Nghiên cứu thành phần hóa học của cây cỏ ngọt = (STEVIA REBAUDIANA (BERTONI) HEMSLEY )

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA HOÁ HỌC
***************

Nguyễn duy công

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
CỦA CÂY CỎ NGỌT
(Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsley)

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Hoá Hữu Cơ

Hà Nội 2009

Nguyễn Duy Công

K31C- Khoa Hoá học
1


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Lời cảm ơn
Trước hết, em xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới thầy

giáo - TS. Nguyễn Văn Bằng- Khoa hoá học- Trường Đại học Sư phạm
Hà Nội 2 đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện và
hoàn thiện khoá luận tốt nghiệp.
Em xin trân trọng cảm ơn TS. Phan Văn Kiệm – Viện hoá học các
Hợp chất thiên nhiên - Viện khoa học và công nghệ Việt Nam đã tạo điều
kiện giúp đỡ em trong quá trình thực hiện và hoàn thiện khoá luận.
Em xin được gửi lời cảm ơn tới các thầy giáo trong Khoa Hoá họcTrường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 và các cán bộ Viện hoá học các Hợp chất
thiên nhiên - Viện khoa học và công nghệ Việt Nam đã ủng hộ và tận tình chỉ
bảo, tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này.
Trong quá trình thực hiện khoá luận tốt nghiệp này dù rất cố gắng nhưng em
vẫn không tránh khỏi một số sai sót. Vì vậy, em kính mong nhận được sự góp
ý chỉ bảo của các thầy, cô và các bạn sinh viên quan tâm.

Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2009
Sinh viên

Nguyễn Duy Công

Nguyễn Duy Công

K31C- Khoa Hoá học
2


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu,

kết quả trong khoá luận này là trung thực. Các kết quả không trùng với các
kết quả đã được công bố.

Sinh viên

Nguyễn Duy Công

Nguyễn Duy Công

K31C- Khoa Hoá học
3


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Mục lục
Lời cảm ơn
Lời cam đoan
Mục lục
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục các hình vẽ và bảng biểu
Trang
Mở đầu.................................................................................................

1

Chương 1: Tổng quan..................................................................

3

1.1. Đặc điểm, tính vị và công dụng của cây cỏ ngọt..............................

3

1.1.1. Thực vật học...........................................................................

3

1.1.2. Phân bố, sinh thái...................................................................

4

1.1.3. Bộ phận dùng..........................................................................

4

1.1.4. Tác dụng dược lý....................................................................

4

1.1.5. Tính vị, công năng..................................................................

6

1.1.6. Công dụng..............................................................................

6

1.2. Thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của cây cỏ ngọt..............

7

1.2.1. Giới thiệu chung.....................................................................

7

1.2.2. Thành phần hoá học và hoạt tính sinh học.............................

8

1.3. Các phương pháp chiết mẫu thực vật................................................

11

1.3.1. Chọn dung môi chiết..............................................................

12

1.3.2. Quá trình chiết........................................................................

14

Nguyễn Duy Công

K31C- Khoa Hoá học
4

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

1.4. Các phương pháp sắc ký trong phân lập các hợp chất hữu cơ..........

15

1.4.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc kí...............................

15

1.4.2. Cơ sở của phương pháp sắc kí................................................

15

1.4.3. Phân loại các phương pháp sắc kí..........................................

16

1.5. Một số phương pháp hoá lý xác định cấu trúc của các hợp chất
hữu cơ....................................................................................................

18

1.5.1. Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy, IR)..........................

18

1.5.2. Phổ khối lượng (Mass spectroscopy, MS)..............................

19

1.5.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance
Spectroscopy, NMR).................................................................................

19

Chương 2: đối tượng và phương pháp nghiên cứu...

23

2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất..................................................

23

2.1.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC)..........................................................

23

2.1.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế......................................................

23

2.1.3. Sắc ký cột (CC)......................................................................

23

2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất......................

23

2.2.1. Điểm nóng chảy (MP)............................................................

23

2.2.2. Phổ khối lượng (ESI-MS)......................................................

24

2.2.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)......................................

24

2.2.4. Độ quay cực []D ...................................................................

24

2.3. Dụng cụ và thiết bị............................................................................

24

2.3.1. Dụng cụ và thiết bị tách chiết.................................................

24

2.3.2. Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc.....................................

25

2.4. Hoá chất............................................................................................

25

Nguyễn Duy Công

K31C- Khoa Hoá học
5


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

2.5. Chiết phân đoạn và phân lập các hợp chất........................................

25

Chương 3: Kết quả và thảo luận........................................

