chỉ bảo những kinh
nghiệm quý báu trong suốt quá trình em thực hiện đề tài.
Xin cảm ơn quý thầy cô giáo trong khoa Công nghệ Thực phẩm đã tận tình giúp
đỡ và truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong suốt quá trình học tập tại
Trường. Xin chân thành biết ơn các thầy cô quản lý các phòng thí nghiệm: Phòng thí
nghiệm Hoá sinh, phòng thí nghiệm Hóa đại cương, phòng thí nghiệm CNCB, phòng
thí nghiệm Công nghệ sinh học và Môi truờng đã tạo điều kiện cho em trong suốt
quá trình làm đề tài.
Xin chân thành cảm ơn các anh chị, cô chú làm việc tại Viện Nghiên cứu và
Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã tạo điều kiện thuận lợi và nhiệt tình giúp đỡ em
trong thời gian làm nghiên cứu tại Viện.
Cuối cùng em xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thành viên trong gia đình, các bạn
đã động viên và nhiệt tình giúp đỡ em thực hiện đề tài.
Sinh viên

Nguyễn Thị Thu Thảo


ii

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .......................................................................................................... i
MỤC LỤC ............................................................................................................... ii
DANH MỤC HÌNH ............................................................................................... iv
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................... v
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................... vi
LỜI MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN ................................................................................... 3
1.1. GIỚI THIỆU VỀ SỤN ĐỘNG VẬT .......................................................... 3
1.2. GIỚI THIỆU VỀ CHONDROITIN SULPHAT ......................................... 4
1.2.1. Đặc điểm và cấu trúc của chondroitin sulphat ........................................ 4
1.2.2. Các phương pháp thu nhận và định lượng chondroitin sulphat .............. 6
1.2.3. Ứng dụng của chondroitin sulphat .......................................................... 7
1.3. GIỚI THIỆU VỀ CÁ MẬP......................................................................... 9
1.3.1. Giới thiệu về cá mập ............................................................................... 9
1.3.2. Tình hình khai thác cá mập hiện nay .................................................... 10
1.4. TỔNG QUAN VỀ ENZYME PROTEASE............................................. 11
1.4.1. Phân loại và đặc điểm của protease ...................................................... 11
1.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng của quá trình thủy phân .................................... 14
1.4.3. Ứng dụng của protease.......................................................................... 15
1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CHONDROITIN SULPHAT . 17
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 19
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ...................................................................... 19
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................ 19

2.2.1. Phương pháp phân tích hóa học ............................................................ 19


iii

2.2.2. Xác định hoạt độ enzyme neutrase theo phương pháp Anson .............. 20
2.2.3. Định lượng chondroitin sulphat theo phương pháp xanh methylen ..... 22
2.2.4. Phương pháp bố trí thí nghiệm ............................................................. 23
2.3. CÁC THIẾT BỊ CHỦ YẾU VÀ HÓA CHẤT ĐÃ SỬ DỤNG ................ 31
2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU ......................................................... 31
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................ 33
3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU XỬ LÝ SỤN CÁ MẬP ................................ 33
3.2. XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ TỐI ƯU CHO QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN
SỤN CÁ MẬP BẰNG ENZYME NEUTRASE................................................... 34
3.2.1. Xác định hoạt độ của enzyme neutrase ................................................. 34
3.2.2. Xác định pH thích hợp cho quá trình thủy phân ................................... 34
3.2.3. Xác định tỷ lệ enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân ................... 36
3.2.4. Xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân........................... 38
3.2.5. Xác định thời gian thích hợp cho quá trình thủy phân ......................... 40
3.3. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH THỦY PHÂN SỤN CÁ MẬP ĐỂ THU NHẬN
CHONDROITIN SULPHAT ................................................................................ 42
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN ................................................................... 45
KẾT LUẬN ........................................................................................................... 45
ĐỀ XUẤT Ý KIẾN ............................................................................................... 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 46
PHỤ LỤC 1. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH KIỂM NGHIỆM HÓA HỌC .
............................................................................................................................... 48
PHỤ LỤC II. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN SỤN CÁ
MẬP BẰNG ENZYME NEUATRASE ............................................................... 55

iv

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của một đơn vị trong chuỗi CS ................................... 5
Hình 1.2. Cấu trúc mạch của các CS ....................................................................... 5
Hình 1.3. Phân loại cá mập ................................................................................... 10
Hình 2.1. Hình ảnh về sụn cá mập ........................................................................ 19
Hình 2.2. Quy trình dự kiến thu nhận chondroitin sulphat từ sụn cá mập ............ 24
Hình 2.3. Sơ đồ xử lý sụn cá mập ......................................................................... 26
Hình 2.4. Xác định pH tối thích cho quá trình thủy phân ..................................... 27
Hình 2.5. Xác định nồng độ enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân ............. 28
Hình 2.6. Xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân ........................... 29
Hình 2.6. Xác định thời gian tối thích cho quá trình thủy phân............................ 31
Hình 3.1. Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng CS thu được sau thủy phân .......... 35
Hình 3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme đến hàm lượng CS thu được sau thủy phân
............................................................................................................................... 37
Hình 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến hàm lượng CS thu được sau thủy
phân ....................................................................................................................... 39
Hình 3.4. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hàm lượng CS thu được sau thủy
phân ....................................................................................................................... 41
Hình 3.5. Sơ đồ quy trình thủy phân sụn cá mập để sản xuất CS bằng neutrase.. 43
Hình 3.6. Hình ảnh về dịch thủy phân sụn cá mập bằng enzyme neutrase........... 44
Hình 3.7. Hình ảnh về chế phẩm chondroitin sulphat thô thủy phân từ sụn cá mập
............................................................................................................................... 44


