Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và hàm lượng men giống cho quá trình len men vang táo mèo

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA : SINH – KTNN
*****

HOÀNG THỊ THUÝ

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA
MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG VÀ HÀM LƯỢNG
MEN GIỐNG CHO QUÁ TRÌNH LÊN MEN
VANG TÁO MÈO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Người hướng dẫn khoa học
TS. ĐINH THỊ KIM NHUNG

HÀ NỘI 5- 2007


LỜI CẢM ƠN
Với tấm lòng biết ơn sâu sắc em xin chân thành c¶m ơn cô giáo: TS. Đinh
Thị Kim Nhung, thầy giáo: Th.S Nguyễn Khắc Thanh đã tận tình hướng dẫn
em trong quá trình thực hiện đề tài.
Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy cô trong khoa Sinh
- KTNN đã tạo điều kiện cho em học tập và nghiên cứu trong thời gian qua.
Xin chân thành c¶m ơn các bạn sinh viên đã giúp đỡ tôi để khoá luận hoàn
thành một cách tốt đẹp.

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2007

Sinh viên
Hoàng Thị Thuý

MỤC LỤC


Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………………….……….5
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………………………7
1.1.Khái quát chung về rượu vang ……………………………………………...7
1.2 .Một số đặc tính sinh học của tế bào nấm men Saccharomyces serevisiae....8
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU….... 18
2.1.Nguyên liệu, thiết bị và hoá chất…………………………………………18
2.2.Phương pháp nghiên cứu …………….……………………………………19
2.3.Phạm vi nghiên cứu ………………………………………………………23
2.4. Địa điểm thực hiện đề tài ……………………………………………….…23
2.5.Thời gian thực hiện đề tài …………………………………………………23
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN………………24
3.1.Phân lập, tuyển chọn, xác định tên khoa học của chủng nấm men lên men
vang táo mèo …………………………………………………………………..24
3.2.Ảnh hưởng của một số nhân tố trong quá trình nhân giống………………..33
3.3.Nghiên cứu động thái lên men vang táo mèo ……………………………...38
3.4.Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men ……………..42
3.5.Ứng dụng lên men vang táo mèo với quy mô phòng thí nghiệm ………....44
3.6.Quy trình công nghệ lên men vang táo mèo …………………………….…45
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ…………………………………………………...47
TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………………48

Danh mục chữ viết tắt, bảng, đồ thị, biểu đồ , hình vẽ

1. Danh mục các chữ viết tắt
Nxb: Nhà xuất bản
SLTB: Số lượng tế bào
HL: Hàm lượng

2. Danh mục các bảng
Bảng 1.1. Thành phần hoá học của các loại quả
Bảng 3.1.2.1.a Khả năng sinh trưởng và phát triển của 4 chủng nấm men
Bảng 3.1.2.1.b Khả năng lên men ở hàm lượng đường cao
Bảng 3.1.2.1.c Thử hoạt lực lên men của bốn chủng nấm men
Bảng3.1.2.1.d Khả năng kết lắng của bốn chủng nấm men
Bảng 3.1.2.1.e Khả năng tạo hương thơm và độ trong sản phẩm của
4 chủng nấm men
Bảng 3.1.2.1.g Tổng hợp kết quả tuyển chọn chủng nấm men
Bảng 3.1.3.2.a. Khả năng lên men các loại đường của chủng TM4
Bảng 3.2.1 . Ảnh hưởng của hàm lượng K2S2O5 trong quá trình nhân giống
Bảng 3.2.2. Ảnh hưởng của hàm lượng cao men bổ sung trong quá trình nhân
giống
Bảng 3.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình nhân giống
Bảng 3.2.5.Ảnh hưởng của hàm lượng oxy hoà tan trong
quá trình nhân giống
Bảng 3.3.1. Động thái lên men vang trong ngày thứ nhất
Bảng 3.4.2. Ảnh hưởng của độ pH đến quá trình lên men vang táo mèo
Bảng 3.4.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ men giống tới quá trình lên
men vang táo mèo
Bảng 3.5 Kết quả phân tích rượu thành phẩm
3. Danh mục đồ thị, biểu đồ
Biểu đồ 3.1. Tốc độ sinh sản trung bình của bốn chủng nấm men

Biểu đồ 3.2.4. Số lượng tế bào trung bình sau 28 giờ nuôi cấy ở các giá trị
pH khác nhau
Đồ thị 3.3.1. Tốc độ phát triển của S.cerevisiae TM4 trong ngày
Đồ thị 3.3.2. Động thái của quá trình lên men vang táo mèo

4. Danh mục các hình ảnh
Hình 3.1. Khuẩn lạc chủng TM4
Hình 3.2. Chủng nấm men
Hình 3.3. Ảnh chụp gel sau điện di soi trên tia uv

ĐẶT VẤN ĐỀ
1. Lý do chọn đề tài


Vang là loại đồ uống có độ cồn nhẹ lên men trực tiếp từ dịch trái cây mà
không phải trải qua quá trình chưng cất. Rượu vang có hàm lượng cồn thấp,
nhiều vitamin và các chất khoáng có mùi thơm dễ chịu, có hương vị đặc trưng
của từng loại quả. Rượu vang kích thích tiêu hoá, tuần hoàn, thần kinh.
Người ta đã biết làm rượu vang từ 3000 năm trước công nguyên. Hàng năm
trên thế giới sản xuất khoảng 18 tỷ lít rượu vang trong đó có 1/3 của Pháp và
Angeri.
Ở Việt Nam ngành sản xuất vang mới thực sự bắt đầu từ những năm 80 của
thế kỉ 20 với sự xuất hiện vang mang nhãn hiệu (Thăng Long, Thanh Ba, Gia
Lâm…). Nguồn nguyên liệu để sản xuất vang tại Việt Nam chủ yếu là từ các
loại quả: nho, dâu, táo, lê, dứa, vải…[7].
Thực tế cho thấy phần lớn các loại quả có chứa đường, axit, vitamin,
khoáng…và không có độc hại thì đều có thể sử dụng để lên men vang, nhưng để
có vang tốt thì không phải loại quả nào cũng làm được. Do đó việc lựa chọn
nguyên liệu phù hợp với yêu cầu của công nghệ và chất lượng của sản phẩm cho