27

3.1. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất.........................

27

3.1.1. Hợp chất 1: Stevioside............................................................

27

3.1.2. Hợp chất 2: -Sitostorol.........................................................

28

3.2. Xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất.....................................

28

3.2.1. Hợp chất 1: Stevioside............................................................

28

3.2.2. Hợp chất 2: -Sitostorol.........................................................

38

Kết luận.............................................................................................

43

Tài liệu tham khảo.....................................................................

45

Nguyễn Duy Công

K31C- Khoa Hoá học
6

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Danh mục các chữ viết tắt
[]D

Độ quay cực Specific Optical Rotation

13

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13

1

1

C NMR

H NMR
H-1H COSY

2D-NMR

Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
Proton Magnetic Resonance Spectroscopy
1

H-1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều
Two-Dimensional NMR

CC

Sắc ký cột Column Chromatography

DEPT

Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

EI-MS

FAB-MS

Phổ khối lượng va chạm electron
Electron Impact Mass Spectrometry
Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh
Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond Connectivity

HMQC

Heteronuclear Multiple Quantum Coherence
Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh phân giải cao

HR-FAB-MS

High Resolution Fast Atom Bombardment Mass
Spectrometry

IR

Phổ hồng ngoại Infrared Spectroscopy

Me

Nhóm metyl

MS

Phổ khối lượng Mass Spectroscopy

NOESY

Nucler Overhauser Effect Spectroscopy

Nguyễn Duy Công

K31C- Khoa Hoá học
7


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

TLC

Khoá luận tốt nghiệp

Sắc ký lớp mỏng Thin Layer Chromatography
Danh mục các hình vẽ và bảng biểu
Trang

Hình 1.1: Cây cỏ ngọt và hoa của cây cỏ ngọt

3

Hình 1.2.2.1: Một số hợp chất khung kauran ditecpen đã được phân
lập từ cây cỏ ngọt.

8

Hình 1.2.2.2: Một số hợp chất khung labdane ditecpen đã được phân
lập từ cây cỏ ngọt.

9

Hình 2.5: Sơ đồ chiết phân đoạn và tinh chế các hợp chất từ cây cỏ
ngọt

26

Hình 3.2.1.1: Phổ 1H-NMR của hợp chất 1

28

Hình 3.2.1.2: Phổ 1H-NMR dãn rộng của hợp chất 1

29

Hình 3.2.1.3: Cấu trúc hóa học của hợp chất 1

29

Hình 3.2.1.4: Phổ 13C-NMR của hợp chất 1

30

Hình 3.2.1.5: Phổ 13C-NMR và các phổ DEPT của hợp chất 1

31

Hình 3.2.1.6: Phổ HSQC của hợp chất 1

35

Hình 3.2.1.7: Phổ HMBC của hợp chất 1

36

Hình 3.2.1.8: Các tương tác HMBC chính của hợp chất 1

37

Hình 3.2.1.9: Phổ khối lượng ESI-MS của hợp chất 1

38

Hình 3.2.2.1: Cấu trúc hoá học của 2

39

Hình 3.2.2.2: Phổ 1H-NMR của 2

39

Nguyễn Duy Công

K31C- Khoa Hoá học
8


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Hình 3.2.2.3: Phổ

Khoá luận tốt nghiệp

13

C-NMR của 2

40

Bảng 1: Kết quả phổ NMR của hợp chất 1

32

Bảng 2: Kết quả phổ NMR của hợp chất 2

40

Bảng 3: Hai hợp chất phân lập được từ lá cây cỏ ngọt.

43

Nguyễn Duy Công

K31C- Khoa Hoá học
9


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Mở đầu
Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, độ ẩm cao
trên 80%, lượng mưa lớn, nhiệt độ trung bình khoảng 15 đến 270C. Đó là điều
kiện rất thích hợp cho thực vật phát triển. Do vậy hệ thực vật Việt Nam vô
cùng phong phú, đa dạng với khoảng 12000 loài, trong đó có tới 4000 loài
được nhân dân ta dùng làm thảo dược [7] . Điều này thực sự có ý nghĩa to lớn
cho sự phát triển của ngành y tế, ngành hoá học và một số ngành khác. Hệ
thực vật phong phú trên được coi như là tiền đề cho sự phát triển ngành hóa
học các hợp chất thiên nhiên ở nước ta.
Từ ngàn xưa, ông cha ta đã sử dụng nhiều phương thuốc dân gian từ cây

