Nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose trong đất trồng trọt khu vực xuân hòa

Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Phạm Hong Hải

Lời cảm ơn

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn thầy
Nguyễn Khắc Thanh đã tận tình hớng dẫn và giúp đỡ em hoàn thành khoá
luận này.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong tổ bộ môn vi sinh vật
học cùng toàn thể các thầy cô giáo trong khoa đã tạo điều kiện và giúp đỡ em
hoàn thành khoá luận của mình.
Tôi xin cảm ơn gia đình cùng bạn bè đã luôn động viên và giúp đỡ tôi
trong suốt quá trình thực hiện khoá luận.
Xuân Hoà, tháng 5 năm 2009
Sinh viên
Bùi Phạm Hoàng Hải

Đại học s phạm H Nội 2

1

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Phạm Hong Hải

Mục lục
Trang

Chơng 1: Phần mở đầu .. 5
Chơng 2: Tổng quan tài liệu ...... 7
2.1. Sơ lợc về xạ khuẩn .................7
2.1.1. Vị trí của xạ khuẩn trong sinh giới ..7
2.1.2. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn .7
2.1.2.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn ..........................................7
2.1.2.2. Cấu tạo xạ khuẩn .......8
2.1.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của xạ khuẩn . 9
2.1.2.4. Đặc điểm của chi xạ khuẩn Streptomyces ..10
2.1.3. Phân bố của xạ khuẩn ........ 11
2.1.4. Vai trò của xạ khuẩn .. 11
2.1.5. Phân loại xạ khuẩn ......... 12
2.1.5.1. Sơ lợc lịch sử phân loại xạ khuẩn .. 12
2.1.5.2. Một số phơng pháp cơ bản trong phân loại xạ khuẩn hiện nay
.. 13
2.1.5.2.1. Dựa vào đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy 13
2.1.5.2.2. Đặc điểm hóa phân loại 14
2.1.5.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa . 15
2.2. Cellulose và Cellulase 16
2.2.1. Cellulose 16
2.2.2. Cellulase .18
Chơng 3: Vật liệu và phơng pháp 19
3.1. Vật liệu ...19

Đại học s phạm H Nội 2

2

K31B Sinh

Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Phạm Hong Hải

3.1.1. Nguyên liệu ..19
3.1.2. Hoá chất ...19
3.1.3. Máy móc và thiết bị nghiên cứu 19
3.1.4. Vi sinh vật kiểm định .. 19
3.2. Phơng pháp nghiên cứu .. 20
3.2.1. Phơng pháp lấy mẫu .. 20
3.2.2. Phơng pháp phân lập và đếm số lợng tế bào 20
3.2.3. Phơng pháp bảo quản và sử dụng giống 21
3.2.4. Phơng pháp quan sát hình thái xạ khuẩn 21
3.2.4.1. Phơng pháp xẻ rãnh thạch .21
3.2.4.2. Phơng pháp khối thạch . 21
3.2.5. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc ... 21
3.2.6. Phơng pháp nghiên cứu các đặc điểm sinh lý, sinh hoá .21
3.2.6.1. Xác định axitamin đặc trng cho thành tế bào .. 22
3.2.6.2. Xác định hoạt tính enzim amylase, protease và cellulase .. 22
3.2.6.3. Xác định khả năng nitrit và nitrat hoá ... 23
3.3. Các môi trờng sử dụng trong nghiên cứu .22
3.3.1. Môi trờng giữ giống xạ khuẩn ........23
3.3.2. Môi trờng nuôi cấy vi sinh vật kiểm định 23
3.3.3. Môi trờng phân lập xạ khuẩn 24
3.3.4. Môi trờng xác định khả năng nitrit và nitrat hoá ..24
3.3.5. Môi trờng nuôi cấy để kiểm tra xạ khuẩn có khả năng phân giải
cellulose .25
Chơng 4: Kết quả và thảo luận ..26
4.1. Kết quả phân lập xạ khuẩn 26

4.2. Đặc điểm hình thái và nuôi cấy của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu

Đại học s phạm H Nội 2

3

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Phạm Hong Hải

..27
4.3. Kiểm tra hoạt tính enzim cellulase cuả xạ khuẩn 29
Chơng 5: Kết luận và kiến nghị ...31
1. Kết luận 31
2. Kiến nghị ......31
Tài liệu tham khảo ..32

Các chữ viết tắt trong khoá luận

HSKS

: Hệ sợi khí sinh

HSCC

: Hệ sợi cơ chất

VSV

: Vi sinh vật

MT

: Môi trờng

Đại học s phạm H Nội 2

4

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Phạm Hong Hải

Chơng 1

Phần mở đầu
Cellulose là thành phần cấu tạo chính của thực vật, nó có tính bền và
đàn hồi rất cao. Chính vì vậy cellulose là một hợp chất rất khó phân giải, điều
này đã gây ra rất nhiều hậu quả rất nghiêm trọng. Mỗi năm cả nớc ta có gần
382.500 tấn vỏ cà phê đợc thải ra, so với các chế phẩm nông nghiệp khác,
chất thải này phân huỷ lâu hơn gây ô nhiễm môi trờng. Cellulose cũng gặp
nhiều trong bã mía, nớc thải công nghiệp, gỗ công nghiệp, công nghiệp dệt và
các chất thải của ngành công nghiệp thực phẩm. Hàng năm công nghiệp chế
biến hoa quả nớc ta thải ra hàng trăm ngàn tấn bã thải. Lợng bã thải này

