Tuyển chọn chủng vi khuẩn acetobacter xylinum cho màng dày, nghiên cứu ảnh hưởng của etanol, axit axetic, ( NH4)2SO4, ph, ứng dụng làm thạch dừa

Khoá luận tốt nghiệp

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA : SINH HỌC

NGUYỄN THỊ QUANG – K29A

“TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN ACETOBACTER XYLINUM CHO
MÀNG DÀY, NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ETANOL, AXIT AXETIC,
(NH4)2SO4, pH,ỨNG DỤNG LÀM THẠCH DỪA ”

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành : Vi sinh vật

Người hướng dẫn :
Thạc sĩ: Nguyễn Khắc Thanh

Hà Nội: 2007
Nguyễn Thị Quang

1

K29A-Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Để có được sự thành công của đề tài khoá luận, em đã nhận được sự giúp đỡ tâm
huyết và tận tình của các thầy cô trong bộ môn Vi Sinh tổ thực vật, đặc biệt là sự
giúp đỡ của thầy Nguyễn Khắc Thanh và cô Đinh thị Kim Nhung cùng các bạn

sinh viên, những ý kiến đóng góp của các bạn trong nhóm vi sinh. Em xin được
bày tỏ lòng cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất về sự giúp đỡ quý báu đó của các
thầy cô, các bạn trong nhóm vi sinh và người trực tiếp hướng dẫn em là thầy
Nguyễn Khắc Thanh.
Hà Nội, tháng 05 năm 2007
Sinh viên: Nguyễn thị Quang

Nguyễn Thị Quang

2

K29A-Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Khoá luận tốt nghiệp này được hoàn thành dưới sự hướng dẫn tận tình của
thạc sĩ Nguyễn Khắc Thanh. Em xin cam đoan rằng:
Đây là kết quả nghiên cứu của riêng em.
Kết quả này không trùng với kết quả của bất kì tác giả nào đã công bố
Nếu sai em xin chịu hoàn toàn trách nhiệm.
Sinh viên: Nguyễn Thị Quang

Nguyễn Thị Quang

3

K29A-Sinh

Khoá luận tốt nghiệp

TÓM TẮT CÔNG TRÌNH
Thạch dừa là sản phẩm được tạo thành trong quá trình nuôi cấy vi sinh
Acetobacter xylinum trong môi trường nước dừa chuyển hoá thành
Hemixenluoza, qua chế biến và xử lý cùng với một số nguyên liệu thành thạch
dừa. Đây là món ăn cổ truyền của một số nước Đông Nam Á: Philipin,
Malaixia... Việt Nam cũng là một trong những xứ sở của dừa. Bên cạnh các món
ăn được chế biến từ dừa như cơm dừa, kẹo dừa, bánh đa...Thì thạch dừa cũng
được khá nhiều người ưa thích. Thạch dừa với thành phần chính là
Hemixenluloza, có tác dụng giúp cho quá trình tiêu hoá tốt hơn, dưỡng da, chống
lão hoá, giảm cholesterol trong máu và phòng ngừa một số bệnh ung thư... Ở
nước ta, việc nghiên cứu ứng dụng vi khuẩnAcetobacter xylinum và sản xuất
thạch dừa rất ít, xuất hịên một vài cơ sở sản xuất thạch dừa (Thành phố Hồ Chí
Minh) nhưng sản lượng ít trong khi nhu cầu sử dụng thạch dừa ngày càng tăng,
hơn nữa nguồn nguyên liệu lại khá dồi dào. Đứng trước nhu cầu và tiềm năng đó
cũng như việc nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylinum đến việc ứng dụng tạo
nguồn thức ăn từ nguyên liệu sẵn có là một việc làm có ý nghĩa thực tiễn và lý
luận sâu sắc, vì vậy tôi đã chọn và nghiên cứu đề tài:”Tuyển chọn chủng vi
khuẩn Acetobacter xylinum cho màng dày, nghiên cứu ảnh hưởng etanol,
axit axetic, (NH4)2SO4, pH, ứng dụng làm thạch dừa”.
Trong đề tài này, từ các nguồn nguyên liệu sẵn có ở trong nước tôi đã
phân lập được 60 mẫu, tuyển chọn được 02 chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum
cho màng dày hơn cả làm đối tượng nghiên cứu tiếp theo. Nghiên cứu khả năng
tạo màng chọn ra hai chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum là A3 và A6 cho màng
dày nhất.
Nghiên cứu tiếp theo là quan sát hình dạng tế bào trên kính hiển vi quang
học.
Nghiên cứu động thái phát triển của hai chủng trên.

Nghiên cứư ảnh hưởng của etanol, axit axetic, (NH4)2SO4, pH tới quá trình
tạo màng của hai chủng này.
Ứng dụng hai chủng đó vào làm thạch dừa trong phạm vi phòng thí
nghiệm.
Nguyễn Thị Quang

4

K29A-Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

PHẦN 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1. Lý do chọn đề tài
Cũng như các linh vực khoa học khác, công nghệ vi sinh mà tiền thân của nó là
công nghệ lên men cổ đã trải qua những chặng đường phát triển đầy khó khăn,
phức tạp. Đã từ rất lâu con người đã biết ứng dụng quá trình lên men trong sản
xuất vào đời sống như: Làm tương, muối dưa, làm bánh mì, sản xuất bia
rượu...mà chưa hiểu hết bản chất của quá trình lên men. Cho đến gần đây khi
trên thị trường đã xuất hiện một loại thực phẩm mới đó là thạch dừa. Đây là một
loại thực phẩm được khá nhiều người ưu thích và bổ dưỡng: Giúp cho quá trình
tiêu hoá tốt hơn, dưỡng da, giảm cholesterol trong máu, chống lão hoá, ngăn
ngừa một số bệnh ung thư…Tuy nhiên trong nước mới chỉ một vài cơ sở sản
xuất, trong khi nhu cầu sử dụng thạch dừa ngày càng cao, hơn nữa nguồn nguyên
liệu thô để sản xuất lại khá dồi dào và cũng rất khố để bảo quản nước dừa. Đứng
trước tiềm năng và nhu cầu ấy chúng tôi đã chọn và tiến hành nghiên cứu đề tài:
:”Tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng dày, nghiên
cứu ảnh hưởng etanol, axit axetic, (NH4)2SO4, pH, ứng dụng làm thạch dừa”
1.2.Mục tiêu của đề tài