đến nay vẫn là vấn đề cấp thiết đối với ngành sản xuất vang ở nước ta. Mặt khác
cũng rất cần phải có quy trình công nghệ hoàn thiện để có thể sản xuất loại vang
thực sự có chất lượng cao, từng bước hội nhập vào thị trường khu vực và quốc tế.
Nguyên liệu mà chúng tôi lựa chọn và nghiên cứu cho lên men rượu vang là
quả táo mèo (Docynia indica). Đây là loại quả có hương vị thơm rất đặc trưng
được trồng nhiều ở các tỉnh miền núi phía bắc nước ta với tổng diện tích 40.000
ha. Nơi có diện tích trồng cây táo mèo nhiều là các tỉnh Yên Bái, Lạng Sơn, Lai
Châu, Sơn La. Tổng diện tích trồng cây táo mèo vẫn tiếp tục tăng trong những
năm gần đây [6].
Nhu cầu tiêu dùng đối với quả táo mèo chủ yếu là ăn trực tiếp, ngâm rượu,
ngâm dịch siro nhưng cũng chỉ chiếm khoảng 35-40% tổng sản lượng quả thu
hoạch, số còn lại thường chưa được sử dụng hết do nhiều nguyên nhân. Trong


khi đó ngành sản xuất vang của nước ta đang phát triển với tốc độ nhanh và
đang thiếu nguyên liệu có chất lượng phù hợp để sản xuất rượu vang có chất
lượng cao giá thành hạ. Chính vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Nghiên
cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và hàm lượng men giống cho quá
trình lên men vang táo mèo”.
2. Mục tiêu của ®Ò tµi
1. Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men phù hợp cho lên men vang táo
mèo, tiến hành định loại chủng nấm men này bằng phương pháp phân tử.
2. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng nấm men đã tuyển chọn.
3. Lên men vang táo mèo với quy mô phòng thí nghiệm, xây dựng quy
trình lên men vang táo mèo.
3. Đối tượng nghiên cứu
- Quả táo mèo (Docynia indica).
- Chủng nấm men có khả năng lên men vang táo mèo.
4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của ®Ò tµi
- Nghiên cứu đặc tính, sinh lý, sinh hoá của chủng nấm men có khả năng lên

men vang táo mèo. Kết quả nghiên cứu này là dữ liệu góp phần bổ sung
cho các nghiên cứu về nấm men và ứng dụng của nấm men trong đời sống.
- Tận dụng nguồn nguyên liệu sẵn có của địa phương nhằm sản xuất một
loại vang phù hợp thị hiếu của người tiêu dùng, góp phần làm phong phú
thị trường vang trong nước và nâng cao thu nhập cho đồng bào dân tộc
vùng cao.

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ RƯỢU VANG


1.1.1. Thành phần của rượu vang
Thành phần chủ yếu của rượu vang bao gồm:
1. Cồn(etanol): do lên men tự nhiên từ dịch trái cây vì vậy không lẫn aldehit,
este. Độ cồn của rượu vang từ 10-12o, nên nhiều người uống được.
2. Chất bổ dưỡng: đường là nguyên liệu để tạo nên các loại rượu trong quá
trình lên men vang. Trong dịch quả chín chủ yếu là các loại đường khử:
fructoza, glucoza, và một ít galactoza ngoài ra còn có cả đường kép:
sacaroza…đường trong vang từ 62-132g/l.
3. Axit vô cơ và axit hữu cơ: axit malic, axit tartaric, axit citric, axit
oxalic...Hàm lượng axit tổng số từ 4-7g/l ( quy ra axit tartaric).
4. Rượu vang giàu vitamin: vitamin có trong nước quả không bị quá trình
lên men phân huỷ mà nó chỉ điều chỉnh lại thành phần [ 3].
5. Các axit amin: các axit amin có vai trò quan trọng đối với sự sinh sản và
phát triển của nấm men. Ngoài lượng axit amin có sẵn trong dịch quả, quá
trình lên men vang cũng tạo thêm được một số axit amin đã làm cho vang
thành phẩm có hương, vị rất đặc trưng. Các axit amin như: Lizin, treonin,
valin, acginin… [ 10].
1.1.2. Phân loại vang

Có nhiều cách phân loại khác nhau, có thể căn cứ vào màu sắc của sản phẩm
mà phân thành các loại: vang đỏ, vang hồng, vang trắng, và tương ứng với các
loại vang này đều có các chỉ tiêu giới hạn về màu sắc nhất định. Chẳng hạn vang
đỏ là loại vang có màu đỏ, đỏ lựu, đỏ thắm, vang trắng là vang có màu vàng rơm
đến vàng ánh, vang hồng có màu hồng đến đỏ tươi.
Căn cứ vào độ rượu, hàm lượng đường, hàm lượng axit…có trong vang mà
phân thành các loại vang: vang khô, vang dịu, vang ngọt…

Xu hướng chung thì vang được phân thành 2 nhóm chính là vang không có
gas (trong vang thành phẩm không có CO2) và vang có gas (trong vang thành
phẩm có CO2) [ 9], [ 5].
1.1.3. Nguyên liệu sản xuất rượu vang


Nguyên liệu để sản xuất là dịch trái cây từ các loại quả: mơ, táo mèo, vải,
dứa, lê, nho…( bảng 1.1).
Bảng 1.1. Thành phần hoá học của các loại quả [6]
Tên quả

