Nghiên cứu xác định hàm lượng vitamin c trong một số loại rau bằng phương pháp von ampe

SVTH: Lê Thị Thu Huyền

Khóa luận tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
Vitamin C (Vit.C) hay còn gọi là axit L-ascobic là một trong những loại
hợp chất quan trọng đối với sự sống của con người.
Vit.C đóng vai trò thiết yếu trong các quá trình sinh hóa xảy ra trong cơ
thể người, nó tham gia vào quá trình trao đổi chất, điều tiết quá trình sinh tổng
hợp hoormon, là chất đề kháng cho cơ thể sinh vật, chất chống lão hóa các tế
bào...Thiếu Vit.C sẽ gây ra một số bệnh nguy hiểm có thể dẫn đến tử vong.
Vit.C còn được sử dụng trong các ngành công nghiệp thực phẩm với
vai trò là chất chống oxi hóa. Nó giúp cho các sản phẩm giữ được sự tươi
ngon trong quá trình bảo quản. Nhiều loại hàng hóa trên thị trường như nước
giải khát, nước ép trái cây đóng hộp, bột dinh dưỡng cho trẻ em...chứa Vit.C
nhằm duy trì chất lượng cũng như là một tiêu chí quảng cáo sản phẩm.
Các loại rau xanh và hoa quả là những nguồn cung cấp Vit.C tự nhiên,
rất tốt cho sức khỏe. Ngoài ra Vit.C cũng được tổng hợp theo con đường nhân
tạo, đáp ứng nhu cầu cao về vitamin của cơ thể người cũng như của các ngành
công nghiệp có liên quan.
Tuy nhiên Vit.C là một chất rất dễ bị phân hủy trong điều kiện nhiệt độ
và ánh sáng bình thường. Do đó việc xác định nó trong các đối tượng trên một
cách chính xác, nhanh chóng là một yêu cầu hàng đầu được đặt ra. Ở Việt
Nam, phương pháp xác định Vit.C trong các phòng thí nghiệm chủ yếu vẫn là
phương pháp chuẩn độ thể tích, có độ chính xác và độ nhạy không cao. Theo
nghiên cứu Vit.C là một hợp chất có tính khử, có thể phân tích bằng các
phương pháp điện hóa đặc biệt là phương pháp von-ampe. Đây là một trong
những phương pháp phân tích hợp chất hữu cơ nhanh và đạt được độ chính

1

SVTH: Lê Thị Thu Huyền

Khóa luận tốt nghiệp

xác cao, hơn thế nữa chi phí cho máy móc và hóa chất rất phù hợp với điều
kiện của các phòng thí nghiệm ở Việt Nam. Vì vậy tôi chọn đề tài nghiên cứu:
NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG VITAMIN C TRONG MỘT
SỐ LOẠI RAU BẰNG PHƢƠNG PHÁP VON-AMPE
Nhiệm vụ chính đặt ra:
- Nghiên cứu quy trình xác định Vit.C bằng phương pháp von-ampe một
cách nhanh chóng, độ chính xác cao, chi phí thấp, dễ thực thi trong các
phòng thí nghiệm ở Việt Nam.
- Đánh giá độ tin cậy của quy trình phân tích.
- Ứng dụng xác định Vit.C trong đối tượng trên thị trường: một số loại
rau

2


SVTH: Lê Thị Thu Huyền

Khóa luận tốt nghiệp

NỘI DUNG
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. ĐẠI CƢƠNG VỀ VIT.C
1.1.1. Công thức và nhận định
Vit.C là tên thường gọi của axit L-ascobic, có tên quốc tế là:
2-oxo-L-threo-hexono-1,4-lactone-2,3-enediol hoặc

(R)-3,4-đyhdroxy-5-((S)-1,2-dihydroxylethyl)furan-2(5H)-one.
Công thức phân tử

C6H8O6

Khối lượng phân tử

176,1

Nhiệt độ nóng chảy

1930C

Công thức cấu tạo
6

CH2OH
5

OH
O

1

O

4
3

HO

pK1 ( C3–OH)

4,2

pK2 ( C2–OH)

11,6

2

OH

(*)

Trong công thức cấu tạo của axit ascobic, C4* , C5* là cacbon bất đối, vì
vậy tồn tại 4 đồng phân quang học: axit L-ascobic, axit izo L-ascobic, axit Dascobic, axit izo D-ascobic. Trong các đồng phân này chỉ có axit L-ascobic và
izo L-ascobic là có tác dụng chữa bệnh, còn các đồng phân D. và izo D. là các
antivitamin, tức là chất ức chế tác dụng của vitamin. Trong thiên nhiên chỉ tồn
tại dạng axit L-ascobic, còn các đồng phân khác chỉ thu được bằng con đường
tổng hợp.

3


SVTH: Lê Thị Thu Huyền

Khóa luận tốt nghiệp

Axit ascobic rắn là những tinh thể đơn tà, không màu, không mùi, có vị

chua, nóng chảy ở 1930C. Axit ascobic dễ tan trong nước, ít tan hơn trong
rượu và không tan trong các dung môi hữu cơ không phân cực.
Axit ascobic rất dễ bị phân hủy dưới tác dụng của ánh sáng, nhiệt độ vì
vậy cần bảo quản axit ascobic trong bóng tối và nhiệt độ thấp.
1.1.2.Tính chất hóa học
a, Tính khử
Axit ascobic là chất khử mạnh, có bán phản ứng như sau:
CH2OH