cỏ để chữa bệnh, bồi bổ cơ thể hay làm hương liệu, phẩm màu ... như lá Tía tô
để giải cảm, Nhân sâm để tăng cường sức đề kháng, Sả để tạo mùi thơm, củ
Nâu để nhuộm màu. Các phương thuốc y học cổ truyền đã thể hiện những mặt
mạnh trong điều trị bệnh là ít độc tính và ít tác dụng phụ. Do có những ưu
điểm như trên nên ngày nay con người ngày càng quan tâm đến các hợp chất
có hoạt tính sinh học cao trong thực vật và động vật. Về lâu dài đối với sự
phát triển các dược phẩm mới thì các hợp chất có hoạt tính sinh học đóng vai
trò quan trọng, nó là khởi đầu cho việc tổng hợp nên các loại thuốc mới có tác
dụng tốt hơn.
Theo tài liệu [28] công bố hiện nay có khoảng 60% - 70% các loại thuốc
chữa bệnh đang được lưu hành hoặc đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm
sàng có nguồn gốc từ các hợp chất thiên nhiên.
Cây cỏ ngọt được biết đến là một loại cây có hoạt tính sinh học cao, chứa
nhiều thành phần hoá học và có nhiều tác dụng dược lý. Tác dụng quan trọng
nhất của cây cỏ ngọt là chữa bệnh đái tháo đường, bệnh béo phì, cao huyết
áp...Việc nghiên cứu, khảo sát thành phần hoá học và tác dụng dược lý của

Nguyễn Duy Công

K31C- Khoa Hoá học
10


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

cây cỏ ngọt ở Việt Nam nhằm đặt cơ sở khoa học cho việc sử dụng chúng một
cách thích hợp, hiệu quả có ý nghĩa thực tiễn đối với sự phát triển của nền y
học Việt Nam hiện đại dựa trên các phương thuốc cổ truyền.

Do đó tôi đã chọn đề tài cho khoá luận tốt nghiệp là:
“Nghiên cứu thành phần hoá học của cây cỏ ngọt (Stevia rebaudiana
(Bertoni) Hemsley)”.
Luận văn này tập trung nghiên cứu thành phần hoá học từ lá cây cỏ
ngọt bao gồm những nội dung chính là:
1. Sử dụng các phương pháp chiết và sắc ký để phân lập được các
stevioside sạch từ cây cỏ ngọt (Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsley).
2. Sử dụng các phương pháp hoá lý kết hợp để xác định cấu trúc hoá học
của các hợp chất đã phân lập được.

Nguyễn Duy Công

K31C- Khoa Hoá học
11


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Chương 1: Tổng quan
1.1. Đặc điểm, tính vị và công dụng của cây cỏ ngọt.
1.1.1. Thực vật học.[7]
Tên khoa học: Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsley.
Hä: Cóc (Asteraceae).

Hình 1.1: Cây cỏ ngọt và hoa của cây cỏ ngọt.
Cây thảo nhỏ, sống nhiều năm, cao 0,5 – 0,6 m và có khi cao tới 1 m.
Thân cứng mọc thẳng, có rãnh dọc và nhiều lông mịn, ít phân nhánh.
Lá mọc đối, hình mác hoặc bầu dục, gốc thuôn, đầu tù hoặc hơi nhọn dài

5 -7 cm, rộng 1 - 1,5 cm, có 3 gân, 4 – 6 đôi răng nhọn ở phần nửa về phía
đầu lá, hai mặt có lông trắng mịn, nhấm lá thấy có vị ngọt rất đậm, cuống lá
rất ngắn.
Hoa lưỡng tính, tụ họp thành đầu màu trắng ở ngọn.
Quả bế, không có mào lông, hạt không có nội nhũ.
Mùa hoa: tháng 5 - 9

Nguyễn Duy Công

K31C- Khoa Hoá học
12


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

1.1.2. Phân bố, sinh thái. [7]
Chi Stevia Cav. Không có một đại diện nào ở vùng Châu á. Cỏ ngọt đang
được trồng phổ biến ở Việt Nam hiện nay, được nhập nội từ một nước Nam
Mỹ (nguồn gốc ở Paraguay) năm 1988.
Cỏ ngọt là cây ưa ẩm và ưa sáng, có thể chịu bóng hoặc ưa bóng vào thời
kỳ cây con. Vốn là cây ở vùng nhiệt đới, cỏ ngọt trồng ở Việt Nam sinh
trưởng và phát triển tốt vào vụ xuân - hè. Về mùa đông, cây có hiện tượng
rụng lá và hơi tàn lụi. Cây ra hoa, quả nhiều hàng năm. Tuy nhiên, người ta
thường áp dụng cách nhân giống bằng cắm cành.
1.1.3. Bộ phận dùng. [7]
Phần trên mặt đất của cây cỏ ngọt. Thu hái lúc cây xum xuê.
1.1.4. Tác dụng dược lý. [7]
1.1.4.1. Tác dụng hạ đường huyết: thành phần steviosid trong lá cây

