Phân lập, tuyển chọn xạ khuẩn khả năng sinh cellulase từ đất tại xuân hoà phúc yên vĩnh phúc
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (847.99 KB, 43 trang )
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH- KTNN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN XẠ KHUẨN
CÓ KHẢ NĂNG SINH CELLULASE TẠI
XUÂN HÒA- PHÚC YÊN- VĨNH PHÚC
Chuyên ngành: Vi sinh vật
Xuân Hòa- 2010
LỜI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Đinh Thị Kim
Nhung đã tận tình chỉ bảo, hướng dãn em trong suốt quá trình học tập
và thực hiện đề tài.
Em cũng xin chân thành cảm ơn toàn thể các thầy cô trong tổ vi
sinh đã chỉ bảo và giúp đỡ để em có thể hoàn thành được khóa luận tốt
nghiệp này.
Em cũng xin chân thành cảm ơn ban chủ nhiệm khoa SinhKTNN và ban giám hiệu nhà trường đã tạo điều kiện tốt nhất để em có
thể hoàn thành được khóa luận tốt nghiệp này.
Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã động
viên giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn!
Xuân Hòa , tháng 05 năm 2010
Sinh viên
Hoàng Mai Linh
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết
quả nghiên cứu , số liệu đƣợc trình bày trong khóa luận là trung thực và
không trùng với kết quả của tác giả khác.
Tác giả
Hoàng Mai Linh
CÁC TỪ VIẾT TẮT
VSV
: Vi sinh vật
ISP
: International Steptomyces Project
N
: Nitơ
C
: Cacbon
CFU
: Colony Forming Unit
HSKS
: Hệ sợi khí sinh
HSCC
: Hệ sợi cơ chất
MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU…………………………………………………………..........1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………………...4
1.1
Vị trí và phân loại xạ khuẩn………………………………............4
1.2
Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn………………………………….9
1.3
1.4.
Cellulose và cellulase……………………………………………...12
Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn sinh cellulase ở Việt Nam và trên thế giới
…………………………………………………………………………….14
CHƢƠNG 2. PHƢƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU………..15
2.1.
Vật liệu…………………………………………………………….15
2.2.
Phƣơng pháp nghiên cứu…………………………………………..18
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……………………………..20
3.1.
Kết quả phân lập xạ khuẩn từ đất…………………………………..20
3.2.
Đặc điểm hình thái của các chủng đã phân lập đƣợc……………….23
3.3.
Xác định khả năng sinh cellulase của xạ khuẩn…………………….30
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………………..34
1.
Kết luận……………………………………………………………..34
2.
Kiến nghị……………………………………………………………34
TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………35
DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH TRONG KHÓA LUẬN
BẢNG
Bảng
Tên bảng
Trang
3.1
Các chủng xạ khuẩn phân lập từ đất mùn
20
3.2
Các chủng xạ khuẩn phân lập từ đất ruộng
21
3.3
Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu
24
3.4
Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu
26
3.5
Hình dạng cuống sinh bào tử của các chủng xạ khuẩn
3.6
nghiên cứu
28-29
Kết quả thử hoạt tính cellulase trên môi trƣờng chứa
30
CMC
3.7
Kết quả thử hoạt tính cellulase trên môi trƣờng chứa bột
giấy
31
HÌNH
Hình
Tên hình
Trang
3.1
22-23
3.2
Một số chủng xạ khuẩn phân giải cellulose phân lập từ
đất
Khuẩn lạc xạ khuẩn
3.3
Sắc tố tan của một số chủng xạ khuẩn phân lập
27-28
3.4
Hình ảnh cuống sinh bào tử của các chủng xạ khuẩn
phân lập đƣợc
29-30
3.5
Hình ảnh hoạt tính cellulase của các chủng xạ khuẩn
nghiên cứu
32-33
25
Khãa luËn tèt nghiÖp §H
Tr-êng §HSP Hµ Néi 2
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Xạ khuẩn cư trú chủ yếu trong đất, chúng đóng vai trò quan trọng trong
quá trình hình thành và phát triển của đất. Xạ khuẩn tham gia tích cực vào các
quá trình chuyển hoá và phân giải nhiều hợp chất hữu cơ phức tạp và bền
vững như cellulose, chất mùn, kitin, keratin, lignin…góp phần khép kín các
vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên. Xạ khuẩn còn giúp tích lũy chất mùn
làm nên độ phì nhiêu của đất.
Ngày nay xạ khuẩn được ứng dụng rộng rãi trong các ngành công
nghiệp lên men (sản xuất axit hữu cơ như lactat, axetat, glutamat…). Chế biến
tạo các sản phẩm enzyme, ứng dụng enzyme do một số xạ khuẩn có khả năng
sinh ra nhiều như: cellulase, proteinase… Hầu hết các loài xạ khuẩn thuộc
giống Actinomyces đều có khả năng hình thành kháng sinh (streptomicine,
oreomicine…), một số vitamin nhóm B (B1, B2, B6, B12) chúng được ứng
dụng trong công nghiệp dược phẩm, y học…[1].
