Thử nghiệm thủy phân sụn cá đuối tạo chondroitin suflate bằng phương pháp sử dụng enzym neutrase

BỘ GIÁO VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
------------

NGUYỄN THỊ KIM HƯƠNG

THỬ NGHIỆM THỦY PHÂN SỤN CÁ ĐUỐI
TẠO CHONDROITIN SULFATE BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ENZYM NEUTRASE

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

CÁN BỘ HƯƠNG DẪN: TS. VŨ NGỌC BỘI

KHÁNH HÒA - 2015


BỘ GIÁO VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
------------

NGUYỄN THỊ KIM HƯƠNG

THỬ NGHIỆM THỦY PHÂN SỤN CÁ ĐUỐI
TẠO CHONDROITIN SULFATE BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ENZYM NEUTRASE

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Mã số sinh viên
: 53130367
Lớp
: 53CNTP2
Cán bộ hướng dẫn : TS. Vũ Ngọc Bội

KHÁNH HÒA - 2015


i

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đề tài tốt tốt nghiệp này
Trước hết em xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Chủ
nhiệm Khoa Công nghệ Thực phẩm sự kính trọng, niềm tự hào được học tập và
nghiên cứu tại trường trong những năm qua.
Sự biết ơn sâu sắc nhất em xin được giành cho: TS.Vũ Ngọc Bội - Khoa Công
nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang, TS. Nguyễn Duy Nhứt – Viện
nghiên cứu khoa học và công nghệ Nha Trang đã tận tình hướng dẫn chỉ bảo và
giúp để em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Xin cảm ơn quý thầy cô giáo trong khoa Công nghệ Thực phẩm đã tận tình
giúp đỡ và tạo điều kiện cho em trong suốt thời gian làm đề tài tại phòng thí nghiêm.
Đặc biệt xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của gia đình và bạn bè luôn
luôn chia sẻ cùng em trong quá trình nghiên cứu.


ii

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................ i

MỤC LỤC ..................................................................................................................... ii
DANH MỤC BẢNG ..................................................................................................... v
DANH MỤC HÌNH ..................................................................................................... vi
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT..................................................................................viii
LỜI MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 3
1.1. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, PHÂN BỐ VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC
CỦA CÁ ĐUỐI ........................................................................................................... 3
1.2 GIỚI THIỆU VỀ SỤN ĐỘNG VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC
CỦA SỤN ................................................................................................................... 5
1.2.1 Sụn động vật .................................................................................................. 5
1.2.2 Thành phần hóa học của sụn cá đuối ............................................................. 6
1.3 CHONDROITIN SULFATE .............................................................................. 6
1.3.1 Đặc điểm và cấu trúc của Chondroitin sulfate............................................... 6
1.3.2 Ứng dụng của Chondroitin sulfate............................................................... 11
1.3.3 Thu nhận và định lượng Chondroitin sulfate............................................... 13
1.4 CƠ SỞ KHOA HỌC CHO VIỆC NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT
CHONDROITIN SULFATE .................................................................................... 14
1.4.1 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về chiết xuất và định lượng
Chondroitin sulfate ................................................................................................ 14
1.4.2 Các phương pháp thu nhận Chondroitin sulfate thô .................................... 15
1.4.3 Khả năng chiết rút Chondroitin sulfate từ sụn cá bằng phương pháp
hóa học và bằng phương pháp sinh học ................................................................ 17
1.4.4 Xác định Chondroitin sulfate trong sụn cá đuối ở Việt Nam ...................... 18
1.4.5 Xác định một số tính chất của Chondroitin sulfate ..................................... 18
1.5 ENZYM NEUTRASE VÀ QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN PROTEIN ............... 20


iii

1.6 PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ NHỮNG NGHIÊN CỨU ĐÃ CÓ, NHỮNG
VẤN ĐỀ CẦN NGHIÊN CỨU GIẢI QUYẾT ........................................................ 24
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....... 26
2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU ...................................................................................... 26
2.1.1. Cá đuối bồng mõm nhọn ............................................................................. 26
2.1.2. Enzym neutras ............................................................................................. 26
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................... 26
2.2.1. Phương pháp phân tíchhóa học.................................................................... 26
2.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm .................................................................... 34
2.3 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG ĐỀ TÀI .............................. 48
2.4 PHƯƠNG PHÁP SỬ LÝ SỐ LIỆU.................................................................. 48
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 49
3.1. XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA NGUYÊN LIỆU.................... 49
3.1.1 Thành phần hóa học của sụn cá đuối ........................................................... 49
3.1.2 Xác định hoạt độ enzym neutrase ................................................................ 49
3.2 XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ CỦA QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN SỤN
CÁ ĐUỐI BẰNG ENZYM NEUTRASE................................................................. 49
3.2.1 Xác định tỉ lệ enzym neutrase bổ sung ........................................................ 49
3.2.2 Xác định nhiệt độ thích hợp......................................................................... 51
3.2.3 Xác định tỉ lệ nước thích hợp ...................................................................... 52
3.2.4 Xác định thời gian thủy phân thích hợp ...................................................... 54
3.2.5 Xác định pH thủy phân thích hợp ................................................................ 55
3.3 ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH THỦY PHÂN SỤN CÁ ĐUỐI TẠO
CHONDROITIN SULFATE BẰNG ENZYM MEUTRASE .................................. 57
3.4 THỬ NGHIỆM THỦY PHÂN SỤN CÁ ĐUỐI ĐỂ TẠO CS THEO
QUY TRÌNH ĐÃ ĐỀ XUẤT ................................................................................... 59
3.5 NGHIÊN CỨU KẾT TỦA CHONDROITIN SULFATE ................................ 63
3.6 ĐÁNH GIÁ QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN SỤN CÁ ĐUỐI BẰNG
ENZYM NEUTRASE .............................................................................................. 64