cỏ ngọt có tác dụng làm đường huyết giảm rõ rệt ở thỏ, chuột cống trắng và
bệnh nhân mắc bệnh đái tháo đường.
1.1.4.2. Tác dụng giãn mạch: Steviosid có tác dụng làm giãn tĩnh
mạch toàn thân rõ rệt.
1.1.4.3. Tác dụng trên thận và huyết áp: thành phần steviosid trong lá
cây cỏ ngọt có tác dụng làm tăng lưu lượng huyết tương qua thận (RPF), tăng
tốc độ lọc cầu thận (GFR), hạ huyết áp, tăng bài niệu và tăng thải trừ natri.
1.1.4.4. Tác dụng tránh thai: Nghiên cứu của PLANAS (năm 1968)
đã thông báo , cho chuột cống trắng cái và đực uống nước có 5% cao cỏ ngọt
thấy có tác dụng ngừa thai. Nhưng trong những năm 70, bốn nhóm thực
nghiệm độc lập, không xác nhận tác dụng này.

Nguyễn Duy Công

K31C- Khoa Hoá học
13


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

1.1.4.5. Tác dụng kháng khuẩn: Cao lá cỏ ngọt có tác dụng đối với
Pseudomonas aeruginosa và Proteus vulgaris. Chưa thấy tài liệu công bố về
tác dụng trên các vi khuẩn Streptococcus inutans, Lactobacillus plantarum và
Lactobacillus casei là những vi khuẩn có liên quan đến quá trình sún răng ở
trẻ em, vì hiện nay có dùng steviosid thay thế đường trong chế biến bánh kẹo.
1.1.4.6. Liều dùng an toàn ở người: Nồng độ steviosid trong một số
nước giải khát ở Nhật Bản là 0,005 – 0,007%. Nếu một ngày uống 1 lit thì
lượng steviosid đưa vào cơ thể là 0,05 – 0,07g tương ứng với khoảng 1g lá cỏ

ngọt. Điều đó có thể được chấp nhận vì là liều an toàn, đã được Nhà nước
Nhật cho phép.
1.1.4.7. Độc tính cấp: Cho chuột uống steviosid với liều 2g/kg không
thấy có chuột chết và cũng không thấy có biểu hiện độc sau 2 tuần theo dõi.
1.1.4.8. Độc tính bán cấp: Cho chuột cống trắng ăn với liều dùng
hàng ngày 0,5g/kg trong 56 ngày. các thông số theo dõi gồm cân nặng, các chỉ
tiêu huyết học, các chỉ tiêu hoá sinh và xét nghiệm tổ chức học gan đều bình
thường.
1.1.4.9. Độc tính trên thận:
a. Thí nghiệm trên chuột cống trắng, liều cao steviosid có thể gây độc
với thận, làm tăng urê và creatinin huyết thanh.
b. Tiêm tĩnh mạch cho chuột cống trắng, liều 0,4; 0,8; 1,2; 1,6g/kg rồi
theo dõi độ thanh thải của một số chất có so sánh với lô đối chứng, thấy từ
liều 0,8g/kg trở lên:
- Độ thanh thải inulin không thay đổi, chứng tỏ chức năng lọc cầu
thận không bị ảnh hưởng.

Nguyễn Duy Công

K31C- Khoa Hoá học
14


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

- Độ thanh thải của glucose tăng, chứng tỏ chức năng tái hấp thu của
ống lượn gần bị suy giảm, một phần glucose không được tái hấp thu và đã bị
thải trừ qua nước tiểu.

