Nghiên cứu thành phần hóa học của một vài cây có tác dụng chữa bệnh răng miệng

B ộ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
/ /
.. ¡riiiiÌ!:L';'

^cJ

,1

NGHIÊN CỨU
THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA MỘT VÀI CÂY
CÓ TÁC DỤNG CHỮA BỆNH RĂNG MIỆNG
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Đ ư ợ c SỸ ĐẠI HỌC KHOẢ 1995- 2000)

Người thực hiện

: Nguyễn Trường (ỉiang.

Ngưòi hướng dẫn

: Tiến sỹ Giang Thị Sơn.
Tiến sỹ Ngô Mai Anh.

Noi thực hiện

: IỈỘ môn Hoá HỮƯ cơ.

Thời gian thực hiện : 1/3- 23/5/2000.

Hà Nội, 5- 2000

*

LỜI CÁM ƠN.

Em xin chân thành gỏi lời cảm ơn đến Tiến sỹ Giatìg Thi Sơn và Tiến sỹ
Ngô Mai Anh, những người đã trực tiếp hướng dẫn em thực hiện kììoá luận
này, xin cảm ơn các cô đã luôn tận tình giúp đỡ em trong suốt thời gian qua,
luôn động viên em những lúc khó khăn khúc mắc.
Em xin cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ nhân viên trong bộ môn Hoá
Hữu cơ và Tiến sỹ Cao Văn Thu vì sự giúp đỡ đ ể em có thể hoàn thành tốt
khoá luận tốt nghiệp này.
Nhân đây em cũng xin gởi lời cảm ơn đến tất cả cấc thầy cô giáo, các cán
bộ nhân viên của Trường Đợi học Dược Hà Nội đã giúp đỡ em írong suốt quá
trình học tập tại trường.
Hà Nội, tháng 5 năm 2000.
Sinh viên Nguyễn Trường Giang.

1


MỤC LỤC.
Trang

Lời cảm ơn

1

Mục ỉ ục

2

Phần I. ĐẶT VẤN ĐỀ

3

Phần II. TỔNG QUAN

4

2.1. Cây lá lốt

4

2.1.1. Mô tả

4

2.1.2. Phân bố địa lý

4

2.1.3. Thành phần hoá học

4

2.1.4. Tác dụng dược lý và công đụng

4

2.2. Cây trầu không

5

2.2.1. Mô tả

5

2.2.2. Phân bố địa lý

6

2.2.3. Thành phần hoá học

6

2.2.4. Tác dụng dược lý và cổng dụng

6

2.3. Một số bài thuốc có Lá lốt và Trầu không.
Phần III. THỰC NGHIỆM VÀ KÊT q u ả

7
8

3.1. Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm

8

3.1.1. Nguyên vật liệu

8

3.1.2. Phương pháp nghiên cứu

8

3.2. Kếl quả thực nghiệm và nhận

xét

9

3.2.1. Định tính thành phần hoá

học cây Lá lốt

9

3.2.2. Định tính thành phần hoá

học cây Trầu không

15

3.2.3. Định lượng và tách Tanin của Lá lốt và Trầukhông.

22

3.2.4. Thăm dò tác dụng kháng khuẩn của các dược liệu

23

Phần IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ x u ấ t

29

Tài liệu tham khảo

30

2


PHẦN I- ĐẶT VÂN ĐỂ
Đất nước Việt Nam có nguồn tài nguyên dược liệu phong phú và có nền Y
học dân tộc phát triển lâu đời. Từ hàng ngàn năm về truớc con người Việt
Nam đã biết sử dụng cây cỏ, động vật xung quanh để làm thuốc và đã có
những nghiên cứu về Y dược lý rất đáng khâm phục. Theo kinh nghiệm dân
gian và một số nghiên cứu trong những năm gần đây thì Lá lỐt(Piper lolot
C.DC) và Trầu không(Piper betle L.) là những cây thuốc có tác dụng chữa
bệnh răng miệng rất tốt. Những cây thuốc này lại rất dễ kiếm và đã được sử
dụng rộng rãi trong nhân dân với các mục đích khác nhau. Chính bởi các lí do
đó chúng tôi mong muốn được tìm hiểu về thành phần hoá học và tác dụng
kháng khuẩn của 2 cây thuốc này để một phần nào lý giải được tác dụng của
chúng trong điều trị bệnh lăng miệng, và đây chính là mục đích của khoá
luận tốt nghiệp Dược sỹ đại học “Nghỉcn cứu thành phần hoá học của một
vài cây có tác dụng chữa bệnh răng miệng “ của chúng tôi.
Trong thời gian thực hiện khoá luận tốt nghiệp này chúng tôi mong muốn

hoàn thành được các mục tiêu như sau:
1. Định tính thành phẩn hoá học của 2 cây Lá lốt và Trầu không.
2. Tìm cách tách được một thành phần hoá học có khả năng là thành phần
tạo nên tác đụng chữa bệnh răng miệng của chúng.
3. Thăm dò khả năng kháng khuẩn của 2 dược liệu này.


t

PHẦN II- TỔNG QUAN
<
t

2.1. Cây Lá lối
Tên khác : Tất bát, ana klùa táo.
Tên khoa học : Piper lolot C.DC.
Họ : Hổ tiêu (Piperaceae).
2.1.1. Mô tả[7, 16]
Lá lốt thuộc loài cây thảo, thường cao 50-60cm, có khi cao tới một mét,
thân hơi có lông, có một ống tiết trong tuỷ. Thân cây chia thành lừng đốt, mỗi
đốt mang một lá, cuống lá có bẹ ngắn. Lá hình trứng rộng, phía cuống hình
tim, đầu lá nhọn, khi soi lên có những điểm trong. Phiến lá rộng 8,5-9cm, dài
13cm. Mặt trên lá nhẵn bóng có màu xanh (hẫm, mặt dưới lá nhạt hon và có
lông mịn. Ra hoa vào cuối mùa xuân, đẩu hè và mùa thu, hoa mọc thành
bông, hoa cái đài lcm. Quả kép nhỏ dài chừng 1-1,5cm gồm nhiều lá noãn
mang hạt.
2.1.2. Phân bố địa /ý[7, 16]
Cây Lá lốt mọc hoang và được trồng ở khắp nơi trong nước ta, nhất In
những vùng đất ẩm ướt . Ngoài ra cây còn phân bố ở một số nước trong vùng
Đông Nam Á như Campuchia, Maỉaixia.

