Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon, ph và nhiệt độ tới quá trình lên men vang táo mèo

TRƯỜNG ĐAỊ HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH-KTNN


NGUYỄN THỊ MAI DUNG

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA
NGUỒN CACBON, pH VÀ NHIỆT ĐỘ
TỚI QUÁ TRÌNH LÊN MEN VANG TÁO MÈO

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học
PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung

Hà Nội, tháng 5 năm 2010


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp, ngoài sự cố gắng của bản thân còn
có sự tạo điều kiện của nhà trường, của khoa và sự hướng dẫn tận tình của
thầy, cô giáo. Với tấm lòng biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn cô giáo
PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong
thời gian qua. Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong
khoa Sinh-KTNN đã tạo điều kiện cho em thực hiện đề tài này.
Em xin chân thành cám ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2010.
Sinh viên
Nguyễn Thị Mai Dung.

Nguyễn Thị Mai Dung

K32B-Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon, pH và
nhiệt độ tới quá trình lên men vang táo mèo” là do tôi thực hiện, không
trùng với đề tài khác.
Nếu sai tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm.
Hà Nội, tháng 5 năm 2010.

Nguyễn Thị Mai Dung

K32B-Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

SLTB

: Số lượng tế bào

TB

: Tế bào

HL

: Hàm lượng

Tg

: Thời gian

Nxb

: Nhà xuất bản

ĐHSP

: Đại học sư phạm

STT

: Số thứ tự

V

: Thể tích

T3

: Saccharomyces.sp T3

Nguyễn Thị Mai Dung

K32B-Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

DANH MỤC HÌNH ẢNH, BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ
Hình Ảnh
Hình 3.1 .Mẫu nấm men phân lập trên môi trường thạch đĩa

16

Hình 3.2. Mẫu nấm men phân lập trên môi trường thạch nghiêng

16

Hình 3.3. Mẫu tế bào nấm men quan sát dưới kính hiển vi quang học độ
phóng đại 1000 lần

17

Biểu đồ
Biểu đồ 3.1. SLTB trung bình sau 24h nuôi cấy ở các giá trị pH khác nhau

20

Biểu đồ 3.2. SLTB trung bình sau 24h nuôi cấy ở các giá trị nhiệt độ khác nhau 21
Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của nguồn cacbon tới quá trình lên men vang táo mèo 25
Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của pH tới quá trình lên men vang táo mèo

27

Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình lên men vang táo mèo

28

Đồ thị
Đồ thị 3.1. Động thái lên men vang táo mèo

Nguyễn Thị Mai Dung

24

K32B-Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần hóa học một số loại quả

3

Bảng 3.2. Hoạt lực lên men của các mẫu nấm men ở độ pH khác nhau

17

Bảng 3.3. Khả năng lên men đường của mẫu T3

18

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng, phát triển của T3 trong
quá trình nhân giống

19

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng, phát triển của T3
trong quá trình nhân giống

21

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến sự sinh trưởng, phát triển
của T3 trong quá trình nhân giống

22

Bảng 3.7. Khả năng lên men của T3 trên môi trường có nồng độ đường
khác nhau

23

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nguồn cacbon tới quá trình lên men vang táo mèo 25
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của pH tới quá trình lên men vang táo mèo

26

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình lên men vang táo mèo

28

Bảng 3.11. Kết quả phân tích rượu thành phẩm

29

Nguyễn Thị Mai Dung

K32B-Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU

1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

1.1. Khái quát chung về rượu vang

3

1.2. Hệ vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men vang và bệnh vang

4

1.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng, phát triển của nấm men

7

1.4. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men vang

8

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

10

2.1. Đối tượng, thiết bị và hóa chất

10

2.2. Phương pháp nghiên cứu

11

2.3. Phạm vi nghiên cứu

14

2.4. Địa điểm thực hiện đề tài

14

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

15

3.1. Phân lập, tuyển chọn, xác định tên khoa học của chủng nấm men

15

3.2. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự sinh trưởng, phát triển của T3 trong
quá trình nhân giống