- Độ thanh thải steviosid cao hơn độ thanh thải inulin, chứng tỏ
steviosid còn bị thải trừ qua niêm mạc của ống thận.
- Ngoài ra, steviosid cong gây bài niệu tăng thải natri niệu và làm tăng
độ thanh thải của paraaminohippuric.
c. Tiêm dưới da cho chuột cống trắng với liều 1,5g/kg, kết quả thấy:
- Những thay đổi giống thí nghiệm trên là tăng nồng độ urê và
creatinin trong huyết thanh, thấy glucose trong nước tiểu.
- Ngoài ra về tổ chức bệnh học, thấy có biến đổi hình thái ở tế bào
niêm mạc ống lượn gần. Những tổn thương này là do hoạt động của 2 enzym
phosphatase kiềm và gama-glutamyl-transpeptidase tăng lên. Những enzym
này khu trú chủ yếu ở điểm bàn chải của tế bào ống lượn gần.
1.1.4.10. Khả năng gây đột biến:
a. Nhiều thí nghiệm nghiên cứu khả năng gây đột biến trên các chủng
Salmonella typhimurium TA 98, TA 100, TA 1535, TA 1538 và TM 677,
hoặc trên chủng Escherichia coli WP2 đều xác định cao cỏ ngọt, steviosid và
steviol là aglycon của steviosid không gây đột biến.
b. Có nghiên cứu cho biết một số chất chuyển hoá của steviosid lại có
thể gây đột biến. Mặc dù steviosid không bị chuyển hoá trong cơ thể và thải
trừ nguyên vẹn qua nước tiểu. Song người ta lo ngại một số tạp khuẩn vùng
màng tràng có thể phân giải được steviosid.
1.1.5. Tính vị, công năng. [7]

Nguyễn Duy Công

K31C- Khoa Hoá học
15


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Cỏ ngọt có vị ngọt rất đậm, có ích cho người đái tháo đường và người
béo phì, thuốc ít độc.
1.1.6. Công dụng. [7]
1.1.6.1. Chữa đái tháo đường: Cỏ ngọt và steviosid có vị ngọt sẽ làm
giảm nhu cầu chất đường và chất bột của người bệnh, vì thế sẽ làm giảm
đường huyết. Liều dùng theo thử nghiệm ở Braxin là mỗi lần 0,25g steviosid
(hoặc 2,5g lá cỏ ngọt), ngày 4 lần. Uống nhiều ngày.
1.1.6.2. Chữa béo phì: Cỏ ngọt và steviosid có vị ngọt sẽ làm giảm
nhu cầu chất đường và chất bột của cơ thể, nên cũng có tác dụng chữa béo
phì. Liều dùng 0,5 – 1g steviosid chia ra 3 – 4 lần trong ngày. Uống nhiều
ngày.
1.1.6.3. Lá cỏ ngọt hoặc steviosid thường dùng làm chất điều vị cho
các loại trà thuốc, trà túi lọc: Tỷ lệ lá cỏ ngọt hoặc steviosid trong đó thường
thấp. Tại Việt Nam, cũng đã có một số chế phẩm trà thuốc có cỏ ngọt như:
- Trà actisô - stevia.
- Trà sâm quy – stevia có sâm khu 5, tam thất, đương quy, thục địa,
táo, long nhã, ngũ gia bì và cỏ ngọt.
- Trà nhân trần, thảo quyết minh, cỏ ngọt.
- Trà túi lọc Sotevin có dừa cạn, hoa cúc, hoa hoè và cỏ ngọt.
1.1.6.4. Chữa cao huyết áp: Hàng ngày uống trà sotevin.
1.1.6.5. Dùng thay thế đường săcharose: Trong công nghiệp thực
phẩm để làm chất điều vị cho bánh mứt kẹo, nước giải khát.
1.2. Thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của cây cỏ ngọt.
1.2.1. Giới thiệu chung

Nguyễn Duy Công

K31C- Khoa Hoá học

16


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Cây cỏ ngọt từ lâu đã được sử dụng như là một chất tạo ngọt tự nhiên
không chứa calo.Các nghiên cứu về thành phần hoá học của cây cỏ ngọt đã
được tiến hành từ lâu và đã xác định thành phần chính tạo ra vị ngọt là các
đitecpen glycosit trong đó chủ yếu là stevioside và các dẫn xuất kauran
ditecpen tương tự. Hàm lượng stevioside trong cỏ ngọt là 3 – 20% tuỳ theo
giống và các điều kiện trồng trọt, thu hoạch.
Hợp chất stevioside có độ ngọt gấp 300 lần so với đường sucrose và tập
trung chủ yếu ở phần lá cây. Nghiên cứu về hàm lượng các chất stevioside
trong cỏ ngọt đầu tiên được công bố năm 1955: stevioside (5-10% trọng
lượng khô), rebaudioside A (2-4%), rebaudioside C (1-2%) và dulcoside A
(0,4-0,7%) [26]. Sau đó một nhóm nghiên cứu Nhật Bản đã phân lập và xác
định cấu trúc của stevioside, rebaudioside A, rehbaudioside B và
steviobioside bằng các phương pháp phổ [13]. Về sau các hợp chất này cũng
được phân lập bởi các nhóm nghiên cứu khác trên thế giới [12, 16, 21].
1.2.2. Thành phần hoá học và hoạt tính sinh học.
1.2.2.1. Một số hợp chất khung kauran ditecpen