2.1.3. Thành phần hoá học
Các tài liệu nghiên cứu trước đây cho thây Lá ỉốt có chứa tinh dáu [1, 16],
hợp chä't Flavonoid [11, 18], hợp chất Alcaloid: piperin và piperidin [11, 18],
Tanin [11, 18].
2.Ỉ.4. Tác dụng dược lý và công dụng
Theo Tuệ Tĩnh và Đỗ Tát Lợi, Lá lốt sắc uống có vị cay, tính ấm chữa đau
lưng, chướng khí, thổ tả, hàn lỵ, thấp khớp, đổ mồ hôi tay chân, đau bụng đi
ngoài, nhức đầu, đau răng [16, 20].

4


Năm 1970 Til ạch Thị Thân trong báo cáo tốt nghiệp Dược sỹ đại học đã
chứng minh Lá lốt có tác đụng kháng khuẩn với các chủng Staphylococcus
aureus, Sarcina lutea, Bacillus subtilis và một số chủng vi khuẩn khác [18].
Trong báo cáo này tác giả cũng chứng minh khả năng chống viêm của nước
sắc lá lốt. trên động vật. Từ đó Lá lốt đã được sử đụng để điều trị bệnh lăng
miệng với hai dạng bào chế là ống Pipelo ngậm và viên nén Pipelo[15].
Trong Tạp chí Y học thực hành số 7 năm 1962, tác giả Triều Đắc đã nêu
phương pháp dùng nước sắc Lá lốt và đầu hạt dọc trộn cám để điều trị các vết
thương nhiễm tiling, vết thương sẽ lành nhanh chóng[9].
Từ các tính chất đó của Lá lốt, bệnh viện Quân Y 115, 354 và 108 đã
nghiên cứu đưa Lá lốt vào sử dụng trong điều trị các bệnh về răng miệng như
viêm lợi, viêm quanh răng, sâu răng..và đã đạt được một vài kết quả tương đối
khả quan [20, 22], Theo thống kê của bác sĩ Lê Tưởng, Hội Răng Hàm Mặt
thì trong 3 năm từ 1977 đến 1979 các bệnh viện trên đã điều trị 150 ca với các
bệnh hôi miệng, cháy máu chân răng, viêm lợi bằng Lá lốt có tỷ lệ khỏi bệnh
đạt 72- 85%[22].
2.2. Cây Trầu không
Tên khác: Trầu, thược tương,hrììe ehang, phù lưu, trầu lương.

Tên khoa học : Piper betle L.
Họ : Hồ tiêu ( Piperaceae ).
2.2.1. Mô tả [7, 16]
Cây Trầu không là cỏ đa niên, mọc leo nhờ rễ mấu ,thân cây nhẵn. Lá mọc
so le hình trái xoan, phía dưới hình tim, dài 10-13 cm rộng 4,5- 9 cm, đẩu lá
nhọn khi soi lên có lất nhiều điểm chứa tinh dầu rất nhỏ. Gân lá thường 5, lá
có bẹ cứng ở cuống dài 1,5- 3,5 cm. Hoa đơn tính, mọc thành bông, lá hoa
không dính vào trục.Hoa đực có 2 nhị. Hoa cái to đến 1 cm, đài 5 cm hay hơn,
có một bầu, một ô với hai đầu nhụy. Quả mọng không có vòi sót lại.

5


I

2.2.2. Phân bố địa ỉý[7, 16]
*

Trầu không được trổng khắp nơi trong nước ía với các địa hình và vùng đui
khác nhau. Ngoài ra câv còn có ở một số nước khác trong vùng như Malaixia,
Indonexia.
2.2.3. Thành phần hoá học
Theo nhiều tài liệu nghiên cứu cho thấy Trầu không có chứa tinh dầu trong
đó có hai thành phần là betel-phenol và chavicol[16], ngoài ra còn có một số
thành phần khác nhưTanin, Cumarin, Flavonoid[14].
2.2.4. Tác dụng dược lý và công dụng
Theo Dược liệu Việt Nam đo Bộ Y tế xây dựng năm 1978 thì Trầu không
vị cay, tính ấm, mùi thơm, có tác dụng trừ phong thấp, tiêu đờm, tiêu viêm, sát
trùng. Dùng lá và thân Trầu để chữa cảm mạo, phong thấp, nhức mỏi, đau
bụng lạnh đầy hơi, rửa vết thương, chữa bỏng, chữa sưng đau[4].

Tuệ Tĩnh trong sách Nam được thần hiệu cũng đã đề câp đến Trẩu không
như một vị thuốc có tác dụng chữa bỏng rất tốt [20].
Theo Đỗ Tất Lợi, Trầu không có tác dụng kháng khuẩn với các chủng
E.coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtỉiis. Dòng trẩu để rửa vết loét, trị
mẩn ngứa, viêm mạch bạch huyết, viêm kết mạc, chàm mặt [16].
Trong báo cáo tốt nghiệp dược sỹ đại học năm 1970, Nguyễn Đình Lân đã
nghiên cứu và kết luận Trầu không có tác dụng kháng khuẩn rất mạnh[14].
v ề lác dụng chữa bệnh răng miệng của cãy thuốc này viện Quân Y 103 đã
dùng Trầu không trong thành phần thuốc bôi cùng với bồ giác, xoan trà, cỏ
lào điều trị viêm quanh răng, đạt kết quả tốt với tỷ lệ khỏi bệnh là 84%[13].