Từ các nguồn nguyên liệu: Bia, rượu vang, hoa quả, giấm tiến hành phân lập
tuyển chọn các chủng cho màng dày, nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố
tới quá trình lên men.
1.3.Nhiệm vụ
Phân lập tuyển chọn các chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng dày, từ
đó chọn ra hai chủng cho màng dày nhất làm đối tượng nghiên cứu.
Tìm hàm lượng của etanol, axit axetic, (NH4)2SO4, pH thích hợp cho sự phát
triển của hai chủng Acetobacter xylinum tuyển chọn được.
1.4 Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của đề tài
Nghiên cứu nhằm đi sâu tìm hiểu hình thái, đặc tính sinh lý, sinh hoá của các
chủng Acetobacter xylinum có khả năng cho màng dày
Góp phần tìm hiểu quá trình sản xuất thạch dừa và nâng cao hiệu quả sản xuất

Nguyễn Thị Quang

5

K29A-Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Phần 2. Tổng quan tài liệu
2.1. Lược sử nghiên cứu và phân loại vi khuẩn Acetobacter xylinum
(A.xylinum)
2.1.1.Lược sử nghiên cứu vi khuẩn A.xylinum
Người ta thường gọi quá trình chuyển hoá rượu thành axit axetic là quá trình lên
men axetic, nhưng thực chất đấy là một quá trình oxi hoá, vi khuẩn gây ra quá
trình này là vi khuẩn axetic thuộc giống Acetobacter. Trước đây con người mới
chỉ ứng dụng quá trình này để làm giấm từ rượu vang hỏng một cách thụ động

mà chưa hề biết đến cơ chế và bản chất cuả nó. Tuy vậy tới những năm đầu của
thế kỉ 19 con người đã điều chế được axit axetic đậm đặc, biết giấm là sản phẩm
lên men của nhóm vi sinh vật mà ngày nay chúng ta gọi là Acetobacter hay vi
khuẩn axetic. Từ đó đến nay đã có rất nhiều khoa học nghiên cứu về loại vi
khuẩn này.
Người đầu tiên nhìn thấy vi sinh vật là Antoni Lơvenhuc (1632-1723) và Person
(1822) là người đầu tiên nghiên cứu về axit axetic từ lớp màng mỏng phát triển
trên giấm. Ông đã chứng minh được đó là một loại vi sinh vật có tên là
Mycoderma axetic
Năm 1973 Kittzing nhận xét quá trình lên men giấm nhất thiết phải có vi sinh
vật, như vậy ông đã khẳng định rõ vai trò của vi sinh vật trong quá trinh lên men
giấm. Cùng năm đó, Hansen cung tách được hai loại vi khuẩn thuần khiết từ
mangf giấm ông gọi đó là Mycoderma aceti và Mycoderma pasteurianum.
Năm (1862-1868) L.pasteur là người đầu tiên khám phá ra cơ chế của quá trình
lên men axetic, đó là một quá trình oxi hoá rượu etylic. Ông đã chứng minh sự
đúng đắn trong nhận xét của Kittzing & Hansen, khẳng định bản chất của quá
trình lên men axetic. Với việc sử dụng kính hiển vi bởi Lơvenhuc thì nhận thức
về sự tồn tại của thế giới vi sinh vật mới thực sự bắt đầu, nhờ đó Pasteur đã xem
xét sự xuất hiện màng trên bia và rượu vang một cách kỹ lưỡng. Cuối cùng ông
kết luận màng đó được tạo thành do một loại trực khuẩn (màng là tập hợp những
tế bào trực khuẩn) và ông cũng gọi là Mycoderma aceti
Những nghiên cứu tiếp theo nhằm mục đích cải tiến quá trình lên men axetic.
Trên cơ sở đó đã có rất nhiều quan điểm phân loại khác nhau ra đời.
Nguyễn Thị Quang

6

K29A-Sinh

Khoá luận tốt nghiệp

2.1.2.Phân loại vi khuẩn Acetobacter
Từ trước tới nay đã có rất nhiều tác giả đề cập đến vấn đề này trong đó đáng chú
ý nhất là khoá phân loại của Beijerinck. Ông phân loại vi khuẩn dựa vào hai dấu
hiệu.
Một là: Khả năng sử dụng đạm amoni để thực hiện sự sinh trưởng và phát triển
Hai là: Có hay không có giai đoạn di động trong quá trình phát triển
Năm 1962 Heneberg đã chia tất cả các vi khuẩn axetic thành 4 nhóm theo nơi
sống đặc trưng của chúng.
Nhóm 1: Vi khuẩn không phát triển trên bia vì hoa Hublon độc với chúng
Nhóm 2: Vi khuẩn phát triển trên bia
Nhóm 3: Vi khuẩn phát triển trong dung dịch rượu vang
Nhóm 4: Vi khuẩn để sản xuất giấm theo phương pháp nhanh
Năm 1934, theo nghiên cứu của hội nhà vi khuẩn học Hoa Kỳ, các vi khuẩn
axetic có khả năng sử dụng các hợp chất tương đối đơn giản của cacbon và nitơ
nên đã kết hợp vào họ Nitrobacteriaceae. Từ đó vi khuẩn giấm giữ tên là
Acetobacter. Năm 1848 Vanght công bố kết quả của mình khi ông quan sát thấy
được sự di động của nhiều loại Acetobacter aceti, Acetobacter pasteurianum,
Acetobacter oxydans, Acetobacter malanogenum
Vanght đã giải thích rằng các loài trên cùng một loại có đơn mao ở cực và đã xác
nhận vị trí của vi khuẩn axetic trong họ Pseudomonadaceae.
Ngày nay theo khoá phân loại của Bergeys và nhiều tác giả khác đã xếp vi
khuẩn Acetobacter và Gluconobacter vào họ Acetobacter iaceae.
Năm 1914 Bergeys phân loại các loài trong giống Acetobacter thành hai loại
- Loại 1: Oxi hoá axit axetic thành CO2 và H2O
+ Loại này sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất, đại diện là vi khuẩn
Acetobacter aceti
+ Không sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất
Trên bề mặt môi trường dịch thể tạo màng nhầy có chứa xenluloza, điển hình là

acetobacter xylinum
Trên bề mặt môi trường dịch thể không tạo màng nhầy chứa xenluloza, dàng
điển hình là Acetobacter rancens, Acetobacter pasteurianum
Nguyễn Thị Quang