19

3.3. Nghiên cứu động thái lên men vang táo mèo

23

3.4. Ảnh hưởng của một số yếu tố tới quá trình lên men vang táo mèo

25

3.5. Ứng dụng lên men vang táo mèo với quy mô phòng thí nghiệm

29

3.6. Quy trình công nghệ lên men vang táo mèo

30

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

33

TÀI LIỆU THAM KHẢO

34

Nguyễn Thị Mai Dung

K32B-Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

MỞ ĐẦU
*Lí do chọn đề tài
Rượu vang (wine, vine) là sản phẩm được tạo thành trong quá trình lên
men các loại nước trái cây không qua chưng cất, giữ được mùi thơm và hương

vị đặc trưng của từng loại quả. Hàng năm trên thế giới sản xuất khoảng 2 tỷ lít
rượu vang, trong đó các nước sản xuất nhiều nhất là: Pháp, Italia, Angieri.
Ở Việt Nam sản xuất vang nho bắt đầu xuất phát từ một số cơ sở nhỏ
lẻ. Sau đó phát triển thành các nhà máy vang Thăng Long, Gia Lâm, Thanh
Ba… Trong sản xuất rượu vang tùy từng phương thức sản xuất và loại quả
chế biến mà cho ra các loại rượu khác nhau. Trên thế giới có hàng trăm loại
rượu vang có chất lượng cao như Chianti, Rhine…
Nước ta có khí hậu nhiệt đới nên các loại cây hoa quả phong phú, trong
đó có nhiều loại quả có thể là nguồn nguyên liệu tốt cho sản xuất rượu vang.
Miền núi phía Tây Bắc nước ta có cây táo mèo cho quả có hương vị thơm
ngon và đặc trưng. Hiện nay quả táo mèo chủ yếu là ăn tươi, ngâm rượu,
ngâm dịch siro. Tổng diện tích trồng táo mèo khoảng 40.000 ha [9], [10]. Nơi
có diện tích cây táo mèo nhiều nhất là các tỉnh Yên Bái, Sơn La, Điện Biên,
Lai Châu. Tuy nhiên số lượng mang đi tiêu thụ hàng năm không đáng kể
(khoảng 35%), số còn lại thường bị bỏ phí do không có nguồn tiêu thụ tại chỗ,
vận chuyển khó khăn, hoặc giá thành rẻ. Hầu hết người trồng quả táo mèo có
thu nhập thấp, đời sống gặp nhiều khó khăn.
Ngành sản xuất rượu vang ở nước ta đang phát triển, có nhiều sản phẩm
bán trên thị trường. Nhưng ứng dụng công nghệ vi sinh vào sản xuất vang
chưa được phổ biến, việc nghiên cứu một số chủng vi khuẩn áp dụng lên men
vang đã được đề cập đến nhưng còn ít.
Vì vậy việc nghiên cứu, sử dụng quả táo mèo để sản xuất rượu vang là
cần thiết và phù hợp với thực tiễn Việt Nam. Chúng tôi đã chọn và tiến hành

Nguyễn Thị Mai Dung

1

K32B-Sinh-KTNN

Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

công trình nghiên cứu “Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon, pH và
nhiệt độ tới quá trình lên men vang táo mèo”.
*Mục tiêu của đề tài
- Phân lâp, tuyển chọn được chủng nấm men lên men vang từ dịch táo
mèo.
- Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men vang táo
mèo.
- Lên men rượu vang táo mèo trên quy mô phòng thí nghiệm, xây dựng
quy trình lên men vang.
*Nội dung của đề tài
- Phân lập, tuyển chọn, xác định tên khoa học của chủng nấm men.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự sinh trưởng, phát
triển của chủng nấm men trong quá trình nhân giống.
- Nghiên cứu động thái lên men vang táo mèo.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố tới quá trình lên men vang
táo mèo.
- Ứng dụng lên men vang táo mèo với quy mô phòng thí nghiệm.
- Xây dựng quy trình công nghệ lên men vang táo mèo.
*Ý nghĩa lí luận và thực tiễn của đề tài
Đề tài của chúng tôi nhằm đáp ứng các yêu cầu khoa học về ý nghĩa lí
luận và thực tiễn như sau:
- Nghiên cứu nhằm đi sâu tìm hiểu hình thái, đặc điểm sinh lí, sinh hóa
của chủng T3 có khả năng lên men vang táo mèo.
- Đề tài mang ý nghĩa thực tiễn đó là tạo nguồn tiêu thụ quả táo mèo
nhằm nâng cao thu nhập cho bà con các dân tộc vùng cao.