v

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Thành phần chính của mô sụn ................................................................ 3
Bảng 3.1. Kết quả đánh giá chỉ tiêu cảm quan mẫu sụn cá có chế độ xử lý sụn khác
nhau ....................................................................................................................... 33
Bảng 3.2. Thành phần hóa học của sụn cá mập .................................................... 33
Bảng 3.3. Xác định hoạt độ enzyme neutrase ....................................................... 34
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng CS thu được sau thủy phân .......... 35
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme đến hàm lượng CS thu được sau thủy phân
............................................................................................................................... 36
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến hàm lượng CS thu được sau thủy
phân ....................................................................................................................... 38
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hàm lượng CS thu được sau thủy
phân ....................................................................................................................... 40
Bảng 3.8. Hiệu suất thu nhận chondrotin sulphat từ sụn cá mập .......................... 44


vi

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CS

Chondroitin sulphat

GAG

Glycosaminoglycan

GlcA

D-glucuronic acid

GalNAc

N-acetyl-D-galactosamine

PG

Proteoglycan

TCA

Tricloacetic acid

TN

Tự nhiên


1

LỜI MỞ ĐẦU
Chondroitin sulphat là thành phần cơ bản cấu tạo nên sụn khớp. Chondroitin
sulphat còn có mặt trong các tổ chức sợi chun (gân, cơ, dây chằng…) tạo sự vận động
linh hoạt và tính đàn hồi trong hoạt động khớp, tạo độ bền khi bị nén ép. Trong y
học, chondroitin sulphat được sử dụng để hỗ trợ điều trị các bệnh lý về xương khớp.
Chondroitin sulphat làm tăng sản xuất chất nhầy và khả năng bôi trơn của dịch khớp,
đảm bảo chức năng dinh duỡng và sự vận động linh hoạt của khớp. Vì vậy,
chondroitin sulphat giúp hạn chế quá trình thoái hoá khớp. Chondroitin sulphat còn
có vai trò bảo vệ sụn khớp bằng cách ức chế các enzyme phá huỷ sụn khớp như
collagenase, phospholipase A2, N–acetylglucosamindase. Ngoài ra, chondroitin
sulphat cũng góp phần nuôi duỡng các tế bào của giác mạc mắt, tái tạo lớp giác mạc.

Một trong những tác dụng quan trọng khác của chondroitin sulphat là khả năng ức
chế hoạt chất angiogenesis - chất kích thích tạo tân mạch trong các khối u, làm cho
khối u hạn chế phát triển. Hiện nay, các thuốc kết hợp chondroitin sulphat và
glucosamine đang được sử dụng hiệu quả để điều trị bệnh viêm khớp.
Do phân tử chondroitin sulphat rất đa dạng và phức tạp cho nên chondroitin
sulphat chưa đuợc tổng hợp bằng con đuờng hóa học mà chủ yếu được thu nhận từ
các nguồn nguyên liệu tự nhiên. Trong đó, sụn cá thường có hàm lượng chondroitin
sulphat cao hơn các loại động vật khác. Một số nghiên cứu trên thế giới cho thấy
chondroitin sulphat có thể được thu nhận từ một số nguồn nguyên liệu như da của cá
Labeo rohita, sụn của mực, cá mập, sụn gà, sụn bò…
Chondroitin sulphat có thể thu nhận từ sụn động vật bằng phương pháp thủy
phân với tác nhân xúc tác là acid. Nhược điểm của phương pháp sử dụng acid là có
hiện tượng tác động đến gốc sulfate dẫn đến làm giảm hoạt tính. Vì vậy, các nhà
nghiêm cứu về chondroitin sulphat đang có xu hướng sử dụng enzyme để thủy phân
sụn cá.


2

Được sự chấp nhận của Nhà trường em tiến hành đề tài: “Thử nghiệm thủy
phân sụn cá mập tạo chondroitin sulphat bằng phương pháp sử dụng enzyme
neutrase”.
Mục tiêu của đề tài:
Thử nghiệm sử dụng enzyme neutrase thủy phân sụn cá mập để tạo chondroitin
sulphat.
Nội dung thực hiện của đề tài:
1. Xác định điều kiện phù hợp cho quá trình thủy phân sụn cá mập tạo
chondroitin sulphat bằng phương pháp sử dụng enzyme neutrase: tỷ lệ enzyme, pH
thích hợp, nhiệt độ thích hợp, thời gian thủy phân.
2. Sơ bộ đề xuất quy trình thủy phân sụn cá mập tạo chondroitin sulphat bằng

enzyme neutrase.
3. Thử nghiệm tạo chondroitin sulphat từ sụn cá mập.
Ý nghĩa khoa học của đề tài:
Số liệu nghiên cứu của đề tài là số liệu mốc, khẳng định việc có thể sử dụng
enzyme neutrase nói riêng và enzyme protease nói chung trong việc thủy phân để thu
chondroitin sulphat.
Ý nghĩa thực tiễn của đề tài:
Kết quả nghiên cứu của đề tài là các số liệu ban đầu làm nền tảng cho quá trình
tiếp tục sử dụng enzyme neutrase trong thủy phân sụn cá để sản xuất chondroitin
sulphat.


3

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1.