Nguyễn Duy Công

K31C- Khoa Hoá học
17

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

OR2

H

H
COOR1

Khoá luận tốt nghiệp

Steviol: R1 = R2 = H
Stevioside: R1 = -D-glucopyranoside, R2 = -D-glucopyranosyl(1->2)--D-glucopyranoside
Rebaudioside A: R1 = -D-glucopyranoside, R2 = -DGlucopyranosyl-(1->3)-[-D-glucopyranosyl-(1->2)]--Dglucopyranoside
Rebaudioside B: R1 = , R2 = -D-Glucopyranosyl-(1->2)-[-Dglucopyranosyl-(1->3)]--D-glucopyranoside
Rebaudioside C: R1 = -D-glucopyranoside, R2 = -LRhamnopyranosyl-(1->2)--D-glucopyranosyl-(1->3)--Dglucopyranoside
Rebaudioside D: R1 = -D-glucopyranosyl-(1->2)--Dglucopyranoside, R2 = -D-Glucopyranosyl-(1->3)-[-Dglucopyranosyl-(1->2)]--D-glucopyranoside
Rebaudioside E: R1 = R2 = -D-glucopyranosyl-(1->2)--Dglucopyranoside
Rebaudioside F: R1 = -D-glucopyranoside, R2 = -DGlucopyranosyl-(1->3)-[-D-xylopyranosyl-(1->2)]--Dglucopyranoside
Dulcoside A: R1 = -D-glucopyranoside, R2 = -Lrhamnopyranosyl-(1->2)--D-glucopyranoside
Steviobioside: R1 = , R2 = -L-Rhamnopyranosyl-(1->2)--Dglucopyranoside

Hình 1.2.2.1: Một số hợp chất khung kauran ditecpen đã được phân lập từ
cây cỏ ngọt.
Các ent – Kauren diterpen glycosid: steviosid(2,2 – 18,5%), rebaudiosid
A, B, C, D. E, dulcosid, steviobiosid. Các thành phần này có vị ngọt ở các
mức độ khác nhau.
1.2.2.2. Một số hợp chất khung labdane ditecpen.

Nguyễn Duy Công

K31C- Khoa Hoá học
18


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

HO

O

CH2OH

OH

OH

OH
R

OH
OH

Sterebin D: R = H
Sterebin C: R = OH
Sterebin B: R = acetoxy

Sterebin G

CH2OR1
R

OH

OH

OH

OH

OH

OH

Sterebin E: R1 = H
Sterebin K: R1 = Me
Sterebin I: R1 = aldehyde

Sterebin M: R = OH
Sterebin N: R = OH

Hình 1.2.2.2: Một số hợp chất khung labdane ditecpen đã được phân lập từ
cây cỏ ngọt.
Ngoài khung kauran ditecpen, trong cây cỏ ngọt còn chứa các đitecpen
thuộc nhóm labdane. Một loạt hợp chất khung này đã được phân lập và được
đặt tên dạng sterebin [14, 17, 18].

Nguyễn Duy Công

K31C- Khoa Hoá học
19


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Các labdan diterpen gồm: jihanol, austroinulin, acetylaustroinulin.
1.2.2.3. Hoạt tính sinh học.
Các hợp chất đitecpen này được biết đến có nhiều hoạt tính sinh học rất
hấp dẫn. Về độc tính khi được dùng làm chất tạo ngọt, stevioside có độ độc
rất thấp khi nghiên cứu trên chuột thí nghiệm với liều lượng LD50 khoảng 10
g/kg thể trọng [25].
Dịch chiết cũng như các chất tách được từ cỏ ngọt có tác dụng mạnh
trong việc điều khiển quá trình chuyển hoá glucozơ và insulin trong cơ thể.
Theo Chen và cộng sự, stevioside với liều 0,5 mg/kg làm giảm lượng đường
glucozơ trong máu đồng thời hạn chế sự kháng insulin ở chuột bị tiểu đường
[4]. Tác giả Ferreira cũng chỉ ra rằng dịch chiết nước cỏ ngọt (20 mg/kg/ngày)
cũng có tác dụng làm ức chế quá trình chuyển hoá glucozơ trong gan trên
chuột thí nghiệm [8]. Trước đó vào năm 1986, Curi đã thử nghiệm tác dụng
của dịch chiết nước cỏ ngọt trên một nhóm người tình nguyện. Kết quả cho
thấy với dịch chiết 5 g lá dùng liên tục trong 3 ngày, hàm lượng đường
glucozơ trong huyết tương giảm rõ rệt [5]. Các nghiên cứu này mở ra khả
năng ứng dụng cỏ ngọt trong việc chữa trị bệnh tiểu đường và các bệnh liên
quan đến sự chuyển hoá glucozơ. Ngoài ra, cùng với tác dụng giảm đường
huyết, stevioside còn có tác dụng hạ huyết áp trên lô chuột bị tiểu đường [11].
Tác dụng chống ung thư và chống viêm của cỏ ngọt cũng được nghiên
cứu chi tiết trên mô hình chuột thí nghiệm gây u bằng 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA). Các hợp chất tách được từ cây này