iv

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN ......................................................................... 65
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 66
PHỤ LỤC .................................................................................................................... 69


v

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Tên các loại cá đuối ..................................................................................... 3
Bảng 1.2 Thành phần chính của mô sụn ..................................................................... 6
Bảng 1.3 Phân loại chondroitin sulfate ..................................................................... 11
Bảng 1.4 Hàm lượng CS được tách từ các nguồn sụn khác nhau ............................ 14
Bảng 1.5 So sánh khả năng chiết rút CS từ sụn cá bằng phương pháp hóa học
và bằng phương pháp sinh học .................................................................................. 17
Bảng 1.6 Hàm lượng CS trong các mẫu sụn cá đuối Việt Nam................................ 18
Bảng 1.7 Một số chỉ tiêu phân tích chế phẩm CS .................................................... 19
Bảng 2.1 Bảng nồng độ xác định đường chuẩn tyrosin ............................................ 31
Bảng 3.1 Bảng thành phần hóa học của sụn cá đuối ................................................. 49
Bảng 3.2 Hàm lượng CS (mg) trong tủa thu được .................................................... 63
Bảng 3.3 Đánh giá quá trình thủy phân sụn cá đuối bằng enzyme neutrase............. 64


vi

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Cá đuối bồng mõm nhọn .............................................................................. 3
Hình 1.2 Cấu trúc hoá học của một đơn vị trong chuỗi CS. ....................................... 8

Hình 1.3 Cấu trúc mạch của các CS............................................................................ 8
Hình 1.4 Cấu trúc Chondroitin Sulfate A ................................................................... 9
Hình 1.5 Cấu trúc Chondroitin Sulfate B .................................................................. 10
Hình 1.6 Cấu trúc Chondroitin Sulfate C .................................................................. 10
Hình 2.1 Mô hình liên kết phức tạp giữa chondroitin sulfate - methylene blue ....... 32
Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát quá trình nghiên cứu ............................ 35
Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn tỉ lệ enzym bổ sung ..................................... 39
Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn nhiệt độ thích hợp........................................ 41
Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn tỉ lệ nước thích hợp ..................................... 43
Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn thời gian thích hợp ...................................... 45
Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn pH thích hợp. ............................................... 47
Hình 3.1 Ảnh hưởng của tỉ lệ enzym neutrase bổ sung đến hàm lượng CS tạo
thành từ sụn cá........................................................................................................... 50
Hình 3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thủy phân sụn cá tạo CS bằng
enzyme neutras .......................................................................................................... 51
Hình 3.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ nước bổ sung đến hàm lượng CS tạo thành từ
sụn cá ......................................................................................................................... 53
Hình 3.4 Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng thủy phân sụn cá tạo CS bằng
enzyme neutrase ........................................................................................................ 54
Hình 3.5 Ảnh hưởng của pH đến khả năng thủy phân sụn cá tạo CS bằng
enzyme neutrase ........................................................................................................ 56
Hình 3.6 Quy trình sản xuất chondirotin sulfate ....................................................... 58
Hình 3.7 Sụn cá đuối ................................................................................................. 59
Hình 3.8 Sụn cá đuối xay nhuyễn ............................................................................. 59
Hình 3.9 Bổ sung nước tỉ lệ 500%/100g ................................................................... 60


vii

Hình 3.10 Xử lý nhiệt 1h........................................................................................... 60

Hình 3.11 Dịch sau thủy phân ................................................................................. 61
Hình 3.12 Dịch sau ly tâm......................................................................................... 61
Hình 3.13 Dịch sau tủa TCA .................................................................................... 61
Hình 3.14 Dịch sau lọc tủa TCA ............................................................................... 61
Hình 3.15 Dịch sau tủa cồn ....................................................................................... 62
Hình 3.16 Thu kết tủa CS .......................................................................................... 62