GIỚI THIỆU VỀ SỤN ĐỘNG VẬT [14]

Sụn động vật là loại mô liên kết đặc, tồn tại trong cơ thể động vật có xương
sống cũng như ở động vật không xương sống. Trong cơ thể nguời và các loài động
vật có xương sống khác, sụn có ở nhiều bộ phận như các khớp, xương suờn, tai, mũi,
ống hô hấp, đĩa đệm cột sống… Sụn là phần chính trong bộ xương của bào thai,
nhưng nó sẽ biến đổi thành xương khi cơ thể truởng thành. Các loài cá sụn
(Chondrichthyes) như cá mập, cá đuối là những loài động vật có xương sống nhưng
bộ xương hoàn toàn sụn ngay cả khi ở tuổi truởng thành.
Sụn chỉ chứa một loại tế bào, không có mạch máu, không chứa các tế bào thần
kinh – aneurol và không chứa hệ bạch huyết – alymphatic.
Có hai loại sụn là sụn khớp và sụn chêm. Thành phần hoá học của hai loại sụn
trên gồm hai pha: chủ yếu là pha lỏng bao gồm nuớc và các chất điện phân, pha rắn

do các đại phân tử tạo thành gồm sợi collagen (collagen loại II trong sụn chêm và
loại I trong sụn khớp), proteoglycan và tế bào sụn (chondrocytes). Tế bào sụn tạo
nên chất cơ bản (matrix) của sụn.
Bảng 1.1. Thành phần chính của mô sụn
Mô

Nước (%)

Collagen (%)

Proteoglycan (%)

Sụn khớp

68.0 – 85.0

10.0 – 20.0 (loại I)

5.0 – 10.0

Sụn chêm

60.0 – 70.0

15.0 – 25.0 (loại II)

1.0 – 2.0

Thành phần chính của hai loại sụn đuợc thể hiện trong bảng 1.1. Ba thành phần
chính này tác động đồng bộ, tạo nên đặc tính cơ học của sụn. Sự thay đổi của các

thành phần này (do bị bệnh lão hoá...) sẽ làm thay đổi đặc tính cơ học phụ thuộc vào


4

thời gian của sụn. Có tới 30% nuớc nằm trong khoảng không giữa các sợi collagen.
Chondroitin là thành phần cơ bản của proteoglycan chứa trong sụn.
1.2.

GIỚI THIỆU VỀ CHONDROITIN SULPHAT [5], [7], [8], [9], [10],

[12], [13]
1.2.1. Đặc điểm và cấu trúc của chondroitin sulphat
Vào những năm 60, Davidson và Meyer là người đã phát hiện và lần đầu tiên
tách chiết được CS. CS thuộc nhóm chất heteropolysaccharide được gọi là
glycosaminoglycan (GAG) ngoại bào được tìm thấy trong tự nhiên như một polime
mạch thẳng không phân nhánh. CS gồm các đơn vị cơ bản cấu tạo bởi 2 đuờng
(disaccharide) N-acetyl-D-galactosamine (GalNAc) và D-glucuronic acid (GlcA) xen
kẽ nhau (polymeric D-galactosamine and D-glucuronic acid), các gốc đường này
được sulfate hóa hoặc không được sunlfate hóa , một số gốc GlcA bị epime hoá thành
L-iduronic acid (IdoA). CS là một polime có phân tử lớn gồm 15 – 150 đơn vị cấu
trúc 2 đường đơn của GlcA và GalNAc. Khối luợng phân tử của CS thuờng biến động
trong khoảng 10.000 – 100.000 Dalton.
Kato (1994) và Bernfield (1999) đã nhận thấy CS thuờng gắn với các protein
bằng liên kết o-glycosid tạo thành một proteoglycan (PG), là hợp chất hữu cơ thuộc
nhóm mucopolysaccharide.
Trong cơ thể sống, các PG và GAG giữ vai trò quan trọng trong nhiều quá trình
khác nhau như: điều hòa hoạt động của enzym và sự bám dính, phát triển và di thực
của tế bào. GAG còn có chức năng cấu trúc và điều khiển trong cơ thể sống. Về cấu
trúc, nó là thành phần chính của mô sụn. Về điều khiển, CS rất dễ gắn kết với protein

trong mô tế bào nhờ có diện tích âm, mối quan hệ này rất quan trọng cho việc điều
hoà các hoạt động của tế bào. Phân tử (monomer) PG của mô sụn (chứa khoảng 80
– 100 mạch CS) cùng với protein gắn kết và acid hyaluronic tạo thành một phức hệ
thuỷ động học có khả năng nén thuận nghịch rất cần thiết cho sụn để chống lại sự ép
nén với sự biến dạng nhỏ nhất.


5

Công thức hoá học của chondroitin sulphat (C14H21NO14S)n:

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của một đơn vị trong chuỗi CS

Hình 1.2. Cấu trúc mạch của các chondroitin sulphat
Chondroitin có 3 loại chính là A, B và C chúng đặc trưng bởi số luợng và vị trí
của nhóm sulphat trong nhóm disaccharide lặp lại của chuỗi polysaccharide.
Chondroitin sulphat A: gốc sulphat gắn ở vị trí C-4 (chondroitin-4-sulphat, CS4), có
nhiều ở mô sụn, CS có thể kết hợp với protein tạo nên chondromucoit. Chondroitin
sulphat B: acid iduronic thay thế acid glucuronic. Chondroitin sulphat C: gốc sulphat
gắn ở vị trí C-6 (chondroitin-6-sulphat, CS6). Loại A và B (CS4) thuờng được tìm
thấy ở sụn động vật có vú (bò và lợn), nguợc lại loại C (CS6) đuợc tìm thấy chủ yếu
ở các loài cá sụn (cá mập, cá đuối (rays, skates)...). Tuy nhiên, CS từ các nguồn
nguyên liệu khác nhau rất đa dạng về cấu trúc và kích thuớc, chúng chứa ở mức độ
nhiều hay ít một số luợng các isome của CS, có tới 16n isome của CS, phụ thuộc vào


6

sự thay đổi vị trí sulfate hoá của các cặp đuờng đôi tạo nên 16 isome/mỗi cặp. Trong
đó, CS A và CS C là những thành phần chủ yếu hình thành PG.