7

K29A-Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

_ Loại 2: Vi khuẩn không oxi hoá axit axetic
+Tạo thành sắc tố trên môi trường glucoza
Sắc tố nâu tới đen nhạt : Acetobacter malanogenus
Sắc tố hồng: Acetobacter zancens
+ Không tạo thành sắc tố.
Nhiệt độ thích hợp nhất là 30-350C: Acetobacter suboxydans
Nhiệt độ thích hợp giưa 18-210C :Acetobacter oxydans
Năm 1960 Shiwel và Car nghiên cứu về đặc trưng nuôi cấy sinh hoá của vi
khuẩn Acetobacter và đưa ra kết luận không thể có sự đồng nhất các vi khuẩn
Acetobacter. Tư những nghiên cứu về Acetobacter người ta đã không ngừng phát
huy vai trò của nó trong đời sống con người. Nhu cầu của con người vè sử dụng
Acetobacter ngày càng đa dạng và chúng được sử dụng nhiều trong các công
trình khoa học phục vụ nhu cầu hàng ngày như: lên men giấm, chế biến thức ăn,
sản xuất vitaminC, B1, B2, B12, sản xuất tơ nhân tạo …
2.2. Đặc điểm chung về vi khuẩn Acetobacter[2]
Ngày nay người ta đã biết vi khuẩn Acetobacter là tác nhân chính của quá
trình lên men axetic. Chúng thuộc vào 2 giống vi khuẩn Acetobacter chu mao
hoặc không bà Gluconobacter đơn mao. Đây là 2 giống vi khuẩn axeticquan

trọng nhất trong họ Acetobaccter iaceae. Chúng phổ biến trongtự nhiên, có trên
bề mặt lá, hoa quả…chúng tạo ra axix axetic từ rượu etylic.
Trong tế bào Gluconobacter không có chu trình tricacboxylic hoạt động
nên nó không thể oxi hoá axetat nhưng có một chu trình khác thay thế( chu trình
glyoxylat)
Không oxi hoá axit axetic
Khi so sánh vi khuẩn này với những vi khuẩn thuộc giồng pseudomonas
thấy có đặc điểm tương tự. Chúng chỉ khác pseudomonas ở chỗ chịu được độ
axit cao hơn, khẳ năng chuyển hoá pepton yếu ít di động và không sinh sắc
tố.Nhiều loại vi khuẩn Acetobacter khi phát triển trên môi trường thiếu thức ăn
hoặc môi trường đã nuôi cấy lâu dễ làm biến đổi hình thái thành dạng có hình
thái đặc biệt
Vi khuẩn Acetobacter ở dạng hình que, có thể có tiêm mao, di động ,
không sinh bào tử,gram âm, hiếu khí bắt buộc.
Nguyễn Thị Quang

8

K29A-Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Trên cơ sở dựa vào tính chất đặc trưng của vi khuẩn Acetobacter mà người
ta xếp chúng vào nhóm độc lập là khả năng oxi hoá rượu etylic thành axit axetic,
pH=4,5. Ngoài ra chúng còn thực hiện quá trình oxi hoá không hoàn toàn các
hợp chất hữu cơ khác để tạo thành các hợp chất xeton,
Vi khuẩn Acetobacter chỉ phát triển tốt trong điều kiện hiếu khí, nhiệt độ
thích hợp từ25-300C, pH thích hợp 5,4-6,8. hoá dị dưỡng hữu cơ [10,15].
Đặc điểm phân biệt Acetobacter và Gluconobacter. So sánh với

Pseudomonas
Đặc điểm so sánh
Gluconobacter
Acetobacter
Pseudomonas
Đơn mao ở cực hoặc
Chu mao hoặc
Chu mao ở
Vị trí tiêm mao
không
không
cực
Phát triển ở
pH=4.5
Oxy hoá etanol
pH=4.5
Oxy hoá axit
axetic
Oxy hoá lactat
Glucoza ->
Gluconate
Sử dụng tinh bột
lactose
Sử dụng Gelatin
Sắc tố huỳnh
quang

+

+

_

+

+

_

_

+

+

_

+

+

+

+



_

_



_

_



_

_



Về hình dạng tế bào, vi khuẩn Acetobacter là những trực khuẩn hình que,
kích thước trung bình từ 0,6-0,8µm. Các tế bào đứng tách riêng hoặc xếp thành
chuỗi, loại đặc biệt có tế bào hình cầu tuỳ thuộc vào điều kiện pH môi trường
,nhiệt độ nuôi cấy. [2].Vi khuẩn Acetobacter không có khả năng sinh bào tử, tạo

Nguyễn Thị Quang

9

K29A-Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

màng nhầy, một số có khả năng di động nhờ tiêm mao,một số không có khả năng

này
Khi nghiên cứu về khuẩn lạc và màng vi khuẩn Acetobacter trên môi
trường cấy cho thấy vi khuẩn Acetobacter phát triển tốt trên môi trường nước
bia, các môi trường có chứa cao nấm men:glucoza, rượu etylic, hoặc manitol.
Trên môi trường đặc chúng phát triển những khuẩn lạc tròn đều đặn đường kính
trung bình là 3mm, bề mặt trơn bóng, phần giữa khguẩn lạc nổi lên dày và sẫm
hơn các phần xung quanh. Một số loại có khuẩn lạc lớn(d=4-5mm) bề mặt trơn
bóng không có màu, mỏng như hạt sương nhỏ dễ dàng dùng que cấy gạt ra khỏi
môi truường .
Trên môi trường lỏng vi khuẩn axetic phát triển tạo thành lớp màng. Dung
dịch dưới màng bao giờ cũng trong suốt. Khi nghiên cứu lớp màng này người ta
thấy có sợi xenluloza giống như ở trong sọi bông.
Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn axetic đối với nguồn cacbon, nitơ và các
chất sinh trưởng rất đa dạng. Chúng sử dụng đường, rượu etylic, axit hữu cơ làm
nguồn cacbon, muối amoni làm nguồn nitơ. Trong quá trình phát triển chúng có
nhu cầu đối với một số axit amin, chất kích thích sinh trưởng…
Một số loài vi khuẩn có khả năng tổng hợp các chất cao phân tử:xenluloza,
tinh bột …Con người đã ứng dụng điều này trong sản xuất công nghiệp
Vi khuẩn axetic có khả năng oxi hoá gluxit theo mấy hướng sau:
-Hướng 1: Không có sự photphoril hoá cơ chất với sự tham gia của enzym
đặc hiệu
-Hướng 2: Oxxi hoá các cơ chất đã được photphoril hoá trong con đường
pentozo photphat.
-Hướng 3: Theo sơ đồ của Entenr-Doudoroff
-Hướng 4: Theo chu trình Krebs hoặc Glyoxylat
2.3.Một số loại vi khuẩn Acetobacter[10,15]
2.3.1.Acetobacter xylinum
Là những trực khuẩn hình que (2µm), đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi,
không di động các tế bào được bao bọc bởi chất dầy, tạo váng nhanh khá dày, bắt
màu xanh với thuốc nhuộm Iốt và H2SO4