Thành phần hoá học
Nước

Đường

Axit tổng số

Pectin

Tanin

Nho ngọt

73,1

9,88

0,56

0,092

0,07

Vải

84,28

16,1

5,16

0,249

0,83

Dứa

54,3

3,9

0,6

_

_

Mơ

73,8

9,0

1,1

_

_

Táo mèo

84,0

4,8

1,45

_

_

1.2. MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA TẾ BÀO NẤM MEN Saccharomyces
cerevisiae
1.2.1. Sơ lược về nấm men
Nấm men (yeast) là tên chung để chỉ nhóm nấm có cấu tạo tế bào, sinh sản
chủ yếu bằng phương pháp nảy chồi. Chúng phân bố rộng rãi trong thiên nhiên
như trong đất, trong nước, không khí và đặc biệt là có mặt nhiều trên bề mặt
nhiều loại quả.
Nấm men có khả năng sinh sản nhanh chóng. Sinh khối của chúng rất giàu
protein, vitamin và lipit. Nấm men có khả năng lên men các loại đường để tạo
thành rượu trong điều kiện yếm khí, còn trong điều kiện hiếu khí thì chúng lại có
khả năng tạo sinh khối tế bào. Vì thế nấm men được ứng dụng rộng rãi trong
công nghiệp thực phẩm để sản xuất rượu, bia, nước giải khát lên men, sản xuất
men bánh mì, sản xuất protein sinh khối… Tuy nhiên một số nấm men dại có
hại cho sản xuất, làm nhiễm các quy trình công nghệ và gây hư hỏng sản phẩm.

1.2.2. Hình thái và cấu trúc của tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae
Hình thái Saccharomyces cerevisiae có dạng hình ovan hoặc hình trứng.
Hình dạng này có thể thay đổi tuỳ thuộc vào điều kiện môi trường, điều
kiện nuôi cấy và tuổi của tế bào


-

Kích thước của tế bào nấm men: khoảng 2-8m x 4-10m và cũng có thể

-

thay đổi tuỳ loài, giống và điều kiện môi trường sống.
Nấm men có màu trắng đục, vàng hoặc hồng nhạt, bề mặt tế bào thường
khô và căng, có thể đứng riêng lẻ hoặc dính nhau thành chuỗi.

1.2.3. Cấu tạo của tế bào nấm men
Mặc dù có cấu tạo đơn bào nhưng nấm men cũng mang đầy đủ tính chất của
một cơ thể sống. Chúng có cấu tạo gồm màng, chất nguyên sinh và nhân.
1.2.3.1. Màng
Có cấu tạo 2 lớp với tỷ lệ glucan và mannan tương đương nhau. Màng tế bào
có cấu tạo chủ yếu là hemixenluloza, chiếm khoảng 70% trọng lượng khô của tế
bào ( 31% mannan + 29% glucan), 6-7% protein và thường protein của nó liên
kết vững chắc với các hidratcacbon, tạo thành một phức chất giàu lưu huỳnh, tồn
tại dưới dạng disunfit ( -S-S- ) hoặc sulfidrin (-SH- ). Ngoài ra màng tế bào còn
chứa lipit, đường khử, nitơ, các axit amin và các chất khoáng. Trên thành tế bào
nấm men có các lỗ nhỏ, qua các lỗ này chất dinh dưỡng được đưa vào trong tế
bào và các sản phẩm trao đổi chất được thải ra ngoài môi trường xung quanh.
Nhiệm vụ của màng tế bào: bảo vệ hình thái tế bào, duy trì áp suất thẩm thấu
bên trong tế bào và điều hoà các quá trình trao đổi chất. Các chất dinh dưỡng
được hấp thụ, chọn lọc qua thành tế bào.
1.2.3.2. Nguyên sinh chất
Màng nguyên sinh chất: nằm ngay dưới lớp thành tế bào, chức năng chủ
yếu của nó là chủ động điều hoà việc hấp thụ chất dinh dưỡng vào tế
bào, và nhờ có hệ enzim pecmeaza mà chất dinh dưỡng được hấp thụ và
tích luỹ lại trong tế bào.
Chất nguyên sinh của tế bào nấm men.
+ Riboxom: bao gồm 2 loại là riboxom 80S ( tồn tại trong tế bào chất) và
riboxom 70S ( có trong ty thể).
+ Ty thể có hình bầu dục dài, kích thước 0,2-0,5nm x 0,4-1,0nm kích thước
và hình dáng có thể thay đổi tuỳ thuộc vào điều kiện môi trường nuôi cấy và
trạng thái sinh lý của tế bào. DNA của nấm men là một phân tử dạng vòng có
khối lượng phân tử là 50x106 Da ( gấp 5 lần so với DNA ty thể động vật bậc

cao) DNA nấm men chiếm 15-23% tổng lượng DNA của toàn tế bào nấm
men.
+ Phức hệ gôngi: nơi giải phóng các sản phẩm của quá trình dị hoá, đồng thời
tổng hợp oligosacarit từ monosacarit cho màng tế bào.
+ Lizoxom: chứa nhiều loại enzim có khả năng phân giải protein, lipit,
polysacarit.
+ Các tế bào nấm men khi già sẽ xuất hiện không bào. Trong không bào có
chứa các enzim thuỷ phân, polyphotphat, lipit, ion kim loại, các sản phẩm
trao đổi chất trung gian. Ngoài tác dụng một kho dự trữ, không bào còn có
chức năng điều hoà áp suất thẩm thấu của tế bào.
1.2.3.3. Nhân
Tế bào nấm men có nhân thật hình tròn hoặc hình ovan, được bao bọc bởi lớp
màng nhân. Nhân có kích thước khá lớn khoảng 1-2,4m x 2-8m cấu tạo bởi
protein, DNA, RNA và nhiều enzim. Nhân quyết định đặc tính di truyền và tham
gia điều khiển tất cả mọi hoạt động sống của tế bào nấm men.
1.2.4. Sinh sản của tế bào nấm men
Nấm men sinh sản dưới hai hình thức: vô tính và hữu tính.
Sinh sản vô tính bao gồm:
+ Sinh sản bằng hình thức nẩy chồi.
+ Sinh sản bằng hình thức phân chia.
Trong đó sinh sản bằng hình thức nẩy chồi là hình thức phổ biến nhất. Khi
tế bào phát triển đến một mức nhất định thì cơ thể của nó đâm ra một chồi nhỏ
gọi là mầm (hay chồi). Mầm sinh ra ở vị trí lệch tâm ở trên đầu tế bào mẹ. Cùng
một lúc tế bào có thể đâm ra nhiều chồi, ở mỗi chồi sẽ nhận được một phần chất
nhân và chất nguyên sinh của tế bào mẹ, sau đó nó tách ra khỏi tế bào mẹ sống
độc lập hoặc không tách khỏi mà tạo thành những chồi nhỏ liên kết với nhau tạo
thành chuỗi gọi là khuẩn ty giả.
Sinh sản hữu tính bằng bào tử túi.
Bào tử túi của nấm men là những bào tử được sinh ra trong những túi nhỏ gọi
là túi hay nang. Mỗi túi chứa từ 4-8 bào tử túi. Nấm men được tạo thành theo