hiện nay vẫn cha đợc xử lý riêng rẽ mà vẫn đợc đổ chung với nguồn rác
thải vừa gây lãng phí, vừa gây ô nhiễm môi trờng. Nếu lợng bã thải này
đợc xử lý làm thức ăn gia súc hoặc phân bón thì sẽ là một nguồn lợi rất lớn
Vậy làm thế nào để giải quyết các vấn đề trên ?
Ngày nay cùng với sự tiến bộ của khoa học công nghệ đã có rất nhiều
công trình nghiên cứu về việc phân giải cellulose nhằm tận dụng các bã thải
nông nghiệp, công nghiệp một cách triệt để. Và xạ khuẩn trong đất chính là
đối tợng đợc sử dụng để phân giải cellulose có hiệu quả nhất. Các chủng xạ
khuẩn trong đất có khả năng phân giải cellulose rất mạnh, nhằm tạo ra chế
phẩm enzim có hoạt tính phân giải pectin và cellulose. Ngoài ra bằng cách sử
dụng xạ khuẩn trong đất có khả năng phân giải cellulose, các sản phẩm phân
bón vi sinh chất lợng cao đã đợc ra đời từ các phụ phẩm nông nghiệp (bã
mía, vỏ cà phê,). Phân bón vi sinh hữu cơ này có tác dụng làm tăng năng
suất cây trồng, tăng độ phì nhiêu của đất và ức chế nấm bệnh cây trồng.
Thị trấn Xuân Hoà nằm ở thị xã Phúc Yên - Tỉnh Vĩnh Phúc. Nơi đây
có một diện tích đất trồng trọt khá lớn. Trong những khu đất này có một số các

Đại học s phạm H Nội 2

5

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Phạm Hong Hải

chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose rất cao. Để tận dụng khả năng
phân giải cellulose của các chủng xạ khuẩn này chúng tôi đã quyết định chọn

đề tài : Nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose
trong đất trồng trọt khu vực xuân hoà .
Đề tài của tôi nhằm giải quyết các vấn đề sau:
1. Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải
cellulose trong đất trồng trọt khu vực Xuân Hoà.
2. Nghiên cứu đặc điểm hình thái và nuôi cấy của các chủng xạ khuẩn
nghiên cứu.
3. Kiểm tra hoạt tính enzim cellulose của các chủng xạ khuẩn phân lập
đợc.

Đại học s phạm H Nội 2

6

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Phạm Hong Hải

Chơng 2
tổng quan ti liệu

2.1. Sơ lợc về xạ khuẩn:
2.1.1. Vị trí của xạ khuẩn trong hệ thống sinh giới
Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm VSV lớn trong giới Bacteria.
Chúng thuộc nhóm VSV Gram (+). Theo Krassilnikov (1970) xạ khuẩn
(Actinomycetes) đợc tách thành một lớp riêng gồm có xạ khuẩn bậc cao (có
hệ sợi phát triển, có cơ quan sinh sản riêng) và nhóm xạ khuẩn bậc thấp (có hệ

sợi kém phát triển, tế bào có dạng hình que hoặc hình cầu). Xạ khuẩn có hệ sợi
ngắn nh họ Mycobacteriaceae và Actinomycetaceae, hoặc hệ sợi dài nh họ
Streptomycetaceae. Xạ khuẩn đợc Bergey xếp vào bộ riêng Actinomycetales
(Bergeys Manual, 1989) thuộc siêu giới nhân sơ (Prokaryota), Giới Bacteria,
Ngành Firmicutes, Lớp Actinobacteria, Lớp phụ Actinobacteriaceae.
Theo hệ thống phân loại hiện nay, xạ khuẩn thuộc nhóm vi sinh vật nhân
nguyên thuỷ (Prokaryota) thuộc giới khởi sinh (Monera) trong hệ thống phân
loại 5 giới hay trong hệ thống phân loại 7 giới thì xạ khuẩn thuộc giới vi khuẩn
chuẩn (Eubacteria) thuộc siêu giới nhân sơ.
Bộ xạ khuẩn gồm 10 họ: Actinomycetaceae, Actinoplanaceae,
Permatophilaceae,

Frankiaceae,

Micromonosporaceae,

Thermomonosporaceae,

Micobacteriaceae,

Nocarddiceae

và

Streptomycetaceae.
2.1.2. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn
2.1.2.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn
Tuỳ loại môi trờng mà xạ khuẩn có hình thái khác nhau. Trên môi
trờng đặc, xạ khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc. Tuỳ theo loài, môi
trờng nuôi cấy mà kích thớc màu sắc khuẩn lạc có thể khác nhau nh đỏ, da

Đại học s phạm H Nội 2

7

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Phạm Hong Hải

cam, vàng, nâu, tím, hồng, xám, khuẩn lạc xạ khuẩn thờng chắc, xù xì, có
dạng da, dạng nhung tơ, hay dạng màng dẻo và thờng có cấu trúc ba lớp: lớp
ngoài có cấu trúc các sợi bền chặt, lớp giữa có cấu trúc tổ ong và lớp trong có
cấu trúc tơng đối xốp. Cấu trúc khuẩn lạc xạ khuẩn với hớng sinh trởng
trong môi trờng tạo ra hệ sợi cơ chất (HSCC) và ngoài mặt môi trờng tạo ra
hệ sợi khí sinh (HSKS). Đờng kính hệ sợi xạ khuẩn thay đổi trong khoảng 0,2
- 1,0 m đến 2,0 - 3,0 m. Đa số các xạ khuẩn có hệ sợi phân nhánh mạnh,
không có vách ngăn. Màu sắc hệ sợi đa dạng, có thể gặp các màu trắng, vàng,
da cam, đỏ, nâu, lục, tím, đen, HSCC có thể sinh ra các sắc tố tan trong nớc
hoặc trong các dung môi hữu cơ. HSKS ở tận cùng thờng là các chuỗi bào tử
có dạng xoắn, lợn sóng, thẳng, vòng, Đây là một đặc điểm khá quan trọng
để phân loại xạ khuẩn. Các bào tử xạ khuẩn có thể có hình tròn, hình bầu dục,
hình que, hay hình trụ, cấu trúc bề mặt bào tử có thể là nhẵn (Smooth), có
gai (Spinny), khối u (Warty), nếp nhăn (Rugose) hay dạng tóc (Hair-like),
hình dạng, kích thớc, cấu trúc bề mặt bào tử cũng là một trong những chỉ tiêu
quan trọng để định loại xạ khuẩn.
Khi nuôi cấy xạ khuẩn trong môi trờng dịch thể, xạ khuẩn có thể mọc
thành dạng màng hay dạng vòng trên thành bình nuôi cấy, trên bề mặt môi
trờng hay thành dạng bọt hoặc kết tủa kiểu vi khuẩn. Khi nuôi cấy chìm trên