2.3.2. Acetobacter aceti
Nguyễn Thị Quang

10

K29A-Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Trực khuẩn hình que không di động, bắt màu gram âm màu vàng với
thuốc nhuộm Iốt. Chúng tạo khuẩn lạc sám trên gelatin với dịch lên men chứa
10% đương xacaroza thường phát triển trên bia
2.3.3.Acetobacter Pasteurianum
Bắt màu xanh với thuốc nhuộm Iốt, tạo thành váng khô và nhăn nheo. Tế
bào xếp rời nhau thành chuỗi, nhiệt độ thích hợp là 30oC
2.3.4.Acetobacter kiitzingianum
Là vi khuẩn có màng nhầy, nhẵn ở mép và được nâng lên theo thành bình.
Trực khuẩn ngắn, to, thô, không di động, tạo thành màng xếp nếp trên các môi
trường lỏng
2.3.5.Acetobacter acetosum
Các tế bào xếp riêng rẽ thành từng chuỗi, không di động, nhiệt độ thích
hợp 30-> 36oC
2.3.6.Acetobacter scutzenbacri
Có dạng hình que, thường đứng riêng rẽ hoặc xếp thành đôi, có thể tạo
thành những dạng tế bào đặc biệt. Trong môi trường có thể tích luỹ tới 11,5%
axit axetic
2.3.7.Acetobacter lindsni
Trực khuẩn xếp riêng rẽ tạo thành chuỗi, đôi khi bắt gặp các tế bào phình
to như hình cầu. Trên các môi trường lỏng, váng vi khuẩn có màu vàng nâu,

nhớt.
2.3.8.Acetobacter subxydans
Dạng hình que, đứng riêng rẽ hay xếp thành chuỗi ngắn, không có khẳ
năng di động, tạo thành những màng mỏng dễ tan vỡ.
2.3.9.Acetobacter hoshiakii
trực khuẩn, thường xếp riêng rẽ, không di động. Khuẩn lạc trên thạch với
chất chiết rút đậu nành nhỏ, tròn, ở dạng hạt sáng, sau đó chuyển màu nâu.
Khuẩn lạc trên thạch với dịch lên mem tròn, màu trắng sữa, về sau ở giữa hoá
nâu, phần ngoài màu vàng nhạt.
2.3.10.Acetobacter ascendens
Trực khuẩn không di động, các khuẩn lạc trên Glucoza, gelatin khô, trắng,
với vùng sáng chói trên các môi trường lỏng tạo màng dày, chắc.
Nguyễn Thị Quang

11

K29A-Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

2.3.11.Acetobacter oxydans
Trực khuẩn, các tế bào rời nhau, có khả năng di động, khuẩn lạc trên
gelatin tròn, sau đó thành những dạng không phân nhánh đặc trưng
2.3.12.Acetobacter plicatum
Trên vài môi trường chúng được nhộm màu như nhau. Ở 28->30oC tạo
thành những khuẩn lạc phồng to kéo dài, khuẩn lạc trên gelatin rượu vang tròn,
hơi nhô lên, ẩm ướt
2.3.13.Acetobacter orleanense
Trực khuẩn dài trung bình, gặp nhiệt độ cao có thể sinh ra dị hình kéo dài,

hoặc phình to ra, váng vi khuẩn tạo ra rất dày ở trên môi trường lỏng. Tích luỹ
được 4,5% axit axetic, thường dùng để sản xuất rượu vang
Tóm lại
Các loại Acetobacter thường phát triển tốt ở nhiệt độ 25-> 30oC. Một số
loại có khả năng tổng hợp vitamin B1, B2, một số loại có khả năng chuyển hoá
rượu socbit thành đường socboza. Chúng được sử dụng trong công nghiệp dược
phẩm sản xuất vitamin C, có khả năng oxi hoá rượu thành axit axetic
Dựa vào đặc điểm trên người ta ứng dụng sản xuất đối với từng chủng
nhưng trong sản xuất để quá trình lên men đạt hiệu quả cao không dùng hỗn hợp
nhiều loại vì trong hỗn hợp có thể gặp loại oxi hoá axit axetic trong khi môi
trường vẫn còn rượu etylic
2.4.Cơ sở khoa học của sự lên men axetic
Người ta gọi quá trình chuyển hoá rượu thành axit axetic là quá trình lên
men axetic hay lên men giấm [5.6]. Nhưng thực ra đây là quá trình oxi hoá khử
nhờ một nhóm vi khuẩn thuộc chi Acetobacter chúng thuộc hai giống
Acetobacter chu mao hoặc không và gluconobacter đơn mao
Bản chất sinh học của quá trình chuyển hoá rượu etylic thành axit axetic
được Kiittzing nêu lên đầu tiên vào năm 1838, đến năm 1868 Pasteur đã xác
nhận sự đúng đắn của nó. Ông cho rằng sự oxy hoá rượu etylic thành axit axetic
có liên quan mật thiết đến việc hấp thụ một lượng lớn oxy. Liebig (1851), người
đầu tiên xác định sự có mặt của axêtaldehit như một sản phẩm trung gian của quá
trình oxy hoá rượu thành axit axetic. Henegerg (1898) xác định phản ứng xảy ra
theo hai giai đoạn:
Nguyễn Thị Quang