CS tinh chế là chất bột màu trắng hoặc trắng ngà, hoà tan tốt trong nuớc vì thế
rất dễ hút ẩm, nhưng không hoà tan trong ethanol, methanol, cetone... Khối luợng
phân tử của CS nguyên liệu thuờng đuợc sử dụng trong chế phẩm thuốc là thấp hơn,
khoảng 15000 - 20000 Dalton.
1.2.2. Các phương pháp thu nhận và định lượng chondroitin sulphat
Do phân tử CS rất đa dạng và phức tạp cho nên CS chưa đuợc tổng hợp bằng
con đuờng hóa học mà chủ yếu được thu nhận từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên.
Một số nghiên cứu trên thế giới cho thấy CS có thể được thu nhận từ một số nguồn
nguyên liệu như da của cá Labeo rohita, sụn của mực, cá mập, sụn gà, sụn bò…
CS thô mới chỉ được thu nhận duy nhất từ các nguồn tự nhiên nhờ chiết xuất
CS từ các loại mô động vật. Sụn cá mập (xương sọ, xương sống, vây...) là nguồn
nguyên liệu CS phổ biến nhất trong các chế phẩm thuốc và chế phẩm bổ sung dinh
duỡng.
CS trong mô động vật liên kết chặt với protein trong dạng phức proteoglycan.
Cho nên để tách CS ra khỏi protein cần làm yếu mối liên kết giữa CS – protein và
phân huỷ protein để giải phóng các phân tử CS.
Hiện nay, quá trình thu nhận chế phẩm CS thô từ sụn được thực hiện bằng
phương pháp hoá học hoặc phương pháp sinh học để thuỷ phân sụn.
Phương pháp hoá học: Mô sụn được xử lý bằng dung dịch muối, kiềm (NaOH)
hoặc acid (HCl, CH3COOH...) để tách GAG khỏi các phân tử khác (protein,
hyaluronic acid…), phương pháp này đã được áp dụng để thu CS từ sụn gà, sụn bò.
Nhược điểm của phương pháp hóa học là có hiện tượng tác động đến gốc sulfate dẫn
đến làm giảm hoạt tính.
Phương pháp sinh học: Dùng enzym để thuỷ phân mô sụn và là phương pháp
rất hiệu quả. CS thu nhận theo phương pháp này không bị biến đổi về cấu trúc, giữ
đuợc hoạt tính sinh học của chúng và làm giảm thiểu ô nhiễm môi truờng do các hoá


7

chất (muối, kiềm, acid...) gây nên. Nhiều nghiên cứu đã sử dụng các protease (papain,
actinase, pronase…) để thuỷ phân sụn giải phóng GAG khỏi các protein liên kết. Sau
khi loại bỏ protein thì CS đuợc tách ra và tinh sạch. Phương pháp này đã đuợc dùng
để thu nhận GAG từ da cá Labeo rohita, sụn của mực, cá mập, cá sấu, cá đuối, sụn
khí quản vịt…
Các chuỗi dài hydrophilic polymers GAG không tan trong ethanol, cetone và
methanol. Vì vậy, có thể sử dụng các dung môi này để thu CS. Một số nghiên cứu
cho thấy ethanol 60-70% tủa đuợc hàm luợng CS cao nhất và tách CS với một số
polysaccharide khác.
1.2.3. Ứng dụng của chondroitin sulphat
CS đuợc xem là chế phẩm bổ sung dinh duỡng và sử dụng rộng rãi. Trong một
năm từ 1998 đến 1999 doanh thu bán lẻ ở Mỹ đạt tới 500 triệu USD. CS có nhiều tác
dụng trong lĩnh vực bệnh lý trong thời gian dài và đang ngày càng đuợc mở rộng ứng
dụng trong các lĩnh vực khác nhau.
Ứng dụng trong y học:
- Bệnh khớp:
Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh CS có tác dụng hỗ trợ điều trị các
bệnh lý về xương khớp, đặc biệt là bệnh viêm xương khớp. CS đuợc tìm thấy trong
hoạt dịch, chất lỏng bao quanh khớp, giúp bôi trơn khớp, tăng sự mềm mại của khớp.
Cơ chế tác dụng của chondroitin sulphat trong việc làm giảm bệnh lý xương khớp
chính là bảo vệ khớp bằng cách ức chế các enzym có vai trò phá hủy sụn như
collagenase,

elastase,

proteoglycanase,

phospholipase

A2

và

N

–

acetylglucosamindase và kích thích tăng hoạt các enzym có vai trò xúc tác phản ứng
tổng hợp acid hyaluronic (là chất giúp khớp hoạt động tốt). Ðiều trị CS với liều dùng
800 mg/ngày trong 3 tháng với liệu trình 2 đợt một năm có tác dụng giảm đau và cải
thiện chức năng rõ rệt ở bệnh nhân bị viêm khớp.