Nguyễn Thị Mai Dung

2

K32B-Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Khái quát chung về rƣợu vang
1.1.1. Các loại rượu vang
Rượu vang theo đúng nghĩa là nước ép nho lên men (không qua chưng
cất). Ngày nay người ta mở rộng khái niệm rượu vang để chỉ các loại rượu lên
men từ các loại quả khác nhau như táo, dâu, vải…
Rượu vang có thể chia làm 2 loại chính:
- Vang không ga (vang bàn ăn).
- Vang có ga (vang bọt sâm banh)
+ Loại không ngọt
+ Loại rất ít đường
+ Loại ngọt [5], [7].
1.1.2. Nguyên liệu sản xuất rượu vang
Nước ta là nước nhiệt đới gió mùa không thích hợp cho cây nho phát
triển tốt. Tuy nhiên nước ta lại có hoa quả phong phú, đây là nguồn nguyên
liệu phục vụ cho ngành nông nghiệp chế biến rượu vang (mơ, táo, dứa,
vải,…). Thành phần hóa học của quả, điều kiện chăm sóc, khí hậu,… có ảnh
hưởng lớn đến chất lượng rượu vang.

Thành phần hóa học của một số loại quả được dẫn ra ở bảng 1.1 [11].
Bảng 1.1. Thành phần hóa học một số loại quả
Tên quả
Nho
Vải
Dứa
Mơ
Dâu
Táo mèo

Nước
73,1
84,28
54,3
73,8
84,74
84

Nguyễn Thị Mai Dung

Thành phần hóa học cơ bản (%)
Đường
Acid
Pectin
9,88
0,56
0,092
16,1
5,16
0,249

3,9
0,6
0,249
9,0
1,1
0,249
9,19
0,49
0,31
4,8
1,45
0,249

3

Tanin
0,07
0,83
0,83
0,83
0,035
0,83

K32B-Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

1.1.3. Tàng trữ rượu vang
Vang được tàng trữ 1-5 năm, có thể tàng trữ hàng trăm năm. Trong thời
gian này xảy ra quá trình oxi hóa-khử màu tím sang màu đỏ tía, vang trắng
chuyển sang vàng, thậm chí đỏ, nâu. Thành phần acid tăng, độ cồn giảm, este
và hương vị tăng lên [6].
1.1.4. Thành phần của rượu
Thành phần chủ yếu của vang gồm:
- Cồn ethanol, do lên men tự nhiên từ dịch trái cây vì vậy không lẫn với
aldehyt, este. Độ cồn của rượu 10- 120.
- Chất bổ sung: Đường trong rượu vang từ 6,2% – 13,2% chủ yếu là
fructose, glucose, một ít galactose.
- Acid vô cơ và acid hữu cơ: Acid oxalic, acid malic…
- Một lượng phong phú các muối với hàm lượng thấp nhưng giữ vai trò
quan trọng, làm tăng hương vị của rượu, tăng giá trị dinh dưỡng của rượu.
- Rượu vang giàu vitamin: Vitamin có trong nước quả không bị quá
trình lên men phân hủy mà nó chỉ điều chỉnh điều chỉnh lại thành phần.
1.2. Hệ vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men vang và bệnh vang
1.2.1. Nấm men
1.2.1.1. Sơ lược, cấu tạo, hình thái tế bào nấm men
- Sơ lược về nấm men: Nấm men là tên chung để chỉ nhóm nấm có cấu
tạo đơn bào, sinh sản bằng lối nảy chồi. Nấm men phân bố khá rộng rãi trong
tự nhiên (trong đất, nước, không khí, thực phẩm, hoa quả), nhiều loại nấm
men có khả năng lên men rượu, vì vậy từ lâu con người đã biết sử dụng nấm
men để sản xuất rượu bia.
Tuy nhiên một số nấm men độc hại, làm nhiễm các quy trình công nghệ
và gây hư hỏng sản phẩm.