CH2OH

OH

OH
O

O

O

O


HO

+ 2H+ + 2e–

OH

O

O

Axit L-ascobic

Axit L-đehiđroascobic

Thế khử của nó phụ thuộc nhiều vào PH của môi trường.
Axit ascobic ở dạng khan khá bền vững, nhưng do trong phân tử có 2
nhóm OH đính vào C chưa no (C2, C3) nên khi bị ẩm ướt hoặc ở trong dung
dịch nó rất dễ bị oxi hóa, ngay cả bởi oxi không khí, nhất là khi có mặt các
ion kim loại đồng, sắt, magie theo phản ứng sau:
CH2OH

CH2OH

OH

OH

O

O

O

O



+ 1/2 O2
HO

OH

+ H2O
O

4

O


SVTH: Lê Thị Thu Huyền

Khóa luận tốt nghiệp

Sản phẩm tạo ra là axit L- đehiđroascobic, chất này cũng có hoạt tính
sinh học tương tự như axit L-ascobic, nhưng không bền, nó dễ bị thủy phân
phá vòng tạo axit 2,3-đixetogulonic CH2OH–(CHOH)2–CO–CO–COOH, là
chất không có tác dụng sinh lý.
Tốc độ oxi hóa axit ascobic thành axit L-đehiđroascobic càng lớn khi
PH càng tăng. Các chất saccarozơ, carotenoit, flavonoit...có khả năng làm
chậm quá trình oxi hóa của axit ascobic nên được dùng làm chất ổn định hóa
Vit.C.
Cơ chế sự phân hủy của axit ascobic bởi chất oxi hóa có thể được biểu
diễn theo sơ đồ sau:

5

SVTH: Lê Thị Thu Huyền

Khóa luận tốt nghiệp

CH2OH

CH2OH

COOH

OH

OH
O

C O

O

-2e, -2H+

H2O

C O

O

O
+2e, +2H+

OH

HO

COOH
COOH
H2O
CHO

OH
HO

O

O

OH
HO

CH2OH

Axit L-ascobic

Axit L-đehiđroascobic

CHO

COOH

OH

[O]

HO

OH
HO

CH2OH

CHO

[O]

Axit 2,3-đixetogulonic
COOH

[O]
HO

HO

CHO

[O]

CH2OH

COOH
COOH

CH2OH

COOH

CH2OH

[O]

C O

[O]

CH2OH
C O
CH2OH

HO
CH2OH

[O]

CH2OH

CH2OH

[O]

C O

CH2OH

[O]

COOH

[O]

C O
CH2OH

CH2OH

Có thể thấy, axit L-ascobic đầu tiên bị oxi hóa thành axit Lđehiđroascobic. Dưới tác dụng của nước, axit L-đehiđroascobic bị thủy phân
mở vòng tạo thành axit 2,3-đixetogulonic không còn hoạt tính vitamin nữa.
Phản ứng này không thuận nghịch, tăng nhanh theo PH và nhiệt độ của dung
dịch. Tiếp theo, axit 2,3-đixetogulonic bị phân hủy thành một loạt các sản
phẩm trung gian khác, cuối cùng tạo axit oxalic.
Ngoài sự phân hủy theo kiểu oxi hóa, axit ascobic còn có xu hướng
phân hủy theo kiểu thủy phân trong môi trường kiềm hoặc axit mạnh thành
fufurol và các sản phẩm khác qua phản ứng decacboxyl hóa và dehydrat hóa.
Tương tự như vậy, axit ascobic dễ dàng cho hiđro cho các peoxit, vì
vậy ngăn không cho các peoxit oxi hóa các hợp chất khác. Do đó người ta sử
dụng axit ascobic làm chất chống oxi hóa trong công nghiệp chế biến.
6


SVTH: Lê Thị Thu Huyền

Khóa luận tốt nghiệp

b, Tính axit
Trong dung dịch nước axit ascobic là một axit yếu ở nấc 1, pKa,1 = 4,2
tưong ứng với quá trình phân ly H+ của nhóm OH đính vào C3 (*), và rất yếu
ở nấc 2, pKa,2 = 11,6 tương ứng với sự phân ly H+ của nhóm OH đính vào C2
(*).
Axit ascobic dễ dàng phản ứng với dung dịch bazơ mạnh như NaOH,
KOH, Ca(OH)2 tạo muối.
CH2OH

CH2OH

OH

OH
O

O



O + NaOH
OH

HO

O + H2O
O

O

Các muối này dễ tan trong nước hơn axit ascobic nên trong công
nghiệp họ sử dụng dạng muối của axit ascobic làm chất bảo quản các dung
dịch nước quả.
Trong dung dịch kiềm đặc, vòng  -lacton bị phá vỡ tạo muối gluconat
CH2OH
OH
O
O + NaOH



CH2OH-(CHOH)3-C-COONa + H2O
‫׀׀‬

HO

O

OH

Tuy nhiên khi axit hóa và đun nhẹ thì vòng lacton lại lập lại.
c, Tác dụng với axit hữu cơ tạo este
Trong CTCT của axit ascobic có nhiều nhóm OH như nhóm chức rượu,
có khả năng tạo este với các axit hữu cơ, đặc biệt là các axit béo như axit

7


SVTH: Lê Thị Thu Huyền

Khóa luận tốt nghiệp

panmitic, axit stearic. Sản phẩm este dạng 6-O-axyl L-ascobic (ascobyl
panmitat, ascobyl stearat) có mạch cacbon dài, dễ tan trong dầu. Những este
này được tổng hợp dùng làm chất bảo quản chất béo trong công nghiệp chế
biến. Một số dẫn xuất khác của axit ascobic cũng được sử dụng là:
CH2OH

CH2OH

OH

OH
O

O

R
O

O

OR

HO

CH2OCOR

OH

5,6-O-ankyliden axit ascobic
CH2OH

CH2OH

OH

OH
O

O

O
O

OH

6-O-ankanoyl ascobat

OH

HO

3-O-ankyl axit ascobic

OH

HO

O

O

RO

2-O-ankyl axit ascobic

O

O

O

O

HO

OCOR

2-O-ankanoyl ascobat

ROCO

OH

3-O-ankanoyl ascobat

Trong đó, R là các gốc hiđrocacbon mạch dài, có thể no hoặc không no,
giúp cho các dẫn xuất của axit ascobic dễ tan trong dầu béo hơn.