6


2.1.3. M ột sô'bài thuốc có Lá lốt và Trầu không
*Chữa đau nhức xương khớp, đau lưng, đau răng
Lá lốt, rễ bưởi bung, rễ cây vòi voi, lễ cỏ xước, tất cả tháimỏng sao vàng,
mỗi vị 15 gam khô, sắc với 600 ml nước, cô còri 200 ml chia 3lần uống trong
ngày[16].
*Chữa đau lưng, sưng đầu gối, bàn chân tê buốt, đau răng
Dùng 8-12 gam đây rễ Lá lốt, phối hợp với dây đau xương, rễ cỏ xước, cỏ
cốt khí mỗi vị 8 gain sắc uống[7].
*ThuỐc Dentoxit chữa bệnh sâu răng, viêm lợi [20]
Cao cồn Lá lốt 10%.
Menthol tinh thể.
Tinh dầu hương nhu.
Cỉorophil.
*Hai dạng bàochế có tên Pipelo[15]
(.l)ống Pipelo ngậm:

(2)Vién nén Pipelo:

Cao mềm Lá lốt.

2 gam.

Đường kính.

2 gam.

Nước vừa đủ.

10 ml.

Cao mềm Lá lốt.

0,25 gam.

Tá dược vừa đủ 1 viên.
Dùng điều trị sâu răng và viêm cận răng, viêm lợi có biến chứng.
*Thuốc Đông Y chữa bệnh viêm quanh răng[13]
Trầu không.
Bồ giác.
Xoan trà.
Cỏ lào
Dùng 4 dược liệu trên điều chế thành cồn thuốc để bôi tại chỗ.

7

PHẦN III- THỤC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.1. Nguyên vật liệu và phưong pháp thực nghiệm
3.Â.I. Nguyên vật liệu
Trầu không (Piper betle L.), và Lá lốt (Piper lolot C.DC) dùng nguyên liệu
là lá và cành mang lá, được thu hái từ vùng ngoại thành Hà Nội.
Nguyên liệu tươi : là nguyên liệu sau khi thu hái được rưả sạch và để ráo
nước.
Nguyên liệu khô : là nguyên liệu tươi được thái nhỏ sau đó phơi hoặc sây
trong tủ sấy ở nhiệt độ 50 độ c đến khô.
3.1.2. Phương pháp nghiên cứu
1.Định tính thành phần hoá học của Lá lốt và Trầu không: Alcaloid,
Flavonoid, Anthraglycosid, Cumarin, Tanin, đường khử bằng các thuốc Ihử
đặc hiệu và sắc ký lớp mỏng với các hệ dung môi thích hợp.
2.Định lượng Tanin theo phương pháp oxy hoá với đung dịch chuẩn là
kalipermanganat, chỉ thị sulfo inđigo.
3.Tách Tanin trong dược liệu bằng phương pháp chiết nhiều lần với dung
môi nước sau đó kết tủa và tinh chế.
4.Thử tác đụng kháng khuẩn bằng phương pháp khuyếch tán trên đĩa thạch,
dùng khoanh giấy lọc tẩm dung dịch thử.

8


I

3.2. Kết quả thực nghiệm và nhận xét
3.2.1. Nghiên cứu thành phần hoá học của Lá lốt
*Định tính Alcaloid [1, 10]
(•)Phương pháp hoá học
Để định tính Alcaloiđ trong Lá lốt bằng phương pháp hoá học chúng tôi

tiến hành chiết xuất và thực hiện phản ứng với các thuốc thử chung của
Alcaloid:
Cho 5,0 gam Lá lốt khô vào bình nón 100 ml, làm ẩm bằng 5 ml dung dịch
amoniac đậm đặc, thêm 50 ml hỗn hợp Diethyl ether và Cloroform (1:1) lắc,
lọc.Cho thêm 10 ml dung địch acid sulfuric 10% vào dịch lọc trong bình gạn.
Lắc, gạn lấy dịch acid (đung dịch A) làm phản ứng :
- Lấy 1 ml đung dịch A cho vào ống nghiệm, thêm 1 giọt thuốc thử
Bouchardat, trong ống nghiệm xuất hiện tuả đỏ nâu.
-Lấy 1 ml dung dịch A cho vào ống nghiệm, thêm 1 giọt dung dịch acid
picric trong Ethanol, trong ống nghiệm xuất hiện tủa trắng.
- Lây 1 ml dung dịch A cho vào ống nghiệm, thêm 1 giọt thuốc thử
Dragendoff, trong ống nghiệm xuất hiện tủa màu vàng cam.
Các phản ứng trên đều dương tính cho thấy trong Lá lốt có thể có Alcaloicỉ.
(••)Phương pháp sắc ký lớp mỏng
Chứng tôi cũng tiến hành định tính Alcaloid trong Lá lốt bằng sắc ký lóp
mỏng theo quy trình:
Cân 20,0 gam Lá lốt khô cho vào bình nón có nút mài 500 ml, thêm 50 ml
Ethanol 90° đã kiềm hoá bằng amoniac (đến pH = 9), đậy nút để yên 18 giờ.
Gạn, lọc lấy địch chiết, lắc địch chiết với Cloroform. Tách lớp Cloroform, sau
đó lắc lại với dung dịch acid sulfuric 20%. Kiềm hoá lớp aciđ bằng dung dịch
amoniac đặc, lắc lớp này với Cloroform, dịch Cloroform đùng để chạy sắc ký
Với các hệ dung m ô i: (A)- cloroform: methanol (9 : 1).
(B )- cloroform: methanol (2 : 1).

9


Thuốc thử hiện màu : Dung dịch Dragendoff.
Kết quả: -Với hệ (A ) bản sắc ký cho 4 vết màu vàng khi phun thuốcthử.
-Với hệ (B ) bản sắc ký cho 5 vết màu vàng khi phun thuốc thử .

Như vậy, chúng tôi kết luận hệ (B) cho kết quả sắc ký tốt hơn và trong Lá lốt
có ít nhất 5 loại Aỉcaỉoid khác nhau . Dưới đây sắc ký đồ Alcaloiđ của Lá lốt
với các hệ dung môi (A ) và (B ).