12

K29A-Sinh

Khoá luận tốt nghiệp

Giai đoạn 1: Rượu etanol được chuyển thành axetaldehit
Giai đoạn 2: Axetaldehit được hydrat hoá thành axit axetic
Tiếp theo đó có nhiều tác giả nghiên cứu về cơ chế quá trình này
Trên cơ sở đó các tác giả đã xây dựng được một sơ đồ chung cho quá trình
oxy hoá này.
Rượu etylic dưới tác dụng của enzym oxi hoá khử bị oxi hoá đến
axetaldehit, axetaldehit tiếp tục bị các alhidrogenaza oxi hoá đến axit axetic.
Trong quá trình này các điện tử được giải phóng đều được chuyển đến các
coenzym của các enzym này như: NADP-> NADPH2 Phương trình tổng quát của
quá trình lên men như sau.
CH3CH2OH + O2 -> CH3COOH + H2O + 494.4 (KJ) hoặc 117 Kcal
Acetobacter là vi khuẩn hiếu khí có khả năng oxy hoá các cơ chất trong
điều kiện hiếu khí nhưng lại tạo ra các sản phẩm chưa được oxy hoá hoàn toàn
như axit axetic, giống như sản phẩm lên men kị khí nên người ta gọi là quá trình
oxy hoá không hoàn toàn [15]
2.5.Các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình lên men axetic
2.5.1.Nhiệt độ
Vi khuẩn axetic thuộc nhóm ưu ẩm nhiệt độ thích hợp là 25 -> 30oC. Nếu
nhiệt độ quá thấp sẽ làm quá trình lên men diễn ra chậm, cong khi nhiệt độ cao
sẽ ức chế hoạt động của vi khuẩn và đến một mức nào đó thì quá trình sinh sản
của vi khuẩn sẽ bi đình chỉ làm giảm hiệu suất của quá trình lên men [10,15]
2.5.2. Ảnh hưởng của các hợp chất vô cơ và hữu cơ
2.5.2.1. Sự axit hoá dịch lên men
Trong quá trình sản xuất giấm người ta thường đưa vào cơ chất ban đầu
một lượng giấm nhất định để axit hoá môi trường nhằm mục đích: Ngăn cản sự
phát triển của vi sinh vật có hại và đưa vào dịch lên men một lượng vi khuẩn
nhất định.
Độ axit ban đầu có thể dao động từ 2->6% Theo nghiên cứu của Eapen và

Rao 1979 thì hiệu xuất cao nhất đạt được ở độ axit ban đầu của cơ chất là 2%.
Nhưng nếu lượng axit cao hơn sẽ hạn chế sự sinh trưởng của vi khuẩn, làm giảm
khả năng lên men. Nodes cho rằng lượng axit axetic cần hoạt hóa là 2->2.5%[10]

Nguyễn Thị Quang

13

K29A-Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

2.5.2.2. Hàm lượng etylic trong dung dịch lên men
Rượu etylic được sử dụng như một cơ chất, hàm lượng có thể thay đổi từ 2
-> 10 %, nếu hàm lượng cao hơn sẽ làm giảm năng suất lên men
Để tránh hiện tượng oxy hoá tiếp tục axit axetic thành CO2 và H2O cần
một lượng rượu sót trong sản phẩm từ 0.2-> 0.5%. Lượng rượu này có tác duụng
ức chế tổng hợp enzym oxi hoá axit axetic và muối axetat [10]
2.5.2.3. Ảnh hưởng của các hợp chất chứa C, N, P
Để quá trình lên men xảy ra nhanh trong dung dịch lên men, ngoài
glucoza, rượu etylic, dung dịch lên men cần được bổ sung một số muối khoáng
như: (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4, KH2PO4, MgSO47H2O, CaHPO4… tuỳ theo nhu
cầu cụ thể của từng loại. Ngoài ra cần bổ sung thêm vitamin và chất kích thích
sinh trưởng như pepton, cao nấm mem, cao thịt [7, 8, 9, 10]
2.5.2.4. Ảnh hưởng của oxy
Theo cơ chế của quá trình lên men để oxy hoá một mol rượu cần một mol
O2.Trong thực tế nhiều tác giả cho thấy lượng oxy cần thiết phải lớn hơn gấp đôi
lượng oxy lý thuyết. Thựec tế cho thấy, càng thoáng khí, năng suất càng cao. Vì
vậy quá trình lên men kéo dài 3 ->5 tuần, nồng độ giấm thu được 3 -> 7 % axit

axetic. Trong khi đó phương pháp tuần hoàn nhờ tạo bề mặt tiếp xúc lớn hơn lên
quá trình rút xuống 5 ->7h. Ở phương pháp chìm thời gian chỉ còn 3->4 ngày
[10]
2.6.Các tiêu chuẩn phân loại Acetobacter
2.6.1. Địa điểm nơi phân lập
2.6.2. Đặc điểm hình thái
Quan sát hình dạng và cách sắp xếp tế bào, sự hình thành vỏ nhầy, tiêm
mao, khả năng di động, màu sắc tế bào khi nhuộm gram, khả năng sinh bào tử.
2.6.3. Đặc điểm nuôi cấy
Vi khuẩn Acetobacter ở trên các môi trường khác nhau thì phát triển khác
nhau. Trên môi trường đặc cần lưu ý quan sát trạng thái vết mọc, đặc điểm vết
mọc, màu sắc. Trên môi trường thạch đĩa cần lưu ý hình dạng kích thước khuẩn
lạc [3,14]

Nguyễn Thị Quang

14

K29A-Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

2.6.4. Đặc điểm sinh lý
Bao gồm quan hệ của vi khuẩn với nhiệt độ, pH của môi trường, khả năng
hình thành sắc tố, kị khí hay hiếu khí, khả năng lên men. Cần đi sâu nghiên cứu
một số đặc điểm sinh hoá, phương pháp hiện nay đang được là tính và so sánh tỷ
lệ