1.1.3. Tính chất sinh lý
Vit.C có tác dụng tăng cường sức đề kháng cho cơ thể, chống lại các
hiện tượng choáng hoặc ngộ độc hóa chất, độc tính của vi trùng do tính chất
khử mạnh của Vit.C.
Vit.C tham gia vào quá trình oxi hóa khử khác nhau của cơ thể như:
chuyển hóa hợp chất thơm thành phenol; quá trình hydroxyl hóa triptophan
thành colagen, nhờ có quá trình hydroxyl hóa prolin thành oxyprolin cần thiết
cho việc tổng hợp colagen, vì vậy Vit.C làm cho vết thương mau lành.
8


SVTH: Lê Thị Thu Huyền

Khóa luận tốt nghiệp

Vit.C có vị trí quan trọng trong quá trình hình thành các hoormon của
tuyến giáp trạng và tuyến trên thận.
Khi cơ thể thiếu Vit.C sẽ xuất hiện các triệu chứng bệnh lý như chảy
máu ở lợi, răng, lỗ chân lông hoặc các cơ quan nội tạng. Đó là do thành các
mạch máu bị mỏng.
Cơ thể bình thường có nhu cầu Vit.C trong 24 giờ là 60–80 mg.
1.1.4. Các nguồn cung cấp Vit.C
Trong tự nhiên, thực vật tổng hợp được Vit.C, do đó Vit.C có nhiều
trong rau xanh đặc biệt là ớt và các loại rau cải, rau ngót..., trong các loại quả
như cam, chanh, bưởi, ổi, khế, táo, dưa hấu... Không thấy xuất hiện Vit.C
trong các sản phẩm từ động vật như thịt, trứng, sữa...
Một số cơ thể sống có khả năng tổng hợp Vit.C từ D-glucozơ nhờ tác
dụng của enzim theo sơ đồ sau:
HO
H

[O]

OH

HO
H

HO

H

H

O

H

enzim

[H]

H

OH

OH

HO

H

H

OH

CH2OH

H

O

HO

enzim

H

H

OH

H

OH

OH

H

H

COOH
COOH

CH2OH

CH2OH

enzim

CH2OH

[O]

OH

OH

O

O

OH

OH

H

H

enzim

O

O

HO

OH

Axit L - ascobic

9


SVTH: Lê Thị Thu Huyền

Khóa luận tốt nghiệp

Ngoài ra con người tổng hợp Vit.C nhằm các mục đích khác nhau. Các
chế phẩm dược chỉ chứa Vit.C, hay các viên Vitamin tổng hợp trong đó có
Vit.C dùng mục đích chữa bệnh, tăng cường sức đề kháng cho người ốm. Các
loại nước hoa quả giải khát, bột dinh dưỡng trẻ em, sữa...chứa một lượng nhỏ
Vit.C, là một tiêu chí quảng cáo cho sản phẩm. Một lượng lớn Vit.C làm chất
bảo quản thực phẩm.
Trong công nghiệp dược phẩm, Vit.C được tổng hợp qua các giai đoạn
sau:
OH

H
HO

H

H2/Ni

H

H

H

OH

HO

HO

HO

H

C O

oxi hoa

H

HO

Acetobacter xylinum

H
HO

H
CH2OH

CH2OH

D-Glucozơ

H

H+

HO C
Tautome hoa

H
H
CH2OH

HO

H+

OH

O

H

+2H2O,H+
-2CH3COCH3

[O]

O C

H3C
C
O H3C

H

H2C

CH3

O
H

10

O

H2C

CH2OH

Vitamin C

H

H

H

H

H

O

H

COOH

H
HO

O H3C

D-Sobozơ

C O
O

C

+2CH3COCH3

OC

HO C

O C

H3C

CH2OH

D-Sobitol

OC

HO

OH

OH

CH2OH

CH2OH

CH2OH

CHO

O

C
CH3

O

CH3
C
CH3


SVTH: Lê Thị Thu Huyền

Khóa luận tốt nghiệp

1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VIT.C
Có thể chia các phương pháp xác định Vit.C thành 2 nhóm lớn:
- Nhóm các phương pháp phân tích hóa học
- Nhóm các phương pháp phân tích công cụ
1.2.1. Phƣơng pháp phân tích hóa học
Trong các phương pháp phân tích hoá học, phương pháp chuẩn độ oxi
hóa khử được sử dụng nhiều nhất, dựa vào tính chất dễ bị oxi hóa thành axit
đehiđroascobic của axit ascobic. Để oxi hóa người ta sử dụng các thuốc thử
khác nhau như: 2,6-điclophenolindophenol, brom, iot, thuốc thử Feling...
2,6-điclophenolindophenol được coi như là thuốc thử chuẩn dùng để
chuẩn độ xác định Vit.C một cách trực tiếp. Nó là một chất oxi hóa có màu
xanh đậm, có công thức phân tử là C12H6Cl2NO2, max trong dung dịch nước =

602 nm. Khi phản ứng với axit ascobic nó bị khử thành một hợp chất không
màu.
C6H8O6 - 2H+ - 2e-