phương thức sinh sản đơn tính, là quá trình tạo thành bào tử trực tiếp từ một


tế bào riêng rẽ, không qua tiếp hợp. Bào tử túi sau khi ra khỏi túi, gặp điều
kiện thích hợp sẽ phát triển thành một tế bào nấm men. Sự hình thành bào tử
túi có 2 ý nghĩa : vừa sinh sản vừa tạo dạng bền vững vì bào tử túi có vỏ dày,
chịu được điều kiện không thuận lợi của môi trường, chịu được nhiệt độ cao
và khô hạn.
1.2.5. Những biến động sinh lý, sinh hoá, vi sinh khi lên men rượu vang,
khả năng lên men đường của Saccharomyces cerevisiae
Quá trình sản xuất rượu vang bắt đầu là phát triển của nấm men để
tăng sinh khối, lúc này môi trường dịch quả cần nhiều oxi để kích thích sự sinh
trưởng của nấm men. Sau đó tạo điều kiện yếm khí để tiến hành lên men tạo
thành rượu etylic, CO2 và nhiều sản phẩm phụ khác như axit lactic, axit axetic,
glixerin…
C6H12O6

2 C2H5OH +2CO2 + Q

*Quá trình lên men rượu xảy ra theo 5 giai đoạn.
Giai đoạn 1. Hoạt hoá phân tử hexoz gồm 3 phản ứng.
Dưới tác dụng của enzim photphoglucokinase, phân tử glucoza kém hoạt
động nhận một gốc photphat từ ATP tạo thành glucozo 6P là dạng hoạt
động.
Phân tử glucozo 6P dưới tác dụng của enzim izomerase chuyển thành
dạng đơn phân của nó là fructozo 6P có cấu tạo kém bền vững hơn.
Từ fructozo 6P, bắng cách photphoril hoá nhờ tác dụng của enzim
photphofructokinase chuyển thành fructozo1,6điphotphat. Phân tử này
rất dễ bị cắt mạch cacbon.

Giai đoạn 2. Cắt mạch cacbon.
Alđolase là enzim xúc tác sự phân li fructozo 1,6 điphophat thành 2 phân
tử trioz photphat (đihiđroxi axeton photphat và glyxeralđehit 3- photphat). 2
trioz photphat này có thể chuyển hoá lẫn nhau nhờ một enzim đồng phân


(trioz-photphat-izomerase). Cân bằng phản ứng lệch về phía tạo thành
glyxeralđehit 3- photphat. Bởi vậy, từ một phân tử fructozo 1,6- điphotphat sẽ
tạo thành 2 phân tử glyxeralđehit 3- photphat.
Giai đoạn 3. oxi hoá
Enzim glyxeralđehit 3 photphat- đehiđrogenase được tách ra rừ nấm men
sẽ xúc tác cho sự oxi hoá glyxeralđehit 3 photphat thành axit tương ứng
là axit 1,3- điphotphoglyxeric. Axit này chuyển gốc phophat cao năng
cho ADP để tạo thành ATP và tạo axit 3- photphoglyxeric. Phản ứng này
rất có ý nghĩa vì năng lượng được giải phóng ra trong quá trình oxi hoá
sẽ được tích luỹ trong phân tử ATP, đảm bảo cung cấp năng lượng cho
mọi hoạt động sống của tế bào trong điều kiện yếm khí.
Giai đoạn 4. sự tạo thành axit pyruvic
Photphoglixeratmutase
Axit 3 - photphoglyxeric
axit 2 photphoglyxeric
Enolase
ADP ATP
H2O
Dạng xeton

Dạng enol
Axit photphoenolpyruvic
Axit pyruvic Pyruvat kinase
Giai đoạn 5. Sự chuyển hoá tiếp tục axit pyruvic thành các sản phẩm cuối cùng.

Sự tạo thành axit lactic
Lactatdehidrogenase
Axit pyruvic
Axit lactic
Lên men rượu: gồm 2 bước
+ Nhờ enzim pyruvat decacboxylase, axit pyruvic bị khử nhóm cacboxyl
thành CO2 và axetaldehit.
+ Axetaldehit bị khử thành etanol nhờ enzim alcol đehirogenase.
- Sự tạo thành α - glixerophotphat và glixerin.
Đihidroxiaxeton P α - glixero P đehidrogenase L -α - glixero P
H2O


NADH+H+ NAD+

Photphatase

Pv
Glixerin
1.2.6 Vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men vang, bệnh vang
1.2.6.1. Nấm men
Nấm men được sử dụng rộng rãi nhất trong sản xuất là chủng nấm men
Saccharomyces cerevisiae. Theo quan điểm kinh tế người ta chia thành các
chủng. [ 6], [ 4], [ 1].
 Chủng lên men với hiệu suất cồn cao, ở thời gian tối ưu sản xuất tới 20.5
% thể tích cồn.
 Chủng lên men với thời gian ngắn, sản sinh 8-12% thể tích cồn, thậm chí
ở nhiệt độ thấp 4-10oC không bị kìm hãm.
 Chủng chịu được độ cồn cao, lên men được trong rượu vang gồm 30%
đường, hàm lượng cồn 12-15% thể tích.