Hình I-(3.2.1). Sắc ký đổ
Alcơloid Lá lốt.

Hệ(A)

Hệ(B)

Kết quả giá trị Rf của các vết sắc ký lớp mỏng Alcaloid Lá lốt với hệ đung
môi (B) được ghi trong bảng sau :

Giá trị Rf

Vết 1

Vết 2

Vết 3

Vết 4

Vết 5

0,29

0,46

0,57

0,73

0,85

Bảng I- (3.2.1 ). Giá trị RỊ của các vết sắc ký Alcaloid Lá lốt.

10


*Định tính Flavonoid [5, 10]
(•)Phương pháp hoá học
Quy trình định tính Flavonoid trong Lá lốt bằng phương pháp hoá học được
chúng tôi tiến hành như sau:
Dùng 20 gam Lá lốt khô cho vào bình nón 250 mỉ, thêm 100 ml Methanol .
Lắp Ống sinh hàn, đun hồi lưu cách thuỷ 1 giờ, lọc lấy dịch lọc. Cô gắn cạn
địch lọc lồi lắc vói Cloroform để loại tạp. Chiết Flavonoid trong Methanol
bằng Ethvlacetat, sau đó bốc hơi cách thuỷ Ethylacetat cho tới cắn . Ho à tan
cắn trong Methanol (dung dịch B ), dùng đung địch này làm các phản ứng hoá
học và sắc ký .
-

Tác dụng với đung dịch kiềm: Trong ống nghiệm sạch cho 1 ml dung

địch B, thêm 0,5 ml dung dịch natrihydroxyd 0,1 N, dung dịch trong ống
chuyển sang màu vàng rơm đậm đần .
-Phản ứng Cyanidin: Lấy 1 ml dung dịch B cho vào ống nghiệm, thêm
0,5ml acid hydroclorid đặc và một ít bột Magie kim loại, dung dịch trong ống
chuyển sang màu đỏ đo Flavonoid đã phản ứng với hydro mới sinh cho dẫn

chất Cyanin có màu đỏ.
-Tác dụng với dung dịch sắt(III)clorid: lấy 1 ml dung dịch B cho vào ống
nghiệm, thêm 2 giọt dung dịch sắt(III)clorid, ống nghiệm xuất hiện màu xanh
đen của phức chất tạo bởi sắt(III) và các hợp chất có nhóm OH phenol.
Bằng kết quả dương tính của các phản ứng trên chúng tôi nhận thây trong Lá
lốt có thể có Flavonoid.
(»•)ĐỊnh tính bằng sắc ký ỉớp mỏng.
Dịch Methanol trên được chúng tôi tiến hành sắc ký lớp mỏng để định tính
Flavonoid với 3 hệ dung môi: (C)-ethylaceíat:methanol:nưó'c(l00:17:13).
(D)-n-butanol: acid acetic: mrớc(4:l:5).
(E)-cIoroform: methanol(2:1).
Thuốc thử hiện màu: hơi amoniac.

11


Kết quả chạy sắc ký: -Với hệ (C) bản sắc ký cho vết màu vàng kéo dài.
-Với hệ (D) bản sắc ký cho 3 vết màu vàng khi hiện màu.
-Với hệ (E) bản sắc ký cho 5 vết màu vàng.
Bằng kết quả trên chúng tôi kết luận hệ dung môi (E) cho kết quả tách tốt nhất
và trong Lá lốt có ít nhất 5 loại Flavonoid khác nhau. Sau đây là hình mô tả
kết quả sắc ký lớp mỏng Flavonoid trong Lá lốt:

#

#

Hệ (C)

Hệ(D)

Hệ(E)

Hình / / (3.2.1)- Sắc kỷ lớ[? mỏng Flavonoid Lá lốt.
Giá trị Rf của quá trình sắc ký lớp mỏng Flavonoid trong Lá lốt với hệ dung
môi (E) trên được thể hiện trong bảng II dưới đây:

Giá trị Rf

Vết 1

Vết 2

Vết 3

Vết 4

Vết 5

0,38

0,58

0,75

0,85

0,89

Bảng //- (3.2.1) giá trị Rf của các vết sắc kỷ Flavonoid Lá ìốỉ.

12


Để định tính Anthraglycosid chúng tôi tiến hành chiết xuất như sau: Cho
10,0 gam Lá lốt khô vào bình nón 250 ml thêm 20 ml acid sulfuric 20%, lắp
ống sinh hàn hồi lưu và đun cách thuỷ trong 20 phứt. Để nguội, thêm 50 ml
Dietylether vào bình, lắc kỹ, ỉọc, tách lấy lớp ether trong bình gạn.
Dịch ether được sử dụng làm các phản ứng định tính :
(*)Định tính bằng phương pháp hoá học với phản ứng Bortraeger: trong ống
nghiệm lấy 1 ml dịch ether trên thêm 1 mi dung dịch natrihydroxid 10%, lớp
kiềm có màu đỏ.
(••)Phương pháp sắc ký lớp mỏng: dùng dịch ether trên để tiến hành sắc ký
lớp mỏng với hệ dung môi benzen: methanol (2:1), hiện màu bằng kali
hydroxid trong Ethanol. Kết quả bản sắc ký cho 2 vết có màu vàng và đỏ với
thuốc thử và có Rf lần lượt là 0,50 và 0,65.
Với 2 kết quả trên có thể kết luận: Trong Lá lốt có dẫn chất Anthraglycosid.
*Địiih tính âiíờng khử [6]
Chúng tôi tiến hành xác định đường khử trong Lá lốt bằng phản ứng khử
thuốc thử Fehling và thuốc thử Tolens: Lấy 20 gam dược liệu tươi cho vào
bình nón dung tích 100 mỉ, thêm 30 ml nước cất, đun sôi, lọc dịch chiết qua
bông và đem tiến hành phản ứng
-Cho vào ống nghiệm I ml dịch chiết, thêm 0,5 ml thuốc thử Fehling, đun
cách thu ỷ 10 phút, ống nghiệm xuất hiện tủa đỏ gạch.
-Cho vào ống nghiệm I ml dịch chiết trên, thêm 0,5 ml thuốc thử bạc nitrat
trong amoniac, đun cách tliuỷ trong 10 phút, xuất hiện tủa bạc kim loại trên
thành ống nghiệm.
Các phản ứng trên đã cho thấy trong Lá lốt có đường khử.
*Định tính Cumarin hằìiqphươHg pháp hoá học ¡5, 101
Để định tính Cumarin trong Lá lốt chúng tôi tiến hành chiết và thử phán