viii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
A664

OD ở bước sóng 664 nm

CĐ

Cá đuối

CPC

Cetylpyridium chloride

CS

Chondroitin sulfate

CS4

Chondroitin-4-sulfate

CS6

Chondroitin-6-sulfate

CTAB

Cetyltrimethylamnonium bromide

MB

Methylene blue

GAG

Glycosaminoglycan

GalNAc

N-acety-D-lgalactosamine

OD

Optical Density

PG

Proteoglycan

TCA

Tricloacetic


1

LỜI MỞ ĐẦU
Cá đuối bồng mõm nhọn (Dasyatis zugei) là loại cá hiện được đánh bắt quanh
năm nhưng giá trị kinh tế không cao. Hiện cá đuối bồng mõn chủ yếu để ăn tươi
hoặc phơi khô. Cá đuối là loại cá sụn trong sụn có chứa Chondroitin sulfate.
Chondroitin sulfate (CS) là thành phần cơ bản cấu tạo nên sụn khớp, CS còn
có mặt trong các tổ chức sợi chun (gân, cơ, dây chằng…) tạo sự vận động linh hoạt
và tính đàn hồi trong hoạt động khớp, tạo độ bền khi bị nén ép. CS có tác dụng hỗ
trợ điều trị các bệnh lý về xương khớp. CS làm tăng sản xuất chất nhầy và khả năng
bôi trơn của dịch khớp, đảm bảo chức năng dinh dưỡng và sự vận động linh hoạt
của khớp. Vì vậy, CS giúp giảm và ngăn chặn quá trình thoái hoá khớp [8]. CS còn
có vai trò bảo vệ sụn khớp bằng ức chế các enzym phá huỷ sụn khớp như
collagenase, phospholipase A2, N–acetylglucosamindase [17]. Một trong những tác
dụng quan trọng khác của CS là khả năng ức chế hoạt chất angiogenesis - chất kích
thích tạo tân mạch trong các khối u, làm cho khối u hạn chế phát triển. CS có khả
năng kháng viêm và ức chế các gốc oxy hóa tự do [11]. Hiện nay các thuốc kết hợp
CS và glucosamine đang được sử dụng hiệu quả để điều trị bệnh viêm khớp.
Do phân tử CS rất đa dạng và phức tạp, cho nên CS chưa được tổng hợp bằng
con đường hóa học mới chỉ được tách chiết từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên.
Những năm trước đây CS được tinh chế chủ yếu từ sụn cá mập, do đó giá thành rất
cao. Một số nghiên cứu trên thế giới đã tách chiết CS từ một số nguồn nguyên liệu
như từ da của cá Labeo rohita [18], cá mập [19], sụn gà [14], sụn bò [18].
Việc nghiên cứu để tách chiết CS từ các nguồn nguyên liệu khác nhau vẫn
được các nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm đặc biệt nhằm hạ giá thành sản phẩm.
Nghiên cứu lựa chọn, ứng dụng enzym thay thế các chất hóa học trong quá

trình thu nhận CS từ sụn động vật (đặc biệt các nguồn sụn thuỷ sản) là rất cần thiết
để giảm độ độc hại trong khi sản xuất cũng như tăng chất lượng của chế phẩm CS.
Ở Việt Nam, vấn đề nghiên cứu thu nhận CS còn mới mẻ, chưa có nhiều công
trình nghiên cứu về vấn đề này. Do vậy, em được giao thực hiện đề tài "Đánh giá


2

khả năng sử dụng enzym neutrase trong thủy phân sụn cá đuối để sản xuất
chondroitin sulfate” có ý nghĩa thực tiễn cao và nhiều triển vọng để ứng dụng vào
thực tế sản xuất dược phẩm nước nhà trong giai đoạn tới.
Mục đích của đề tài:
Đánh giá khả năng sử dụng enzym neutrase trong thủy phân sụn cá đuối để sản
xuất chondroitin sulfate.
Nội dung của đề tài:
Đề tài cần thực hiện nhiệm vụ chính sau:
1) Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân sụn cá đuối bằng
enzym neutrase (tỉ lệ enzym,pH thích hợp, nhiệt độ thích hợp, thời gian thủy phân,
tỉ nước thích hợp)
2) Sơ bộ đề xuất quy trình thủy phân sụn cá đuối tạo chondroitin sulfate bằng
enzym neutrase.
3) Thử nghiệm tạo chondroitin sulfate từ sụn cá đuối.
Ý nghĩa khoa học của đề tài.
- Các kết quả thu được của đề tài là cơ sở khoa học cho việc sử dụng neutrase
trong thủy phân sụn cá để sản xuất CS và là tiền đề cho quá trình sản xuất CS từ sụn
cá bằng công nghệ enzym.
- Các kết quả thu được của đề tài sẽ bổ sung hữu ích nguồn tài liệu phong phú
cho các nhà nghiên cứu các sản phẩm có giá trị gia tăng từ phế liệu thuỷ sản.
Ý nghĩa thực tiễn của đề tài:
- Kết quả sẽ mở ra một hướng tận dụng sụn cá đuối sản xuất CS dùng cho

con người.
- Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở cho các nhà thực nghiệm thử nghiệm
sử dụng các chất có tính dược học vào đời sống con người, góp phần nâng cao giá
trị sử dụng của sụn cá.


3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, PHÂN BỐ VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC
CỦA CÁ ĐUỐI
1.1.1 Đặc điểm hình thái

Hình 1.1 cá đuối bồng mõm nhọn
Bảng 1.1 Tên các loại cá đuối
TÊN LOẠI
THỦY SẢN

TÊN KHÁC (ĐỊA TÊN THƯƠNG MẠI TÊN KHOA HỌC
PHƯƠNG)
(TIẾNG ANH)
(LATINH)

Cá đuối quạt

Cá đuối

Holland kate, stringray
fish

Raja hollandi

Cá đuối bồng
đuôi vằn

Cá đuối

Blue spotted stingray
fish

Dasratis kuhlii

Cá đuối bồng
mõm nhọn

Cá đuối

Pake- edged stringray,
stringray fish

Dasyatis zugei

Cá đuối (CĐ) thuộc lớp cá sụn (Chondrichthyes) là cá có cơ thể bẹt giống như
cá nhám và cá mập, là các loài cá sụn chủ yếu sinh sống ngoài biển, nghĩa là chúng
có bộ xương không cấu tạo từ chất xương mà là từ chất sụn cứng và đàn hồi. Phần
lớn các loài cá đuối có 5 lỗ huyệt cơ thể giống như khe hẹp ở bụng, gọi là các khe