AT

GX
hoặc
trong tế bào hoặc nhân [3]
GX
AT

Nguyễn Thị Quang

15

K29A-Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

PHẦN 3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tượng nghiên cứu
Đó là các chủng vi khuẩn acetobacter xylinum thuần khiết được phaâ lập từ
màng giấm, nước dừa và dịch hoa quả.
3.2.Hoá chất và môi trường
 Hoá chất
Các loại đường; Glucoza, Xacaroza, Fructoza
Một số chất vô cơ như: K2HPO4, KH2PO4, MgSO47H2O, (NH4)2SO4,
(NH4)2HPO4, CaCO3, NaOH…
Một số chất hữu cơ như: Rượu etylic, axit axetic, pepton, agar…
Dụng cụ và thiết bị: Hộp lồng, ống nghiệm, pipec, bàn trang thuỷ tinh, que
cấy, đèn cồn, các loại bình cầu, bình tam giác, nồi hấp, tủ sấy, buồng vô
trùng, cân phân tích, kính hiển vi.
 Môi trường
MT1 dùng cho phân lập

Nước máy
C6H12O6
Agar
CaCO3
(NH4)2SO4
K2HPO4
(NH4)2HPO4
KH2PO4
MgSO47H2O

Nguyễn Thị Quang

MT2: Tuyển chọn
1000ml

Nước máy

1000ml

20g
20g
8g
5g
5g
2g
2g
2g

CH3COOH
C6H12O6

Agar
Pepton
K2HPO4
(NH4)2HPO4
MgSO47H2O
CaCO3

2ml
20g
20g
5g
5g
2g
2g
8g

16

K29A-Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

MT3: Môi
trường nghiên
cứu
Nước máy
C6H12O6
pepton
(NH4)2SO4

K2HPO4
(NH4)2HPO4
MgSO47H2O

MT4: Thử khả năng tạo
màng
1000ml
20g
5g
8g
5g
2g
2g

Nước dừa
SA(amonisunfat)
DAP(amoniphotphodipazic)
Sacaroza

1000ml
0,8%
0,2%
2%

3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Phân lập các chủng vi khuẩn Acetobacter theo phương pháp của
Vinogradski
Để có các chủng vi khuẩn Acetobacter chúng tôi tiến hành phân lập chúng từ
các dịch lên men như: giấm, nước hoa quả, bia, nước dừa. Nguồn nguyên liệu
này được pha loãng trên môi trường 3. Xác định hàm lượng đường, rượu

etylic, axit axetic trên cơ sở đó chuẩn bị môi trường có thành phần thích hợp,
có đủ dinh dưỡng, nguồn cacbon, nitơ, rượu etylic tạo điều kiện cho chúng
phát triển tốt. Môi trường lên men được pha chế, phân vào các bình tam giác
hoặc bình cầu, khử trùng trong nồi hấp ở 0,5 at, để nguội, bổ sung rượu etylic
đưa vào tủ ấm có nhiệt độ 28-300C trong 7-15 ngày. Vi khuẩn axetic là loại
hiếu khí vì vậy trên môi trường lỏng bao giờ cũng tạo thành màng, màng đó
chính là tập hợp tế bào vi khuẩn axetic. Tiếp đó chúng tôi thu nhậnvi khuẩn
axetic. Sau khi đã có dịch lên men, để có được các chủng vi khuẩn thuần
khiết, đầu tiên sử dụng phương pháp pha loãng pasteur, Việc pha loãng được
thực hiện với dung dịch NaCL 0,5% vô trùng hoặc nước cất, pipet vô trùng,
ống nghiệm vô trùng(10 ống). Cho vào mỗi ống nghiệm 9ml nước cất, dùng
pipet hút 1ml dịch len men cho vào ống nghiệm đã chứa sẵn 9ml nước cất
trên, lắc đều ta được dung dịch pha loãng 10-1. Từ ống nghiệm này lại hút 1ml
dịch cho vào ống nghiệm có sẵn 9ml nước cất thứ 2, khuấy đều được dung
Nguyễn Thị Quang

17

K29A-Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

dịch pha loãng có nồng độ 10-2. Cứ tiếp tục như vậy hết 10 ống nghiệm ta
được các dung dịch pha loãng từ 10-1 đến 10-10. Các mức pha loãng này quyết
định số lượng vi sinh vật dự kiến ban đầu có trong mẫu.
Sau khi có dung dịch pha loãng tiến hành phân lập trên môi trường thạch
đĩa(môi trường 1). Ta dùng pipet hút 1 lượng nhỏ dung dịch pha loãng ở mức
độ nhất định( thường 10-7- 10-9), mở nắp đĩa không quá to, nhỏ 1 giọt dung
dịch pha loãng vào. Dùng bàn trang vô trùng, trang một lượt đều khắp mặt

thạch, thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Tuy nhiên môi trường thạchđĩa trước
đó phải được khử trùng bằng nồi hấp ở 0,5 at trong thời gian 3 ngày liên tiếp,
sau đó đổ ra hộp lồng để đông lại mới tiến hành phân lập. Các dụng cụ khác
cũng phải được khử trùng bằng nồi hấp sau đó sấy khô.
Sau khi phân lập được 4-7 ngày thì trên môi trường xuất hiện những khuẩn
lạc mọc riêng rẽ. Chọn những khuẩn lạc có vòng phân giải lớn đường kính từ
0,8mm trở lên [2,6,11,12,13]
3.3.2.Tuyển chọn các chủng vi khuẩn Acetobacter thuần khiết
Dùng que cấy( đã được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn) gợt lấy từng khuẩn
lạc riêng rẽ và cấy vào các ống thạch nghiêng( môi trường 2). Môi trường này
cũng phải được khử trùng bằng nồi hấp ở 0,5 at thời gian 30 phút trong 3
ngày, sau đó đặ vào các ống nghiệm đặt nghiêng để nguội, môi trường đông
lại là được. Mỗi ống là một mẫu, mẫu nuôi được mã hoá dưới 1 kí tự riêng để
vào tủ ấm. Sau 5-6 ngày các chủng vi khuẩn này sẽ phát triển theo đường cấy.
Tiếp theo làm mẫu tiêu bản nhuộm gram và quan sát hình dạng tế bào dưới
kính hiển vi, cách làm như sau:
Bước 1: Rửa sạch lam kính bằng NaOH sau đó rửa lại bằng HCL hoặc
H2SO4. Cuối cùng rửa lại bằng cồn, nước cất và lau khô.
Bước 2: Nhỏ 1 giọt nước vô trùng lên lam kính, dùng que cấy đã khử trùng
lấy 1 ít vi khuẩn trong ống nghiệm hoà vào giọt nước vô trùng trên lam kính.
Hơ qua trên ngọn lửa đèn cồn để cố định vết bôi
Đặt lên vết bôi miếng giấy lọc, nhỏ dung dịch tim gentian giữ trong 1-2 phút.
Lấy miếng giấy lọc ra, nghiêng cho thuốc nhuộm chảy xuống chậu hứng, nhỏ
dung dịch lugon lên vết bôi giữ trong 5 phút. Rửa tiêu bản bằng nước,