Cellulose là thành phần chủ yếu tạo lên bộ khung xương tế bào thực
vật. Trung bình mỗi năm ước tính có khoảng 30 tỉ tấn chất hữu cơ được cây
xanh tổng hợp trên trái đất trong đó có 30% là thành tế bào thực vật, thành
phần chủ yếu của thành là cellulose. Hàng năm trái đất phải nhận về một
lượng chất thải khổng lồ (chất thải sinh hoạt, chất thải thực vật như lá, cành
…, chất thải công nghiệp), thành phần chủ yếu của các loại chất thải này là
cellulose. Để phân giải lượng lớn cellulose này khu hệ vi sinh vật trong đất
đóng vai trò không nhỏ, muốn làm được điều đó các vi sinh vật phải sản sinh
ra cellulase, enzyme này đóng vai trò phân giải cellulose.
Ngoài protenase ứng dụng trong công nghiệp chế biến sữa, amylase
trong công nghiệp rượu, bia thì cellulase cũng là một trong những enzyme
Hoµng Mai Linh
-1-
K32D - Sinh
Khãa luËn tèt nghiÖp §H
Tr-êng §HSP Hµ Néi 2
được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp sản xuất giấy, công nghiệp may,
sợi… Cellulase ứng dụng sản xuất thức ăn cho gia súc, xử lý chất thải nông
nghiệp, sản xuất các loại đường probiotin mà nguyên liệu dùng ở đây chủ yếu
là dùng vi sinh vật sống.
Từ những lí do trên với mục đích tìm hiểu, làm quen với phương pháp
nghiên cứu vi sinh vật (VSV) nói chung, phương pháp nghiên cứu xạ khuẩn
có khả năng sinh cellulase nói riêng, tôi chọn đề tài: “Phân lập, tuyển chọn
xạ khuẩn có khả năng sinh cellulase từ đất tại Xuân Hòa- Phúc Yên- Vĩnh
Phúc”.
2. Mục tiêu của đề tài
- Phân lập, tuyển chọn xạ khuẩn có khả năng sinh cellulase ở các độ sâu:
0cm, 5cm, 10cm, 15cm, 20cm, 25cm, 30cm từ hai loại đất mùn và đất ruộng
tại Xuân Hòa – Phúc Yên – Vĩnh Phúc.
- Nghiên cứu các đặc điểm hình thái: hệ sợi khí sinh (HSKS), hệ sợi cơ chất
(HSCC), sắc tố tan, cuống sinh bào tử của các chủng xạ khuẩn phân lập được.
- Thử hoạt tính enzyme cellulase của một số chủng xạ khuẩn phân lập được.
3. Nội dung của đề tài
Đề tài “ Phân lập, tuyển chọn xạ khuẩn có khả năng sinh cellulase từ đất
tại Xuân Hòa – Phúc Yên – Vĩnh Phúc” để tìm hiểu:
-
Đặc điểm sự phân bố của xạ khuẩn và khẳng định được vai trò của
chúng trong đất.
-
Nghiên cứu đặc điểm hình thái (HSKS, HSCC, sắc tố tan, cuống sinh
bào tử…).
-
Thử hoạt tính sinh cellulase của xạ khuẩn phân lập từ đất.
Hoµng Mai Linh
-2-
K32D - Sinh
Khãa luËn tèt nghiÖp §H
Tr-êng §HSP Hµ Néi 2
4. Ý nghĩa của đề tài
Đề tài góp phần tạo cơ sở khoa học cho các phương thức canh tác, cày xới,
cải tạo đất, bón phân… theo hướng lợi dụng VSV phân giải cellulose, tăng
cường các quá trình phân giải hợp chất hữu cơ để làm giàu dinh dưỡng cho
đất, tăng năng suất cây trồng.
Mặt khác đề tài còn cho phép tuyển chọn những chủng xạ khuẩn có khả
năng sinh cellulase cao, từ đó có thể tạo ra các chế phẩm VSV chớ các chủng
xạ khuẩn này phục vụ cho việc xử lí rác thải (ủ rác sinh học), chế biến thức ăn
gia súc probiotin…
Hoµng Mai Linh
-3-
K32D - Sinh
Khãa luËn tèt nghiÖp §H
Tr-êng §HSP Hµ Néi 2
CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.
Vị trí và phân loại xạ khuẩn
1.1.1. Vị trí của xạ khuẩn trong sinh giới
Theo Krassinikov, xạ khuẩn được tách thành lớp riêng gồm xạ khuẩn
bậc cao có hệ sợi phát triển, có cơ quan sinh sản riêng và xạ khuẩn bậc thấp
có hệ sợi không phát triển, tế bào hình que hoặc hình cầu.
Trong cuốn “Bergey’s Manual” (1989) Bergey xếp xạ khuẩn vào bộ
riêng (Actinomycetales). Bộ xạ khuẩn thuộc lớp Thallobacteria, ngành
Firmicutes, giới Bacteria, siêu giới Prokaryota.