1.2.6.2. Nấm mốc
Nấm mốc phát triển ở quả, chất bã của quá trình sản xuất rượu vang, thùng
chứa thiết bị hoặc do bụi, không khí đưa đến. Đại diện:chi Rhizopus,
Aspergillus.
1.2.6.3. Vi sinh vật làm hỏng vang
Có không ít vi sinh vật làm cho vang bị đục, có vị chua gắt, mùi khó chịu, làm
cho vang bị hỏng như: Bacterium gracile, Acetobacter xylinum, Acetobacter
axeti. [ 4].
Các vi khuẩn kị khí: các vi khuẩn lactic như: L.brevia, L.pastoerianus, L.
buchneri…đã làm cho vang bị vẩn đục, có mùi dưa muối. Các vi khuẩn hiếu
khí: Một số loại nấm men tạo mang trên bề mặt vang như: Candida, Zygopichia,
Pichia… phân giải đường thành các axit hữu cơ: citric, axetic…làm cho vang bị
đục, độ chua tăng cao, vị không ngon [8].
1.2.6.4. Bệnh vang
Là hiện tượng rượu vang bị chua chất lượng rượu vang bị giảm rất nhanh.
Nguyên nhân do rượu vang bị tiếp xúc với không khí và do dưới tác dụng của vi


khuẩn axetic đã biến cồn thành axit axetic. Hoặc có thể do vi sinh vật lên men
trong điều kiện kị khí gây ra.
1.2.7.Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của nấm men
1.2.7.1. Nguồn cacbon
Cacbon là thành phần quan trọng trong các hợp chất hữu cơ tham gia vào cấu
trúc và hoạt động sống của tế bào. Trong hợp chất hữu cơ cacbon chiếm vị trí
quan trọng hàng đầu cho sự sống của vi sinh vật là nguồn thức ăn chủ yếu của vi
sinh vật là hydratcacbon, nó đáp ứng 3 nhu cầu sau:
-

Sản sinh năng lượng.

-

Tạo tiền chất.

-

Thực hiện những quá trình oxi hoá - khử để biến tiền chất thành những
sản phẩm trung gian hoặc cuối cùng để xây dựng tế bào hoặc tích tụ
trong môi trường.

1.2.7.2.Nguồn nitơ vô cơ
Nấm men cần nitơ để xây dựng tế bào. Vì vậy, môi trường nuôi cấy nấm men
cần bổ sung hợp chất chứa nitơ mà nấm men có thể đồng hoá. Do đó trong môi
trường phân lập cũng như trong môi trường nuôi cấy ta thường bổ sung
(NH4)2SO4.
1.2.7.3.Nguồn photpho vô cơ
Hợp chất photpho có vai trò quan trọng. Nếu thay đổi nồng độ hợp chất
photpho trong môi trường sẽ dẫn đến sự thay đổi các quá trình tổng hợp hàng
loạt các hợp phần của tế bào có chứa photpho, tế bào chất và chất nhân. Ngoài
ra, photpho có trong môi trường còn có tác dụng điều chỉnh hoạt tính hệ enzim
đồng hoá các loại thức ăn cacbon. Trong môi trường phân lập cũng như trong
môi trường nuôi cấy ta thường bổ sung KH2PO4.
1.2.7.4. Nguồn nguyên tố khoáng khác
Muối khoáng có trong môi trường tham gia chủ yếu vào thành phần hạt
nhiễm sắc và các enzim. Vì vậy, một trong những tính chất của chúng là làm


thay đổi trạng thái hoá keo của tế bào chất. Dưới tác dụng của muối vô cơ, bề
mặt tế bào không ngường thay đổi và dẫn đến làm thay đổi phản ứng enzim
trong quá trình trao đổi chất. Như vậy, có thể nói rằng muối khoáng có vai trò

quan trọng trong quá trình trao đổi chất của nấm men.
Ion Ca2+, Mg2+ điều chỉnh sự phát triển của tế bào nấm men.
Ion Fe3+, Mg2+ nằm trong thành phần của enzim hoạt động.
Ngoài ra, một số nguyên tố vi lượng và các chất kích thích sinh học cũng
ảnh hưởng tới sinh trưởng và phát triển của nấm men.
1.2.7.5. Nguồn oxi
Có liên quan tới sự tổng hợp các xitocrom. Nếu nồng độ oxi là 0,05µM/l thì
hệ thống các xitocrom a, b, c, c1 sẽ vắng mặt. Vì vậy, lượng oxi cung cấp có một
ý nghĩa hết sức đặc biệt.
Khi trong môi trường có oxi nấm men sẽ sinh trưởng tăng sinh khối.
Khi trong môi trường không có mặt oxi nấm men sẽ tiến hành lên men.
1.2.8.Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men
1.2.8.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm men và
chất lượng của vang.
- Nhiệt độ < 20oC: sự lên men chậm chạp, độ rượu tạo thành thấp.
- Nhiệt độ < 10oC: không diễn ra quá trình lên men.
- Nhiệt độ ở 35oC: nguy hiểm cho quá trình lên men, nấm men không chết
nhưng mất tác dụng.
- Nhiệt độ > 35oC: quá trình lên men dừng lại, lượng đường sót cao, vi khuẩn
hoạt động, đặc biệt nhiều vi khuẩn chuyển hoá đường thành axit axetic gây chua,
giảm chất lượng vang.
Nhiệt độ thích hợp nhất cho nấm men phát triển là 26-28oC[7].