4

mang dẫn tới các mang, nhưng họ Hexatrygonidae có 6 lỗ huyệt. Phần lớn các loài
cá đuối có 5 khe mang nhưng có loài có tới 6 khe mang, các khe mang của các loài
cá đuối nằm dưới các vây ngực trên mặt bụng, trong khi ở cá nhám và cá mập thì
các khe mang ở hai bên đầu. Phần lớn các loài cá đuối có thân phẳng, giống như cái
đĩa bẹt, trong khi phần lớn các loài cá nhám có cơ thể thuôn động học. Nhiều loài cá
đuối có các vây ngực phát triển thành các phần phụ rộng và bẹt, giống như cánh.
Chúng không có vây hậu môn. Các mắt và các lỗ thở nằm trên đỉnh đầu.
Cá đuối rất đa dạng, nặng từ vài kilôgam đến trên một tấn, dài từ vài chục
centimet đến 6-7m, phần lớn là cá đáy, ăn chủ yếu các loài động vật trôi nổi, động
vật đáy, thân mềm, giáp xác, cá con. Ở Việt Nam, đã phát hiện 33 loài, thuộc 16 chi,
10 họ. Loài có giá trị kinh tế đáng kể nhất: CĐ bồng gai (Dasyatis zugei) có thể dài
đến 2m, được khai thác chủ yếu bằng lưới kéo đáy. Cá đuối xương của chúng không
giống như xương cá bình thường mà là những đốt sụn có thể nhai được. Bộ xương
của các loài cá sụn có thành phần chủ yếu là sụn.
Phần lớn các loài cá đuối có các răng phát triển, nặng, thuôn tròn để nghiền
nhai vỏ cửa các loài sinh vật tầng đáy như ốc, trai, hàu, động vật giáp xác, và một
vài loài cá, phụ thuộc vào từng loài.
Cá đuối được chia thành 2 bộ:
- Bộ Cá đuối thường (Rajiformes) không có cơ quan phát điện. Bộ cá này
trông giống như cá mập, có đuôi để bơi và các vây ức nhỏ hơn so với phần lớn các
loài cá đuối khác. Các vây ức của chúng gắn với phần trên của mang như ở mọi loài
cá đuối khác, làm cho chúng có bề ngoài với đầu rộng. Chúng có mõm dài, phẳng
với một hàng các tấm răng ở cả hai hàm. Mõm chúng dài tới 1,8 mét (6 ft), và rộng
30 cm (1 ft), được dùng để chém và xiên qua các con cá nhỏ cũng như để thăm dò
trong bùn nhằm tìm kiếm các sinh vật ẩn nấp trong đó. Một vài loài dài tới 6 mét
(20 ft). Bộ CĐ thường gồm nhiều họ: CĐ đĩa (Platyrhinidae), CĐ bướm
(Gymnuridae), ngoài ra còn có các họ cá ó, có hình dạng như hình con chim, là loài
cá đắt nhất do thịt của chúng rất ngon như cá ó thường (Myliobatidae), cá ó dơi
(Mobulidae), cá ó một hàng răng (Aetobatidae), cá ó mõm bò (Rhinopteridae).

5

- Bộ CĐ điện (Torpediniformes) có cơ quan phát điện, có hình dạng như cây
đàn ghi ta, nếu đâm chúng bằng xiên sắt tay sẽ bị tê giật như điện giật. Cá đuối điện
có các cơ quan phát ra điện trong các tấm vây ức. Bộ CĐ điện có 2 họ: CĐ điện hai
vây lưng (Torpedinidae) và CĐ điện một vây lưng (Narkidae).
1.1.2 Đặc điểm phân bố
Phần lớn các loài cá đuối sống tại đáy biển, trong các khu vực địa lý khác nhau
nhiều loài trong vùng nước ven bờ, một vài loài tại vùng biển sâu tới độ sâu ít nhất
là 3.000 m (9.800 ft), phần lớn các loài cá đuối có sự phân bố rộng khắp thế giới,
trong các môi trường nhiệt đới và cận nhiệt đới, ôn đới hay vùng nước lạnh. Chỉ vài
loài, như cá ó nạng hải (Manta birostris), là sinh sống ngoài biển khơi, và chỉ vài
loài sinh sống trong vùng nước ngọt. Một số loài cá đuối có thể sống trong các vùng
nước lợ và cửa sông. Các loài cá đuối sinh sống tại tầng đáy thở bằng cách lấy nước
vào thông qua các lỗ thở, chứ không phải thông qua miệng như phần lớn các loài cá
khác vẫn làm, và đẩy nước qua các mang ra ngoài.
Cá đuối thường xuất hiện nhiều từ tháng giêng đến tháng ba âm lịch, xương
của chúng không giống như xương cá bình thường mà là những đốt sụn có thể nhai
được. Bộ xương của các loài cá sụn có thành phần chủ yếu là sụn.
1.2 GIỚI THIỆU VỀ SỤN ĐỘNG VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA SỤN
1.2.1 Sụn động vật
Sụn động vật là loại mô liên kết đặc tồn tại trong cơ thể động vật có xương
sống, cũng như ở động vật không xương sống (sam, sên biển và động vật chân đầu
(cephalopod)...) [9]
Trong cơ thể người và các loài động vật có xương sống khác, sụn có ở nhiều
bộ phận như các khớp, xương sườn, tai, mũi, ống hô hấp, đĩa đệm cột sống….Các
loài cá sụn (chondrichthyes) như cá mập, cá đuối là những loài động vật có xương
sống nhưng bộ xương chứa hoàn toàn sụn cả khi ở tuổi trưởng thành. Sụn khác biệt
ở chỗ chỉ chứa một loại tế bào, không có mạch máu, không chứa các tế bào thần

kinh (aneurol) và không chứa hệ bạch huyết [19]
Có hai loại sụn là sụn khớp và sụn chêm. Thành phần hoá học của cả hai loại