Theo hệ thống phân loại hiện nay, xạ khuẩn thuộc nhóm VSV nhân
nguyên thủy (Procaryota) thuộc giới khởi sinh (Monera) trong hệ thống phân
loại năm giới hay bảy giới thì xạ khuẩn đều thuộc giới vi khuẩn chuẩn
(Eubacteria), thuộc siêu giới nhân sơ.
Bộ xạ khuẩn bao gồm 10 họ :
- Actinomycetaceae
- Actinoplanaceae
- Permatophilaceae
- Frankiaceae
- Micramonosporaceae
- Thermonosporaceae
- Mycobacteriaceae
- Norcarddiceae
- Streptomycetaceae
Hoµng Mai Linh
-4-
K32D - Sinh
Khãa luËn tèt nghiÖp §H
Tr-êng §HSP Hµ Néi 2
Trong đó Streptomycetaceae là loại xạ khuẩn có hệ sợi giống nấm và được
nghiên cứu khá kĩ.
1.1.2. Phân loại xạ khuẩn
1.1.2.1. Lƣợc sử phân loại xạ khuẩn
Krainki lần đầu tiên đề ra các chỉ tiêu mới trong việc phân biệt các loài
khác nhau và đã sơ bộ phân loại 17 chủng thuộc chi Actinomyces. Ông coi các
đặc điểm sinh lí, sinh hóa là mấu chốt trong nguyên tắc phân loại [8].
Waksman và Cutis đã đề cập đến dạng trung gian trong mô tả phân loại
của mình và coi đặc điểm hình thái bào tử là đặc tính quan trọng nhất của các
cá thể và đưa ra một số loài mới có ý nghĩa [8].
Millard và Burr tìm ra 17 loại, Jensen tìm ra 2 loại mới, Dutche tìm ra
13 loại mới [8].
1chi Streptomyces dựa trên HSKS, HSCC và một số đặc điểm trung gian
khác [8]
Waksman và Henrici đã đưa ra hệ thông phân loại và đến năm 1961 hệ
thống phân loại này đã được sửa đổi lại. Trong hệ thống phân loại này thì xạ
khuẩn được xếp thành 3 họ, 10 chi và đã mô tả được hơn 250 loài thuộc chi
Streptomyces. Hệ thống phân loại này dựa vào màu sắc HSKS, HSCC, hình
dạng bào tử, chuỗi bào tử…[8].
Krassinicov công bố hệ thống phân loại nấm tia mới dựa tên hệ thống
đã công bố năm 1949, trong đó xạ khuẩn được chia thành 6 họ với 26 chi [8].
Những năm gần đây các hệ thống phân loại ngày càng nhiều, để thống
nhất trong cách mô tả, ISP (International Streptomyces Project) đã nêu lên các
phương pháp và môi trường mô tả [9].
1.1.2.2. Một số phƣơng pháp trong phân loại xạ khuẩn
Nhờ sự phát triển nhanh chóng của khoa học kĩ thuật, số lượng xạ
khuẩn được mô tả ngày càng nhiều và chính xác dựa trên cơ sở sự phát triển
Hoµng Mai Linh
-5-
K32D - Sinh
Khãa luËn tèt nghiÖp §H
Tr-êng §HSP Hµ Néi 2
của sinh học phân tử, hóa sinh học, lí sinh học… Để phân loại nhanh chóng
và chính xác, người ta sử dụng phân loại số (Numberical taxonomy), nghiên
cứu chủng loại phát sinh ( Phylogeny taxonomy).
Tuy nhiên hiện nay trong thực nghiệm, người ta vẫn chủ yếu dựa vào
các đặc điểm hình thái, tính chất nuôi cấy, đặc điểm sinh lí, sinh hóa , miễn
dịch học và sinh học phân tử.
1.1.2.2.1. Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy
Dựa vào đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy người ta chia xạ khuẩn ra
làm 4 nhóm chính:
- Nhóm 1: Gồm các xạ khuẩn mang bào tử rõ rệt, sinh sản bằng bào tử và
phân hóa thành HSKS, HSCC.
- Nhóm 2: Gồm các xạ khuẩn có bào tử nang, hệ sợi phân chia theo
hướng vuông góc với nhau tao thành cấu trúc tương tự nang bào tử.
- Nhóm 3: Gồm các xạ khuẩn có dạng Norcadia, sinh sản bằng phân đốt
hệ sợi.
- Nhóm 4: Gồm các xạ khuẩn có dạng Corynebacter và dạng cầu, tế bào
có hình chữ T, V và thường không có hệ sợi.
Trong những năm gần đây, dựa vào nghiên cứu xạ khuẩn trên các môi
trường khác nhau, người ta chia hình dạng chuỗi bào tử xạ khuẩn thành 6
kiểu:
- Kiểu S: Type “Sprina” – chuỗi bào tử xoắn.
- Kiểu SRA: Type “Sprina- Rectinaculum- Apertum” – chuỗi bào tử
xoắn có dạng móc câu hay xoắn không hoàn toàn.
- Kiểu SRF: Type “Spirina- Rectus- Flexibilis” - chuỗi bào tử xoắn, cong
đến thẳng.
- Kiểu RA: Type “Rectinaculum- Apertum” - chuỗi bào tử có móc, có
khóa.
