Kiểm nghiệm listeria monocytogenes

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM

ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA: KHOA HỌC ỨNG DỤNG

KIỂM NGHIỆM
LISTERIA MONOCYTOGENES
GVHD: Th.S Bùi Anh Võ
Lớp: 10060301, 08SH1D
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 3
năm 2013

SV thực hiện:
1) Nguyễn Triết Lãm - MSSV:
61003212
2) Bùi Văn Thành – MSSV: 080569H


1. Giới thiệu về Listeria Monocytogenes


1. Giới thiệu về Listeria monocytogenes


1. Giới thiệu về Listeria monocytogenes


1. Giới thiệu về Listeria monocytogenes

Nguồn chứa vi khuẩn L. monocytogenes

2. Khả năng nguy hiểm của Listeria
monocytogenes


2. Khả năng nguy hiểm củaListeria
monocytogenes
Bệnh Listeriosis:


2. Khả năng nguy hiểm của Listeria
monocytogenes
Biện pháp phòng tránh:


3. Định tính Listeria Monocytogenes

1. Phát hiện nhanh Listeria monocytogenes
trong thực phẫm thịt, sữa.


3. Định tính Listeria Monocytogenes
1.2 Quy trình phân tích:


3. Định tính Listeria Monocytogenes

1.2.1 Mồi cho phản ứng PCR

3. Định tính Listeria Monocytogenes

1.2.2 Xác định tính đặc hiệu của mồi


3. Định tính Listeria Monocytogenes

1.2.3 Tiến hành
- Phương pháp chuẩn bị mẫu


3. Định tính Listeria Monocytogenes

1.2.3 Tiến hành
- Tăng sinh


3. Định tính Listeria Monocytogenes

1.2.3 Tiến hành
- Phản ứng PCR và xử lý kết quả


3. Định tính Listeria Monocytogenes
- Đánh giá kết quả: các mẫu
xuất hiện các băng DNA
tương ứng với vị trí 468bp
trong các phản ứng PCR với
cặp mồi là các mẫu bị nhiễm 468 bp
L. monocytogenes

400 bp
Kết quả phản ứng PCR với
khuôn DNA tinh sạch được
thể hiện trong hình 1-giếng 2
cho thấy một băng DNA có
Hình 1
kích thước nằm trong khoảng 1.Thang DNA chuẩn
2.Mẫu chuẩn dương tính
kích thước sản phẩm PCR
3.Mẫu chuẩn âm tính
thiết kế.


3. Định tính Listeria Monocytogenes
2. Quy trình phân tích L. monocytogenes theo
truyền thống
2.1 Nguyên lý phương pháp
Sử dụng phương pháp cấy đếm Listeria
monocytogenes trên môi trường nuôi cấy chuyên biệt
sau khi ủ ấm ở nhiệt độ 370C trong 48 giờ. Chọn các
khuẩn lạc nghi ngờ xác định Listeria monocytogenes
bằng các thử nghiệm sinh vật hoá học.


3. Định tính Listeria Monocytogenes
2.2 Dụng cụ, môi trường và thuốc thử
2.2.1 Môi trường, thuốc thử
- Nước Pepton 0,1 %.
- Thạch Oxford.
- Thạch Tryptone soya có 0,6% cao men (yeast extract)

-TSA-YE.
- Canh thang Tryptone soya có 0,6% cao men (TSB-YE)
- Thạch máu cừu.
- Môi trường SIM.
- Môi trường Clurk-Lubs.
- Canh thang đường Manitol, Xylose, Rhamnose 5%, có
chỉ thị màu Bromocresol và ống Durham.
- Bộ thuốc nhuộm Gram.
- Hydrogen Peroxide 3%


3. Định tính Listeria Monocytogenes

2.3 Tiến hành
2.3.1. Bước 1 :
- Đánh dấu lên đĩa thạch nồng độ dung dịch mẫu
thử.
- Dùng pipet 1ml vô trùng hút chính xác 0,1 ml từ
dung dịch thử 10-1 , nhỏ lên bề mặt đĩa thạch chọn
lọc đã đánh dấu nồng độ dung dịch mẫu thử tương
ứng.
- Dùng que cấy kim loại hoặc que cấy thuỷ tinh ria
đều để dung dịch mẫu được phân bố khắp mặt thạch
sao cho các khuẩn lạc mọc phân tán đều
- Ủ ở 370C/48giờ.