6

sụn nêu trên đều bao gồm hai pha chủ yếu là pha lỏng bao gồm nước và các chất
điện phân, pha rắn do các đại phân tử tạo thành gồm sợi collagen (collagen loại II
trong sụn chêm và loại I trong sụn khớp), proteoglycan và tế bào sụn
(chondrocytes). Tế bào sụn tạo nên chất cơ bản (matrix) của sụn [9]
Bảng 1.2 Thành phần chính của mô sụn
Mô

Nước (%)

Collagen (%)

Proteoglycan (%)

Sụn khớp

68,0 – 85,0

10,0 - 20,0 (loại I)

5,0-10,0

Sụn chêm

60,0 – 70,0

15,0 - 25,0 (loại II)

1,0- 2,0

Thành phần chính của hai loại sụn được thể hiện trong bảng 1.1. Ba thành
phần chính này tạo nên đặc tính cơ học của sụn. Sự thay đổi của các thành phần này
(do bị bệnh lão hoá...) sẽ làm thay đổi đặc tính cơ học phụ thuộc vào thời gian của
sụn. Có tới 30% nước nằm trong khoảng không giữa các sợi collagen. Kích thước
sợi collagen và hàm lượng nước được xác định nhờ áp suất trương sinh ra do mật độ
điện tích của các đại phân tử proteoglycan mang điện tích âm phân bố trong khối
collagen. Sự gắn kết của proteoglycan ảnh hưởng đến trương lực và sự chuyển động
của pha lỏng khi bị nén ép. Chondroitin là thành phần cơ bản của proteoglycan chứa
trong sụn [9].
1.2.2 Thành phần hóa học của sụn cá đuối
Trong sụn cá đuối với hàm ẩm 65% thì có khoảng 13,8 % protein; 0,19% chất
béo; 17,12% là chất khoáng và khoảng 3,61% là các hydrate cacbon khác [7].
1.3 CHONDROITIN SULFATE
1.3.1 Đặc điểm và cấu trúc của Chondroitin sulfate
CS được phát hiện và lần đầu tiên được tách chiết từ những năm 60 do
Davidson và Meyer. CS thuộc nhóm chất heteropolysaccharide gọi là
glycosaminoglycan (GAG) ngoại bào được tìm thấy trong tự nhiên như một polime
mạch thẳng gồm các đơn vị cơ bản cấu tạo bởi 2 đường (disaccharide) N-acetyl-Dgalactosamine (GalNAc) và D-glucuronic acid (GlcA) xen kẽ nhau (polymeric D-


7

galactosamine and D-glucuronic acid), các gốc đường này được sulfate hoá hoặc
không bị sulfate hoá, một số gốc GlcA bị epime hoá thành L-iduronic acid (IdoA).
CS là một polime có phân tử lớn gồm 15-150 đơn vị cấu trúc 2 đường đơn của GlcA

và GalNAc. Khối lượng phân tử của CS thường trong khoảng 10.000 - 100.000
Dalton [15].
Kato (1994) và Bernfield (1999) đã nhận thấy CS thường gắn với các
protein bằng liên kết o-glycosid tạo thành một proteoglycan (PG) (glucoprotein),
là hợp chất hữu cơ thuộc nhóm mucopolysaccharide [16].
Sự kết hợp giữa nhóm sulfate (SO42-) của gốc đường với các nhóm carboxyl (COO-) của gốc đường acid làm cho phân tử chondroitin có mật độ điện tích âm rất
cao (anionic polysaccharide) dễ dàng liên kết đồng hoá trị với các protein trong cấu
tạo của PG. Chuỗi CS được gắn với nhóm -OH của gốc serine ở một số protein.
GAG được tổng hợp trong mạng lưới nội bào và trong thể Golgi. Sự gắn kết của
chuỗi GAG bắt đầu với 4 gốc đường đơn theo phương thức cố định là Xyl- Gal-GalGlcA; xylose được gắn với protein trong mạng lưới nội bào, còn các phân tử đường
khác được gắn trong hệ Golgi [17].
CS ưa nước vì thế hàm lượng nước trong mô sụn cao. Các điều kiện thủy phân
cũng có thể làm giảm trọng lượng phân tử trung bình của sản phẩm thu được. Mỗi
phân tử đường có thể không bị sulfate hoá, bị sulfate hoá 1 lần hay 2 lần. Quá trình
sulfate hoá là nhờ các enzym sulfotransferase đặc hiệu. Việc sulfate hoá ở các vị trí
khác nhau tạo nên hoạt tính sinh học đặc thù của CS.
Trong cơ thể sống, các PG và GAG giữ vai trò quan trọng trong nhiều quá
trình khác nhau như: điều hòa hoạt động của enzym và sự bám dính, phát triển và di
thực của tế bào. GAG còn có chức năng cấu trúc và điều khiển trong cơ thể sống.
Về cấu trúc, nó là thành phần chính của mô sụn. Về điều khiển, CS rất dễ gắn kết
với protein trong mô tế bào nhờ có điện tích âm, mối quan hệ này rất quan trọng cho
việc điều hoà các hoạt động của tế bào. Phân tử (monomer) PG của mô sụn (chứa
khoảng 80-100 mạch CS) cùng với protein gắn kết và acid hyaluronic tạo thành một
phức hệ thuỷ động học có khả năng nén thuận nghịch rất cần cho sụn để chống lại