Hoµng Mai Linh
-6-
K32D - Sinh
Khãa luËn tèt nghiÖp §H
Tr-êng §HSP Hµ Néi 2
- Kiểu RA- RF : Type “Rectinaculum Apertum- Rectus Flexibilis” –
chuỗi bào tử có dạng móc hay xoắn không hoàn toàn.
- Kiểu RF : Type “Rectus- Flexibilis” – chuối bào tử thẳng đến lượn
sóng.
Hiện nay có rất nhiều khóa phân loại xạ khuẩn nhưng có thể gộp thành hai
hệ thống sau đây :
1. Hệ thống phân loại chủ yếu giựa vào đặc điểm hình thái để phân loại
nhóm lớn như họ, giống. Các phân loại thấp hơn loài thì dùng đặc điểm
nuôi cấy, sinh lí, sinh hóa để phân loại [8]
2. Hệ thống phân loại chủ yếu giựa vào các đặc điểm sinh lí như màu sắc
hệ sợi… để phân nhóm, sau đó dùng các đặc điểm nuôi cấy để phân
loại đến loài. Nhóm hệ thống này của Waksman, Gause… các tác giả
đều thống nhất lấy đặc điểm sử dụng nguồn nitơ, cacbon làm yếu tố bổ
sung cho phân loại đến loài.
1.1.2.2.2. Đặc điểm hóa phân loại
Phương pháp hóa phân loại dựa vào các dữ liệu về định tính, định lượng
các thành phần hóa học trong tế bào VSV để phân loại, chủ yếu là các đặc
điểm sau :
- Type thành tế bào
- Type peptidoglucan
- Axit mycolic
- Axit béo
- Menaquinon
- Type photpholipit
Trong type thành tế bào, người ta phân thành tế bào xạ khuẩn thành 4 dạng :
+ Type I: Thành tế bào có L- ADP và glixin
+ Type II: Thành tế bào có m- ADP và glixin
Hoµng Mai Linh
-7-
K32D - Sinh
Khãa luËn tèt nghiÖp §H
Tr-êng §HSP Hµ Néi 2
+ Type III : Thành tế bào có m- ADP
+ Type IV : Thành tế bào có m- ADP, đường arabinose, galactose
Trong type peptidoglucan người ta chia xạ khuẩn thành :
Type
Type phụ
A (3-4)
B (2-4)
Cầu liên kết
A1
- Liên kết peptide trực tiếp
A2
- Chuỗi peptide bên
A3
- Glycerol hoặc axit monocacboxylic
A4
- Axit dicacboxylic
B1
- Axit được diamine hóa
B2
- Các axit amin được diamine hóa
1.1.2.2.3. Phân loại số
Phương pháp này dựa trên sự đánh giá về mức độ giống nhau giữa các
VSV trong một số lớn các đặc điểm chủ yếu là các đặc điểm hình thái, sinh
hóa, sinh lí để so sánh các chủng với nhau từng đôi một theo công thức sau :
SAB = nS*100/ ( nS + nd )
Trong đó :
- SAB: mức độ giống nhau giữa hai cá thể
- nS: tổng số các đặc điểm dương tính của 2 chủng so sánh
- nd: tổng số các đặc điểm dương tính của chủng này mà âm tính của
chủng kia
Kết quả này được biểu hiện trên sơ đồ nhánh và tùy thuộc mức độ giống
nhau mà các VSV được xếp vào các nhóm.
1.1.2.2.4. Nghiên cứu về phát sinh chủng loại
Nhờ sự sắp xếp phát sinh chủng loại mà các sinh vật được xếp vào hệ
thống phân loại gần tự nhiên hơn.
Các nghiên cứu về di truyền phân tử nhằm xây dựng cây phát sinh
chủng loại bằng cách tiến hành so sánh các cao phân tử ADN, ARN, protein
Hoµng Mai Linh
-8-
K32D - Sinh
Khãa luËn tèt nghiÖp §H
Tr-êng §HSP Hµ Néi 2
mà quan trọng hơn cả là sự sắp xếp các nucleotit của rARN 16S. Mức độ
giống nhau giữa hai cá thể so sánh thể hiện mối quan hệ giữa chúng.
1.2. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn
1.2.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn
Tùy loại môi trường mà xạ khuẩn có hình thái khác nhau. Trên môi
trường đặc, xạ khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc. Tùy theo loài, môi
trường nuôi cấy mà kích thước màu sắc khuẩn lạc có thể khác nhau như : đỏ,
da cam, vàng, nâu, hồng, xám… Khuẩn lạc xạ khuẩn thường chắc, xù xì, có
dạng nhung tơ, hay dạng màng dẻo và thường có cấu trúc 3 lớp : lớp ngoài có
cấu trúc sợi bền chặt, lớp giữa có dạng cấu trúc tổ ong và lớp trong cùng có
cấu trúc tương đối xốp. Cấu trúc khuẩn lạc xạ khuẩn với hướng sinh trưởng
trong môi trường tạo ra HSCC và mặt ngoài môi trường tạo ra HSKS. Đường
kính hệ sợi xạ khuẩn thay đổi trong khoảng 0,2-1,0µm đến 2,0-3,0µm . Đa số
các xạ khuẩn có hệ sợi phân nhánh mạnh, không có vách ngăn. Màu sắc hệ
sợi đa dạng, có thể gặp các màu trắng, vàng, da cam, nâu, tím, đen… HSCC
có thể sinh ra các sắc tố tan trong nước hoặc tan trong dung môi hữu cơ.