gồm stevioside, rebaudiosides A và C, và dulcoside A ức chế mạnh quá trình
gây viêm đồng thời hỗn hợp các hợp chất này ngăn ngừa tốt sự hình thành
ung thư da trên chuột với liều 1,0 và 0,1 mg/con [27].

Nguyễn Duy Công

K31C- Khoa Hoá học
20


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Mới đây, tác giả Boonkaewwan cũng cho thấy tác dụng chống viêm
của stevioside và steviol thông qua quá trình ngăn ngừa sự tổng hợp TNF-ỏ và
IL-1õ với nồng độ khá thấp (0,01-0,2 mM). Cả hai hợp chất này đều có khả
năng ngăn chặn sự phát triển của 3 dạng tế bào T84, Caco-2 và HT29. Hoạt
tính này được biết có liên quan đến quá trình ức chế yếu tố phiên mã NF-kB
[1].
Hợp chất stevioside còn được sử dụng trong trị liệu chữa ỉa chảy hiệu
quả. Khởi nguồn từ kết quả nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn và kháng virut
của dịch chiết nóng cây cỏ ngọt cho thấy tác dụng diệt mạnh chủng E. coli là
nguyên nhân gây ra bệnh ỉa chảy [24]. Các nghiên cứu tiếp sau đó khẳng định
tác dụng và khả năng ứng dụng rất cao của cỏ ngọt cũng như nhóm chất
stevioside trong việc chữa trị ỉa chảy [19, 20, 23].
Ngoài các hợp chất đitecpen, trong cây cỏ ngọt còn chứa lớp chất
phenol và flavonoit. Tác giả Ghanta đã định lượng được hàm lượng nhóm
chất này trong dịch chiết etyl axetat là tương đương 0,86 mg axit galic và
0,83 mg quercetin trên 1 mg. Bằng phân tích LC-MS và phổ NMR, nhóm tác

giả đó nhận dạng được sự có mặt của quercetin-3-O-arabinoside, quercitrin,
apigenin, apigenin-4-O-glucoside, luteolin, and kaempferol-3-O-rhamnoside.
Dịch chiết methanol và etyl axetat cho thấy có khả năng diệt các gốc tự do
bằng phương pháp thử DPPH và lipid peroxidation. Nghiên cứu này chứng tỏ
cây cỏ ngọt còn là một dược liệu thiên nhiên chống oxy hoá hiệu quả [9].
1.3. Các phương pháp chiết mẫu thực vật.
Sau khi tiến hành thu hái và làm khô mẫu, tuỳ thuộc vào đối tượng chất
có trong mẫu khác nhau (chất phân cực, chất không phân cực, chất có độ phân
cực trung bình...) mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau.
1.3.1. Chọn dung môi chiết.

Nguyễn Duy Công

K31C- Khoa Hoá học
21


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Thông thường các chất chuyển hoá thứ cấp trong cây có độ phân cực
khác nhau. Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm.
Dung môi dùng trong quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cẩn
thận.
Điều kiện của dung môi là phải hoà tan được những chất chuyển hoá thứ
cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với
chất nghiên cứu), không độc, không dễ bốc cháy.
Những dung môi này nên được chưng cất để thu được dạng sạch trước
khi sử dụng. Nếu chúng có lẫn các chất khác thì có thể ảnh hưởng đến hiệu

quả và chất lượng của quá trình chiết. Thường có một số chất dẻo lẫn trong
dung môi như các diankyl phtalat, tri-n-butyl-axetylcitrar và tributylphosphat.
Những chất này có thể lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất hoặc trong
khâu bảo quản như trong các thùng chứa hoặc các nút đậy bằng nhựa.
Methanol