8

sự ép nén với sự biến dạng nhỏ nhất [16]
Công thức hoá học của chondroitin sulfate (C14H21NO14S)n :

Hình 1.2 Cấu trúc hoá học của một đơn vị trong chuỗi CS.
Chondroitin-4-sulfate: R1 = H; R2 = SO3H; R3 = H.
Chondroitin-6-sulfate: R1 = SO3H; R2, R3 = H.

Hình 1.3 Cấu trúc mạch của các CS
Chondroitin có 3 loại chính là A, B và C chúng đặc trưng bởi số lượng và vị trí
của nhóm sulfate trong nhóm disaccharide lặp lại của chuỗi polysaccharide.
Chondroitin sulfate A: gốc sulfate gắn ở vị trí C-4 (chondroitin-4-sulfate, CS4), có
nhiều ở mô sụn sulfate C: gốc sulfate gắn ở vị trí C-6 (chondroitin-6-sulfate, CS6).
Chondroitin sulfate B: acid iduronic thay thế acid glucuronic. Loại A và B (CS4)


9

thường được tìm thấy ở sụn động vật có vú (bò và lợn), ngược lại loại C (CS6) được
tìm thấy chủ yếu ở các loài cá sụn (cá mập, cá đuối (rays, skates)...). Tuy nhiên, CS
từ các nguồn nguyên liệu khác nhau rất đa dạng về cấu trúc và kích thước, chúng
chứa ở mức độ nhiều hay ít một số lượng các isome của CS, có tới 16n isome của
CS, phụ thuộc vào sự thay đổi vị trí sulfate hoá của các cặp đường đôi tạo nên 16
isome/ mỗi cặp [19]. Trong đó CS A và CS C là những thành phần chủ yếu hình
thành PG [15].
Chondroitin Sulfate A (GlcA-GalNAc-4S)-CS4n, CS có thể kết hợp với
protein tạo nên chondromucoit.

Hình 1.4 Cấu trúc Chondroitin Sulfate A

Chondroitin sulfate B (IdoA-GalNAc-4S) -CS4
Tên cũ là dermatan sulfate (iduronic acid thay cho glucuronic acid), có nhiều
ở da, còn thấy có ở van tim, gân, thành mạch. Vị trí bị sulfate hoá ở C-4 của

GlcNAc và C-5 của glucuronic acid bị epime hoá thành iduronic acid


10

.
Hình 1.5 Cấu trúc Chondroitin Sulfate B

Chondroitin Sulfate - C (GlcA-GalNAc-6S ) - CS6

Hình 1.6 Cấu trúc Chondroitin Sulfate C
CS được tách chiết trước khi cấu trúc của nó được xác định. Vì vậy tên gọi
của CS cũng có sự thay đổi. Ngoài ra còn có chondroitin sulfate D. Phân loại các
CS được tóm tắt trong bảng 1.3.


11

Bảng 1.3: Phân loại chondroitin sulfate
Tên

Vị trí bị sulfate hoá

Tên phân loại

Chondroitin sulfate A

Carbon 4 của đường - N- Chondroitin-4-sulfate (CS4)
acety-D-galactosamine ở người có trong: sụn khớp,
(GalNAc)

giác mạc, da, thành mạch...

Chondroitin sulfate B
(Dermatant sulfate)

Carbon 4 của GalNAc –
L-iduronic acid

Chondroitin-4-sulfate (CS4)

Chondroitin sulfate C

Carbon 6 của GalNAc

Chondroitin-6-sulfate (CS6)

Chondroitin sulfate D

Carbon 2 của glucuronic
acid and 6 của GalNAc

Chondroitin-2,6-sulfate
(C2,S6)

CS tinh chế là chất bột màu trắng hoặc trắng ngà, hoà tan tốt trong nước vì thế
rất dễ hút ẩm; nhưng không hoà tan trong ethanol, methanol, cetone... Khối lượng
phân tử của CS nguyên liệu thường được sử dụng trong chế phẩm thuốc là thấp hơn,
khoảng 15000 - 20000 Dalton.
1.3.2 Ứng dụng của Chondroitin sulfate
CS đã được sử dụng rộng rãi trong các loại chế phẩm bổ sung dinh dưỡng

(dietary supplements) khác nhau trong thời gian dài và đang ngày càng được mở
rộng ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau. Thị trường chế phẩm bổ sung CS và
glucosamine rất lớn. Trong một năm (1998-1999) doanh thu bán lẻ ở Mỹ đạt tới 500
triệu USD [8]. CS có nhiều tác dụng trong điều trị bệnh lý cũng như trong các lĩnh
vực khác.
1.3.2.1 Ứng dụng trong y học
• Bệnh khớp (osteoarthritis): Nhiều nghiên cứu trên thế giới [5] cho thấy CS
đã được ứng dụng rộng rãi trong điều trị các bệnh lý về xương khớp, đặc biệt là
bệnh viêm khớp theo các cơ chế :
- Giảm đau, kháng viêm, giảm sưng khớp do làm giảm tạo ra tân dịch.
- CS còn được tìm thấy trong hoạt dịch, chất lỏng bao quanh khớp, giúp bôi
trơn khớp, tăng sự mềm mại của khớp.
- Tham gia vào cấu trúc tái tạo sụn khớp.