Nguyễn Thị Mai Dung

4

K32B-Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

- Cấu tạo chủ yếu của tế bào là hemicellulose chiếm 70% trọng lượng
khô (trong đó 31% manman, 29% glucan). Ngoài ra còn chứa 1-3% kitin, 610% protein, 8-8,5% lipid, 7% khoáng. Thành phần nội bào quan trọng của
nấm men là ti thể, không bào và nhân. Số lượng ti thể khoảng 10-20/tế bào.
Chúng có vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng, sinh sản của nấm
men. Không bào được hình thành từ thể Golgi hay mạng lưới nội chất. Không
bào chứa hệ thống keo bao gồm : Enzyme, protein, hydrocarbon, muối canxi,
kali, phenolflavin, riboflavin, acid nucleic, và các chất dự trữ khác. Nhân có
hình ovan, tròn nằm gần không bào trung tâm với kích thước khoảng 2,4  m .
Nhân chứa toàn bộ hệ men tham gia điều khiển quá trình sinh tổng hợp của tế
bào nấm men.
- Hình thái tế bào: Đa số có hình trứng, cầu hay ovan. Kích thước từ (310) x (5-12)  m. Hình dạng kích thước tế bào điển hình chỉ được tạo ra
trong điều kiện môi trường phù hợp. Khi điều kiện bất lợi thì hình dạng, kích
thước tế bào sẽ bị biến dạng (khi môi trường nghèo dinh dưỡng nấm men có
hình đế giày).
1.2.1.2. Sinh sản của tế bào nấm men
Trong điều kiện bình thường tế bào nấm men sinh sản bằng lối nảy
chồi. Trong điều kiện không thuận lợi một số có thể chuyển sang sinh sản
bằng bào tử.
Sinh sản nảy chồi ở nấm men là hình thức phổ biến nhất. Khi tế bào
phát triển đến một mức độ nhất định thì trên cơ thể của nó đâm ra một chồi
nhỏ gọi là mầm (chồi). Mầm (tế bào con) đâm ra ở vị trí lệch tâm trên một
đầu của tế bào mẹ. Sau khi nảy mầm, tế bào con phát triển trên cơ thể mẹ

hoặc tách khỏi cơ thể mẹ để phát triển độc lập.
Nấm men Saccharomyces có khả năng hình thành bào tử, bào tử túi
được sinh ra trong các túi nhỏ gọi là túi nang, mỗi túi chứa 1-8 bào tử. Nấm

Nguyễn Thị Mai Dung

5

K32B-Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

men Saccharomyces được hình thành theo lối sinh sản vô tính. Đó là quá trình
hình thành bào tử từ một tế bào riêng rẽ không qua tiếp hợp. Bào tử túi sau
khi ra khỏi túi gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành một tế bào nấm men.
Tiếp theo tế bào nấm men lại sinh sản theo lối nảy chồi.
*Nấm men được dùng trong lên men rượu vang là Saccharomyces
crevisiae. Nấm men chứa trung bình 75% nước, 25% chất khô.
Theo quan điểm kinh tế người ta chia nấm men thành các chủng:
- Chủng lên men với hiệu suất cao, ở thời gian tối ưu sản sinh tới 20%V
cồn.
- Chủng lên men ở thời gian ngắn, lên men tạo 8-10%V cồn
- Chủng chịu nồng độ cồn cao, lên men trong rượu vang dưới 30%,
đường tạo 10-13%V cồn.
1.2.2. Vi khuẩn
Trong nước quả và rượu vang có thể phát triển những dạng vi khuẩn là
nguyên nhân gây nên những biến đổi sâu sắc trong rượu vang về vị chua, mùi,

có loài còn gây đục vang. Đó thường là các loài vi khuẩn Acetobacter
xylnium, Acetobacter aceti. Pasteur đã tìm ra cơ chế làm hỏng vang khi rượu
vang tiếp xúc với không khí nhiễm vi khuẩn Bacillus [10].
Do vậy để bảo quản rượu vang người ta có thể dùng thanh trùng
Pasteur nhưng nó lại làm giảm chất lượng rượu vang. Ngoài ra, người ta còn
dùng phương pháp vi lọc hoặc dùng một số chất bảo quản phổ biến như SO 2
(75-120 mg/l).
1.2.3. Nấm mốc
Nấm mốc phát triển ở quả, chất bã của sản xuất rượu vang, thùng chứa
thiết bị hoặc do bụi không khí đưa đến như nấm mốc thuộc chi Rhizopus,
Aspergillus [6], [10].

Nguyễn Thị Mai Dung

6

K32B-Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

1.2.4. Bệnh vang
Bệnh vang luôn là vấn đề phải quan tâm của các nhà sản xuất rượu
vang. Vấn đề bệnh vang được khám phá đầu tiên bởi Pasteur. Bệnh vang làm
cho rượu bị chua, mùi khó chịu và phẩm chất rượu giảm rất nhanh [5], [9].
Các vi sinh vật kị khí: vi khuẩn Lb. brevia, Lb. pasteurianus, Lb. plantarum
đã làm cho vang bị vẩn đục, làm chuyển hóa acid c itric, tạo ra lượng lớn acid
lactic, acid acetic và 2,3-butanediol.