ứng theo quy trình sau: Cân 20,0 gam lá lốt tươi cho vào bình nón 100 ml,

13


thêm vào đó 50 nil Ethanol 90°, đun cách thuỷ sôi 30 phút. Để nguội, lọc lấy
dịch chiết.
-Phản ứng đóng 1Ĩ1Ở vòng lacton: lấy 2 ống nghiệm, cho vào mỗi ống 1 ml
dịch chiết trên, ống thứ nhất thêm 1 ml natri hydroxyd 10%. Đun cách thuỷ cả
2 ống trong 10 phút sau đó cho vào mỗi ống 3 ml nước cất: ống thứ nhất
trong, Ống thứ hai đục. Acid hoá ống thứ nhất bằng 1 ml acid hyđroclorid đậm
đặc thì ống này đục như ống thứ hai như vậy trong Lá lốt có thể có Cumarin vì
tính tan của hợp chất này thay đổi theo pH môi trường đã tạo hiện tượng trên.
-Phản ứng huỳnh quang: trên một tờ giấy lọc, nhỏ một giọt dịch chiết, hơ
khô rồi nhỏ chồng lên một giọt natri hydroxid 10%, sấy nhẹ. ơ ie một nửa vết
dịch chiết rồi đặt dưới ánh sáng tử ngoại, nửa vết không bị che có huỳnh
quang xanh.Khi không che nữa thì nửa vết còn lại cũng có huỳnh quang đậm
dần lên bằng nửa kia.
Từ hai thí nghiệm trên chúng tôi kết luận trong Lá lốt có hợp chất Cumarin.
*Định tính Tanin bằng phản ứtig hoá học [5]
Tanin là những hợp chất đa phenol, dễ tan trong nước và các dung môi
pliân cực, ít tan trong các dung môi không phân cực, do vậy chúng tôi đã chiết
xuất và định tính như sau:
Trong một bình nón đung tích 250 ml, cho 50,0 gam Lá lốt khô thái nhỏ,
thêm vào bình TOO ml nước cất. Đun sôi trong 1 giờ, lọc qua bông. Dịch lọc
được thử các phản ứng:
-Tạo phức với dung dịch sắt(IIĨ): Lấy Iml dịch lọc cho vào ống nghiệm,
thêm một giọt dung dịch sắt(III)clorid ] %, dung dịch trong ống có màu xanh
đen.
-Phản ứng kết tủa với Gelatin: Trong ống nghiệm, lấy 1 ml địch lọc, cho

thêm vào ống một giọt dung dịch Gelatin ị %, có tủa trắng xuất hiện.
-Tạo tủa với formol: và acid hydroclorid (phân biệt Tanin pyrogalic và
Tanin pyrocatechic): Cho 50 ml dịch lọc vào bình nón 100 ml cùng với 10 ml

14


formch và 5 ml acid hydroclorid đặc. Đun nóng bình trong 10 phút, không có
tủa xuất hiện.
Qua các kết quả trên, có thể kết luận trong Lá lốt có Tanin thuộc loại
Pyrogalic.
3.2.2. Định tính thành phần hoá học của trầu không
*Địiìh tính Alcaloìd[6,10/
(*)Định tính bằng phương pháp hoá học
Phương pháp xác định Alcaloid trong lá Trầu không bằng các phản ứng
hoá học là thực hiện chiết nóng bằng đung môi Ethanol đã được kiềm hoá sau
đó định tính bằng các thuốc thử đặc hiệu:
Trong bình nón 250 ml cho 50,0 gam lá Trầu khô, thêm 100 ml Ethanol
90°đã kiềm hoá bằng amoniac(đến pH=9), lắp ống sinh hàn hồi lưu, đun cách
thuỷ trong 1 giờ. Lọc nguội, dịch lọc được lắc với ether đầu hoả loại tạp sau
đó được lắc với Diethyỉether. Chiết Alcaloid trong dịch Diethylether bằng
dung địch acid sulfuric 20%. Dung địch acid này được sử dụng để định tính
AlcaIoid(dung địch A).
-Cho 1 ml dung dịch A vào ống nghiệm, thêm 1 giọl thuốc thử Mayer,
trong Ống nghiệm xuất hiện tủa trắng.
-Lấy 1 ml dung dịch A cho vào ống nghiệm, thêm 1 giọt thuốc thử
Dragendoff, xuất hiện tủa vàng cam.
-Trong ống nghiệm cho 1 ml dung địch A và 1 giọt thuốc thử Bouchardat,
có tủa nâu xuất hiện.
Căn cứ vào các kết quả thu được (rong các thí nhgiệm trên chúng tôi sơ bộ kết

luận trong lá Trầu có hợp chất Alcaloid.
(••)ĐỊnh tính bằng sắc ký lớp mỏng
Chúng tôi tiến hành sắc ký lớp mỏng Alcaloid trong lá Trầu bằng cách
kiềm hoá dung dịch acid (dung địch A) trên, lắc với ether và sắc ký dịch ether
này.

15


I

Sử dụng các hệ dung môi: (A)-cloroform: methanol(4: 1).
(B)-n-butanol: acid acetic: nước(5: 1: 4).
Thuốc thử hiện màu: đung dịch Dragendoff.
Kết quả: -Hệ(A) cho 2 vết màu vàng với thuốc thử có giá trị Rf lần lượt là 0,54
và 0,67.
-Hệ(B) không tách được vết.
Do đó có thể kết luận trong trầu có ít nhất 2 loại Alcaloid khác nhau và hệ
dung môi (A) cho kết quả tách vết tốt hơn. Dưới đây là sắc ký đồ Alcaloid
Trầu không với hệ dung môi(A).