HSKS ở tận cùng thường là các chuỗi bào tử có dạng xoắn, lượn sóng, thẳng,
vòng… Đây là đặc điểm khá quan trọng để phân loại xạ khuẩn [1]
Các bào tử xạ khuẩn có thể có hình tròn, bầu dục, hình que, hay hình
trụ… Cấu trúc bề mặt bào tử có thể có dạng nhẵn (Smooth), có gai (Spinny),
khối u (Warty), nếp nhăn (Rugose) hay dạng tóc (Hairy). Hình dạng, kích
thước, cấu trúc bề mặt bào tử cũng là một trong những chỉ tiêu quan trọng để
định loại xạ khuẩn [1].
Khi nuôi cấy xạ khuẩn trong môi trường dịch thể, xạ khuẩn có thể mọc
thành dạng màng hay dạng vòng trên thành bình nuôi cấy, trên bề mặt môi
trường hay thành dạng bọt hoặc kết tủa kiểu vi khuẩn. Khi nuôi cấy chìm trên
máy lắc hoặc nồi lên men được khuấy đảo thì xạ khuẩn phát triển thành dạng
Hoµng Mai Linh
-9-
K32D - Sinh
Khãa luËn tèt nghiÖp §H
Tr-êng §HSP Hµ Néi 2
sợi bông hoặc cặn xốp. Nhưng thường gặp hơn cả là xạ khuẩn phát triển thành
những quả cầu nhỏ chứa đầy môi trường, kích thước từ 0,1mm đến 2-3mm.
1.2.2. Cấu tạo của xạ khuẩn
Xạ khuẩn có cấu tạo tương đối giống vi khuẩn gồm có thành tế bào,
màng tế bào chất, vật chất nhân sơ và các hạt dự trữ. Xạ khuẩn thuộc nhóm
VSV Gram (+). Thành tế bào dày khoảng 20nm có vai trò duy trì hình dạng
hệ sợi và bảo vệ tế bào, được cấu tạo chủ yếu gồm các lớp glucopeptit, các
gốc N-Acetylglucosamine liên kết với N-Acetylmuramic (hoặc NGlycolylmuramic, ví dụ như chi Micromonospora).
Căn cứ vào kết cấu hóa học có thể chia thành tế bào xạ khuẩn thành 4
nhóm sau :
- Nhóm 1 (Type I): có chứa L-ADP (L-Diaminopimelic) và glixin. Gồm
có các chi Streptomyces, Norcardioider…
- Nhóm 2 (Type II): có chứa m-ADP (meso- Diaminopimelic) và glixin.
Gồm các chi Micromospora, Actinoplans, Ampullariella…
- Nhóm 3 (Type III): có chứa m-ADP (meso- Diaminopimelic). Gồm có
Actinomadura, Actinobigfida, Micronobispora…
- Nhóm 3 (Type III):có chứa m-ADP (meso- Diaminopimelic) ,
đường arabinose, galactose. Gồm có Norcadia, Pseudonocardia,
Mycrobacterium…
1.2.3. Đặc điểm sinh lí , sinh hóa của xạ khuẩn
Xạ khuẩn là một nhóm cơ thể dị dưỡng, chúng sử dụng đường, rượu,
axit hữu cơ, lipid, protein và nhiều hợp chất hữu cơ khác làm nguồn cacbon.
Còn nitrat, nitrit, muối amon, ure, pepton, cao thịt… để làm nguồn nitơ. Ở các
loài khác nhau thì khả năng hấp thụ các hợp chất này là khác nhau. Phần lớn
xạ khuẩn là VSV hiếu khí, ưa ẩm, nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng và phát
triển là 25-300C. Đa số xạ khuẩn phât triển tốt trong môi trường kiềm.
Hoµng Mai Linh
- 10 -
K32D - Sinh
Khãa luËn tèt nghiÖp §H
Tr-êng §HSP Hµ Néi 2
Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn Gram (+), đặc biệt khác với các sinh vật
khác của nhóm nhân sơ có tỉ lệ (G+X) cao (trên 70%), trong khi đó vi khuẩn
khá thấp (25-45%). Một trong những đặc điểm đáng lưu ý của xạ khuẩn là
chúng không bền vững về mặt di truyền và thường xảy ra sự sắp xếp lại trong
phân tử ADN. Điều này gây ra tính đa dạng của hình thái, tính chất, sinh lí,
sinh hóa của xạ khuẩn (khả năng đồng hóa nguồn cacbon, nitơ, hoạt tính
kháng sinh, tính kháng thuốc, khả năng phân giải cellulose…).