máy lắc hoặc nồi lên men đợc khuấy đảo thì xạ khuẩn phát triển thành dạng
sợi bông hoặc cặn xốp. Nhng thờng gặp hơn cả là xạ khuẩn phát triển thành
những quả cầu nhỏ chứa đầy môi trờng, kích thớc từ 0,1mm đến 2 - 3mm.
2.1.2.2. Cấu tạo xạ khuẩn
Xạ khuẩn có cấu tạo tơng đối giống vi khuẩn gồm có thành tế bào,
màng tế bào chất, vật chất nhân sơ và các hạt dự chữ. Xạ khuẩn thuộc nhóm
VSV Gram (+). Thành tế bào dày khoảng 20 nm có vai trò duy trì hình dạng hệ
sợi và bảo vệ tế bào. Thành đợc cấu tạo chủ yếu gồm các lớp Glucopeptide

Đại học s phạm H Nội 2

8

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Phạm Hong Hải

gồm các gốc N-Acetylglucosamine liên kết với N - Acetylmuramic (hoặc N Glycolylmuramic ví dụ nh chi Micromonospora).
Căn cứ vào kết cấu hoá học có thể chia thành tế bào xạ khuẩn thành 4
nhóm sau:
Nhóm 1 (TypeI): có chứa L - Diaminopimelic (L - ADP) và glycine.
Gồm có các chi Streptomyces, Streptoverticillium, Chairia, Nocardioider.
Nhóm 2 (TypeII): Có chứa Meso - Diaminopimelic (Meso - ADP) và
glycine. Gồm các chi Micromospora, Actinoplans, Ampullariella,
Dactilosporangium.
Nhóm 3 (TypeIII): Có chứa Meso - Diaminopimelic (Meso - DAP).
Gồm có Actinomadura, Actinobigfida, Dermatophilus, Geodermatophilus,

Nocardiopsis, Micronobispora,
Nhóm 4 (Type IV): Có chứa Meso - Diaminopimelic (Meso - DAP).
Gồm có Nocardia, Oerskovia, Promicromonospora, Pseudonocardia,
Rhodococcus, Mycrobacterium,
2.1.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của xạ khuẩn
Xạ khuẩn là một nhóm cơ thể dị dỡng, chúng sử dụng đờng, rợu,
axít hữu cơ, lipit, prôtêin và nhiều hợp chất khác để làm nguồn cacbon. Còn
nitrat, nitrit, muối amôn, urê, axit amin, pepton, cao men, cao thịt, để làm
nguồn nitơ. ở các loài khác nhau thì khả năng hấp thụ các hợp chất này là
khác nhau.
Phần lớn xạ khuẩn là VSV hiếu khí, a ẩm, nhiệt độ thích hợp cho sinh
trởng và phát triển là 25 - 300C. Đa số xạ khuẩn phát triển tốt trong môi
trờng có PH là 6,8 - 7, một số ít có khả năng phát triển tốt trong môi trờng
kiềm.
Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn Gram (+), đặc biệt khác với các sinh vật
khác của nhóm nhân sơ là có tỉ lệ G+X cao (>70%), trong khi đó vi khuẩn khá
thấp (25 - 45 %).
Đại học s phạm H Nội 2

9

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Phạm Hong Hải

Một trong những đặc điểm đáng lu tâm của xạ khuẩn là chúng không
bền vững về mặt di truyền và thờng xảy ra sự sắp xếp lại trong phân tử ADN.

Điều này đã gây ra tính đa dạng của hình thái, tính chất sinh lí, sinh hoá của xạ
khuẩn (khả năng đồng hoá các nguồn cacbon, khả năng đồng hoá các nguồn
nitơ, hoạt tính kháng sinh, tính kháng thuốc, khả năng phân giải cellulose,).
2.1.2.4. Đặc điểm của chi xạ khuẩn Streptomyces
Chi Streptomyces có số lợng loài mô tả lớn nhất, chi này có HSKS, HSCC
phát triển và phân nhánh, khuẩn lạc thờng không lớn, đờng kính khuẩn lạc
từ 1-5 mm. Khuẩn lạc chắc dạng da, mọc đâm sâu vào cơ chất, bề mặt khuẩn
lạc thờng đợc phủ bởi HSKS dạng nhung, dày hơn HSCC và đôi khi không
thấm nớc. Chuỗi bào tử đợc tạo thành trên cuống sinh bào tử, chúng có thể
thẳng, lợn sóng hoặc xoắn. Bề mặt bào tử có thể nhẵn, xù xì, có lông hoặc có
gai. Xạ khuẩn có khả năng tạo thành các loại sắc tố khác nhau, sắc tố này có
thể nhuộm màu HSKS, HSCC, đôi khi nhuộm màu môi trờng.
Các loài thuộc chi Streptomyces có cấu tạo thành giống thành của vi khuẩn
Gram dơng, là vi sinh vật hiếu khí, kị dỡng. Nhiệt độ sinh trởng tối u là từ
25-30 0C, pH tối u : 6,5-8,0. Một số loài có thể sinh trởng ở nhiệt độ cao hơn
hoặc thấp hơn (xạ khuẩn a nhiệt và xạ khuẩn a lạnh). Bên cạnh các đặc điểm
hình thái, nuôi cấy trên thì xạ khuẩn thuộc chi này còn có những đặc điểm hoá
phân loại sau:
Type thành tế bào: Type I dạng LL-DAP và glixin.
Type Peptidoglucan: A3.
Axit béo: Mạch thẳng bão hoà, đồng phân nhánh 15-17C với số lợng ít và
số lợng lớn các axit phân nhánh 16 Ciso và 15-17 Canteiso.
Dạng menaquinon: MK-9 (H6), hoặc MK-9 (H9).
Dạng photpholipit: PII.
Không có axit mycolic.