1.2.8.2. Ảnh hưởng của nồng độ cồn
Khả năng chịu cồn cao và lên men được trong môi trường có nồng độ cồn hợp
lý là một trong những yêu cầu của chủng nấm men lên men rượu vang, vì trong


quá trình lên men luôn sinh ra cồn. Nếu nồng độ cồn cao sẽ làm tê liệt hoạt động

sống của tế bào nấm men, ức chế, kìm hãm quá trình đồng hoá hydratcacbon và
nitơ [7].
1.2.8.3. Ảnh hưởng của pH
pH ở các mức khác nhau thì quá trình lên men diễn ra với tốc độ khác nhau.
pH = 2,3 thì quá trình lên men yếu, pH = 6,5-7,5 thì quá trình lên men dừng lại.
Đối với quá trình lên men vang một số loại quả pH thích hợp từ 4,0-4,5 [7].
1.2.8.4. Ảnh hưởng của hàm lượng giống
Hàm lượng tế bào nấm men có trong dịch lên men càng thấp thì thời gian
nhân giống và lên men sẽ kéo dài hơn, dễ bị nhiễm khuẩn, ngược lại hàm lượng
men giống trong dịch lên men càng cao thì thời gian lên men sẽ ngắn hơn, hạn
chế được khả năng nhiễm khuẩn do sự áp đảo của nấm men. Nhưng hàm lượng
men giống quá cao sẽ làm thay đổi thành phần môi trường lên men và sẽ không
có lợi cho quá trình lên men và chất lượng rượu vang [7].
Nhìn chung hàm lượng nấm men giống thích hợp nhất trong dịch lên men từ
4-10 triệu tế bào/1ml dịch lên men.
1.2.8.5. Ảnh hưởng của hàm lượng đường
Hàm lượng đường phù hợp cho quá trình lên men vang là 12-25%.Hàm lượng
đường 30%V sẽ ức chế quá trình lên men. Các kết quả nghiên cứu cho thấy khi
hàm lượng đường trong dịch lên men tăng thì hàm lượng axit axetic trong vang
cũng cao. Mặt khác tỉ lệ các loại đường có trong dịch lên men cũng ảnh hưởng
không nhỏ tới tốc độ và hiệu suất lên men. Kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả
đã cho thấy: glucoza là loại đường phù hợp nhất cho sự sinh sản và phát triển
của tế bào nấm men cũng như quá trình tạo rượu, tiếp đó là đường fructoza và
đường sacaroza… Vì vậy quả có chứa hàm lượng đường khử càng cao càng có
lợi cho quá trình lên men và chất lượng của vang thành phẩm [7].

1.2.8.6. Ảnh hưởng của nồng độ oxy hoà tan


Nồng độ oxy hoà tan giữ vai trò quan trọng không chỉ đối với sự sinh sản và

phát triển tối đa của nấm men mà còn quyết định đến hiệu suất lên men và chất
lượng của vang. Trong điều kiện lên men rượu, các đường đơn glucoza, fructoza
sẽ được phân giải theo con đường EMP và chu trình ATC, tiếp đó là chuỗi hô
hấp hoạt động, khi nấm men thu được nhiều năng lượng, sinh khối trong dịch
lên men cũng tăng, môi trường cũng dần chuyển sang kị khí và nấm men chuyển
sang lên men rượu, do đó sản phẩm của quá trình lên men rượu bao gồm: etanol,
CO2, sinh khối, các axit hữu cơ và các sản phẩm phụ khác…Do đó, việc cung
cấp oxy cho quá trình lên men vang không chỉ đáp ứng yêu cầu sinh sản và phát
triển mạnh của nấm men mà còn làm mất đi một số sản phẩm lên men không
cần thiết.
-Khi môi trường có đầy đủ oxy thì nấm men sẽ sử dụng đường làm nguồn
năng lượng tăng sinh khối.
-Khi môi trường thiếu oxy thì nấm men lại tiến hành hô hấp kị khí và chuyển
thành rượu.

CHƯƠNG 2


NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, HOÁ CHẤT
2.1.1. Nguyên liệu chính
- Quả táo mèo thu nhận từ hai tỉnh Yên Bái và Sơn La.
- Dịch táo mèo được sử dụng làm các môi trường phân lập, tuyển chọn giống
nấm men, môi trường nghiên cứu một số đặc tính sinh học của nấm men đồng
thời cũng chính là nguyên liệu để nghiên cứu lên men vang táo mèo.
2.1.2. Hoá chất và thiết bị
2.1.2.1. Hoá chất
Một số hoá chất được sử dụng: MgSO4,KH2PO4, (NH4)2SO4, axit xitric (hãng:
FENXICHUN-Trung Quốc), K2S2O5 (hãng: BATOL-của C.H Pháp), các loại
muối nitrat, các loại đường (hãng: BDH-Anh)…

2.1.2.2. Thiết bị
Hộp petri, ống nghiệm, đường kế Đức, tủ sấy, tủ lạnh sâu, buồng cấy vô
trùng, buồng đếm Goriaev, máy đo pH, máy quang phổ kế, máy ly tâm, kính
hiển vi quang học Nikon Nhật, nồi khử trùng cao áp, máy lắc ổn nhiệt, …
2.1.3 Các loại môi trường
2.1.3.1 Môi trường Hansen (môi trường 1) g l
1. Đường glucoza :

50g

2. Pepton

5g

:

3. MgSO4.7H2O :

0,5g

4. KH2PO4

:

1g

5. (NH4)2SO4

:

1g

6. Thạch Aga

:

20g

7. Nước

:

1000ml

2.1.3.2. Môi trường nhân giống (môi trường 2) g/l


1.
2.
3.
4.
5.
6.