8

Các nghiên cứu duợc lý tại châu Âu trong khoảng 10 năm gần đây cho thấy CS
đuợc sử dụng điều trị cho bệnh nhân đã không có một phản ứng phụ nào nghiêm
trọng xảy ra.
- Bệnh mắt:
Theo sách “Matindale, The complete drug reference” (34th, ed, 2005), CS là
chất sinh lý của giác mạc duy trì độ trong suốt cho mắt, tạo độ nhớt thích hợp và bồi
bổ nội mô giác mạc, nuôi duỡng các tế bào giác mạc mắt, tái tạo lớp phím nuớc mắt
trước giác mạc, tăng cuờng độ đàn hồi của thấu kính, chống tình trạng khô mắt.
Mac Rae và cộng sự đã chỉ ra CS có tác dụng giảm sự tổn thương thấu kính mắt.
CS đuợc dùng trong thuốc nhỏ mắt để phòng ngừa và điều trị các tình trạng khô mắt,
mỏi mắt, thoái hoá võng mạc. Hiện nay, tại Việt Nam Công ty TNHH ROHTOMENTHOLATUM đã sản xuất thuốc nhỏ mắt New V.Rohto có chứa CS chữa các
bệnh: mỏi mắt, xung huyết kết mạc, bệnh mắt do tia cực tím hay các tia sáng khác,
nhìn mờ do tiết dịch, mắt ngứa, viêm mi…
- Các bệnh khác:
CS của sụn cá mập đuợc một số công trình nghiên cứu ghi nhận có chứa chất

“ức chế sự hình thành các vi mao mạch tân sinh” (angiogenesis) của khối u ung thư,
ngăn các tế bào ung thư không sinh sản và tăng trưởng. CS kết hợp với mitomycin C
có thể ức chế các tế bào ung thu cổ truớng sarcoma 180.
Sụn cá mập cũng có khả năng tăng cuờng hệ miễn dịch nên giúp giảm nhẹ các
chứng thấp khớp, đau nhức xương, vẩy nến, chàm…
Nhiều nghiên cứu cho thấy CS có khả năng tăng cuờng kháng viêm ức chế sự
tiết các cytokine tiền viêm TNF-a, interleukin-1ß nitric oxid và các gốc oxy hóa tự
do.
Những công dụng của CS đã và đang góp phần lớn cho ngành y học và nhiều
lĩnh vực khác. Do đó, việc nghiên cứu để thu nhận và ứng dụng CS trong thực tế là
một điều hết sức cần thiết hiện nay.


9

1.3.

GIỚI THIỆU VỀ CÁ MẬP [6], [14]

1.3.1. Giới thiệu về cá mập
Cá mập thuộc lớp cá sụn (Chondrichthyes) cùng Bộ cá đuối, cá kiếm. Thân hình
thủy động học dễ dàng rẽ nước, có từ 5 đến 7 khe mang dọc mỗi bên hoặc ở gần đầu.
Khe đầu tiên sau mắt gọi là lỗ thở, da có nhiều gai nhỏ bao bọc cơ thể chống lại các
ký sinh trùng.
Với một thân hình không nhỏ, lẽ ra chúng phải có một khung xương chắc khỏe,
tuy nhiên loài cá này lại không hề có xương. Bộ khung nâng đỡ cơ thể được kết bằng
chất sụn. Trong suốt cuộc đời mình, cá mập có thể thay răng nhiều lần: có 3000 chiếc
răng xếp bên trong bộ hàm khỏe và ngay khi một chiếc răng bị rụng đi khi cắn phải
vật cứng thì sẽ có chiếc khác thay thế chỉ trong vòng 24 tiếng. Chúng có thói quen
đớp mồi và nuốt chửng thay vì xé, nhai và nhấm nháp con mồi.

Cá mập thuộc loài ít di chuyển và được xem là kình ngư cừ nhất đại dương, có
thể bơi với vận tốc 46km/h, trong khi con người chỉ có thể đạt vận tốc 4km. Nhìn xa,
cá mập không có vảy, nhưng thực chất bộ da của chúng được phủ rất nhiều vảy nhỏ
rất nhám.
Cá mập có khứu giác hoàn hảo và thị giác khá tốt cộng thêm khả năng cảm nhận
điện trường của động vật đã ấn định cho cá mập ngôi vị vua biển cả. Với giác quan
này, một con cá mập có thể xác định mùi máu, hay nước tiểu của con mồi ở xa hàng
km.
Có hơn 440 loài cá mập dựa theo hình thái sinh học được liệt kê dưới đây theo
mối quan hệ tiến hóa của chúng từ thời cổ xưa đến hiện đại. Được chia thành 8 nhóm.
Quần thể cá mập rất không đồng nhất và được đại diện bởi một loạt các loài,
chúng có sự khác biệt rõ rệt trong những thói quen và sinh học, đặc biệt trong sự phát
triển và sinh sản. Chúng sinh sống ở các môi trường khác nhau, rộng từ đáy đại dương
biển nước ngọt sông, hồ, vùng cửa sông ven biển và đầm phá, từ vùng biển Bắc Cực
để làm ấm các vùng nhiệt đới. Cá mập khác nhau rất nhiều về kích thước bao gồm
các loài có kích cỡ chỉ bằng bàn tay, như Euprotomicrus bispinatus là một loài cá


10

sống dưới đáy biển chỉ dài 22 xentimet, đến cá mập voi khổng lồ (Rhincodon typus),
loài cá lớn nhất với chiều dài 12 mét. Hình thức sinh sản cá mập cũng rất khác nhau
giữa các loài, có loài đẻ trứng, mang thai và một số tạo phôi. Cá mập đẻ trứng nhưng
hầu hết các trứng được nuôi dưỡng trong cơ thể mẹ cho tới khi nở.