Đại học s phạm H Nội 2

10

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Phạm Hong Hải

2.1.3. Phân bố của xạ khuẩn
Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Xạ khuẩn
có thể phân lập từ đất , nớc, không khí, bùn, rác Đặc biệt trong đất xạ
khuẩn chiếm số lợng rất lớn (Kuster, 1986).
Theo Waksman thì trong đất xạ khuẩn chiếm 9 % - 45 % tổng số các
VSV. Và trong một gam đất có chứa tới 29000 - 24.000.000 mầm xạ khuẩn.
Tuy nhiên tuỳ các vùng đất khác nhau trên thế giới mà có sự biến đổi
lớn về số lợng xạ khuẩn trong đất. Số lợng xạ khuẩn ở miền Nam bán cầu
bao giờ cũng cao hơn miền Bắc bán cầu. Ngoài ra số lợng xạ khuẩn trong đất
còn phụ thuộc vào mức độ canh tác, độ phì nhiêu của đất, mức độ che phủ của
thực vật, Đất giàu dinh dỡng, hữu cơ , khoáng thì có nhiều xạ khuẩn hơn
so với đất nghèo dinh dỡng. Trong một gam đất canh tác có thể phân lập đợc
5.000.000 CFU/g xạ khuẩn. Đất vùng sa mạc khô nóng, nghèo dinh dỡng có
số lợng xạ khuẩn ít hơn, dao động trong khoảng 10.000 - 100.000 CFU/g.
Xạ khuẩn là nhóm VSV a trung tính hay kiềm yếu, do đó sự phân bố
của xạ khuẩn trong đất còn phụ thuộc vào độ PH của đất. ở các đất có độ PH
trung tính hoặc hơi kiềm thì có mật độ xạ khuẩn cao hơn so với các vùng đất
có độ PH quá kiềm hoặc quá axit (chua).
Đồng thời số lợng xạ khuẩn còn phụ thuộc vào các thời điểm trong
năm. Do đó khi lấy mẫu đất nghiên cứu cần phải chú ý tới các điều kiện nh
thành phần lớp đất, sinh cảnh, thời điểm lấy mẫu, độ ẩm, nhiệt độ,
2.1.4. Vai trò của xạ khuẩn
Xạ khuẩn là một trong nhiều loại VSV có ý nghĩa quan trọng trong tự

nhiên bởi vai trò tích cực trong việc tham gia vào các quá trình chuyển hoá
những hợp chất trong đất, nớc.
Xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh, có 60% - 70% xạ khuẩn
phân lập từ đất có khả năng này nh: Atinoplanes, Streptoverticinnium,

Đại học s phạm H Nội 2

11

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Phạm Hong Hải

Streptomyces, các chất kháng sinh có giá trị do chúng sinh ra đợc sử dụng
rộng rãi trong y học.
Xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose trong bã sắn phế thải nhằm
ứng dụng trong chế biến thức ăn gia súc, phân bón hữu cơ.
2.1.5. Phân loại xạ khuẩn
2.1.5.1. Sơ lợc lịch sử phân loại xạ khuẩn
Trớc thế kỉ XIX, ngời ta xếp xạ khuẩn vào giới nấm (Fungi). Về sau,
các nghiên cứu cho thấy chúng có nhân nguyên thuỷ, kích thớc bề ngang nhỏ
nh vi khuẩn nên ngời ta xếp vào giới vi khuẩn (Eubacteria).
Foster là ngời đầu tiên phân lập một loài xạ khuẩn từ tuyến mắt của
ngời và đợc John miêu tả năm 1874. Và đến năm 1977, Harz mô tả đầu tiên
một loài xạ khuẩn có hệ sợi rất điển hình, đựợc phân lập từ bệnh nấm sao
của trâu bò và đặt tên là Actinomyces bovis.
Đến năm 1914, Krainski lần đầu tiên đề ra các chỉ tiêu mới trong việc

phân biệt các loài khác nhau và sơ bộ phân loại 17 chủng thuộc chi
Actinomyces. Ông coi các đặc điểm sinh lý là mấu chốt trong nguyên tắc phân
loại.
Waksman và Curtis (1979) đã đề cập đến các dạng trung gian trong mô
tả phân loại của mình. Các ông coi đặc điểm hình thái của bào tử là đặc tính
quan trọng nhất của các cơ thể.
Năm 1926, Millard và Burr đã tìm ra 17 loài mới, Jensen (1930-1931)
tìm ra đợc 2 loài mới. Đến năm 1934, Dutche tìm ra 13 loài mới.
Baldacci và cộng sự nghiên cứu xạ khuẩn từ năm 1936- 1953 công bố
một khoá phân loại chi Streptomyces dựa trên cơ sở HSKS, HSCC và một số
đặc điểm trung gian khác.
Waksman và Henrici (1953) đã đa ra một hệ thống phân loại, đến năm
1961 đợc sửa đổi lại. Trong hệ thống phân loại này, xạ khuẩn đựơc xếp thành

Đại học s phạm H Nội 2

12

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Phạm Hong Hải

nhóm gồm 3 họ, chia nhỏ thành 10 chi và mô tả chi tiết hơn 250 loài thuộc chi
Streptomyces.
Krassinilcov từ năm 1941 - 1949 đã phát hiện trên 38 loài mới. Năm
1970, ông công bố hệ thống phân loại nấm tia mới dựa vào hệ thống công bố
năm 1949, trong đó xạ khuẩn đợc phân thành 6 họ gồm 26 chi.