C6H6O6

C12H7Cl2NO2 + 2H+ + 2e-

C12H9Cl2NO2

Người ta có thể theo dõi quá trình chuẩn độ bằng mắt, đo quang hay đo
điện thế.
Việc chuẩn độ axit ascobic thông thường được tiến hành bằng cách nhỏ
từ từ dung dịch thuốc thử từ buret vào dung dịch nghiên cứu chứa axit ascobic
trong môi trường có PH thích hợp. Điểm cuối chuẩn độ được nhận ra khi có
sự xuất hiện màu của giọt thuốc thử dư đầu tiên. Phương pháp này có thể
được áp dụng trực tiếp để xác định Vit.C trong dược phẩm. Tuy nhiên trong
các đối tượng khác như rau quả, lương thực, thực phẩm thường chứa các chất
khử khác nữa và dung dịch nghiên cứu thường có màu và đục, gây khó khăn
cho việc xác định điểm cuối chuẩn độ.
11


SVTH: Lê Thị Thu Huyền

Khóa luận tốt nghiệp

Người ta cũng có thể chuẩn độ axit ascobic bằng dung dịch iot, với chất
chỉ thị hồ tinh bột để xác định Vit.C trong bắp cải, hoặc chuẩn độ gián tiếp,
xác định Vit.C trong mật ong, bằng cách thêm lượng dư dung dịch KBr vào

dung dịch mẫu đã được axit hóa bằng dung dịch H2SO4 1:1. Hỗn hợp này
được chuẩn độ bằng dung dịch KBrO3 cho đến khi xuất hiện màu vàng của
Br2 dư.
Thực chất đã xảy ra phản ứng:
5Br- + BrO3- + 6H+
C6H8O6 + Br2

3Br2 + 3H2O
C6H6O6 + 2Br- + 2H+

Khi hết axit ascobic lượng BrO3- cho vào, sẽ sinh ra Br2 không được
phản ứng tiếp. Sau đó lại xác định lượng Br2 dư đó bằng phương pháp chuẩn
độ iot bằng dung dịch natri thiosunphat chuẩn.
Tuy nhiên các phương pháp chuẩn độ tiến hành khá phức tạp, đồng thời
có độ chọn lọc, độ nhạy và độ chính xác không cao. Vì vậy từ khi các phương
pháp phân tích công cụ ra đời, người ta đã khắc phục được rất nhiều nhược
điểm của các phương pháp phân tích hóa học.
1.2.2. Nhóm các phƣơng pháp phân tích công cụ
Thời gian gần đây, cùng với sự phát triển như vũ bão trong tất cả các
lĩnh vực của xã hội, những yêu cầu đặt ra cho ngành phân tích là phải nhanh,
chích xác, quy trình đơn giản, lượng mẫu tiêu thụ nhỏ, không những tiết kiệm
tiền của, công sức mà cả thời gian cho xã hội. Với sự hỗ trợ của các phương
pháp phân tích công cụ và những thiết bị hiện đại, việc xác định Vit.C cũng
đã đạt được những yêu cầu đó. Đặc biệt, quy trình phân tích nhanh và đa số
trường hợp không phải xử lý mẫu trước đã giảm thiểu được sự mất mát Vit.C
trong quá trình định lượng.

12

SVTH: Lê Thị Thu Huyền

Khóa luận tốt nghiệp

Các phương pháp công cụ có thể xác định Vit.C gồm các phương pháp
phân tích quang học và nhóm các phương pháp phân tích điện hóa.
Trong đó hầu hết các phương pháp đều xác định Vit.C một cách gián
tiếp. Như đã trình bày, dung dịch Vit.C là không màu, do đó không thể cho tín
hiệu đo quang ở vùng khả kiến, vì vậy người ta thường dùng một tính chất
nào đó của Vit.C mà sự biến đổi nồng độ Vit.C sẽ gây ra tín hiệu quang biến
đổi tương ứng, cùng tăng hoặc cùng giảm theo hàm lượng Vit.C. Hay khi
dùng phương pháp hấp thụ nguyên tử, do Vit.C rất dễ bị phân hủy ở nhiệt độ
cao nên không thể cho tín hiệu trực tiếp trên máy AAS. Người ta dùng một
ion kim loại mang tính oxi hóa (ví dụ Fe III) để tác dụng với Vit.C theo tỷ lệ
xác định. Việc xác định hàm lượng kim loại đó trên máy AAS là dễ dàng, từ
đó có thể tính ra hàm lượng Vit.C ban đầu. Nhóm các phương pháp điện hóa,
trong đó xác định Vit.C bằng phương pháp cực phổ, sử dụng điện cực giọt
thủy ngân, là trực tiếp dựa trên tính chất oxi hóa khử của Vit.C. Ngoài điện
cực giọt Hg, người ta còn dùng các điện cực biến tính, bằng cách tạo một lớp
màng có hoạt tính điện hóa với Vit.C trên bề mặt điện cực rắn.
Để hỗ trợ thêm cho các phương pháp phát hiện Vit.C, các kỹ thuật tách
cũng được kết hợp để tăng độ chính xác, độ nhạy và độ chọn lọc của phương
pháp phân tích. Có thể kể đến các kỹ thuật sắc ký, gồm sắc ký khí (GC), sắc
ký lỏng cao áp (HPLC) kỹ thuật tiêm mẫu phân tích vào dòng chảy (FIA).

1.2.2.1. Các phƣơng pháp phân tích quang học
Vit.C là chất rắn dạng tinh thể không màu, dung dịch Vit.C cũng trong
suốt nhưng nó dễ bị oxi hóa và có tác dụng ức chế hay xúc tác cho các phản
ứng phát quang. Thông qua đó người ta có thể định lượng Vit.C.