12

- Bảo vệ khớp ức chế các enzym phá hủy sụn khớp như collagenase, elastase,
proteoglycanase, phospholipaseA2 và N-acetylglucosamindase; kích thích hoạt
động các enzym xúc tác phản ứng tổng hợp hyaluronic acid giúp khớp hoạt động tốt [8].
Điều trị CS với liều 800 mg/ngày trong 3 tháng với liệu trình 2 đợt một năm
có tác dụng giảm đau và cải thiện chức năng rõ rệt ở bệnh nhân bị viêm khớp
[10]. Các nghiên cứu dược lý tại châu Âu trong khoảng 10 năm gần đây cho thấy
CS được sử dụng điều trị cho bệnh nhân đã không có một phản ứng phụ nào nghiêm
trọng xảy ra [23].
• Bệnh mắt:
CS là chất sinh lý của giác mạc duy trì độ trong suốt cho mắt, tạo độ nhớt
thích hợp và bồi bổ nội mô giác mạc, nuôi dưỡng các tế bào giác mạc mắt, tái tạo
lớp phím nước mắt trước giác mạc, tăng cường độ đàn hồi của thấu kính, chống tình
trạng khô mắt. Mac Rae và cộng sự đã chỉ ra CS có tác dụng giảm sự tổn thương

thấu kính mắt. CS được dùng trong thuốc nhỏ mắt để phòng ngừa và điều trị các
tình trạng khô mắt, mỏi mắt, thoái hoá võng mạc [5]. Ngoài ra CS còn được sử dụng
để điều chế chất nhầy thường được dùng trong phẫu thuật lấy thủy tinh thể và đặt
thủy tinh thể nhân tạo nhằm bảo vệ biểu mô và nội mô của giác mạc [5]. Công ty
TNHH ROHTO-MENTHOLATUM (Việt Nam) sản xuất thuốc nhỏ mắt New
V.Rohto có chứa CS chữa các bệnh: mỏi mắt, xung huyết kết mạc, bệnh mắt do tia
cực tím hay các tia sáng khác, nhìn mờ do tiết dịch, mắt ngứa, viêm mi ...
• Các bệnh khác
CS của sụn cá mập được một số công trình nghiên cứu chứng minh là có khả
năng ức chế một số loại ung thư. Vì từ sụn cá mập tinh chế chứa các chất có khả
năng ức chế sự hình thành các vi mao mạch tân sinh mà các mô ung thư rất cần để
phát triển, nên có thể hạn chế các khối u. CS cùng với mitomycin C có thể ức chế
các tế bào ung thư.
Sụn cá mập cũng có khả năng tăng cường hệ miễn dịch nên giúp giảm nhẹ các
chứng miễn dịch như thấp khớp, đau nhức xương (phong thấp), vẩy nến, chàm
(eczema), luput đỏ [5].


13

Nhiều nghiên cứu cho thấy CS có khả năng tăng cường kháng viêm, ức chế
tiết các cytokine tiền viêm TNF-α, interleukin-1β, nitric oxid và các gốc oxy hóa tự
do [11].
1.3.2.2 Các ứng dụng khác
CS có trong thành phần các mỹ phẩm (tác nhân dưỡng tóc, kem dưỡng và chất
giữ ẩm…) [17]. CS còn có trong thành phần các chế phẩm chứa gelatin (thực phẩm,
mỹ phẩm, thuốc, nguyên liệu công nghiệp và làm ảnh).
CS còn có thể bổ sung để điều trị và ngăn tắc nghẽn động mạch, có tác động
chống đông máu.
CS có tác động điều khiển tế bào. CS làm tăng sinh một số loại tế bào bạch

cầu, tăng tổng hợp RNA trong tế bào sụn nuôi cấy do đó làm tăng tổng hợp
proteoglycogens và collagens, thúc đẩy sự tích luỹ hyalin trong gan và hạt lympho [23].
1.3.3 Thu nhận và định lượng Chondroitin sulfate
Cấu trúc phân tử CS rất đa dạng và phức tạp nên chưa thu nhận CS được bằng
con đường tổng hợp hoá học, cho đến nay mới chỉ tổng hợp được các mạch
oligosaccharide ngắn có trình tự giống một đoạn mạch CS như một số CS
tetrasaccharide (4 gốc đường đơn) có khả năng kích thích sự phát triển và phân hoá
của neron thần kinh , còn phân tử disaccharide thì không có tác dụng trên.
Vì thế, hiện nay nguyên liệu CS thô mới chỉ được thu nhận duy nhất từ các
nguồn tự nhiên nhờ chiết xuất CS từ các loại mô động vật. Sụn cá mập (xương sọ,
xương sống, vây...) là nguồn nguyên liệu CS phổ biến nhất trong các chế phẩm
thuốc và chế phẩm bổ sung dinh dưỡng.
CS trong mô động vật liên kết chặt với protein trong dạng phức proteoglycan.
Cho nên việc đầu tiên là phải tách CS ra khỏi protein nhờ việc làm yếu mối liên kết
giữa CS-protein và phân huỷ protein để giải phóng các phân tử CS.
Hàm lượng CS được thu nhận từ các nguồn nguyên liệu sụn khác nhau qua các
phương pháp đã được mô tả và được tóm tắt trong bảng 1.3.