Năm 1957, Gause và cộng sự đã công bố hệ thống phân loại mới. Hệ
thống phân loại mới này dựa vào màu sắc HSKS, HSCC, hình dạng màng bào
tử và cuống sinh bào tử. Hệ thống này đợc chỉnh lý và tái bản năm 1983.
Càng ngày, số lợng hệ thống phân loại xạ khuẩn càng nhiều nh hệ
thống phân loại của Prihan (1972), Nonomura (1972) và đáng chú ý hơn là hệ
thống phân loại của Goodfellow Stackebradt (1988).
Để thống nhất trong cách mô tả, ISP (Iternational Streptomyces Project)
đã nêu lên các phơng pháp, môi trờng mô tả (Shirling và Gottlieb, 1966).
2.1.5.2. Một số phơng pháp cơ bản trong phân loại xạ khuẩn hiện nay
2.1.5.2.1. Dựa vào đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy
Hầu hết các chi xạ khuẩn đợc mô tả hiện nay phân chia khác nhau tuỳ
thuộc vào sự khác nhau về đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy nh: màu
sắc của HSKS, HSCC và màu sắc của sắc tố tan, hình dạng cuống sinh bào tử,
hình dạng và kết cấu bề mặt bào tử,
Dựa vào các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy ngời ta chia xạ
khuẩn thành 4 nhóm chính sau:
Nhóm 1: Gồm các xạ khuẩn có bào tử rõ rệt. Đặc trng của nhóm này là
sinh sản bằng bào tử, có hệ sợi phân nhánh thành HSKS và HSCC.
Nhóm 2: Gồm các xạ khuẩn có các bào tử nang. Đặc trng của nhóm này là
hệ sợi phân chia theo hớng vuông góc với nhau tạo thành các cấu trúc tơng
tự nang bào tử.
Nhóm 3: Gồm các xạ khuẩn có dạng Nocardia. Đặc trng của nhóm này là
sinh sản bằng cách phân đốt hệ sợi.

Đại học s phạm H Nội 2

13

K31B Sinh

Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Phạm Hong Hải

Nhóm 4: Gồm các xạ khuẩn có dạng tơng tự Corynebacterium và dạng
hình cầu. Tế bào có hình chữ V, T hoặc dạng cầu, thờng không có hệ sợi.
Theo tài liệu của ISP đợc nêu lên bởi Shirling và Gottlieb (1968, 1969
và 1972) và trong cuốn Bergeys Manual đợc xuất bản lần thứ 8, ngời ta
chia xạ khuẩn thành 6 kiểu (Section) căn cứ vào hình dạng cuống sinh bào tử:
Section S: Type Spira = chuỗi bào tử xoắn.
Section SRA: Type Spira Retinaculum Apertum = Chuỗi bào tử xoắn có
khoá, có móc.
Section SRF: Type Spira Rectus Flexbilis = Chuỗi bào tử xoắn, cong đến
thẳng.
Section RA: Type Retinaculum Apertum = Chuỗi bào tử có móc, có khoá.
Section RARF: Type Retinaculum Apertum Rectus Flexbilis = Chuỗi bào
tử có khoá, thẳng, lợn sóng.
Section RF : Type Rectus Flexbilis = Chuỗi bào tử thẳng đến lợn sóng.
Trớc đây, các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy đợc coi là dữ
liệu cơ bản dùng trong phân loại xạ khuẩn nhng do chính cùng một loài có
thể biểu hiện khác nhau về mặt hình thái do biến dị tự nhiên hay những loài
khác nhau có thể giống nhau về mặt hình thái. Vì vậy ngày nay trong phân loại
xạ khuẩn phải dùng thêm các chỉ tiêu bổ sung khác nh : Đặc điểm sinh lí,
sinh hoá, miễn dịch học, sinh học phân tử.
2.1.5.2.2. Đặc điểm hoá phân loại
Trong 20 năm trở lại đây việc sử dụng các thông tin về thành phần hoá
học của tế bào đã đợc ứng dụng rộng rãi để phân loại Procaryota hoá phân
loại.
Hoá phân loại chủ yếu dựa vào các đặc điểm sau:

Type thành tế bào: Dựa trên cơ sở phân tích axit amin trong thành
phần dây nối peptit, đờng trong thành tế bào hay các polysaccarit gắn vào
thành tế bào.

Đại học s phạm H Nội 2

14

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Phạm Hong Hải

Type Peptidoglucan (PG).
Axit mycolic.
Axit béo.
Menaquynon.
Type phospholipit.
Trong các đặc điểm trên, type thành tế bào là đặc điểm quan trọng nhất
trong phân loại xạ khuẩn. Theo hớng phân loại sinh hoá, ngời ta chia thành
tế bào xạ khuẩn thành 4 type sau:
Type 1: Thành tế bào có LL - DAP và glixerin.
Type 2: Thành tế bào có m - DAP và glixerin.
Type 3: Thành tế bào có m - DAP.
Type 4: Thành tế bào có m DAP, đờng arabinose, galactose.
2.1.5.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá
Khi phân loại xạ khuẩn đến loài, ngời ta sử dụng hàng loạt các đặc
điểm sinh lý, sinh hoá nh: khả năng sử dụng nguồn C và N, nhu cầu về nhân

tố sinh trởng, khả năng sinh các enzim dezoxyribonuclease, nitrat reductase,
phosphatase, catalase, amylase, protase, cellulase,; nhu cầu về ôxi, PH, nhiệt
độ tối u, khả năng chịu mặn, khả năng sinh chất kháng sinh,
Tuy nhiên, theo Hopwood và cộng sự (1975) thì hầu hết các đặc điểm
sinh lý, sinh hoá rất dễ biến dị do mức độ ổn định di truyền không cao. Vì vậy,
ngày nay để phát hiện những loài mới trên cơ sở khác nhau về đặc điểm sinh
lý, sinh hoá, ngời ta cũng sử dụng các phơng pháp nh: phơng pháp phân
loại số dựa trên sự giống nhau giữa các VSV theo một số lớn các đặc điểm,
chủ yếu là các đặc điểm hình thái, sinh lí hoá sinh; phơng pháp nghiên cứu
chủng loại phát sinh và phơng pháp sinh học phân tử nh lai axit nucleic
ADN và ARN, protein và đặc biệt là so sánh trình tự ARN 16S;
Phân loại số:

Đại học s phạm H Nội 2

15

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Phạm Hong Hải

Phơng pháp này dựa trên sự đánh giá về mức độ giống nhau giữa VSV
trong một số lớn các đặc điểm chủ yếu là đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh
hoá để so sánh các chủng với nhau từng đôi một theo công thức sau:
SAB= S*100/(nS +nd)
Trong đó:
SAB: Mức độ giống nhau giữa hai cá thể.