Hìnhỉỉỉ(3.2.2) - sắc kỷ đồ AỉcơỉoidTrơu không.

16


*Định tính Flavonoid [5, 10]
Quá trình định tính Flavonoid trong Trầu không được tiến hành như sau:
cân 20,0 gam lá Trầu khô cho vào bình nón 250 ml, thêm 100 ml Methanol,
lắp Ống sinh hàn hồi lưu và đun cách thuỷ trong 1 giờ. Lọc lấy dịch chiết, cô

tới gần cạn. Lắc phần dịch còn lại với Clorofom để loại tạp, sau đó chiết
Flavonoid trong Methanol bằng Ethylacetat, cô cạn Ethylacetat tới cắn. Hoà
tan cắn vào Methanol(dung dịch B), dùng dịch này để định tính.
(•)Định tính bằng phương pháp hoá học:
-Tác dụng với dung dịch kiềm: lấy 1 ml dung địch B cho vào ống nghiệm,
thêm vào đó 0,5 ml đung địch natri hydroxyd 0,1 N, dung dịch chuyển màu
vàng rơm đậm đo Flavonoid đã tác dụng với dung địch kiềm.
-Phản ứng Cyanidin: cho vào ống nghiệm 1 ml dung dịch B và 0,5 ml dung
địch acid hydroclorid đậm đặc, thêm vào ống một ít Magie kim loại, dung
dịch trong ống chuyển sang màu vàng rồi màu hổng của dẫn chất Cyan in.
-Với thuốc thử sắt(III)clorid: í ml đung dịch B cho tác dụng với 1 giọt
thuốc thử sắt(HI)clorid, đung địch chuyển sane; màu xanh đen.
Như vậy có thể kết luận trong lá Trầu có Flavonoid.
(••)Định tính bằng sắc ký lớp mỏng: chúng tôi tiến hành sắc ký lớp mỏng
dung dịch B để phái hiện Flavonoid trong Trầu không.
Với các hệ đung môi: (C)-n-butanol: acid acetic: nước(5: 1: 4).
(D)-clorofom: acid acetic(9: 1).
(E)-clorofom: methanoỉ(9: 1).
Thuốc thử hiện màu: hơi amoniac.
Kết quả: - Hệ (C) cho 3 vết khi hiện màu.
- Hệ (D) cho vết màu vàng kéo dài.
-

Hệ (E) cho 5 vết màu từ vàng đến hổng với thuốc thử

Qua đó có thể thấy trong lá Trầu có ít nhất 5 loại Flavonoid khác nhau.


Hình dưới đãy mô tả kết quả sắc ký lớp mỏng Flavonoid trong lá Trầu với các
hệ dung môi (C) và (E).

'IIIf
jdffUSlhw

IP

dũi
^SÌF

Hệ(C))

Hệ(E)

Hình ỊV (3.2.2)- sắc ký lớp mỏng Flavonoid Trẩu không.
Giá trị Rf của các vết sắc ký Flavonoid Trầu không với hệ dung môi (E) được
ghi trong bảng sau:

Giá trị Rf

Vết 1

Vết 2

Vết 3

Vết 4

Vết 5

0,17

0,32

0,42

0,56

0,72

BẩnỉỊ III-ị3.2.2) Giá trị R f của các vết sắc kỷ Flavonoid Trâu không.
*Định tính Anthraglycosid[5, 10]
Trong bình nón 250 rnl cho 10,0 gam lá Trầu khô, 20 rnl acid suỉíuric 20%,
lắp ống sinh hàn, đun cách thuỷ trong 20 phút, để nguội thêm vào bình 50 ml
Diethylether. Lắc kỹ, lọc qua bông và gạn lấy dịch ether.


(•)Phương pháp hoá học với phản ứng Bortraeger: Cho I ml dịch ether trên
vào ống nghiệm, thêm 1 ml dung dịch natri hydroxyd 10%, lớp kiềm có màu
đỏ.
(••)Phương pháp sắc ký lóp mỏng: Dịch ether được đem sắc ký lớp mỏng
với hệ dung môi benzen: methanol (2: 1), hiện màu bằng dung dịch
kalihydroxyd trong Ethanol. Trên bản sắc ký có 1 vết cho màu đỏ có Rf = 4,2
với thuốc thử hiện màu.
Như vậy có dẫn chất Ani.hrag1ycos.id trong Trầu không.
*Định tỉnh dường khử bàng phươiuị pháp hoá học /ổ /
Tương tự như đối với Lá lốt chúng tôi dùng thuốc thủ' Fehling và thuốc thử
Tolens để định tính đường khử (rong Trầu không: Dùng 20,0 gam lá Trâu tươi
cho vào bình nón dung tích 100 ml, chiết bằng 50 ml nước cất sôi, để nguội,
lọc qua bông. Dịch lọc được đem thử các phản ứng:
-Trong ống nghiệm lấy 1 ml dịch lọc trên, thêm 0,5 ml thuốc thử Fehling,