Các vi khuẩn hiếu khí: Một số loại nấm men tạo màng trên bề mặt vang
như: Candida, Zygopichia, Pichia… phân giải đường thành các acid hữu cơ:
citric, acetic…[2].
1.3. Các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình sinh trƣởng, phát triển của nấm
men
1.3.1. Nguồn cacbon
- Cacbon là nguồn nguyên liệu cơ bản kiến tạo nên bộ khung tế bào
nấm men, là thành phần quan trọng của tất cả các chất trao đổi. Cacbon là
nguồn dinh dưỡng hàng đầu của vi sinh vật.
- Nguồn cacbon cung cấp cho nấm men Saccharomyces cerevisiae
được lấy chủ yếu từ các nguồn đường: glucose, saccharose, fructose.
- Nguồn cacbon đáp ứng được 3 nhu cầu cơ bản của nấm men.
+ Sản sinh năng lượng thông qua quá trình oxi hóa khử.
+ Tạo thành những tiền chất.
+ Tham gia vào các quá trình oxi hóa khử.
1.3.2. Nguồn nitơ và khoáng chất
Nitơ là thành phần quan trọng trong tế bào vi sinh vật, nó là một trong
những nguyên tố cấu thành nên acid nucleic. Nitơ cung cấp cho vi sinh vật
chủ yếu từ 2 nguồn: nguồn vô cơ và nguồn hữu cơ. Các nguyên tố khoáng

Nguyễn Thị Mai Dung

7

K32B-Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

như S, P đóng vai trò quan trọng trong trao đổi chất của tế bào nấm men. Ion
Fe 3 , Mg 2 nằm trong tế bào của enzyme hoạt động.
1.3.3. Ảnh hưởng của oxy
Quá trình tăng sinh của nấm men là quá trình hiếu khí vì vậy oxy là
nguồn quan trọng để nấm men tăng sinh khối trong giai đoạn nhân giống.
1.4. Các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình lên men vang
1.4.1. Hàm lượng cồn và pH
Nấm men lên men luôn sản sinh một lượng cồn. Nồng độ cồn thích hợp
cho nấm men phát triển tốt là 9-14%V. Khả năng chịu cồn và lên men tốt
trong môi trường có nồng độ cồn thích hợp là một tiêu chí để tuyển chọn
chủng nấm men cho quá trình sản xuất rượu.
Trong quá trình lên men pH môi trường luôn biến đổi. Ở giai đoạn cuối
pH hơi tăng do nấm men tự phân hủy giải phóng ra NH3. Ở pH =2,3 quá trình
lên men yếu, pH > 6,5-7,5 khả năng lên men không còn. pH thích hợp là 4-5
[10].
1.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng khá lớn đến quá trình lên men. Mỗi loại nấm
men có khoảng nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển:
- Nhiệt độ <200C: Sự lên men chậm chạp, độ rượu tạo thành thấp.
- Nhiệt độ <100C: Không diễn ra quá trình lên men.
- Nhiệt độ ở 350C: Nguy hiểm cho quá trình lên men, nấm men không
chết nhưng mất tác dụng.
- Nhiệt độ >350C: Quá trình lên men dừng lại, lượng đường sót cao, vi
khuẩn hoạt động đặc biệt nhiều vi khuẩn chuyển hóa đường thành acid acetic
gây chua, giảm chất lượng vang.
Nhiệt độ thích hợp nhất cho nấm men phát triển là 26-280C.
1.4.3. Hàm lượng đường và hàm lượng men giống

Nguyễn Thị Mai Dung

8

K32B-Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

Đường và các chất hòa tan tạo nên áp suất thẩm thấu ảnh hưởng đến
quá trình vận chuyển các chất ra vào tế bào. Hàm lượng đường thích hợp cho
quá trình lên men là 12-25%. Hàm lượng đường 30%V sẽ ức chế quá trình lên
men. Các kết quả nghiên cứu cho thấy khi hàm lượng đường trong dịch lên
men tăng thì hàm lượng acid acetic trong vang cũng cao. Mặt khác tỉ lệ các
loại đường trong dịch lên men cũng ảnh hưởng không nhỏ đến tốc độ và hiệu
suất lên men. Kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả cho thấy: glucose là loại
đường phù hợp nhất cho sự sinh sản và phát triển chủng nấm men cũng như
quá trình tạo rượu, tiếp đó là đường fructose và saccharose… Vì vậy quả có
chứa hàm lượng đường khử càng cao thì càng có lợi cho quá trình lên men và
chất lượng vang thành phẩm [10].
Hàm lượng men giống cũng ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình sinh
trưởng cũng như quá trình lên men của nấm men. Hàm lượng tế bào nấm men
có trong dịch lên men càng thấp thì thời gian lên men càng kéo dài hơn, dễ bị
nhiễm khuẩn, ngược lại hàm lượng men giống trong dịch lên men càng cao thì
thời gian lên men ngắn hơn, hạn chế được khả năng nhiễm khuẩn do sự áp
đảo của của tế bào nấm men. Nhưng hàm lượng men giống quá cao sẽ làm
thay đổi thành phần môi trường lên men và sẽ không có lợi cho quá trình lên
men và chất lượng rượu vang. Nhìn chung hàm lượng men giống thích hợp
cho quá trình lên men khoảng 10%.