nS: Tổng số các đặc điểm dơng tính của hai chủng so sánh.
nd: Tổng các đặc điểm dơng tính của chủng này mà âm tính của chủng kia.
Kết quả của sự so sánh này đợc biểu hiện trên sơ đồ nhánh và tuỳ thuộc
vào mức độ giống nhau mà các VSV đợc xếp vào các nhóm.
Nghiên cứu về phát sinh chủng loại:
Nhờ sự sắp xếp phát sinh chủng loại mà các VSV đợc xếp vào hệ
thống vào hệ thống phân loại gần tự nhiên hơn.
Các nghiên cứu về di truyền phân tử nhằm xây dựng cây phát sinh
chủng loại bằng cách tiến hành so sánh các cao phân tử ADN, ARN, protein
mà quan trọng hơn cả là sự sắp xếp các nucleotit của rARN 16S. Mức độ giống
nhau giữa hai cá thể so sánh thể hiện mối quan hệ giữa chúng.
2.2. Cellulose và Cellulase
2.2.1. Cellulose
Cellulose là một polysaccarit mạch thẳng gồm từ 1400 - 12000 gốc -Dglucose liên kết với nhau bởi các liên kết -1,4-glucozit. Trong phân tử
Cellulose các phân tử -D-glucose có cấu trúc không gian dạng ghế bành. Hai
phân tử khác nhau quay góc với nhau 1800. Cellulose là loại hợp chất hữu cơ
dồi dào trong tự nhiên chiếm tới 40-50% hyđratcacbon.
Cellulose có cấu trúc dạng sợi song song, dài khoảng 5m với đờng
kính 3nm. Các sợi này liên kết với nhau bởi các liên kết hyđro và các liên kết
Vandervan tạo thành các bó sợi nhỏ có đờng kính 10-40nm gọi là vi sợi

Đại học s phạm H Nội 2

16

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Phạm Hong Hải

(microfibrin). Các vi sợi có cấu trúc không đồng nhất tạo nên cấu trúc mixen
của Cellulose. Cellulose dạng mixen gồm hai vùng:
Vùng kết tinh (Crystolline regions) : Có các sợi chặt chẽ, đậm đặc ngăn
cản sự hấp thụ nớc và ít chịu tác động phân giải. Vùng này chiếm 3/4 cấu
trúc Cellulose.
Vùng vô định hình (Amorphous regions) : Có cấu trúc kém chặt chẽ, dễ bị
trơng lên và dễ bị phân giải.
Trong tự nhiên Cellulose khá bền vững, không tan và bị trơng lên khi
hấp thụ nớc. Cellulose bị thuỷ phân khi đun nóng với axit hay kiềm ở
nồng độ khá cao, hoặc bị phân giải bởi các Cellulase sinh ra từ nhiều loại
sinh vật.

Hình 2: Cấu trúc không gian
lập thể của cellulose

Hình 1:Mô hình cấu trúc không
gian lập thể của cellulose

Đại học s phạm H Nội 2

17

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Phạm Hong Hải

2.2.2. Cellulase
Enzim cellulase xúc tác cho quá trình chuyển hoá cellulose thành các
sản phẩm hoà tan, dễ sử dụng (hấp thu). Hệ thống cellulase bao gồm ba loại
chính sau:
Endo--glucanase

hay

1,4--D-glucan

glucan

hydrolase,

cellobiohydrolase (CBH), CMC-ase (Cx): Enzim này tấn công vào các
điểm khác nhau trên chuỗi cellulose của CMC, cellulose trơng phồng,
các cello-oligosaccarit. Chúng phân cắt các chuỗi cellulose một cách
ngẫu nhiên, sản phẩm tạo thành là glucose và các oligosacarit (có thể từ
3-6 C hoặc nhiều hơn). Sự phân cắt này hình thành các đầu khử tự do,
tạo điều kiện cho exo glucanase hoạt động. Bởi vậy cellulose vùng kết
tinh đợc phân giải triệt để, hiệu quả.
Exo--glucanase hay 1,4--D- glucan cellobio hydrolase, Avicelase:
Enzim này tấn công vào đầu không khử (non-reducing end) của
cellulose và kết quả là tạo ra các cellobiose.
-glucosidase hay cellobiose: Thuỷ phân cellobiose và một vài cellooligosaccarit thành glucose. Hoạt tính của -glucosidase mạnh nhất trên
cellobiose và giảm dần theo chiều dài của chuỗi.

Đại học s phạm H Nội 2

18

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Phạm Hong Hải

Chơng 3
vật liệu và phơng pháp
3.1. Vật liệu
31.1. Nguyên liệu:
Các mẫu đất lấy từ đất trồng trọt thuộc khu vực Xuân Hoà - Thị xã Phúc
Yên - Tỉnh Vĩnh Phúc.
3.1.2. Hoá chất
Các hoá chất: KH2P04, MgSO4. 7H20, NH4Cl, KN03, NaN03,
(NH4)2SO4, NH4NO3, NaCl, NaOH, HCl, FeSO4. 7H20, CaC03,
Tinh bột tan, cao nấm men, pepton, thạch, Cazein, CMC (Cacboxyl
Methyl Cellulose), cao thịt,
3.1.3. Máy móc và thiết bị nghiên cứu
- Tủ ấm vi sinh (Heaeus - Đức).
- Tủ sấy (Heaeus - Đức).
- Nồi hấp (TOMY Nhật).
- Máy li tâm (Shorwall super T21 Mỹ).
- Máy đo PH (MP200R Thụy Sĩ).
- Cân điện tử (Precisa XT 320M Thụy Sĩ).
- Giấy sắc kí loại chạy chậm của hãng Whatsman.
- Kính hiển vi quang học
3.1.4. Vi sinh vật kiểm định

Các chủng vi sinh vật kiểm định (VSVKĐ):
Vi khuẩn (VK): Bacillus subtilis, Escherichia coli, Salmonella typhimurium.
Staphylococcus aureus.
Nấm:
Nấm men: Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae.
Nấm mốc: Aspergillus niger, Fusarium oxysporum, Mucor sp,
Penicillium sp.
Đại học s phạm H Nội 2