đun cách thu ỷ 10 phút, xuất hiện tỏa đỏ gạch của đỒng(I)oxyd.
-Lấy I ml dịch lọc cho vào ống nghiệm, thêm 0,5 mỉ thuốc thử Tolens, đun
cách thu ỷ ống nghiệm trong 10 phút, có tủa bạc bám lên thành ống nghiệm.
Từ kết quả thu được chúng lôi có nhân xét có đường khử trong TrÀu không.
*Định tính Cumarin bằng các phản ứng hoá học /5 /
Cho 20.0 gam Trầu không tươi vào bình nón 100 ml Cling với 50 ml cồn
ethylic 90°, đun cách thu ỷ có ống sinh hàn trong 30 phút. Lọc dịch chiết qua
bông và tiến hành định tính:
-Phản ứng đóng mở vòng lacton: Dùng 2 ống nghiệm, mỗi ống lấy I ml
dịch chiết, cho thêm vào ống thứ nhất 1 ml natri hydroxyd 10%. Đun cách
thuỷ cả 2 ống trong 10 phút, sau đó thêm vào mỗi ống 3 ml nước cất: ống thứ
hai đục, ống thứ nhất trong. Acicl

hoá ống thứ nhất bằng I ml acid

hydroclorid đậm đặc thì ống này cũng đục như ống thứ hai, kết quá này có

19


được do tính tan khác nhau của Cumarin khi ở dạng ester nội(có vòng lacton)
»

và khi ở dạng muối(không có vòng lacton).
-Phản ứng huỳnh quang (dựa vào tính chất phát huỳnh quang đâm dần
trong môi trường kiềm của Cumarin): Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, hơ
nhẹ cho khô rồi nhỏ chồng iên đó 1 giọt natri hydroxyd 10%, để khô. Che nửa
vết địch chiết, đặt giấy ỉọc dưới ánh sáng tử ngoại: nửa vết không bi che có
huỳnh quang màu lục, khi kết thúc che thì nửa vết còn lại cũng có huỳnh
quang sáng dần lên.

Từ 2 phản ứng trên kết luận trong lá Trầu có Cumarin.
*Định tính Tanin bằnẹ phương pháp hơá học [5]
Cân 50 gam lá Trầu khô cho vào bình nón 250 ml, thêm 100 ml nước cất,
đun sôi trong 1 giờ. Lọc lấy địch chiết để định tính:
-Trong ống nghiệm có 1 ml dịch chiết trên cho 1 giọt dung dịch
sắt(IĨI)clo.rid 1%, dung dịch trong ống có màu xanh đen, sơ bộ kết luận có hợp
chất phenol trong lá Trầu.
-Lấy 1 ml địch chiết cho vào 1 ống nghiệm, thêm 1 giọt dung dịch Gelatin
[%, xuất hiện tủa vẩn màu trắng trong ống, kết hợp với kết quả của phản ứng
iĩẫiĩ có thể kết luận trong lá Trầu có Tanin vì hợp chất này có phản ứng tạo tủa
với các Protein.
-50 ml dịch chiết cho tác dụng với 10 ml formol, và 5 ml acid hydroclorid
đặc, đun nóng 10 phút không có tủa xuâ't hiện, như vậy Tanin trong lá Trầu là
Tanin pyrogalic vì Tanin pyrocatechic sẽ cho tủa trong phản ứng này.
Từ các phản ứng trên chúng tôi kết luân trong lá Trầu có Tanin và là Tanin
pyrogalic (Tanin thuỷ phân dược).

20


Sau đây là bảng tổng hợp kết quả định tính thành phần hoá học Lá lốt và
Trầu không bằng phương pháp hoá học.
Stt

1

Nhóm chất

Alcaloid

Phản ứng dịnh tính

Lá lốt

Trầu khổng

Kốl luân

-Thuốc thử Drae,enđoff

tủa vàng

tủa vàng

Có

-Thuốc thử Bouchardal

lủ a nâu

tủa nâu

Alcaloid

tủa trắng

-Thuốc thử Mayer
-Thuốc thử acid picric

2

Flavonoid

tủa trắns,

-Phản ứng với kiềm

vàng

vàng,

Cổ

-Phản ứng Cyanid in

đỏ

hồng

Flavonoid

xanh đen

xanh đen

đỏ

dỏ

-Phản Ú'!1 R với sắl(ÌII)cIorid

Anlhra3

4

5

6

-Phản ứng Borlraeger

Có
Anlhiaalycosyil

-glycosyđ
-Đóne, mở vồng lacton

++

++

Có

Cumarin

-Phản ứng huỳnh quang

+++

+++

Cumarin

Đơờng

-Thuốc thử Fehling

tủa đỏ

lủa dỏ

Có

kỉủr

-Thuốc thửTơlens

tủa trắng

tủa trắng

clưìín*: khử

-Tác clụtiR với sắt(III)clorid

xanh đen

xanh den

Có

-Tác dụng với dung dịch Gelatin 1%

tủa trắng

tủa trắng

Tan ¡11

-Tác dụng với formol- và HCI đặc

không tủa

khổng tủa

pyroaalie

Tanin

Ghi chú: (+)- Phản ứng dương tính.
Bảng IV- Đinh tính thàỉih phấn ìioá học Lá lốt và Trẩu khô/iạ.
o Nhận xét về thành phấn hoá học của Lá lốt và Trầu không:
Qua kết quả định tính thực hiện trong phần 3.2.1 và 3.2.2 chúng tồi nhận
thấy (xong Lá lốt và Trầu không đểu có: Alcaloicl, Flavonoid, Anthraglycosicl,
Cumarin, đường khử và Tanin pyrogalic. Điều này có thể do 2 cây này rất gần
gũi về mặt phân loại nên thành phần hoá học có những điểm tương đổng. Mặt
khác cả 2 cây này đều được sử dụng trong (hực tế để chữa bệnh răng miệng
nên có thể là một vài thành phần chung của chúng có tác dụng sinh học, vì

21

vậy chúng tôi đã nghiên cứu sâu hơn về thành phần Tanin trong Lá lốt và Trẩu
không- thành phần mà theo tài liệu[5] thì có tác dụng kháng khuẩn mạnh.
3.2.3. Định lượng và nghiền cứu tách Tanin của Lá lốt và Trầu không
*Định lượng và tách Tanin trong Lá lốt
(*)Kết quả định tính ở phần trên cho thấy trong Lá lốt có Tanin vì vậy
chúng tồi đã tiến bành định lượng Tanin của Lá lốt và đùng phương pháp của
Dược điển Việt Nam I [2],
Nguyên tắc: trong môi tnrờng aciđ, Tanin bị oxy hoá bởi kalipermanganat,
nhận biết điểm tương đương bằng chỉ thị Siìỉíb indigo.
Tiến hành: cân chính xác 2,000 g am Lá lốt khô đã thái nhỏ cho vào bình
nón 100 ml. Chiết Tanin bằng nước đun sôi 3 lần, mỗi lần 20 ml khi dịch chiết
không còn phản ứng vói thuốc thử sắt(III)clorid. Gộp các dịch chiết, thêm
nước vừa đủ 250,00 rnl. Lấy chính xác 25,00 ml dịch trên, cho vào bình n ón
1000 ml, thêm 750 ml nước và 25 ml đung dịch sulfo indigo, định lượng bằng
đung dịch kalipennanganat 0 ,IN cho tới khi có màu vàng.
Song song làm mẫu trắng.
1

ml dung địch kalipennanganat 0 ,IN tương ứng với 0,004157 gam Tanin.