Nguyễn Thị Mai Dung

9

K32B-Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng, thiết bị và hóa chất
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Quả táo mèo thu nhận từ hai tỉnh Yên Bái và Sơn La.
- Các chủng nấm men nghiên cứu được phân lập từ dịch quả táo mèo có
vị trí phân loại theo Yelinov N.P (1996) sau đây:
1. Lớp: Hemiascocetes
2. Bộ : Endomycetales
3. Họ : Saccharomyces
4. Loài: Cerevisiae
2.1.2 Hóa chất và thiết bị
2.1.2.1. Hóa chất
Một số hóa chất được sử dụng: MgSO 4 , KH 2 PO 4 , (NH 4 ) 2 SO 4 , acid
citric, các loại muối, các loại đường…
2.1.2.2. Thiết bị
Hộp petri, ống nghiệm, đường kế, tủ sấy, tủ lạnh, buồng cấy vô trùng,
buồng đếm Goriaev, giấy quỳ tím, máy li tâm, kính hiển vi quang học, nồi

khử trùng cao áp, máy lắc ổn nhiệt, máy lắc sinh học…
2.1.3. Các loại môi trường
2.1.3.1. Môi trường Hansen (môi trường 1) g/l
1. Đường glucose: 50g

5. (NH 4 ) 2 SO 4 : 1g

2. Pepton

: 5g

6. Thạc agar

: 20g

3. MgSO 4

: 0,5g

7. Nước

:1000ml

4. KH 2 PO 4

: 1g

Nguyễn Thị Mai Dung

10

K32B-Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

2.1.3.2. Môi trường nhân giống (môi trường 2) g/l
1. Đường glucose : 50g
2. Pepton

:5g

3. MgSO 4

: 0,5g

4. KH 2 PO 4

: 1g

5. (NH 4 ) 2 SO 4

: 1g

6. Nước

: 1000ml

2.1.3.3. Môi trường lên men (môi trường 3) g/l
1. Dịch siro hoa quả: Pha với nước cất để được hàm lượng
đường 22%. Tổng thể tích là 1000ml
2. MgSO 4 .7H 2 0 : 0,5g
4. KH 2 PO 4

: 1g

5. (NH 4 ) 2 SO 4

: 1g

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Các phương pháp vi sinh
2.2.1.1. Phương pháp chọn khuẩn lạc nấm men
Chúng tôi tiến hành phân lập trên hộp lồng petri nhằm tuyển chọn một
tập hợp tế bào nấm men của cùng một nòi có hình thái, kích thước, khả năng
lên men như nhau.
Môi trường phân lập là môi trường 1 được khử trùng và phân vào các
hộp petri vô trùng để nguội. Dịch hoa quả đã được pha loãng 10 1 - 10 9 bằng
nước cất. Nhỏ 1-2 giọt huyền phù với độ pha loãng 10 9 lên mặt thạch, trang
đều bằng bàn trang. Gói kín và nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 300C trong 3-4
ngày, thấy xuất hiện khuẩn lạc. Từ các hộp lồng lựa chọn những khuẩn lạc to,
trơn, nhẵn, bóng, sáng đem cấy riêng rẽ vào các ống thạch nghiêng, nghiên
cứu đặc tính sinh học của các mẫu tuyển chọn.