Nguyễn Thị Quang

18

K29A-Sinh

Khoá luận tốt nghiệp

cồn(20s) rửa lại bằng nước. Nhỏ dung dịch Fuchsin lên giữ trong 1-2 phút,
rửa nước, hong khô tự nhiên.
Mục đích của phương pháp này là để phân loại vi khuẩn: phân loại vi khuẩn
gram âm (Gr-)và vi khuẩn gram dương(Gr+). Nếu sau khi nhuộm kép mà tế
bào bắt màu hồng thì đó là vi khuẩn Gr-, nếu bắt màu tím là vi khuẩn Gr+. Vi
khuẩn Gr+ là do chất nguyên sinh của tế bào được cấu tạo từ 1 loại protein
đặc biệt có chứa muối nucleatmagie. Muối này có khả năng tạo với tím
gentian và lugon thành một phức chất bền khó bị rửa trôi bởi cồn nên khi
quan sát tế bào vi khuẩn Gr+ bắt màu tím( màu của gentian). Trong khi đó
những vi khuẩnGr-+ không có khả năng tạo phức chất bền với thuốc nhuộm
gentian và lugon nên dễ bị rửa trôi bởi cồn. Do đó khi nhỏ fuchsin lên tế bào
vi khuẩn Gr- sẽ bắt màu hồng( màu của fuchsin)
Có thể sơ tuyển các chủng vi khuẩn Acetobacter bằng cách thử khả năng oxi
hoá etanol trên 2 môi trường A và B
Môi trường A: Dịch chiết nấm men 3%, CaCO3 2%, agar 2%, rượu etylic
15%- 2ml. Khi nhân giống vi khuẩn axetic nếu là Gluconobacter sẽ tạo một
vòng sáng xung quanh khuẩn lạc, nếu là Acetobacter vòng sáng rõ hơn nhiều
và có một lớp cặn đục ở viền khuẩn lạc hướng về phía vòng sáng
Môi trường B: Dịch chiết nấm men 3%, agar 2%, xanh lục Bromclesol 1ml
của dung dịch 2,2%, rượu etylic 15%- 1ml.
Khi cấy giống vi khuẩn axetic nếu là Gluconobacter nó sẽ làm cho môi
trường biến thành màu vàng. Nếu là Acetobacter cũng làm biến đổi môi
trường thành màu vàng nhưng có một váng màu xanh lơ do quá trình oxi hoá
các axit[ 12]
Để giữ giống cần tiến hành cấy chuyển 2 tháng 1 lần từ ống thạch nghiêng
này sang ống thạch nghiêng khác [11, 12, 13]

3.3.3. Phương pháp tuyển chọn các chủng vi khuẩn A. xylinum cho màng
dày
Sau khi đã tuyển chọn được các chủng Acetobacter thuần khiết, chúng tôi tiến
hành tuyển chọn các chủng A. xylinum cho màng dày để nghiên cứu tiếp,
phương pháp tuyển chọn như sau:

Nguyễn Thị Quang

19

K29A-Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Cấy các chủng vi khuẩn Acetobacter thuần khiết được lựa chọn bằng 2
phương pháp trên ở các ống thạch nghiêng sang môi trường nước dừa( môi
trương 4), sau đó:
- Quan sát quá trình hình thành màng và đo độ dày màng khi màng đạt độ
dày nhất định .
- Quan sát đặc điểm màng tạo thành trên môi trường lỏng, dày hay mỏng,
nhăn hay trơn, dễ vỡ hay dai, có ăn thành bình hay không.
- Quan sát hình dạng tế bào trên kính hiển vi
- Xác định hàm lượng axit axetic tạo thành của mỗi mẫu vi khuẩn A.
xylinum
- Quan sát môi trường nuôi cấy đục hay trong.
- Nghiên cứu đặc tính sinh lí của các chủng đã chọn được.
3.3.4. Phương pháp xác định số lượng tế bào của các chủng vi khuẩn
Acetobacter
Để xác định số lượng tế bào vi khuẩn trên môi trường cấy nhanh, đơn giản,

chúnh xấct dùng phương pháp đếm số lượng tế bào trên buồng dếm hồng cầu.
Dụng cụ dùng để đếm là buồng đếm Goriaep. Đó là một phiến kính dày có các
đường kẻ ở giữa để chia thành 400 hình vuôngcó diện tích tổng cộng là 1400m2
Cách tiến hành: Lắc đều canh trường, dùng pipet chia độ pha loãng canh trường
ở các mức độ 10-1- 10-7 tuỳ theo giai đoạn phát triển của vi khuẩn trong môi
trường mà pha loãng ở độ pha loãng khác nhau. Dùng pipet vô trùng nhỏ 1 giọt
vào khe hở giữa 2 lưới đếm và lamen
-Cách đếm: Đếm trong 5 ô lớn chéo nhau hình dấu (x). Đếm 4 ô ở 4 góc và 1 ô ở
giữa. Để đảm bảo độ chính xác đếm lặp lại 3-4 lần
Cách tính số lượng tế bào : X=a.50xf
X: Số lượng tế bào trong 1ml canh trường
A: Số tế bào trung bình có trong 1 ô
F: Hệ số pha loãng
Sau đó xử lí số liệu bằng thống kê toán học
3.3.5.Xử lí số liệu bằng thống kê toán học
3.3.5.1: Tính giá trị trung bình cộng các chỉ số

Nguyễn Thị Quang

20

K29A-Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

M=

1 n
 Xi

n i 1

M: Tb cộng các chỉ số tạo thành
Xi: Chỉ số tạo thành
n: Số lần thí nghiệm
3.3.5.2.T rung bình bình phương các sai biệt cho biết số lần thí nghiệm thu được
sai khác nhau nhiều hay ít  