13


SVTH: Lê Thị Thu Huyền

Khóa luận tốt nghiệp

Các tác giả sử dụng các chất oxi hóa khác nhau và thông qua nó gián
tiếp xác định hàm lượng Vit.C.
Kali cromat được sử dụng làm chất oxi hóa axit ascobic, kali cromat
còn dư sẽ phản ứng với điphenyl cacbazit (DPC) có mặt axit nitric tạo phức
màu có max = 548 nm. Mật độ quang A đo ở max = 548 nm sẽ tỷ lệ thuận với
lượng kali cromat dư, và tỷ lệ nghịch với lượng Vit.C trong mẫu.
2CrO42- + 3C6H8O6 + 10H+
CrO42- + sym-DPC

Cr3+ + 3C6H6O6 + 8H2O

Cr-DPC phức ( max = 548 nm)

Cr (III) tạo ra trong phản ứng thứ nhất là rất nhỏ nên không đóng góp
đáng kể vào mật độ quang A đo ở max = 548 nm. Ưu điểm của phương pháp
là sử dụng hóa chất đơn giản, dễ kiếm, máy đo quang không đắt tiền, phổ biến
trong các phòng thí nghiệm.
Hơn nữa, theo nghiên cứu thì các chất khác có mặt trong đối tượng
nghiên cứu cùng với Vit.C: các hợp chất glucozơ, fructozơ, sucrozơ, lactozơ,
saccarozơ; các axit thường xuất hiện trong trái cây như axit xitric, axit oxalic,
axit malic, axit tactric; các muối natri clorua, canxi clorua; các chất có thể
xuất hiện trong thuốc tổng hợp như axit benzoic, axit salixilic,
axetaminophen,... không gây ảnh hưởng đến kết quả đo ở mức sai số  5% khi

hàm lượng của chúng gấp 200 lần lượng axit ascobic.
Trong điều kiện thí nghiệm đó, tác giả và cộng sự đã xây dựng được
đường chuẩn tuyến tính đến hàm lượng Vit.C đến 5µg/mL (tương ứng 5ppm,
khoảng 3.10-5 mol/L), và giới hạn phát hiện tới 0,02µg/mL (20ppm, khoảng
10-7 mol/L). Ứng dụng xác định Vit.C trong thuốc viên và thuốc nước chứa
Vit.C, nước ép hoa quả, các loại rượu hoa quả cho kết quả tốt.

14


SVTH: Lê Thị Thu Huyền

Khóa luận tốt nghiệp

Chen, Xu-wei và các cộng sự đã nghiên cứu quy trình xác định Vit.C
bằng phương pháp tiêm mẫu vào dòng chảy kết nối với detectơ đo quang.
Trên cơ sở sử dụng Fe(III) làm chất oxi hóa axit ascobic, sản phẩm Fe(II) sinh
ra tạo phức màu với 2,2’-đipiridin trong môi trường axit yếu (PH=5), kết quả
đo A ở max = 523nm sẽ tỷ lệ thuận với lượng axit ascobic trong mẫu. Ưu điểm
của phương pháp này là khả năng tự động hóa, cho phép xác định 60 mẫu
thuốc/giờ.
Trong khi đó, Yebra-Biurrun và cộng sự lại sử dụng pemanganat làm
chất oxi hóa axit ascobic, dùng kỹ thuật FIA và đầu ghi AAS để xác định hàm
lượng Mn(VII) còn dư, Mn(II) tạo ra sẽ được giữ trên lớp nhựa poly (axit
aminophotphoric) sẽ không gây ảnh hưởng đến kết quả xác định Mn(VII) dư.
Theo báo cáo cho biết thì giới hạn phát hiện chỉ khoảng 0,06 µg/mL (khoảng
60ppm, 3,5.10-4mol/L), tuy nhiên điều này không quan trọng lắm, vì hàm
lượng Vit.C trong mẫu phân tích thường lớn. Nhưng quy trình phân tích này
cho phép xác định tự động 90 mẫu/h, có khả năng ứng dụng trong các phòng
phân tích của các nhà máy.

Việc tăng độ nhạy xác định Vit.C đạt được khi sử dụng các phản ứng
quang hóa mà axit ascobic có tác dụng xúc tác cho quá trình chuyển mức
năng lượng. Dựa trên phản ứng quang hóa của Rodamin B và Ceri(IV) trong
môi trường axit sunfuric, quy trình cho phép xác định Vit.C tới 10 -13 mol/L,
đường chuẩn tuyến tính trong khoảng 3,8.10-13 đến 10-10 mol/L.
Vit.C có khả năng phản ứng với nhiều chất oxi hóa khác nhau, do vậy
các tài liệu nghiên cứu xác định hàm lượng Vit.C bằng phương pháp phân tích
quang học rất phong phú và đa dạng. Tuy nhiên không tránh khỏi một phần
Vit.C có thể phản ứng với oxi không khí hay các chất khử khác cũng có thể
phản ứng với các chất oxi hóa đó.

15


SVTH: Lê Thị Thu Huyền

Khóa luận tốt nghiệp

1.2.2.2. Các phƣơng pháp phân tích điện hóa
1.2.2.2.1. Sơ lƣợc về phƣơng pháp von-ampe
•

Nguyên tắc của phương pháp
Phương pháp von-ampe (phương pháp phân tích cực phổ) là phương

pháp quan trọng nhất trong số các phương pháp phân tích điện hóa. Phương
pháp này dựa trên lý thuyết về quá trình điện cực, phụ thuộc chủ yếu vào việc
đưa chất điện hoạt từ trong lòng dung dịch đến bề mặt điện cực làm việc và
ghi đường von-ampe (đường biểu diễn sự phụ thuộc cường độ dòng Faraday
vào giá trị thế của điện cực làm việc so với điện cực so sánh).