Hình 1.3. Phân loại cá mập
1.3.2. Tình hình khai thác cá mập hiện nay
Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Tuấn Long và Võ Sĩ Tuấn – Viện Hải
Dương học Nha Trang vào năm 2012 đã báo cáo rằng:
Có khoảng 530 phương tiện đang tham gia khai thác cá nhám/mập tại 6 tỉnh ven

biển từ Quảng Ngãi đến Bình Tuận, nhiều nhất là là Bình Thuận 181 chiếc, Bình
Định 140 chiếc, Khánh Hòa 98 chiếc, Phú yên 74 chiếc, Quãng Ngãi 32 chiếc và
Ninh Thuận 5 chiếc.
Nhìn chung, nghề khai thác cá nhám/mập tương đối đa dạng gồm câu cá mập,
câu cá ngừ đại dương, lưới cản (lưới rê tầng mặt), lưới ba màng, lưới vây và lặn.
Trong đó, nghề câu cá mập có số lượng phương tiện khai thác nhiều nhất 187 chiếc


11

và khu vực khai thác khá rộng từ bờ ra khơi, cao nhất là Bình Định có 80 chiếc (chủ
yếu tại Nhơn Lý, Tân Phụng và Tam Quan Bắc), Bình Thuận 70 chiếc (ở La Gi, Phú
Quý và Liên Hương), Quãng Ngãi 27 chiếc, Phổ An và Phú Yến 12 chiếc.
Hoạt động khai thác cá nhám/mập của 6 tỉnh ven biển từ Quảng Ngãi đếm Bình
Thuận diễn ra tại nhiều khu vực khác nhau tùy từng loại nghề, trong đó tập trung tại
3 khu vực chính là vùng ven bờ (từ bờ ra đến 24 hải lý) số lượng phương tiện khai
thác rất ít 12 chiếc, ở tuyến lộng từ 6 – 24 hải lý và tuyến khơi. Có khoảng 13 loài cá
nhám/mập được ngư dân khai thác, hầu hết các loài đều bắt gặp vùng tuyến khơi.
Một số loài khai thác phổ biến gồm cá nhám đuôi dài (Alopias pelagicus), cá nhám
đá (Carcharhinus albimarginatus), cá mập da trơn (Carcharhinus falciformis), cá
mập

thâm

(Carcharhinus

limbatus),

cá

mập

sọc

trắng

(Carcharhinus

amblyrhynchoides)…
Năng suất khai thác nghề câu cá mập là cao nhất (trung bình: 0.53
tấn/ghe/tháng), trong đó tuyến khơi có năng suất khai thác cao gấp 2 lần (0.80
tấn/ghe/tháng) so với tuyến bờ (0.45 tấn/ghe/tháng). Mùa vụ khai thác hầu hết của
các loại nghề không khác nhiều và chủ yếu tập trung từ tháng 2 – 10. Ở tuyến bờ
mùa vụ khai thác tập trung vào tháng 2 – 8, trong khi đó hoạt động ở tuyến khơi kéo
dài từ 2 – 10 tháng. Tháng 5 – 7 là tháng khai thác tập trung và năng suất cao nhất.
Hiện nay, ở Việt Nam nguồn nguyên liệu CS được nhập từ nước ngoài nên giá
thành còn rất cao và các công trình nghiên cứu thu nhận CS vẫn chưa được phổ biến.
Vì thế việc nghiên cứu tách chiết từ các loài sụn động vật là điều hết sức cần thiết và
ý nghĩa trong việc giảm giá thành của CS.
1.4.

TỔNG QUAN VỀ ENZYME PROTEASE [2], [3]

1.4.1. Phân loại và đặc điểm của protease
Nhóm enzyme proteaza xúc tác cho quá trình thủy phân các liên kết peptit (-CO
– NH-) trong phân tử protein và các cơ chất tương tự đến sản phẩm cuối cùng là các
acid amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vận
chuyển acid amin.

12

 Phân loại protease có thể căn cứ vào các tiêu chí:
+ Căn cứ vào cơ chất phản ứng của enzyme tham gia.
+ Căn cứ vào pH tối thích cho hoạt động của enzyme như protease acid, protease
kiềm và protease trung tính.
+ Nguồn thu nhận enzyme protease chủ yếu từ 3 nguồn cơ bản:
 Enzyme được tách từ các mô như: tụy tạng, dạ dày, ruột của nội tạng của
một số động vật thủy sản (mực, cá…) thường là trypsin, pepsin, chymotrypsin,
cathepsin.
 Từ thực vật có thể thu được papain (từ đu đủ), bromelain (từ thân, lá, vỏ
dứa).
 Vi sinh vật là một nguồn rất phong phú để thu enzyme, thường từ các loài
Aspergillus, Bacillus, Clostridium, Streptomyces và một số loài nấm men.
+ Tính đặc hiệu cơ chất của enzyme gồm: endopeptidase (endopeptit hydrolase,
hay proteinase) và exopeptidase (peptidase), amino peptidase, cacboxyl peptidase,
dipeptidase.
 Theo phân loại quốc tế các enzyme protease được chia thành 4 nhóm
phụ:
+ Aminopeptidase: Enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptid ở đầu nito của
mạch polypepetit.
+ Cacboxypeptidase: Xúc tác cho sự thủy phân các liên kết peptit ở đầu cacbon
của mạch polypeptit.
+ Dipeptihydrolase: Xúc tác sự thủy phân các dipeptit.
+ Proteinaza: Xúc tác sự thủy phân liên kết peptit nối mạch.
 Theo Barret và Donald (1956), Protease được phân chia thành 2 nhóm lớn
là nhóm endopeptidase và nhóm exopeptidase.
+ Nhóm 1: Endopeptidase là enzyme phân giải các liên kết nằm trong mạch
polypeptide. Dựa vào động học của cơ chất xúc tác, endopeptidase được chia thành
4 phân nhóm:

13

- Phân nhóm 1: Proteinase – serin là những proteinase chứa nhóm –OH của
gốc serin trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt
động xúc tác của các enzyme. Nhóm này gồm các enzyme như: trypsin,
chymotrypsin.
- Phân nhóm 2: Proteinase – xistein là protease mà trong trung tâm hoạt động
của nó chứa nhóm thiol (-SH) của acidamin xistein. Nhóm này gồm các enzyme
cathepxin.
- Phân nhóm 3: Proteinase – aspartic là những protease trong trung tâm hoạt
động của nó có các nhóm cacboxyl (-COOH) của aspactic như enzyme pepsin.
- Phân nhóm 4: Protease – kim loại. Đây là những protease trong trung tâm
hoạt động của nó có ion kim loại và hoạt động trong môi trường trung tính.
+ Nhóm 2: Exopeptidase hay peptidase. Các enzyme thuộc nhóm này gồm:
Cacboxylpeptidase, amino peptidase, dipeptidase. Các exopeptidase không có khả
năng thủy phân liên kết peptit ngoài cùng của chuỗi polypeptit hoặc đầu amin, hoặc
đầu cacboxyl, tuần tự tách từng acidamin ra khỏi chuỗi polypeptit.
Trong các nguồn thu nhận enzyme thì vi sinh vật là nguồn thích hợp cho việc
sản xuất enzyme ở quy mô công nghiệp vì có những ưu điểm sau:
- Có thể chủ động trong quá trình sản xuất.
- Chu kỳ phát triển của vi sinh vật ngắn do đó có thể sản xuất enzyme từ vi
sinh vật trong thời gian ngắn từ 36 – 60h.
- Có thể định hướng việc tổng hợp enzyme ở vi sinh vật theo hướng sản xuất
chọn lọc enzyme với số lượng lớn.
- Giá thành chế phẩm enzyme từ vi sinh vật thấp hơn so với các nguồn khác vì
môi trường nuôi cấy nuôi cấy tương đối đơn giản, rẻ tiền.
Do những ưu điểm này mà ngày nay việc nghiên cứu ứng dụng enzyme trong
đời sống này mang nhiều ý nghĩa khoa học lẫn thực tiễn hơn.

14

1.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân
Tốc độ thủy phân bằng enzyme chịu ảnh hưởng của rất nhiều yếu tố, cụ thể là:
Ảnh hưởng của nồng độ enzyme: Khi nồng độ enzyme thấp, lượng cơ chất
lớn, vận tốc thủy phân phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme. Khi nồng độ
enzyme tăng tốc độ phản ứng thủy phân tăng đến một giá trị giới hạn v = vmax thì nếu
nồng độ enzyme tiếp tục tăng, tốc độ thủy phân bởi enzyme tăng không đáng kể và
thậm chí không tăng.
Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất: Nồng độ cơ chất có ảnh hưởng lớn tới tốc
độ phản ứng thủy phân, khi tăng nồng độ cơ chất, tốc độ phản ứng thủy phân càng
tăng, nhưng khi tốc độ phản ứng thủy phân đạt tới giới hạn v=vmax, nếu tiếp tục tăng
nồng độ cơ chất, vận tốc phản ứng thủy phân hầu như không tăng.
Ảnh hưởng của nhiệt độ: Enzyme là protein có hoạt tính xúc tác nên kém bền
với nhiệt, chúng chỉ có hoạt tính trong khoảng nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ làm chúng
biến tính. Trong khoảng nhiệt độ đó, khi nhiệt độ tăng tốc độ phản ứng thủy phân
tăng. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng thủy phân do enzyme xúc tác
được đặc trưng bằng hệ số:
Q10 =
Với

Kt

𝑘𝑡+10
𝑘

hằng số tốc độ phản ứng tại nhiệt độ t

Kt+10 Hằng số tốc độ phản ứng tại nhiệt độ t+10oC.
Vùng nhiệt độ tạo cho enzyme có hoạt độ cao nhất gọi là vùng nhiệt độ thích
hợp của enzyme, trong đó có một giá trị nhiệt độ mà ở đó, tốc độ enzyme đạt cực đại
gọi là nhiệt độ tối thích. Đa số enzyme, vùng nhiệt độ thích hợp trong khoảng 40 –
50oC. Nhiệt độ làm cho enzyme mất hoạt tính gọi là nhiệt độ tới hạn, và nhiệt độ tới
hạn của enzyme khoảng 700C, vói các enzyme bền nhiệt (bromelin, papain…), nhiệt
dộ tới hạn cao hơn.


15

Ảnh hưởng của pH: pH có ảnh hưởng mạnh mẽ đến hoạt tính của enzyme vì
pH ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, ion hóa enzyme và đến độ bền của protein
enzyme. Đa số enzyme có khoảng pH thích hợp từ 5 – 9, mỗi enzyme chỉ hoạt động
thích hợp nhất ở một pH xác định gọi là pH hoạt động tối thích của enzyme.
Ảnh hưởng của thời gian thủy phân: Thời gian thủy phân cần thích hợp để
enzyme phân cắt các liên kết trong cơ chất, tạo thành các sản phẩm cần thiết của quá
trình thủy phân nhằm đảm bảo hiệu suất thủy phân cao, chất lượng sản phẩm tốt.
Thời gian thủy phân kéo dài hay rút ngắn đều ảnh hưởng đến hiệu quả của quá trình
thủy phân và chất lượng sản phẩm thủy phân. Thời gian thủy phân dài ngắn khác
nhau tùy thuộc vào loại enzyme, nồng độ cơ chất, pH, nhiệt độ, sự có mặt của các
chất hoạt hóa, ức chế… Trong thực tế, thời gian thỷ phân phải xác định bằng thực
nghiệm và kinh nghiệm thực tế cho từng quá trình thỷ phân cụ thể.
Ảnh hưởng của lượng nước: Nước vừa là môi trường để phân tán enzyme và
cơ chất lại, vừa trực tiếp tham gia phản ứng nên tỷ lệ nước có ảnh hưởng lớn đến tốc
độ, chiều hướng và là một yếu tố điều chỉnh phản ứng thủy phân bởi enzyme.
Ảnh hưởng của chất hoạt hóa: Chất hoạt hóa là những chất khi có mặt trong
phản ứng có tác dụng làm tăng hoạt tính enzyme, các chất này có bản chất hóa học
khác nhau, có thể là ion kim loại, anion hoặc các chất hữu cơ. Tuy nhiên, các chất
hoạt hóa chỉ có tác dụng trong giới hạn nồng độ cho phé, hoạt độ enzyme sẽ giảm.