1.2.4. Phân bố của xạ khuẩn
Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Xạ
khuẩn có thể phân lập từ đất, nước, không khí, bùn, rác thải…Đặc biệt
trong đất xạ khuẩn chiếm số lượng rất lớn. Theo Waksman thì trong đất xạ
khuẩn chiếm 9-45% tổng số các VSV. Và trong 1g đất có chứa tới 29.00024.000.000 mầm xạ khuẩn. Tuy nhiên tùy vùng đất khác nhau trên thế giới
mà có sợ biến đổi lớn về số lượng xạ khuẩn trong đất, số lượng xạ khuẩn ở
nam bán cầu bao giờ cũng cao hơn bắc bán cầu. Ngoài ra số lượng xạ
khuẩn trong đất còn phụ thuộc vào mức độ canh tác, độ phì nhiêu của đất,
mức độ che phủ của thực vật… Đất giàu dinh dưỡng, hữu cơ, khoáng thì có
nhiều xạ khuẩn hơn so với đất nghèo dinh dưỡng. Trong 1g đất canh tác có
thể phân lập được 5.000.000 CFU/g xạ khuẩn. Đất vùng sa mạc khô nóng,
nghèo dinh dưỡng có số lượng xạ khuẩn ít hơn, không dao động trong
khoảng 10.000 – 100.000 CFU/g.
Xạ khuẩn là nhóm VSV ưa trung tính hay kiềm yếu, do đó sự phân bố của
xạ khuẩn trong đất phụ thuộc vào độ pH của đất. Ở các đất có độ pH trung tính
hoặc hơi kiềm thì có mật độ xạ khuẩn cao hơn so với các vùng đất có độ pH kiềm
hoặc axit. Đồng thời số lượng xạ khuẩn còn phụ thuộc vào các thời điểm trong
năm. Do đó khi lấy mẫu đất nghiên cứu cần phải chú ý tới các điều kiện như thành
phần lớp đất, sinh cảnh, thời điểm lấy mẫu, độ ẩm, nhiệt độ…
Hoµng Mai Linh
- 11 -
K32D - Sinh
Khãa luËn tèt nghiÖp §H
Tr-êng §HSP Hµ Néi 2
1.2.5. Vai trò của xạ khuẩn
Xạ khuẩn là một trong nhiều loại VSV có ý nghĩa trong tự nhiên bởi
vai trò tích cực tham gia vào quá trình chuyển hóa những hợp chất trong đất,
nước…
Xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh, có 60-70% xạ khuẩn phân
lập từ đất như Streptomyces, Actinomyces… có khả năng này, các chất kháng
sinh do chúng sinh ra được sử dụng rộng rãi trong y học.
Ngoài ra xạ khuẩn còn có khả năng phân giải cellulose trong bã thải
nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm để chế biến thức ăn gia súc probiotin,
phân bón hữu cơ, xử lí rác thải…
1.3. Cellulose và cellulase
1.4.1. Cellulose
Cellulose là một polysaccharite mạch thẳng gồm từ 1400- 12.000 gốc
β-D-glucose liên kêt với nhau bởi các liên kết β-1,4-glucoside. Trong phân tử
cellullose các phân tử β-D-glucose có cấu trúc không gian dạng ghế bành. Hai
phân tử khác nhau quay góc với nhau 1800. Cellulose là loại hợp chất hữu cơ
dồi dào trong tự nhiên chiếm tới 40-50% hydratcacbon. Cellulose có cấu trúc
không gian dạng sợi song song, dài khoảng 5µm , đường kính 3nm. . Các sợi
này liên kết với nhau bới các liên kết hidro và các liên kết vandervan tạo
thành các bó sợi nhỏ có đường kính 10-40nm gọi là vi sợi (microfibrin). Các
vi sợi có cấu trúc không đồng nhất tạo nên cấu trúc mixen của cellulose [8]
Cellulose dạng mixen gồm 2 vùng :
- Vùng kết tinh (Crystolline regions) : Có các hệ sợi chặt chẽ, đậm đặc
ngăn cản sự hấp thụ nước và ít chịu tác động phân giải. Vùng này
chiếm 3/4 cấu trúc cellulose.
- Vùng vô định hình (Amorphous regions) : Có cấu trúc kém chặt chẽ, dễ
bị trương lên và dễ bị phân giải.
Hoµng Mai Linh
- 12 -
K32D - Sinh
Khãa luËn tèt nghiÖp §H
Tr-êng §HSP Hµ Néi 2
Trong tự nhiên cellulose khá bền vững, không tan và bị trương lên khi hấp
thụ nước. Cellulose bị phân hủy khi đun nóng với axit hay kiềm ở nhiệt độ
khá cao hoặc bị phân giải bởi các cellulose sinh ra từ nhiều loại sinh vật.