•

Hình 1.1: Sơ đồ thiết bị phân tích von-ampe

SP: nguồn điện

SW: cầu chia thế

W: điện cực làm việc

R: điện cực so sánh

A: điện cực phù trợ

V: vôn kế

i: điện kế

16


SVTH: Lê Thị Thu Huyền
•

Khóa luận tốt nghiệp

Điện cực làm việc:
Phương pháp phân tích von-ampe sử dụng điện cực giọt Hg, hay dùng

là điện cực giọt treo (HMDE), điện cực giọt rơi (DME), và điện cực giọt tĩnh

(SMDE). Điện cực là giọt Hg lỏng hình cầu có đường kính khá nhỏ ( ≤ 1mm),
được rơi ra từ một mao quản có chiều dài khoảng 10-15 cm, với đường kính
trong khoảng 30-50 µm, mao quản được nối với bình chứa Hg bằng một ống
dẫn nhỏ polietilen.
Trong điện cực giọt rơi, giọt Hg liên tục được hình thành ở đầu ống
mao quản và rơi ra do lực hấp dẫn, kích thước và chu kì (hay tốc độ chảy) của
giọt Hg được điều khiển bởi kích thước mao quản và chiều cao của bình chứa
Hg. Tốc độ đó được quy ước tính bằng khối lượng Hg rơi ra khỏi mao quản
trong một vị thời gian (theo mg/s). Thông thường người ta chọn kích thước
mao quản và chiều cao bình chứa sao cho tốc độ chảy khoảng 1,5  4,0 mg/s.
Chu kì mỗi giọt khoảng từ 2-6s.
Trong điện cực giọt treo (thường dùng trong phân tích von-ampe hòa
tan và von-ampe vòng), giọt Hg có kích thước nhỏ, có thể thay đổi được tùy
theo yêu cầu thực nghiệm. Giọt được hình thành rất nhanh và được giữ ở đầu
mao quản trong quá trình đo.
Ưu điểm của điện cực giọt Hg
- Khoảng thế phân tích rộng, quá thế H2 trên điện cực giọt Hg lớn, vì
vậy mở rộng khoảng thế phân tích đến -1V (so với điện cực calomen bão hòa)
trong môi trường axit và đến -2V trong môi trường bazơ. Tuy nhiên do có quá
trình oxi hóa của Hg lỏng nên điện cực chỉ được sử dụng đến -0,3V hoặc 0,4V
(so với điện cực calomen bão hòa) tùy môi trường.

17


SVTH: Lê Thị Thu Huyền

Khóa luận tốt nghiệp

- Bề mặt giọt luôn được đổi mới và không bị làm bẩn bởi sản phẩm của

phản ứng điện cực.
- Với các điện cực hiện đại, giọt Hg được điều khiển bởi hệ thống van
khí, do vậy độ lặp lại của giọt cao, tăng độ lặp, độ đúng và độ chính xác khi
phân tích.
- Kích thước giọt nhỏ nên lượng chất tiêu tốn khi phân tích là không
đáng kể, do đó sự giảm nồng độ trong quá trình phân tích do sự oxi hóa khử
trên điện cực thực tế là không xảy ra.
•

Điện cực so sánh:
Thường hay sử dụng điện cực Ag/AgCl hay điện cực calomen bão hòa.

Điện cực so sánh phải có thế ổn định.
•

Sóng cực phổ khuyếch tán:
- Sóng cực phổ cổ điển có dạng bậc thang, dòng cực đại i d tỷ lệ tuyến

tính với nồng độ chất phân tích trong dung dịch id =f(C), người ta lợi dụng
tính chất này để phân tích định lượng. Tuy nhiên sóng cực phổ cổ điện có độ
phân giải không cao cũng như có dòng dư lớn. Do đó hạn chế độ nhạy của
phương pháp chỉ xác định được 10-5M, và khả năng xác định nhiều chất cùng
trong một hỗn hợp là khó khăn, độ chọn lọc kém. (Hình 1.2)
- Với kỹ thuật quét thế, kỹ thuật ghi dòng hiện đại đã khắc phục được
nhược điểm đó, đồng nghĩa với tăng độ nhạy lên rất nhiều. Có thể kể đến
+ Cực phổ sóng vuông (SqW)
+ Cực phổ dòng xoay chiều hình sin (AC)
+ Cực phổ xung thường và xung vi phân (NP và DP)
+ Các phương pháp von ampe trên điện cực đĩa quay

18


SVTH: Lê Thị Thu Huyền

Khóa luận tốt nghiệp

+ Phân tích điện hóa hòa tan
Với độ nhạy đối với
+ Cực phổ cổ điển (DC)

10-4 – 10-6 M

+ Cực phổ sóng vuông và xung vi phân

10-6 – 10-8 M

+ Von ampe hòa tan anot điện cực giọt Hg treo 10-6 – 10-9 M
+ Von ampe hòa tan anot dùng cực màng Hg

10-8 – 10-10 M

trên cực rắn đĩa
Có thể thấy các phương pháp phân tích điện hóa rất phong phú và đa
dạng. Phạm vi đối tượng nghiên cứu rộng, cả hợp chất vô cơ và hàng nghìn
hợp chất hữu cơ các loại. Trong đó Vit.C là một trong những hợp chất hữu cơ
được nghiên cứu ứng dụng xác định theo nhiều cách khác nhau dưới lý thuyết
của các phương pháp phân tích điện hóa.