Đường glucoza :
Pepton
:
MgSO4 . 7H2O :
KH2PO4
:

(NH4)2SO4
:
Nước
:

50g
5g
0,5g
1g
1g
1000ml

2.1.3.3. Môi trường lên men (môi trường 3)g/l
1. Dịch siro hoa quả :
200ml
2. MgSO4.7H2O
:
0,5g
3. KH2PO4
4. (NH4)2SO4
5. Nước

:
:
:

1g
1g
1000ml

2.2.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Các phương pháp vi sinh
Nguồn nấm men được chúng tôi sử dụng phân lập và tuyển chọn để nghiên
cứu lên men vang táo mèo là từ thiên nhiên và được tiến hành theo các bước cơ
bản sau:
2.2.1.1.a. Tạo nguồn giống nấm men để phân lập và tuyển chọn
Nguyên liệu dùng để sản xuất rượu vang ở đây là các loại quả táo mèo (quả
sơn tra). Táo mèo được thu hoạch vào tháng 6, tháng 7. Quả thu hoạch về cần
phải được chọn lấy các quả đã chín, loại bỏ các quả non, quả dập nát thối rữa.
Quả đã chọn đem rửa sạch bằng nước đạt tiêu chuẩn vệ sinh rồi để ráo nước. Sau
đó cho vào các ang thùng ngâm đường theo tỉ lệ 1:1. Quả táo mèo ta khía các
đường nhỏ quanh quả. Khoảng hai ngày khuấy trộn một lần. Sau một tháng ta
thu được một thứ siro nước quả có nồng độ đường khoảng 60-80 % và nhiều
dưỡng chất khác được chiết ra từ thịt quả.
Theo dõi dịch lên men phân tích nồng độ cồn trong dịch quả lựa chọn mẫu có
độ cồn bằng 10% V làm nguồn cung cấp nấm men để tiến hành phân lập.
2.2.1.1.b. Phân lập giống nấm men


Pha loãng dịch quả bằng nước đảm bảo vệ sinh cho đến khi đạt nồng độ
đường 20%. Dịch pha loãng được sunfít hoá bằng K2S2O5 với liều lượng thích
hợp để không giết chết nấm men thuần chủng. Sau đó để lên men tự nhiên ở
nhiệt độ 26 - 28 0C, đến ngày lên men thứ 3-5 chúng tôi lấy khoảng 5-10ml dịch
đang lên men đem pha loãng ở các nồng độ khác nhau: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 105
….10-10. Từ mỗi ống nghiệm chứa dịch pha loãng ta lấy 1 giọt, dùng bàn trang
trải đều trên hộp lồng có chứa môi trường Hansen rồi để trong tủ ấm 26 - 280C
trong khoảng thời gian 2 - 3 ngày [6]. Từ các hộp lồng này ta lựa chọn lấy các
khuẩn lạc to, trơn, nhẵn, bóng, sáng đem cấy riêng rẽ vào các ống thạch
nghiêng, nghiên cứu đặc tính sinh học của các chủng tuyển chọn.
2.2.1.2. Đếm số lượng tế bào nấm men

Phương pháp đếm số lượng tế bào dùng để xác định mật độ tế bào trong môi
trường nuôi cấy là phương pháp đơn giản, thuận tiện, cho kết quả nhanh. Dụng
cụ để đếm số lượng tế bào là buồng đếm hồng cầu Thoma- Goriaev có cấu tạo là
một khung đếm bằng phiến kính bao gồm 400 ô vuông nhỏ với tổng thể tích của
buồng đếm là = 0,1m3.
Việc đếm số luợng tế bào nấm men có trong môi trường nuôi cấy được thực
hiện đúng theo nguyên tắc đếm số lượng hồng cầu trong máu.
2.2.1.3. Phương pháp hoạt hoá giống
Các khuẩn lạc được chọn sẽ được cấy vào thạch nghiêng để ở 26-280C trong
vòng 24 giờ được giống cấp 1. Nấm men được lấy từ thạch nghiêng để đưa vào
dịch lên men. Để có số lượng nấm men lớn và có những tế bào trẻ, to khoẻ,
chúng tôi tiến hành hoạt hoá giống bằng cách nuôi trong môi trường nhân giống
ở 26-280C trong 24 giờ trên máy lắc, được giống cấp 2. Dùng giống cấp 2 để lên
men.
2.2.1.4.Xác định hoạt lực lên men
Chúng tôi xác định hoạt lực lên men của nấm men thông qua việc xác định
hàm lượng CO2 được sinh ra ( g/l dịch lên men ) khi tiến hành lên men trong các
bình tam giác với 50ml dịch môi trường lên men. Hàm lượng CO2 sinh ra càng
nhiều chứng tỏ hoạt lực lên men càng tốt.


Trong một số trường hợp khi nghiên cứu về nấm men ở giai đoạn nhân giống
hoặc lên men vang chúng tôi kết hợp phân tích hàm lượng cồn và đường sót để
xác định hiệu suất lên men, nếu hiệu suất lên men càng cao thì hoạt lực lên men
của nấm men được đánh giá càng tốt.
Hiệu suất lên men được tính bằng công thức:
VTT
N=

x 100%

VLT

Trong đó

N : Hiệu suất lên men
VTT : Nồng độ cồn thực tế ( %m)
VLT : Nồng độ cồn tính theo lý thuyết