Nguyễn Thị Mai Dung

11

K32B-Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

2.2.1.2. Phương pháp xác định hoạt lực lên men
- Phương pháp cân bình trọng lượng:
Lên men trong các bình có cùng thể tích 100ml, cùng một lượng tế bào
nấm men của các giống khác nhau. Sau 24h, mở nắp bình lên men, đem cân
trọng lượng bình một lần thấy trọng lượng bình giảm đi. Đó là do lượng CO 2
sinh ra trong quá trình lên men bay hơi. Lượng CO2 sinh ra càng nhiều, trọng
lượng bình càng giảm thì chứng tỏ hoạt lực lên men càng cao.
- Phương pháp xác định số lượng tế bào bằng buồng đếm Goriaev:
Trong môi trường nhân giống nuôi ở 300C lắc đều canh trường, dùng
pipet lấy dung dịch pha loãng cho một giọt vào khe hở giữa lưới đếm kính.
Chú ý tránh để dịch xuống các rãnh thành bọt khí. Sau đó, đặt lá kính lên để
yên 3-5 phút rồi tiến hành soi trên kính hiển vi quang học với độ phóng đại
1000 lần. Đếm số lượng tế bào trong 5 ô chéo lớn.
Cách tính số lượng tế bào trong 1ml.
M=A.50.N
Trong đó: M: số lượng tế bào trong 1ml dịch huyền phù
N: Độ pha loãng của dung dịch huyền phù
A: Số lượng tế bào có trong 1 ô vuông

* Lưu ý: Từ phương pháp này ta có thể lấy được V dịch chứa số lượng
tế bào bằng nhau để nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố trong quá trình
nhân giống.
2.2.1.3. Phương pháp hoạt hóa giống

Khuẩn lạc được chọn cấy vào ống thạch nghiêng để ở 24-280C (nhiệt
độ phòng) trong vòng 24h được giống cấp 1. Nấm men lấy từ các ống thạch
nghiêng để đưa vào dịch lên men phải qua hoạt hóa giống trong môi trường
nhân giống để được giống cấp 2 có số lượng nấm men lớn, tế bào to, khỏe
được lấy để lên men.

Nguyễn Thị Mai Dung

12

K32B-Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

2.2.1.4. Phương pháp quan sát tế bào nấm men trên kính hiển vi quang học
độ phóng đại 1000 lần.
Tế bào nấm men được nhuộm đơn bằng cách lấy một lượng nhỏ tế bào
từ ống thạch nghiêng, dàn đều lên lam kính có chứa một giọt nước cất, sau đó
cố định vết bôi bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn. Nhỏ 1-2 giọt Xanh
methylen hay fuchsin lên vết bôi để khoảng 2-3 phút rồi rửa sạch bằng nước
cất. Cuối cùng hơ trên ngọn lửa đèn cồn, để khô và quan sát hình thái tế bào
nấm men trên kính hiển vi quang học 1000 lần.
2.2.2. Phương pháp vật lí, hóa học
- Xác định hàm lượng đường bằng đường kế.
- Xác định nồng độ pH bằng giấy thử pH và máy đo pH.
- Xác định hàm lượng cồn bằng cồn kế.
2.2.3. Phương pháp toán học

- Giá trị trung bình số học
n

X

 Xi
i 1

n

-Độ lệch chuẩn
S

 ( X i  X )2

S

 ( X i  X )2

n 1

( nếu n  30 )

( nếu n  30 )

n

- Sai số trung bình học
m

Nguyễn Thị Mai Dung

S
n

13

K32B-Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

- Hệ số biến thiên
Cv 

S
.100%
X

Trong đó:

n: Số lần nhắc lại
X i : Giá trị của lần thứ i

2.3. Phạm vi nghiên cứu
Chủng nấm men Saccharomyces, tuyển chọn trên đối tượng là quả táo
mèo được thu từ Trạm Tấu (Yên Bái), Sơn La.
2.4. Địa điểm thực hiện đề tài

Phòng thí nghiệm Vi sinh, Khoa Sinh-KTNN Trường Đại học sư phạm
Hà Nội 2.

Nguyễn Thị Mai Dung

14

K32B-Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập, tuyển chọn, xác định tên khoa học của chủng nấm men
Tác nhân chính thực hiện quá trình chuyển hóa đường trong dịch táo
mèo là nấm men. Vì vậy ta phải phân lập và tuyển chọn sao cho lấy được mẫu
tốt nhất. Chúng tôi dựa vào các chỉ tiêu sau để phân lập, tuyển chọn chủng
nấm men.
- Chịu được độ cồn, độ acid cao.
- Tốc độ phát triển nhanh, chu kì lên men ngắn.
- Có khả năng lên men tốt trên môi trường có hàm lượng đường cao.
- Hương thơm có tạo este đặc biệt.
- Dễ lắng trong [12].
3.1.1. Phân lập chủng nấm men từ dịch táo mèo
Bằng phương pháp chọn khuẩn lạc nấm men (đã trình bày ở trên) chọn
được 4 mẫu có đường kính khuẩn lạc khoảng 1,5mm. Chúng tôi dùng 4 mẫu
làm đối tượng nghiên cứu tiếp, kí hiệu là T1, T2, T3, T4.
3.1.2. Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men táo mèo