1.4.2. Cellulase
Enzyme cellulase xúc tác cho qua trình chuyển hóa cellulose thành các sản
phẩm hòa tan dễ sử dụng. Hệ thông cellulase gồm 3 loại chính sau:
- Endo-β-glucanase hay 1,4-β-D-glucanhydronase, cellobiohydrolase
(CBH), CMC-ase: Enzyme này tấn công vào các điểm khác nhau trên
chuỗi
cellulose
của
CMC,
cellulose
trương
phồng,
các
celloligosaccharide. Chúng phân cắt các chuỗi cellulose một cách ngẫu
nhiên, sản phẩm tạo thành là glucose và các oligosaccharide (có thể từ
3-6C hoặc nhiều hơn). Sự phân cắt này hình thành các đầu khử tự do,
tạo điều kiện cho exoglucanase hoạt động. Bởi vậy cellulose vùng kết
tinh được phân giải triệt để, hiệu quả.
- Exo-β-glucanase hay 1,4- β-D-glucan cellobiohydronase, avicelase:
enzyme này tấn công vào đầu không khử của cellulose và kết quả tạo ra
các cellobinose.
- β-glucosidase hay cellobinose: Thủy phân cellobinose và một vài
celloligosaccharit thành glucose. Hoạt tính của β-glucosidase mạnh
nhất trên cellobinose và giảm dần theo chiều dài chuỗi.
1.4.3. Hệ enzyme phân giải cellulose
Một số nhóm VSV phân giải được cellulose là nhờ phức hệ enzyme
cellulose gồm 4 enzyme khác nhau tác dụng với các mối liên kết của
cellulose.
Đầu tiên enzyme cellobihydrolase có tác dụng cắt đứt liên kết hidro,
biến cellulose tự nhiên có cấu hình không gian thành dạng cellulose vô định
hình không có cấu trúc lớp.
Hoµng Mai Linh
- 13 -
K32D - Sinh
Khãa luËn tèt nghiÖp §H
Tr-êng §HSP Hµ Néi 2
Enzyme thứ hai là endoglucanase có khả năng cắt đứt kiên kết β-1,4glucozit tạo thành những chuỗi dài.
Enzyme thứ ba là exoglucanase tiến hành phân giải các chuỗi trên
thành disaccharite gọi là cellobinose.
Enzyme thứ tư là β-glucosidase tiến hành thủy phân cellobinose thành
glucose.
1.4. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn sinh cellulase ở Việt Nam và
trên thế giới
Hàng năm hoạt động trong ngành nông nghiệp đã thải ra môi trường
hàng ngàn tấn phế phẩm và đang là một trong những nguyên nhân gây ô
nhiễm môi trường. Nếu lượng phế phẩm này được xử lý làm thức ăn gia súc
hoặc phân bón vi sinh thì đó sẽ là một nguồn lợi lớn. Vì vậy trên thế giới và ở
Việt Nam đã có những ngiên cứu về khả năng sinh cellulase của các VSV
trong đất để phân giải cellulose từ các phế phẩm nông nghiệp. Đặc biệt xạ
khuẩn là một loài VSV có khả năng sinh cellulase khá mạnh và có thể cho
nguồn enzyme dồi dào phục vụ cho việc xử lý rác thải, chế biến thức ăn gia
súc probiotin…
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu về xạ khuẩn và khả năng sinh
cellulase của nó vẫn còn khá mới. Đã có nhiều nghiên cứu về cellullase
ứng dụng trong thức ăn chăn nuôi nhưng đối tượng nghiên cứu chủ yếu lại
là nấm mốc, nấm men… như: Nguyễn Lân Dũng (1991) đã lên men xốp
sắn bằng cách sử dụng Aspergillus hennebergii, Aspergillus niger sản
phẩm dùng làm thức ăn cho trâu, bò. Chu Thị Thanh Bình và cộng sự
(2002) đã ứng dụng các chủng nấm men trong bã thải hoa quả giàu
cellulose làm thức ăn gia súc… Tuy nhiên Việt Nam là đất nước sản xuất
nông nghiệp là chủ yếu nên việc nghiên cứu về khả năng sinh cellulase
của xạ khuẩn có triển vọng rất lớn.
Hoµng Mai Linh
- 14 -
K32D - Sinh
Khãa luËn tèt nghiÖp §H
Tr-êng §HSP Hµ Néi 2
CHƢƠNG 2
PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Nguyên liệu
Các mẫu đất lấy từ các loại đất thuộc phường Xuân Hòa – Phúc Yên –
Vĩnh Phúc.
2.1.2. Hóa chất
Các hóa chất : K2HPO4, MgSO4.7H2O, NH4Cl, KNO3, NaNO3,
(NH4)2SO4, NaCl, FeSO4…..
Tinh bột tan, Sacharose, thạch agar, CMC (Cacboxyl Methyl
Cellulose), bột giấy…
2.1.3.Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu
- Dụng cụ : Hộp petri, ống nghiệm, bàn trang, que cấy, đèn cồn, bình
tam giác, giá đựng ống nghiệm.
- Thiết bị : Tủ ấm vi sinh (Heraeus – Đức ), tủ sấy (Heraeus – Đức ),
nồi hấp (Tomy – Nhật Bản), cân Sartorius, tủ cấy vô trùng, tủ lạnh.