3. Định tính Listeria Monocytogenes
2.3.2. Bước 2:
Đọc kết quả sơ bộ sau 48 giờ.

- Đếm toàn bộ các khuẩn lạc có đặc tính: Tròn đều,
màu nâu đen hoặc xanh đen. Đường kính: 2-3 mm
và môi trường xung quanh khuẩn lạc có màu đen
với trung tâm khuẩn lạc lõm xuống. Đây là đặc
điểm đặc trưng của giống Listeria.


3.Tính
Định
Listeria
Monocytogenes
kếttính
quả theo
công thức
(tài liệu TN Vi sinh) :

N
A=
n1. f1.V +.... + ni f iV

Trong đó:
-A : Số tế bào vi khuẩn (đơn vị hình thành khuẩn lạc)
trong 1ml mẫu; CFU/ml
- N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các hộp đã
chọn.
- V: Thể tích mẫu cấy trên môi trường đĩa.
- n1 : Số đĩa đếm được ứng với độ pha loãng ban đầu.
- ni : Số đĩa đếm được ứng với độ pha loãng thứ i.

3. Định tính Listeria Monocytogenes

2.3.3. Bước 3: Tăng sinh thuần chủng và xác định
hình thể, tính chất bắt màu.
2.3.3.1. Tăng sinh thuần chủng:
- Lấy khuẩn lạc điển hình từ thạch chọn lọc cấy vào
môi trường TSA-YE và ủ ấm ở 370C / 24h thu được
khuẩn lạc thuần nhất tròn, trong, bóng và hơi lồi.
2.3.3.2. Hình thể và tính chất bắt màu:
Từ khuẩn lạc thuần nhất nhuộm Gram xem hình thể:
Nhuộm Gram sau 16 - 24h nuôi cấy thấy: Trực
khuẩn ngắn bắt màu thuốc nhuộm Gram. Đường
kính 0,4 - 0,5 mm và dài 0,5 - 2 mm.


3. Định tính Listeria Monocytogenes
- Soi tươi trên lam kính xem tính chất di động:
+ Lấy 1 khuẩn lạc mọc trên TSA-YE cấy vào
môi trường canh thang TSB-YE. Để ở 25oC qua
đêm.
+ Canh trùng được soi tươi trên lam kính thấy :
Hình que ngắn, mảnh, di động kiểu xoay tròn
nhẹ hoặc nhào lộn. Di động kiểu bơi không phải
là giống Listeria.


3. Định tính Listeria Monocytogenes
2.3.4 Bước 4: Tính chất sinh vật hoá học:
2.3.4.1.Tính chất di động trên thạch SIM :
- Lấy canh trùng từ TSB-YE cấy vào môi trường thạch

SIM .
- Ủ ấm : 2-7 ngày ở 25oC. Thấy di động tạo hình cái ô.
2.3.4.2.Tính chất lên men đường: Xylose, Rhamnose,
Manitol.
- Dùng canh thang có chỉ thị màu Bromocresol và có
ống Durham để xác định tính chất lên men các loại
đường.
- Để các ống canh trùng thử khả năng lên men đường ở
tủ ấm 35oC / 4 - 7 ngày.
- Quan sát hàng ngày (24-48h) để xem sự thay đổi màu


3. Định tính Listeria Monocytogenes
Tiêu chuẩn xác định Listeria monocytogenes
trong thực phẩm:
Danh mục
Thực phẩm làm sẵn, là nguyên
nhân liên kết với bệnh Listeriosis
(như phó-mát, pa-tê gan, xà lách
trộn hạn sử dụng >10 ngày, sản
phẩm thịt lợn).

Giới hạn
(LM)
> 0 cfu/50g

Tất cả các loại thực phẩm làm sẵn > 0 cfu/25g
khác hỗ trợ cho sự tăng trưởng của
Listeria monocytogenestrong điều
kiện làm lạnh và hạn sử dụng >10

ngày.

Tình trạng Hành động cần
GMP
thiết
n/ad
Loại I: Thu về đối
với việc bán lẻ.

n/a

Xem xét, báo cáo
cộng đồng, theo
dõi tại nhà máy.
Loại II: Thu hồi
sản phẩm.