3.1.2.1. Quan sát tế bào trên kính hiển vi quang học
Khuẩn lạc chứa mẫu nấm men T1, T2, T3, T4 cấy trên môi trường
Hansen là khuẩn lạc có hình tròn, màu trắng, viền xung quanh không có răng
cưa. Mẫu bao gồm những tế bào có hình ovan hoặc hình trứng, kích thước.
Trong đó mẫu T3 có kích thước tế bào lớn nhất.

Nguyễn Thị Mai Dung

15

K32B-Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

Hình 3.1. Mẫu nấm men phân lập trên môi trƣờng thạch đĩa

Hình 3.2. Mẫu nấm men phân lập trên môi trƣờng thạch nghiêng

Nguyễn Thị Mai Dung

16

K32B-Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

Hình 3.3. Mẫu tế bào nấm men quan sát dƣới kính hiển vi quang học
độ phóng đại 1000 lần
3.1.2.2. Xác định hoạt lực lên men của các mẫu nấm men ở độ pH khác nhau
Xác định hoạt lực lên men (phương pháp đã trình bày rõ ở mục 2.2.1.2)
thông qua hàm lượng CO2 được sinh ra (g/l) khi tiến hành lên men trong các
bình cùng dung tích. Hàm lượng CO2 sinh ra càng nhiều chứng tỏ hoạt lực lên
men càng tốt.
Môi trường nghiên cứu là dịch siro táo mèo bổ sung cao men và được
pha loãng để đạt nồng độ đường là 22%. Tiến hành lên men trong các bình
100ml với thời gian 28h, thu được kết quả ở bảng dưới. Các mẫu đều có khả
năng sinh trưởng, phát triển tốt, đạt số lượng tế bào cực đại ở 24h nuôi cấy.
Bảng 3.2. Hoạt lực lên men của các mẫu nấm men ở độ pH khác nhau
STT

Mẫu

1

pH
3

3,5

4

4,5

5

T1

+

+

+++

++

+

2

T2

+

++

++++

+++

++

3

T3

++

++

+++

++++

++

4

T4

+

++

+++

+++

++

Nguyễn Thị Mai Dung

17

K32B-Sinh-KTNN

Khóa luận tốt nghiệp
Trong đó:

Trường ĐHSP Hà Nội 2

++++ : Hàm lượng CO2 tạo ra > 15g/l
+++

: Hàm lượng CO2 tạo ra 10-15g/l

++

: Hàm lượng CO2 tạo ra 6-9g/l

+

: Hàm lượng CO2 tạo ra 1-5g/l

Kết quả cho thấy:
- Thứ nhất: Các mẫu đều có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt trong
khoảng pH 4-5.
- Thứ hai: Mẫu T3 có hoạt lực lên men mạnh nhất, lượng CO2 thoát ra
nhiều phủ kín bình lên men, môi trường lên men ít bị nhiễm khuẩn do sự phát
triển của tế bào nấm men át chế vi khuẩn phát triển, tạp cồn và hạn chế nấm
men dại. Chúng tôi quyết định giữ mẫu T3 làm đối tượng nghiên cứu tiếp.
3.1.2.3. Khả năng lên men đường
Để xác định khả năng lên men đường của mẫu T3 chúng tôi sử dụng
phương pháp lên men trong các bình 100ml bằng cách cấy mẫu T3 vào 4 môi

trường dinh dưỡng khác nhau (mỗi môi trường ứng với một loại đường).
Chúng tôi dựa vào một số tiêu chí đánh giá khả năng lên men đường là:
- HL đường sót.
- HL cồn.
- Lượng CO2 tạo thành.
Bảng 3.3. Khả năng lên men đƣờng của mẫu T3
Loại đường

Khả năng lên men

Saccharose

Lên men nhưng không mạnh

Glucose

Lên men mạnh

Sorbitol

Lên men mạnh

Dịch quả

Lên men

Kết quả cho thấy mẫu T3 phát triển tốt trên các môi trường đường
saccharose, glucose, sorbitol, dịch quả. Đặc biệt là glucose.

Nguyễn Thị Mai Dung

18

K32B-Sinh-KTNN