Ảnh hưởng của các chất kìm hãm: Chất kìm hãm (hay chất ức chế) là những
chất vô cơ hay hữu cơ mà khi có sự hiện diện của chúng, enzyme có thể bị giảm hoạt
mất hoạt tính. Với mỗi enzyme ta phải biết rõ các chất kìm hãm khác nhau, vì vậy
khi sử dụng enzyme ta phải biết rõ các chất kìm hãm để điều chỉnh phản ứng.
1.4.3. Ứng dụng của protease
Từ xưa, con nguời đã biết sử dụng enzyme vào thực tiễn và các ứng dụng này
chỉ mang tính tự phát chưa có cơ sở khoa học. Ở nuớc ta, việc nghiên cứu và sử dụng
protease đã đuợc bắt đầu từ những năm 60 và cũng thu đuợc một số thành tựu đáng


16

kể, tạo nhiều chế phẩm có ý nghĩa thực tiễn lớn như: thuốc, thực phẩm (sản xuất
nuớc mắm ngắn ngày, bột làm mềm thịt, bột dinh duỡng cao cấp), chế biến sữa, dệt
may, thức ăn cho chăn nuôi và thuỷ sản, xử lý môi truờng.
Trong công nghiệp: Nguời ta dùng protease bổ sung vào xà phòng, chất tẩy
rửa để nâng cao tính năng tẩy rửa các loại dầu mỡ và chất bẩn hay có thể dùng
protease để khử lông trâu bò trong công nghệ thuộc da.
Trong công nghệ dược phẩm và y học: Protease được sử dụng để sản xuất các
loại thuốc làm tăng khả năng tiêu hóa protein, dùng để phân giải các cục protein trong
cơ thể, chữa bệnh nghẽn tim mạch, tiêu mũ các vết thương, các ổ viêm, làm thông
đường hô hấp.
Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm:
- Các enzyme amylase thường được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực thực
phẩm và đã mang lại chất lượng hiệu quả cao.
- Sử dụng enzyme amylase trong sản xuất maltose sử dụng trong công nghệ
sản xuất bia, nước giải khất, sản xuất bánh kẹo.
- Nếu đưa vào bột nhào 0,002 – 0,003% chế phẩm amylase thì chất lượng bánh
mì tăng cao, bánh xốp hơn, ngọt hơn và màu sắc đẹp hơn.
- Sử dụng enzyme amylase để sản xuất glucose từ tinh bột thay cho phương

pháp dùng acid clohidric kém hiệu quả.
- Sử dụng protease thu nhận từ quả dứa, đu đủ, nội tạng để làm mềm thịt, làm
tăng hương vị của sản phẩm sau khi chế biến. Thịt sau khi làm mềm có thể chế biến
câc sản phẩm có giá trị gia tăng.
- Sử dụng protease để sản xuất bột đạm thủy phân từ các nguyên liệu giàu
protein.


17

1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CHONDROITIN SULPHAT
[1], [12], [13]
Một số đề tài nghiên cứu sử dụng chondroitin sulphat:
Năm 2006, S.C. Shin, S.J. You, B.K. An và C. W. Kang – Trung tâm Nghiên
cứu Tài nguyên động vật, Cao đẳng chăn nuôi – Hàn Quốc đã công bố kết quả công
trình nghiên cứu “Nghiên cứu chiết xuất mucopolysaccharide-protein có chứa
Chondroitin sulphat từ sụn gà”. Kết quả nghiên cứu cho thấy điều kiện tối ưu của
việc chiết xuất bằng phương pháp đun nóng là ở 1000C trong 120 phút với sản lượng
40.09% và hàm lượng CS của sụn là 28.46%. Đối với alcalase, điều kiện tối ưu 2%
alcalase trong 120 phút thì năng suất thủy phân là 75.87% và hàm lượng CS là
26,61%. Việc sử dụng enzyme để chiết xuất CS có năng suất cao hơn so với đun
nóng. Đồng thời, kết luận rằng trong sụn gà có chứa một lượng chondroitin sulphat
đáng kể.
Năm 2014, đề tài nghiên cứu sản xuất Chondroitin sulphat từ khí quản vịt của
Vittayanont, M. and Jaroenviriyapap, T – Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa
Nông nghiệp, Đại học Prince of Songkla, Hatyai, Songkhla, Thái Lan. Tiến hành
nghiên cứu xử lý khí quản vịt bằng kiềm (NaOH 0.01 – 0.5M, ở 40C trong khoảng 1
– 6h), enzyme (alcalase 0.1 – 0.5%, ở 550C, pH = 8, 1 – 6h) và đun nóng (1 – 120
phút). Các mẫu được đun nóng được thủy phân bằng papain ở điều kiện 0.0625 – 1%
trong 1 – 10h. Kết quả nghiên cứu cho thấy 80% CS được chiết xuất ở điều kiện

0.025% papain trong 10h. Các hydrolysate đông khô từ khí quản sụn chứa 10.6% CS
thu được 39% sau khi kết tủa protein.
Hiện nay, trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu tách chiết CS từ các nguồn
nguyên liệu như da của cá Labeo rohita, sụn cá mập, sụn của cá mực, sụn gà, sụn
bò…Cho đến nay, tại Việt Nam vấn đề nghiên cứu thu nhận CS còn rất mới mẻ và
chưa phổ biến.