1.2.2.2.2. Ứng dụng các phƣơng pháp phân tích điện hóa xác định Vit.C

Phương pháp phân tích điện hóa được dùng chủ yếu là phương pháp
von-ampe. Trong đó việc sử dụng điện cực thủy ngân đặc biệt là có sự hỗ trợ
của thiết bị điện tử, kết nối với máy vi tính, tăng độ nhạy và độ chính xác của
phép phân tích lên rất nhiều, đồng thời quy trình cho phép phân tích nhanh,
không cần xử lý mẫu phức tạp, tránh được sự mất mát Vit.C do sự oxi hóa của
không khí.
Trước năm 1950, phương pháp cực phổ cổ điển đã được áp dụng xác
địmh hàm lượng Vit.C trong nhiều mẫu thuốc, rau, quả. Nhiều công trình
nghiên cứu đã tìm được điều kiện thích hợp cho phép xác định Vit.C. Tuy
nhiên do giới hạn của phương pháp cực phổ cổ điển, mà việc định lượng

19


SVTH: Lê Thị Thu Huyền

Khóa luận tốt nghiệp

Vit.C vẫn bị gây cản trở bởi một số chất có thế khử gần với thế khử của axit
ascobic. Các hợp chất sunfuhydryl thường có mặt trong các mô thực vật là
một trong số đó. Vì vậy đối tượng phân tích còn hạn chế.
Gần đây, các kĩ thuật quét thế, và ghi dòng được hỗ trợ bởi các thiết bị
điện tử hiện đại, những máy điện hóa đa chức năng ra đời và rất phổ biến ở
các phòng thí nghiệm. Những nhược điểm đó được khắc phục, nhưng không
nhiều công trình nghiên cứu xác định Vit.C trực tiếp trên điện cực giọt thủy
ngân mà một số nghiên cứu đi theo hướng chế tạo điện cực biến tính, điện cực
sinh học. Chủ yếu là tạo màng sinh học, hay màng polime, các loại màng
được chế tạo đều có khả năng hoạt động điện hóa với axit ascobic.
Sự xuất hiện của ion Cu2+ có mặt trong các enzym trong vỏ quả dưa
chuột, và các loại quả khác, cũng như các ion Cu2+, Ni2+ được tạo ra trên bề

mặt màng polime là tác nhân oxi hóa axit ascobic. Tín hiệu đo được tỷ lệ
thuận với hàm lượng axit ascobic trong mẫu phân tích. Các chất khác có mặt
trong mẫu đều không ảnh hưởng đến phép phân tích. Giới hạn phát hiện theo
những nghiên cứu này đạt được lớn nhất là 2,5.10-7 M.
Khả năng tự động hóa tăng lên, cho phép xác định 120 mẫu/h. Tuy
nhiên tuổi thọ của các điện cực này ngắn, do trong quá trình phân tích, axit
ascobic đã khử các ion kim loại trên bề mặt điện cực. Để duy trì điện cực
người ta thường cho thêm vào hỗn hợp phản ứng một chất oxi hóa để tái tạo
các ion trên bề mặt, Julio Cesar đã dùng H2O2 là chất oxi hóa giúp tái tạo ion
Cu2+ từ ion Cu+, là sản phẩm của phản ứng điện cực với axit ascobic.
Quay trở lại điện cực giọt Hg, ngoài nhược điểm duy nhất là tính độc
của Hg thì nó vẫn là điện cực tối ưu trong phương pháp cực phổ xác định các
chất hữu cơ. Tuy nhiên các hãng sản xuất cũng đã khắc phục tối đa nhược
điểm này, kích thước hạt nhỏ ( đường kính < 1 mm ), nếu sử dụng giọt treo thì

20


SVTH: Lê Thị Thu Huyền

Khóa luận tốt nghiệp

khối lượng Hg cho phép đo là không đáng kể, có thể thu hồi được, ví dụ một
giọt Hg ở thiết bị phân tích điện hóa đa năng VA757 của Metrohm có diện
tích bề mặt từ 0,15 đến 0,60 mm2.
Thế của axit ascobic trên điện cực Hg, trong điều kiện nền thích hợp,
(so với điện cực Calomen bão hòa) cách khá xa thế khử của các ion kim loại
cũng như các vitamin và các hợp chất khác. Các vitamin A, D, B1, B2, B6,
B12, Bc đều có sóng cực phổ ở khoảng thế âm, từ -0,3V của Vit.B2 trong nền
đệm Britton-Robinson pH=1,81 đến -2,01V của vitamin D2 trong nền H2O:

dioxan 1:9, TBAOHO 1M, còn thế của Vit.C là +0,23V trong nền axetat
0,05M pH=3, NaNO3 0,01M. Thêm nữa, dùng kỹ thuật xung vi phân (DDP),
giúp cho việc xác định vị trí và chiều cao pic của Vit.C một cách rõ ràng và
chính xác. Điều này có nghĩa là có khả năng xác định trực tiếp Vit.C trên điện
cực giọt Hg mà không cần xử lý mẫu để loại những chất nền ảnh hưởng đến
bản chất hóa học của phương pháp. Quy trình nhanh, chính xác, khả năng
phân tích hàng loạt là có thể đạt được. Vì vậy tôi chọn sử dụng điện cực giọt
Hg treo trong phân tích Vit.C.