 ( Xi  M )2
n 1

δ: Trung bình bình phương các sai biệt của chỉ số tạo thành
3.3.5.3: Sai số đại diện trung bình cộng
 m 


n

3.3.5.4. Hệ số biến thiên trung bình cộng các chỉ số tạo thành
Cv=


M

.100 

m
M

Nguyễn Thị Quang

n .100

21

K29A-Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1. Phân lập vi khuẩn acetic từ màng của bia, chuối, giấm, nước dừa,
tuyển chọn các chủng vi khuẩn A. xylinum
Để tiến hành phân lập, trước tiên chúng tôi tiến hành làm dịch lên men.
Cho vào bình cầu hoặc bình tam giác có dung tích 500 ml khoảng 200 ml
nước hoa qua hoặc giấm, thêm vào đó 1 ml rượu etylic và axit hoá môi trường
bằng 2 ml axetic, có thể có vài lát chuối tiêu chín đã bóc vỏ với mục đích
cung cấp thêm nguồn gluxit, vitamin cho vi khuẩn axetic phát triển, đạy bằng
nút bông, cho vào tủ ấm 300C. Sau 5-7 ngày trên bề mặt thoáng của bình cầu
sẽ xuất hiện lớp màng màu trắng, màng đó chính là tập hợp tế bào vi khuẩn
axetic có trong dịch lên men từ các nguồn nguyên liệu kể trên[11,12,14]
Hình 1 :Mẫu dịch lên men từ nguồn nguyên liệu là giấm

Nguyễn Thị Quang

22

K29A-Sinh

Khoá luận tốt nghiệp

Khi đã có dịch lên men tôi tiến hành phân lập tạo các mẫu vi khuẩn Acetobacter.
Để phân lập được các vi khuẩn acetic ta dùng que cấy hoặc đũa thuỷ tinh đã vô
trùng lấy dịch chiết lên men hoặc lấy 1 lượng màng nhất định cho vào nước vô
trùng đánh tan đều . Tiếp theo tiến hành pha loãng theo phương pháp pasteur ở
các độ pha loãng khác nhau từ 10-1 -10-10 Sau đó gieo cấy trên môi trường thạch
đĩa (mt 1) đã được hấp để khử trùng để tách khuẩn lạc riêng rẽ. Sau khi phân lập
được 4-7 ngày trên bề mặt môi trường thạch đĩa xuất hiện những khuẩn lạc có
kích thước to nhỏ khác nhau . Hầu như các khuản lạc có đường kính từ 0,6-2,4
mm, bề mặt trơn bóng, phần giữa dày lên và sẫm màu hơn các phần xung quanh.
Cũng có dạng bề mặt xù xì, nhăn nheo.
Hình 2 : Khuẩn lạc vi khuẩn acetic ở độ pha loãng 10-8

Nguyễn Thị Quang

23

K29A-Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Sau khi đã có khuẩn lạc trên môi trường thạch đĩa dùng que cấy đã được khử
trùng trên ngọn lửa đèn cồn gợt lấy từng khuẩn lạc riêng rẽ. Mỗi khuẩn lạc
cấy trên 1 ống thạch nghiêng và là 1 mẫu , mỗi mẫu được mã hoá bằng 1 kí tự
riêng. Sau 1 thời gian phân lập và tuyển chọn liên tục tôi đã tuyển chọn được
60 mẫu vi khuẩn acetic từ các nguồn nguyên liệu nói trên. Sau 3-5 ngày các tế
bào này phát triển theo đường cấy
Hình 3 : Vi khuẩn acetic trên môi trường thạch nghiêng

Tiếp theo tôi tiến hành nuôi cấy 60 mẫu vi khuẩn này vào môi trường số 3 .
Khi nuôi cấy được 15 ngày cần kiểm tra khả năng oxi hoá etanol và xác định
xem các mẫu đó là Acetobacter hay Gluconobacter. Trong 60 mẫu đó tôi xác
định được 6 mẫu là chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum. So sánh với đặc
điểm của vi khuẩn A.xylinum tôi thấy vi khuẩn A.xylinum là loại trực khuẩn
hình que 2µm đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi, không di động, các tế bào
được bao bọc bởi chất nhầy tạo váng nhăn và dày, bắt màu xanh với thuốc
nhuộm Iot và H2SO4

Nguyễn Thị Quang

24

K29A-Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Căn cứ vào đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hoá của vi khuẩn A.xylinum tôi
khẳng định 6 chủng đã chọn là vi khuẩn A.xylinum, kí hiệu từ A1-> A6
4.2. Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái sinh lí, sinh hoá của vi khuẩn
A. xylinum
Tôi dùng 6 chủng vi khuẩn A. xylinum nuôi cấy sang môi trường nước dừa(
mt 4). Môi trường này được khử trùng ở 0,5 at, trong 30 phút để nguội, cấy
giống vào. Theo dõi khả năng tạo màng, quan sát hình dạng tế bào trên kính
hiển vi quang học
4.2.1. Quan sát khả năng tạo màng của 6 chủng vi khuẩn A.xylinum
Khi cấy sang môi trường nước dừa tôi thấy 1 ít chủng màng xuất hiện ở ngày
thứ 3, đa số xuất hiện ở ngày thứ 5. Ba ngày đầu kể từ khi xuất hiện màng dày

nhanh , những ngày sau đó màng phát triển nhưng chậm lại, môi trường cấy
có cả đục và trong. Sau 20 ngày nuôi cấy kết quả thu được ở bảng 1
Bảng 1: Khả năng tạo màng của 6 chủng vi khuẩn A.xylinum

STT Ký hiệu chủng
1
2
3
4
5
6

A.xylinum A1
A.xylinum A2
A.xylinum A3
A.xylinum A4
A.xylinum A5
A.xylinum A6

Khả năng tạo màng
Rất mỏng Mỏng
+
++
+
++
-

Dày
+++
+++

Môi trường
nuôi cấy
Đục
Trong
+
+
+
+
+
+
-

Ghi chú:
Dấu (+): có
Dấu (-): Không
Dấu (++): Màng dày tăng dần
Dấu (+++): Màng rất dày và tăng lên nhanh[12]
Kết quả bảng 1 cho thấy 6 chủng vi khuẩn A. xylinum đều có khả năng tạo
màng dày. Kết quả thực nghiệm đã chỉ ra:
Nguyễn Thị Quang

25

K29A-Sinh