Kết quả: tỷ lệ tanin trong Lá lốt khô là 0,85%.
(**)Dựa vào kết quả trên chúng tôi đã tiến hành chiết tách Tanin trong Lá
lốt: lây 100 gam Lá lốt khô cho vào bình nón 500 ml, cho vào bình 100 ml
nước cất, đun sôi trong 30 phút, gạn lọc lấy dịch chiết, tiếp tục chiết như trên
3 lẩn. Gộp các dịch chiết, cô tới khi còn 50 ml, kết tủa Tanin bằng amoni
sulfat. Lọc tủn qua phễu lọc Bucliner rồi sấy đến khô. Lấv tủa ra và hoà tan lại
trong Aceton, lọc, bốc hơi Aceton đến cắn. Kết tinh lại trong méthane! vài !ần
được tủa màu vàng nâu, thử định tính lại tủa bằng các phản ứng hoá học đối
với Tanin đã cho kết quả dương tính. Kết quả tách được Tanin với tỷ lệ 0,63 %

so với lá khô, hiệu suất chiết đạt 74%.

22


*Tiêh ỉiànli định ìượng và tách Tanin trong Trẩu kliônẹ
(•)Định lượng Tanin: Kết quả định tính ở phẩn 3.2.2 đã chứng minh trong
lá Trầu có Tanin, do đó chúng tôi tiến hành định lượng Tanin trong lá Trầu và
cũng sử dụng phương pháp oxy hoá như đối với Lá lốt (phương pháp trong
Dược điển Việt Nam I): Cân 2,000 gam lá trầu khô cho vào bình nón 100 ml,
chiết Tanin bằng nước sôi 5 lần, mỗi lần dừng 20 ml cho tới khi dịch chiết
không còn phản ứng với thuốc thử sắt(ĨII)clond. Gộp các dịch chiết vào bình
định mức 250 ml, thêm nước tới vạch. Lấy chính xác 25 mỉ đung dịch trong
bình định mức, cho vào bình nón lOOOml, thêm 750 ml nước cất định lượng
bằng kalipermanganat 0,1 N, chỉ thị màu là sulfo Índigo cho tới khi có màu
vàng.
Song song làm một mẫu trắng.
lml dung dịch kalipermariganat. tương ứng với 0,004157 gam Tanin.
Kết quả: hàin lượng Tallin trong Trầu không khô là 0,96%.
(••)Tiến hành nghiên cứu tách Tani.n trong Trầu không: dùng 100

Ram

lá

trẩu khô, chiết Tanin bằng nước cất đun sôi 3 lần, mỗi lần 100 ml, gộp các
dịch chiết và cô cho tới khi còn 1/5. Tủa Tanin bằng amoni sulfat, sấy khô tủa,
hoà tan lại trong Aceton, lọc. Kết tinh lại tủa nhiều lần bằng Methanol, sấy
khô được Tanin kết tinh màu nâu với tỷ ]ệ so với lá khô là 0,72%, hiệu suất
chiết đạt. 75%.

o

Nhận xét: qua định lượng và nghiên cứu tách chiết chima tôi thấy: lỷ lệ

Tanin trong Lá lốt và Trẩu không tương đối cao và có thể tách được bằng
phương pháp chiết với dung môi nước, trong đó tỷ lệ Tanin trong Trẩu không
cao hơn trong Lá lốt. Do đó theo chúng tôi Tan in có thể là thành phẩn mang
lại tác dụng sinh học cho Lá ỉốt và Trầu không vì các dạng bào chế như "ƯỞO
sắc và cao đều có tác dụng.

23


3.2.4. Thăm dò khả năng kháng khuẩn của các dược liệu
Dựa vào thông tin trong các lài liệu tham kháo đã đề cập tới khả năng
kháng khuẩn của Lá lốt và Trầu không, chúng tôi khảo sát với các chế phẩm:
í . Tinh đầu trầu không.
2. Cao lỏng 1:1 (tính theo lá khô) Trầu không.
3. Dịch ép lá Trầu không.
4. Cao lỏng Lá lốt 1:1 (tính theo lá khô).
5. Dịch ép Lá lốt.
Tác dụng kháng khuẩn được thử trên các chủng vi khuẩn kiểm định:
Các chủng Gram (+): -Staphylococcus aureus ATCC 1228.
-Sarcina 111tea ATCC 9341.
-Bacillus cereus ATCC 9946.
-Bacillus subtilis ATCC 6633
-Bacillus purmilis ATCC 10241.
Các chủng Gram (-): -Shigella flexneri DT I 12.
-Salmonella typhi DT 220.
-Escherichia coli DT 118 B14.

-Pseudomonas aeruginosa VM 201.
-Proteus mirapilis BV 108.
Các chủng vi khuẩn này gồm 5 chỉing Gram( h) và 5 chủng Gram(-) do Bộ
môn Công nghiệp Dược và Tổ môn Vi nấm kháng sinh Trường Đại học Dược
Hà Nội cung cấp.
*Chuẩn bị nguyên liệu /hử
Tinh dầu: Cất tinh dầu trong lá Trầu không bằne, phương pháp cất kéo hơi
nước, dùng 250 garn lá, cất trong 3 giờ, được I ml tinh dầu màu vàng rơm, có
tỷ trọng lớn hơn nước.

24