19

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Phạm Hong Hải

3.2. Phơng pháp nghiên cứu
3.2.1. Phơng pháp lấy mẫu
Mẫu đất đợc lấy ngẫu nhiên tại các vị trí khác nhau. Lấy mẫu đất tại
các lớp đất mặt (0,1 - 0,2cm) và đất sâu (10 cm).
Dùng dụng cụ vô trùng lấy mẫu đất ở các lớp đất mặt (0,1 0,2cm) và
đất sâu (10 cm) tại các vị trí ngẫu nhiên. Đựng các mẫu đất vào các túi nilon
vô trùng, buộc kín miệng túi, đánh số, ghi độ sâu lấy mẫu... sau đó các mẫu
đất đợc bảo quản, vận chuyển về phòng thí nghiệm để tiến hành phân lập.
3.2.2. Phơng pháp phân lập và đếm số lợng tế bào
Dùng dụng cụ vô trùng lấy 1gam đất cho vào bình nớc muối sinh lý vô
trùng 99 ml, lắc đều, pha loãng ở 102 lần. Tiếp tục hút 1ml dịch huyền phù cho
vào ống nghiệm chứa 9ml nớc muối sinh lí vô trùng, lắc đều, pha loãng ở 103

lần.
Dùng pipet vô trùng hút 0,2 ml dịch huyền phù ở độ pha loãng 103 lần
nhỏ lên bề mặt môi trờng Gause I, Czapek tinh bột tan, đã chuẩn bị trong
các hộp petri. Trang đều dịch đất lên mặt môi trờng, nuôi trong tủ ấm 280C300C. Sau 7 - 14 ngày mang các hộp petri ra quan sát, đếm số lợng khuẩn lạc
xạ khuẩn.
Từ đó tính số lợng xạ khuẩn trong 1gam đất theo công thức:

M = ( X + 2X ) ì b / V (CFU )
Trong đó :
M : Tổng số xạ khuẩn trong 1gam đất.

X : Số khuẩn lạc mọc lên từ độ pha loãng này

2X : Độ lệch bình phơng trung bình.
b: Độ pha loãng nuôi cấy.
V: Thể tích dịch huyền phù dùng để phân lập.
CFU: Đơn vị hình thành khuẩn lạc (Colony Forming Unit).

Đại học s phạm H Nội 2

20

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Phạm Hong Hải

3.2.3.Phơng pháp bảo quản và sử dụng giống

Dùng que cấy vô trùng tách xạ khuẩn từ các khuẩn lạc riêng rẽ sang các
ống môi trờng thạch nghiêng Gause I đã chuẩn bị sẵn. Sau 7 - 14 ngày nuôi
cấy, lấy ra kiểm tra và loại bỏ những ống nhiễm sau khi đã tách loại xạ khuẩn
sang các ống khác, cuối cùng thu đợc các ống giống thuần.
Các ống giống thuần đợc bảo quản ở tủ lạnh 2 40C. Cấy truyền định
kì 1 tháng một lần. Trớc khi tiến hành nghiên cứu các đặc điểm sinh lý - hoá
sinh cần phải hoạt hoá các chủng xạ khuẩn và cấy truyền giữ giống.
3.2.4. Phơng pháp quan sát hình thái xạ khuẩn
3.2.4.1. Phơng pháp xẻ rnh thạch
Cấy xạ khuẩn lên môi trờng dinh dỡng trong hộp petri bằng cách trải
dày bằng que trang. Dùng dao vô trùng xẻ một rãnh thạch trong hộp petri. Đặt
một hoặc hai lá kính vô trùng lên bờ của rãnh thạch vừa xẻ, đậy nắp hộp petri
để vào tủ ấm 280 300C trong 7 14 ngày. Lấy ra quan sát và chụp ảnh cuống
sinh bào tử, hệ sợi dới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 -1000 lần.
3.2.4.2. Phơng pháp khối thạch
Đổ môi trờng Gause I vô trùng vào hộp petri sao cho thành một lớp
mỏng (1 - 1,5mm). Đổ khô môi trờng, dùng khoan nút chai ( = 0,9mm)
khoan các khối thạch. Đặt các khối thạch lên lam kính vô trùng đã chuẩn bị
sẵn, đặt trong hộp petri vô trùng (trong mỗi hộp petri có một cục bông ẩm).
Cấy xạ khuẩn lên khối thạch. Đặt vào tủ ấm 280 - 300C trong 7 - 14
ngày. Quan sát hệ sợi và cuống sinh bào tử dới kính hiển vi quang học ở độ
phóng đại 400 1000 lần.
3.2.5. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc
Nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trờng Gause I thạch đĩa hoặc thạch
nghiêng. Quan sát hình thái và mô tả màu sắc khuẩn lạc xạ khuẩn theo thang
màu chuẩn của Bondarsev (1954), qua đó sơ bộ phân nhóm xạ khuẩn.
3.2.6. Phơng pháp nghiên cứu các đặc điểm sinh lí, sinh hoá

Đại học s phạm H Nội 2

21

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Phạm Hong Hải

3.2.6.1. Xác định axit amin đặc trng cho thành tế bào
Nuôi cấy xạ khuẩn trong môi trờng dịch thể Gause I và Gause II, trong
7 ngày ở nhiệt độ 280 -300C trên máy lắc với tốc độ 200 - 220 vòng/phút. Li
tâm thu sinh khối và sấy khô trong 2 giờ ở nhiệt độ 400C. Rửa sạch sinh khối
bằng nớc cất và cồn rồi làm khô ở nhiệt độ 280 C.
Cân 10 mg sinh khối sấy khô, bổ sung 1ml dung dịch HCl 1N nút kín và
thuỷ phân ở nhiệt độ 600C trong vòng 4 giờ.
Dịch đợc đun cách thuỷ để loại HCl và bổ sung thêm nớc cất đến khi
PH đạt tới 5,6 6,0.
Chấm 20 m dịch lên giấy sắc kí chạy trong hệ dung môi mêtanol: H20:
HCl 6N: Pirimidin = 40:13:2:5 trong 17giờ. Để giấy khô tự nhiên và hiện hình
bằng dung dịch ninhydrin 0,5% trong aceton, sấy khô ở 800C.
Dạng LL - DAP có vệt màu vàng chanh còn dạng m - DAP có vệt màu
xanh lá cây và chạy chậm hơn LL - DAP.
3.2.6.2. Xác định hoạt tính enzim amylase, protease và cellulase
Cấy chấm điểm xạ khuẩn trên môi trờng thạch đĩa có các cơ chất tơng
ứng. Sau 7 ngày thử hoạt tính enzim bằng thuốc thử đặc trng và đo vòng phân
giải (D-d,mm) với D: vòng phân giải cơ chất, d: đờng kính xạ khuẩn.
Xác đinh hoạt tính enzim protease bằng môi trờng thạch chứa 1% tinh
bột tan hoặc tinh bột sắn. Thuốc thử lugol.
Xác định hoạt tính enzim protease bằng môi trờng chứa 5% bột sữa