14

Bảng 1.4. Hàm lượng CS được tách từ các nguồn sụn khác nhau [7]
STT

Nguyên liệu

CS4 (%)

CS4 (%)

Loại CS

1

Vây cá mập

9,60 ± 1,05

8,76 ± 0,96

CS6,CS4

Sụn lưỡi

14,84 ± 0,38

13,54 ± 0,35

CS6,CS4

Xương sườn

5,56 ± 0,96

5,08 ± 0,87

CS6,CS4

Xương ức

11,55 ± 0,88

10,54 ± 0,80

CS6,CS4

Cổ họng

9,51 ± 1,99

8,68 ± 1,81

CS6,CS4

3

Cá đuối

5,27 ± 0,91

4,81 ± 0,84

CS6,CS4

4

Xương lưỡi hái của gà

14,08 ± 2,51

13,38 ± 4,74

CS4,CS6

5

Sụn mũi bò

11,50

Cá sấu:

2

CS4, CS6

Như vậy hàm lượng CS trong các nguyên liệu sụn biến động từ khoảng 10,0 28,3%, phần lớn chứa cả 2 loại CS4 và CS6.
1.4 CƠ SỞ KHOA HỌC CHO VIỆC NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT
CHONDROITIN SULFATE
1.4.1 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về chiết xuất và định lượng
Chondroitin sulfate
a) Các nghiên cứu nước ngoài
• C.W.Kang và các cộng sự trường đại học Konkuk, Hàn Quốc đã tiến hành
nghiên cứu chiết xuất mucopolysacharide-protein chứa Chondroitin sulfate từ sụn
gà và nhận thấy khi xử lý sụn với nhiệt (1000C, p < 0,01) trong 90 phút và sử dụng
enzym acalase 2% thì thu được mucopolysacharide-protein. Tuy vậy chỉ mới thu
được mucopolysacharide-protein cần tiếp tiếp tục thủy phân thu CS.
• T. Anakano và L. Ozimek khoa thực phẩm và dinh dưỡng , Đại học Meji,
Nhật Bản Nghiên đã tiến hành nghiên cứu phương pháp chiết xuất chondroitin
sulphate-peptide từ sụn mũi trâu, bò và nhận thấy sử dụng HCL 6M ở 1100C trong

24h cho ra hiệu suất thu hồi CS cao. Tuy vậy công trình nghiên cứu sử dụng phương pháp


15

hóa học HCl làm ảnh hưởng chất lượng CS thu được mất gốc sulfate 4 của CS.
• Xie, J., Ye, H. I. và Lou, X. F. Khoa dược phẩm, trường đại học công nghệ
Trung Quốc đẫ tiến hành nghiên cứu cách chế tạo hiệu quả Chondroitin Sulfate và
collagen từ sụn cá mập công trình tiến hành thử nghiệm trên nhiều loại enzym
papain, acalase, neutrase, bromelain, pancreatic và nhận thấy neutrase cho hiệu quả
thu CS cao nhất. Tuy nhiêu phương pháp phân tích rất phức tạp bằng sắt kí.
• Vittayanon, M và Jroenviriyapap, T. Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa
Nông nghiệp, Đại học Prince Songkla, Hatyai, Songkhla, Thái Lan đã tiến hành
nghiên cứu Sản xuất chondroitin sulfate thô từ khí quản vịt và nhận thấy rằng kết
hợp NaOH và enzym acalase để sản xuất CS. Tuy vậy tác giả đã sử dụng kiềm làm
ảnh hưởng gốc sulfate 6 của CS
• Somashekar P.L, Tripathy A. S, Sathish K.P, Chandrashekar Javali and
Palakshi Gouda. Thư viện trường đại học dược, Ấn Độ đã nghiên cứu phương pháp
định lượng Chondroitin Sulfate trong viên thuốc bằng cách so màu với thuốc thử
Methylene Blue.
b) Các nghiên cứu trong nước
• Võ Hoài Bắc, Đỗ Ngọc Tú - Viện Công nghệ Sinh học.Trần Cảnh Đình Phòng sau thu hoạch đã tiến hành nghiên cứu tách chiết Chondroitin Sulfate từ
xương sụn cá đuối (Dasyatis Kuhlii ) và cà nhám (Carcharhinus Sorrah ) bằng công
nghệ sinh học và nhận thấy rằng sử dụng chế phẩm enzym từ vi sinh vật để tách
chiết CS. Tuy vậy thời gian thủy phân kéo dài đến 48 giờ.
• Vũ Thị Thanh Tâm và Võ Hoài Bắc, Đại học Nha Trang đã tiến hành
nghiên cứu quy trình thu nhận Chondroitin Sulfate từ nguyên liệu thủy sản bằng
phương pháp sinh học và nhận thấy rằng sử dụng enzym thủy phân sụn cá đuối ở
Việt Nam đã thu CS. Tuy vậy hiệu suất còn thấp, thời gian thủy phân dài 24 giờ.
1.4.2 Các phương pháp thu nhận Chondroitin sulfate thô

Quá trình thu nhận chế phẩm CS thô từ sụn có thể được thực hiện bằng
phương pháp hoá học hoặc phương pháp sinh học (dùng enzym) để thuỷ phân sụn.