và

chlorofrom

thường

chứa

dioctylphtalat

[di-(2-

etylhexyl)phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat]. Chất này sẽ làm sai lệch kết
quả phân lập trong các quá trình nghiên cứu hoá thực vật, thể hiện hoạt tính
trong thử nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây. Chlorofrom,
metylen clorit và methanol là những dung môi thường được lựa chọn trong
quá trình chiết sơ bộ một phần của cây như: lá, thân, rễ, củ, quả, hoa...
Những tạp chất của chlorofrom như CH2Cl2, CH2ClBr có thể phẩn ứng
với một vài hợp chất như các ancaloit tạo muối bậc 4 và những sản phẩm
khác. Tương tự như vậy sự có mặt của lượng nhỏ axit clohiđric (HCl) cũng có
thể gây ra sự phân huỷ, sự khử nước hay sự đồng phân hoá với các hợp chất
khác. Vì chlorofrom có thể gây tổn thương cho gan và thận nên nó cần được
thao tác khéo léo, cẩn thận ở nơi thoáng và phải đeo mặt nạ phòng độc.
Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn chlorofrom.

Nguyễn Duy Công

K31C- Khoa Hoá học
22


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Methanol và etanol 80% là những dung môi phân cực hơn các
hiđrocacbon thế clo. Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ
thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu
được lượng lớn các thành phần trong tế bào. Trái lại, khả năng phân cực của
chlorofrom thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào. Các ancol
hoà tan phần lớn các chất chuyển hoá phân cực cùng với các hợp chất phân
cực trung bình và thấp. Vì vậy khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng bị
hoà tan đồng thời. Thông thường dung môi cồn trong nước có nhứng đặc tính
tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ.
Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng
methanol trong suốt quá trình chiết [10]. Thí dụ trechlonolide A thu được từ
Trechonaetes aciniata được chuyển thành trechonolide B bằng quá trình phân
huỷ 1-hydroxytropacocain cũng xảy ra khi erythroxylum novogranatense
được chiết trong methanol nóng.
Người ta thường ít sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ cây mà
thay vào đó là dùng dung dịch nước của methanol.
Dietyl ete hiếm khi được dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất
dễ bay hơi, bốc cháy và rất độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit
dễ nổ, peroxit của dietyl ete dễ gây phản ứng oxi hoá với những hợp chất

không có khả năng tạo cholesterol như các carotenoid. Tiếp đến là axeton
cũng có thể tạo thành axetonit nếu 1,2-cis-diol có mặt trong môi trường axit.
Quá trình chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình
phân tách đặc trưng, cũng có khi xử lý các dịch chiết bằng axit-bazơ có thể
tạo thành những sản phẩm mong muốn.
Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hoá thứ cấp trong
cây được chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợp cho

Nguyễn Duy Công

K31C- Khoa Hoá học
23


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

quá trình chiết tránh được sự phân huỷ chất bởi dung môi và quá trình tạo
thành
chất mong muốn.
Sau khi chiết dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không
quá 30-400C, với một hoá chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn.
1.3.2. Quá trình chiết.
Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau:
- Chiết ngâm.
- Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet.
- Chiết sắc với dung môi nước.
- Chiết lôi cuốn theo hơi nước.
Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất

trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sực và thời
gian. Thiết bị sử dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khoá ở dưới đáy để
điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi. Dung môi
có thể nóng hoặc lạnh nhưng nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn. Trước đây,
máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhưng hiện nay có thể dùng
bình thuỷ tinh.
Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phương
pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng
24 giờ rồi chất chiết được lấy ra. Thông thường quá trình chiết một mẫu chỉ
thực hiện qua 3 lần dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa những
chất giá trị nữa. Sự kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một vài cách
khác nhau.

Nguyễn Duy Công

K31C- Khoa Hoá học
24


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Như vậy tuỳ thuộc vào mục đích cần chiết lấy chất gì để lựa chọn dung
môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lý nhằm đạt hiệu quả cao.
Ngoài ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các
lớp chất mà ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết.
1.4. Các phương pháp sắc ký trong phân lập các hợp chất hữu cơ.
Phương pháp sắc ký (chromatography) là một phương pháp phổ biến và
hữu hiệu nhất hiện nay, được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các hợp

chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng.
1.4.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký.
Sắc ký là phương pháp tách các chất dựa vào sự khác nhau về bản chất
hấp phụ và sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và pha tĩnh.
Sắc ký gồm có pha tĩnh và pha động. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu
tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất
của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan…). Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác
nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình pha động chuyển động dọc
theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá
trình hấp phụ và phản hấp phụ. Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh
sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu
hơn với pha này. Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá
trình sắc ký.
1.4.2. Cơ sở của phương pháp sắc ký.
Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai
pha động và pha tĩnh. ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ
thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch (hoặc

Nguyễn Duy Công

K31C- Khoa Hoá học
25