1.2.2.2.3. Phƣơng pháp cực phổ xung vi phân
Phương pháp cực phổ xung vi phân là phương pháp phân tích điện hóa
hiện đại, được cải tiến cả về kỹ thuật quét thế và kỹ thuật ghi dòng, khắc phục
được đa số nhược điểm của phương pháp cực phổ cổ điển và phương pháp
xung thường.
Trong phương pháp xung vi phân, điện cực được phân cực bằng một
điện áp một chiều biến thiên tuyến tính với tốc độ chậm. Ghi dòng tại hai thời
điểm trước khi nạp xung và trước khi ngắt xung. Đường biểu diễn sự khác
nhau giữa hai dòng này vào thế điện cực có dạng píc, rất dễ xác định, có độ
21


SVTH: Lê Thị Thu Huyền

Khóa luận tốt nghiệp

phân giải cao. Do vậy mà phương pháp xung vi phân giảm tối đa dòng dư,
một hạn chế của cực phổ cổ điện (hình 1.2)
Sự phụ thuộc dòng cực đại trong cực phổ xung vi phân vào các thông
số của quá trình đo cực phổ được tính toán lý thuyết cho hệ thức sau:
i = nFSC (D/  tx)1/2 P (  2 – 1)/[(  +P)(1+P  )]

(1.1)

Trong đó
n: số e– trao đổi trong phản ứng điện cực
F: hằng số Faraday
S: diện tích bề mặt điện cực
C: nồng độ chất điện hoạt
D: hệ số khuyếch tán
tx: thời gian một xung

 = exp(nF∆E/(2RT))

(1.2)

P = exp[(nF/(RT))(E – E1/2 + ∆E/2)]

(1.3)

∆E: biên độ xung
R: hằng số khí
T: nhiệt độ Kelvin
E1/2: thế bán sóng
Tại thế đỉnh píc, P = 1 thì phương trình (1.1) còn lại là
i = nFSC (D/  tx)1/2 (  - 1)/(  + 1)

(1.4)

Ep = E1/2 - ∆E/2

(1.5)

Bán chiều rộng của píc được xác định bởi công thức:

22


SVTH: Lê Thị Thu Huyền

Khóa luận tốt nghiệp

W1/2 = 2RT/(nF) cosh-1[2 + cosh(nF∆E/(2RT))]

(1.6)

Do vậy khi tăng biên độ xung thì theo phương trình (1.4) dòng i tăng
lên, nhưng đồng thời bán chiều rộng píc cũng tăng theo (1.6), do đó giảm độ
phân giải của phương pháp. Trong trường hợp biên độ xung đủ nhỏ thì bán
chiều rộng được tính bởi công thức (1.7)
W1/2 = 3,52 RT/(nF) = 90/n mV ở 250C

(1.7)

Vì vậy để đạt được giá trị dòng lớn đồng thời W1/2 đủ nhỏ, thường đặt
biên độ xung khoảng từ 10 đến 100 mV.

Hình 1.2 so sánh sự giống và khác nhau về kĩ thuật biến đổi thế và kĩ
thuật ghi dòng giữa các phương pháp cực phổ cổ điển (DC), cực phổ xung
thường (NP) và cực phổ xung vi phân (DP). Thấy rõ ưu điểm của phương
pháp von-ampe từ việc phân tích sóng cực phổ có dạng píc là tăng độ nhạy,

tăng độ phân giải, độ chọn lọc. Vì vậy chúng tôi chọn phương pháp von-ampe
(phương pháp phân tích cực phổ) để xác định hàm lượng Vit.C trong các đối
tượng thực tế.

Qua phân tích một số đặc điểm của Vit.C và nhận thấy ưu điểm của
phương pháp von-ampe tôi tiến hành thực nghiệm. Mục đích là tìm ra điều
kiện tối ưu xác định Vit.C theo phương pháp này một cách phù hợp với điều
kiện thiết bị phòng thí nghiệm của Việt Nam và ứng dụng xác định Vit.C
trong các đối tượng thực tế.

23


SVTH: Lê Thị Thu Huyền

Khóa luận tốt nghiệp

Hình 1.2: Sơ đồ biểu diễn sự biến thiên thế theo thời gian và dạng sóng cực
phổ trong một số phương pháp
(a): Thế biến thiên trong thời gian đo cực phổ
(b): Thế biến thiên trong 1 chu kì giọt
(c): Sóng cực phổ
DC: Cực phổ cổ điển NP: Cực phổ xung thường DP: Cực phổ xung vi phân

24


SVTH: Lê Thị Thu Huyền

Khóa luận tốt nghiệp

Chƣơng II: THỰC NGHIỆM
2.1. DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT
2.1.1. Dụng cụ:
Các dụng cụ thủy tinh, buret, pipet, bình định mức của Đức có độ chính
xác cao, được ngâm rửa thường xuyên bằng hỗn hợp kali đicromat và axit
sunfuric đặc 98%.
2.1.2. Thiết bị, máy móc
•

Máy phân tích điện hóa đa chức năng 757VA Computrace,

Metrohm.
- Điện cực làm việc: điện cực giọt Hg
- Điện cực so sánh: điện cực Ag/AgCl
- Điện cực phù trợ: điện cực Pt
• Máy pH meter Precisa 900, Thụy Sĩ
• Cân phân tích STARTORIUS ( độ chính xác  0,2 mg).
• Xử lý số liệu trên máy tính, dùng chương trình Excel.
2.1.3. Hóa chất
• Axit ascobic ( North general pharmaceutical factory China )
• Axit axetic băng
• Natri axetat, natri clorua, NaH2PO4.2H2O, K2HPO4.3H2O
• Axit pecloric, axit oxalic, axit tactric, axit citric
Các hóa chất đều thuộc loại tinh khiết phân tích (PA).

25