2.2.1.5 Quan sát hình dạng tế bào trên kính hiển vi
Tế bào nấm men được nhuộm đơn bằng cách: lấy một lượng nhỏ tế bào từ
ống thạch nghiêng, dàn đều lên lam kính có chứa một giọt nước cất sau đó cố
định vết bôi bằng cách hơ lên ngọn lửa đèn cồn. Nhỏ 1-2 giọt xanhmetilen lên
vết bôi, để trong khoảng 2-3 phút rồi rửa lại bằng nước cất. Cuối cùng hơ trên
ngon lửa đèn cồn, để khô rồi quan sát hình thái tế bào nấm men trên kính hiển vi
quang học có độ phóng đại 1000 lần.
2.2.1.6. Xác định khả năng kết lắng
Khả năng kết lắng của chủng nấm men được xác định bằng tốc độ lắng của
sinh khối phương pháp này được tiến hành như sau: hoà sinh khối nấm men vào
dung dịch đệm axetat (có pH=4,5) được đựng trong các ống nghiệm có hình
dạng và kích thước như nhau với thể tích của dung dịch đệm và số lượng nấm
men hoàn toàn bằng nhau. Lắc kỹ trên máy với tốc độ 200 vòng/phút trong thời
gian 3-5 phút, để lắng 15 phút, lúc này toàn bộ khối dịch phân thành 2 lớp ( phía
dưới đáy của ống nghiệm là nấm men đã kết lắng). Tiến hành đo chiều cao lớp
kết lắng của nấm men trong từng ống nghiệm để xác định khả năng kết lắng của


chủng nấm men. Ống nghiệm nào có chiều cao kết lắng cao nhất là chủng nấm
men có độ kết lắng tốt nhất.
2.2.1.7. Xác định tên khoa học của chủng nấm men
Chúng tôi sử dụng khoá phân loại của Lodder (1970) để xác định tên khoa

học của chủng nấm men do chúng tôi phân lập và tuyển chọn được để lên men
vang táo mèo thông qua các tiêu chí cơ bản.
Đặc điểm sinh học ( cấu tạo, hình thái, sinh lý, điều kiện hình thành túi
-

bào tử và số lượng bào tử…).
Khả năng đồng hoá cacbon.
Khả năng đồng hoá các loại muối nitrat.

2.2.2.Phương pháp hoá học
Xác định hàm lượng đường bằng đường kế.
Xác định độ pH bằng máy đo pH và giấy đo pH.
Xác định hàm lượng axit trong dịch lên men bằng chuẩn độ dung dịch
NaOH 0,1N. Từ số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn ta suy ra hàm lượng
axit dịch lên men.
Xác định hàm lượng cồn bằng cồn kế hoặc bằng phương pháp hoá học.
2.2.3. Phương pháp toán học
Chúng tôi tiến hành xử lý kết quả thu được bằng phương pháp thống kê toán
học qua các thông số sau:
2.2.3.1.Giá trị trung bình số học:

M

Trong đó

=

n

Mi

i =1

n



M : trung bình tổng thể
Xi : giá trị của mỗi kết quả thí nghiệm từ thứ 1 đến thứ n
N: số lần thí nghiệm


2.2.3.2 Độ lệch chuẩn:

 = ±1/2  (X – M)

2

i

Trong đó:

Xi: giá trị của mỗi kết quả thí nghiệm từ thứ 1 đến thứ n
M: trung bình tổng thể

2.2.3.3. Hệ số biến thiên của trung bình tổng thể
 x 100
CV =

(%)

M

Trong đó:

CV: hệ số biến thiên của trung bình tổng thể
M: trung bình tổng thể
: độ lệch chuẩn

2.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Chủng nấm men Saccharomyces tuyển chọn trên đối tượng là quả táo mèo
được thu từ Trạm Tấu (Yên Bái), Sơn La.
2.4. ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
Phòng thí nghiệm Vi sinh-CNSH, Khoa sinh-KTNN Trường ĐHSP Hà Nội
Phòng thí nghiệm Vi sinh, Khoa sinh-KTNN Trường ĐHSP Hà Nội 2
2.5. THỜI GIAN THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
Đề tài thực hiện từ tháng 9 năm 2005 đến tháng 12 năm 2006


CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1 PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN, XÁC ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CỦA
CHỦNG NẤM MEN LÊN MEN VANG TÁO MÈO
3.1.1. Phân lập chủng nấm men có khả năng lên men vang táo mèo
Sau 10 lần phân lập chúng tôi thu được 38 mẫu nấm men. Từ số mẫu này
tuyển chọn được 4 chủng có đường kính khuẩn lạc lớn hơn 1,5mm, chúng tôi
dùng 4 chủng làm đối tượng nghiên cứu tiếp, các chủng này kí hiệu là TM1,
TM2, TM3, TM4.
3.1.2. Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang táo mèo
Nấm men đóng vai trò quan trọng đối với toàn bộ quy trình sản xuất và chất
lượng của vang. Nấm men sử dụng lên men rượu vang từ dịch táo mèo phải đạt

các yêu cầu sau: [12]
1. Lên men được ở nồng độ đường và nồng độ axit khá cao.
2. Có hiệu suất lên men cao.
3. Có khả năng kết lắng tốt và làm trong sản phẩm.
4. Tạo được hương thơm đặc trưng và không có vị lạ, không sinh độc tố.
5. Ổn định lâu dài trong sản xuất
3.1.2.1. Sơ bộ tuyển chọn chủng nấm men để lên men vang táo mèo
Sau khi đã phân lập được 4 chủng nấm men ( theo phương pháp đã nêu trên)
chúng tôi tiếp tục các bước tiếp theo để tuyển chọn chủng nấm men phù hợp với
yêu cầu đã đề ra ( mục 3.1.2) bằng các phương pháp sau.
3.1.2.1.a. Thử khả năng phát triển của chủng nấm men
Môi trường chúng tôi dùng để thử khả năng sinh trưởng và phát triển của 4
chủng nấm men thu được là môi trường dịch siro táo mèo có bổ sung nước chiết
giá đỗ xanh. Môi trường nuôi cấy sau khi được khử trùng được đưa vào các bình
tam giác 250 ml và đặt lên máy lắc ổn nhiệt (26-280C) tốc độ 150 vòng /phút.
Tiến hành xác định số lượng tế bào nấm men với khoảng thời gian thử mẫu là 4
giờ một lần trong 23 giờ liên tục. Kết quả được dẫn ra ở bảng