2.1.4. Môi trƣờng phân lập xạ khuẩn
- Môi trường 1 : Gause I , pH = 7,0
Hóa chất
Khối lƣợng
Tinh bột tan
20g
KH2PO4
0,5g
KNO3
MgSO4.7H2O
NaCl
1g
5g
0,5g
H2 O
1000ml
FeSO4
Vết
Thạch agar
20
Hoµng Mai Linh
- 15 -
K32D - Sinh
Khãa luËn tèt nghiÖp §H
Tr-êng §HSP Hµ Néi 2
- Môi trường 2 : Czapeck- tinh bột , pH =7,2- 7,4
Hóa chất
Khối lƣợng
Tinh bột tan
20g
KH2PO4
1g
NaNO3
3g
MgSO4.7H2O
0,5g
KCl
0,1g
NaCl
0,1g
H2 O
1000ml
FeSO4
Vết
Thạch agar
20
- Môi trường 3 : Czapeck ( nguyên gốc) , pH = 7,2
Hóa chất
Khối lƣợng
Sacharose
20g
K2HPO4
1g
NaCl
30g
MgSO4.7H2O
0,5g
H2 O
1000ml
FeSO4
Vết
Thạch agar
20g
Hoµng Mai Linh
- 16 -
K32D - Sinh
Khãa luËn tèt nghiÖp §H
Tr-êng §HSP Hµ Néi 2
2.1.5. Môi trƣờng thử hoạt tính phân giải cellulose của xạ khuẩn
- Môi trường 1 : 1% CMC
Hóa chất
Khối lƣợng
NaNO3
1,5g
KH2PO4
0,5g
MgSO4.7H2O
0,5g
KCl
0,5g
NaCl
10g
Thạch agar
20g
CMC
10g
H2O
1000ml
- Môi trường 2 : 1% bột giấy
Hóa chất
Khối lƣợng
NaNO3
1,5g
KH2PO4
0,5g
MgSO4.7H2O
0,5g
KCl
0,5g
NaCl
10g
Thạch agar
20g
Bột giấy
10g
H2 O
1000ml
+ Chuẩn bị nƣớc chiết đất :
1kg đất + 1l nước sạch
Hấp khử trùng trong nồi hấp 30 phút
Bổ sung thêm 1g CaCO 3
Rồi lọc lấy nước trong
Hoµng Mai Linh
- 17 -
K32D - Sinh
Khãa luËn tèt nghiÖp §H
Tr-êng §HSP Hµ Néi 2
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phƣơng pháp lấy mẫu [3]
Trên mỗi loại đất dùng dụng cụ lấy đất ở các độ sâu 0cm, 5cm, 10cm,
15cm, 20cm, 25cm, 30cm. Ở mỗi độ sâu thì lấy khoảng 10g cho vào túi nilon,
trên túi có ghi độ sâu lấy mẫu, nơi lấy mẫu, loại đất, sau đó buộc túi lại để
tránh bay hơi nước và tránh các VSV lạ xâm nhập vào. Mẫu đất sau khi được
thu thập cần phải tiến hành phân lập ngay. Nếu chưa phân lập được thì phải
bảo quản mẫu trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4-50C.
2.2.2. Phƣơng pháp phân lập xạ khuẩn từ mẫu đất [3]
Lấy 1g đất cho vào ống nghiệm chứa sẵn 10ml nước cất vô trùng lắc
đều rồi dùng pipet hút 1ml dung dịch đất này cho sang ống nghiệm có chứa
sẵn 9ml nước cất vô trùng lắc đều thu được dịch đất với độ pha loãng 10 -1
cứ tiếp tục như vậy với ống nghiệm tiếp theo ta có dung dịch đất với độ
pha loãng 10-2, 10-3,.... 10-10. Tùy theo mật độ phân bố của xạ khuẩn trong
mẫu đất mà ta chọn dịch đất có độ pha loãng thích hợp. Ở đây tôi chọn dịch
đất có độ pha loãng 10-5, 10-7. Dùng pipet vô trùng hút 0,5 ml dung dịch đất
có độ pha loãng 10-5, 10-7 nhỏ lên bề mặt thạch trong hộp petri, lấy bàn
trang thủy tinh trang đều khắp bề mặt thạch. Với mỗi mẫu đất ở các độ sâu
trên cấy lên 3 môi trường: Gause I, Czapeck- tinh bột, Czapeck . Sau đó
nuôi trong tủ ấm 3-5 ngày ở nhiệt độ 30oC, theo dõi các khuẩn lạc xạ khuẩn
mọc trên bề mặt thạch. Cấy truyền những khuẩn lạc xạ khuẩn mọc riêng
biệt không bị nhiễm sang các ống thạch nghiêng có chứa môi trường Gause
I. Các giống này được đưa vào tủ ấm và giữ ở nhiệt độ 30 oC sau 3- 4 ngà y
mang ra kiểm tra lại nếu thấy ống nghiệm nào không mọc hoặc bị nhiễm thì
loại bỏ cấy truyền lại để cuối cùng ta được các ống nghiệm có các chủng xạ
khuẩn thuần chủng.
Hoµng Mai Linh
- 18 -
K32D - Sinh