tách bơ.
* Môi trờng thử hoạt tính protease:
Lấy 500ml H20 bổ sung 18g thạch, hấp ở 1210C trong 30phút (1).
Lấy 500ml H20 hoà tan với 5g bột sữa, hấp ở 800C lần 1 để nguội rồi
hấp 800C lần 2, để nguội đến 400C (2).
Sau khi hấp xong (1) và (2), đổ (1) vào (2) để loại phần vẩn đục ra, lắc
tan và đổ môi trờng bình thờng.

Đại học s phạm H Nội 2

22

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Phạm Hong Hải

Xác định hoạt tính enzim cellulose bằng môi trờng chứa 0,5% bột giấy
và CMC, thử bằng thuốc thử lugol.
3.2.6.3. Xác định khả năng nitrit và nitrat hoá
Nuôi cấy xạ khuẩn trong ống nghiệm chứa môi trờng lỏng Gause I với
KNO3 thay bằng (NH4)2SO4 (thử hoạt tính nitrit hoá) và KNO2 (thử hoạt tính
nitrat hoá).
Cho 1 2 giọt dịch nuôi cấy vào bản sứ lõm, thêm vào đó 1 giọt thuốc
thử Griss I và 1 giọt Griss II. Khi có mặt muối nitrit dịch có màu đỏ còn khi
môi trờng chỉ có mặt nitrat thì dịch có màu trắng.
3.3. Các môi trờng sử dụng trong nghiên cứu
3.3.1. Môi trờng giữ giống xạ khuẩn

Môi trờng (MT) Gause I:
Tinh bột tan: 20g

FeSO4: 0,01g

K2HPO4: 0,5g

Thạch: 20g

MgSO4: 0,5g

Nớc cất: 1lit

KNO3: 0,5g

PH: 6.5

MT Gause II:
Cao thịt: 3g

Thạch: 20g

Pepton: 5g

Nớc cất: 1lit

Glucose: 10g

PH : 6,5

3.3.2. Môi trờng nuôi cấy vi sinh vật kiểm định
MT nuôi cấy vi khuẩn: MT MPA
Cao thịt: 5g

Thạch: 20g

Pepton: 5g

Nớc cất: 1lit

NaCl: 5g

PH : 6,5

MT nuôi cấy nấm mốc:
Saccharose: 30g

MgSO4: 0,5g

NaNO3: 3g

FeSO4: 0,01g

Đại học s phạm H Nội 2

23

K31B Sinh

Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Phạm Hong Hải

KH2PO4: 0,5g

Thạch: 20g

KCl: 0,5g

Nớc cất: 1lít

MT nuôi cấy nấm men: MT Hanxen
Glucose: 5g

Thạch: 12-20g

Pepton: 5g

Nớc cất: 1lít

KH2PO4: 3g

PH: 6,5

MgSO4.7H2O: 2g
3.3.3. Môi trờng phân lập xạ khuẩn
MT Czapeck-tinh bột:
Tinh bột tan: 20g

CaCO3: 3g

KCl: 0.5g

FeSO4.7H2O: 0.01g

MgSO4.7H2O: 0.5g

Thạch: 20g

NaNO3: 3g

Nớc cất: 1lít

K2HPO4: 1g

PH: 6.5

MT Czapeck-glucose:
Glucose: 30g

FeSO4.7H2O: 0.01g

KCl: 0.5g

Thạch: 20g

CaCO3: 3g

Nớc cất: 1lít

MgSO4.7H2O: 0.5g

PH: 7.0

NaNO3: 3g
K2HPO4: 1g
Nguồn cacbon: Glucose, saccharose, innositol, malnitol, malnose, maltose,
lactose, cellulose. Thanh trùng bằng đèn cực tím trong 30 phút hoặc lọc qua
phễu lọc vi khuẩn rồi bổ sung vào môi trờng lúc còn nóng.
3.3.4. Môi trờng xác định khả năng nitrit và nitrat hoá
MT nitrit hoá:
(NH4)2SO4: 2g

FeSO4: 0.1g

K2HPO4: 1g

CaCO3: 1g

Đại học s phạm H Nội 2

24

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Phạm Hong Hải

MgSO4.7H2O: 0.5g

Nớc cất: 1 lít

NaCl: 2g

Glucose: 20g

MT nitrat hoá:
NaNO2: 1g

FeSO4: 0.1g

K2HPO4: 0.5g

NaCO3: 1g

MgSO4.7H2O: 0.3g

Nớc cất: 1 lít

NaCl: 0.2g

Glucose: 20g

3.3.5. Môi trờng nuôi cấy để kiểm tra xạ khuẩn có khả năng phân giải
cellulose
Môi trờng 1:
Pepton: 5g

Nớc cất: 1000ml

Cao thịt bò: 3g

PH: 6.8-7.0

NaCl: 5g
Thạch: 20g
Môi trờng 2:
Glucoza: 1g

Nớc chiết đất: 100ml

K2HPO4: 0.5g

Nớc cất: 900ml

Thạch: 20g

PH: 6.5-7.0

(Chuẩn bị nớc chiết đất:
1Kg đất + 1 lít nớc sạch
Hấp khử trùng 30 phút trong nồi hấp
Bổ sung thêm 1g CaCO3 rồi lọc lấy nớc trong)

Đại học s phạm H Nội 2

25

K31B Sinh