Tổng quan về sản xuất Butanol bằng phương pháp lên men tĩnh

Đồ án chuyên ngành

GVHD: Lê Văn Việt Mẫn

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
Do sự gia tăng liên tục giá thành của dầu thô-nguồn năng lượng chính trên thế giới
hiện nay, rất nhiều đề tài nghiên cứu gần đây quan tâm đến việc phát triển các nguồn
nhiên liệu mới có giá trị về mặt kinh tế và môi trường. Có thể nói nhiên liệu sinh học là
một nguồn nhiên liệu đầy tiềm năng hứa hẹn thay thế cho nguồn xăng dầu sắp cạn kiệt
trong tương lai, đặc biệt là những nhiên liệu được sản xuất thông qua quá trình lên men từ
các nguồn nguyên liệu tái tạo, điển hình là butanol. Hiện nay butanol thương mại được
sản xuất chủ yếu từ con đường hóa dầu nhưng kết quả nghiên cứu cho thấy quá trình lên
men từ vi sinh vật để thu nhận butanol có rất nhiều triển vọng. Quá trình lên men sản xuất
butanol hay còn gọi là quá trình lên men Ethanol-Butanol-Acetone (ABE) được thực hiện
bởi giống vi khuẩn Clostridium, đặc biệt là loài Acetobutylicum (Lin và Blaschek, 1983).
Loài vi sinh vật này được xem là lâu đời nhất trong nghành công nghiệp lên men kỵ khí
bắt buộc. Nó được xếp ở vị trí thứ hai chỉ sau lên men ethanol từ nấm men
Saccharomyces cerevisiae ở quy mô sản xuất. Quá trình lên men ABE được thực hiện
rộng rãi trong công nghiệp đến nửa đầu thế kỷ 20 với 66% sản lượng tiêu thụ trên toàn
thế giới của butanol được sản xuất từ phương pháp sinh học (Dürre, 2008). Tuy nhiên,
với sự ra đời của Thế chiến thứ hai và sự phát triển leo thang của ngành công nghiệp hóa
dầu, sản xuất butanol từ phương pháp sinh học nhanh chóng giảm dần. Đến năm 1960,
hiệu quả thấp của quá trình lên men ABE so ngành công nghiệp hóa dầu cùng với các chi
phí cao hơn khi sử dụng các nguồn carbohydrate làm cơ chất dẫn tới kết quả là việc đã
xoá bỏ hoàn toàn các hoạt động công nghiệp từ quá trình lên men này. Tuy nhiên, khi giá
dầu bắt đầu tăng từ đầu những năm 1970 do "cuộc khủng hoảng dầu thô" cùng với sự suy
giảm dần về nguồn dầu và hơn nữa là sự thúc đẩy xã hội trên toàn thế giới nhận thức về
các vấn đề môi trường đang trong tình trạng cấp cứu, đã làm cho con người quan tâm đến
ngành công nghiệp sinh học (Dürre, năm 1998; Dürre, 2008). Kể từ đó, những nỗ lực
nghiên cứu đáng kể về quá trình lên men ABE sản xuất butanol đã được thực hiện trong
nhiều lĩnh vực, cụ thể là trong ngành công nghệ vi sinh vật, tạo ra các chủng đột biến mới

nhằm nâng cao sản lượng dung môi, nghiên cứu thay đổi các điều kiện lên men nhằm cải
thiện năng suất thấp và nồng độ butanol trong dịch lên men.
Giống như trong mọi quá trình sinh học khác, quá trình lên men ABE thể hiện một số
hạn chế về kinh tế và khả năng cạnh tranh so với các quá trình sản xuất bằng phương
pháp hóa học tinh khiết. Những bất lợi chính trong trường hợp này liên quan đến con
đường trao đổi chất khá phức tạp bởi các vi khuẩn sản xuất butanol.
Trong một chu trình lên men ABE tiêu biểu từ nguồn carbohydrate: axit butyric,
propionic và acetic trước hết được sinh tổng hợp bởi C. acetobutylicum (acidogenesis)
trong giai đoạn tăng trưởng theo cấp số nhân của tế bào. Khi vi sinh vật bước vào giai
SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên

1


Đồ án chuyên ngành

GVHD: Lê Văn Việt Mẫn

đoạn ổn định sẽ bắt đầu giai đoạn tạo thành acetone, butanol và ethanol theo tỷ lệ 3:6:1
tương ứng (solventogenesis) (Fond et al, 1985.). Quá trìnhchuyển pha từ acidogenesis
sang solventogenesis được điều khiển bằng cách thay đổi hoặc làm giảm pH (<5) ở cuối
giai đoạn tăng trưởng theo cấp số nhân hoặc tăng nồng độ acid butyric (> 2 gl -1)
(Gottschalk và Morris, 1981; Gottwald và Gottschalk, 1985; Monot etal., 1984). Tuy
nhiên, quá trình lên men trong thực tế khá phức tạp cần phải kiểm soát chặt chẽ các điều
kiện lên men để đạt hiệu quả cao (Chauvatcharin et al., 1998).
Trong quá trình lên men ABE truyền thống, mật độ tế bào vi sinh vật thấp trong môi
trường lên men làm hiệu suất sinh tổng hợp butanol từ glucose nói chung là khá thấp
thường khoảng 15% (w / w) và hiếm khi vượt quá 25% (w / w). Ngoài ra, việc sinh tổng
hợp butanol còn bị giới hạn bởi nhiều yếu tố ức chế khác, trong đó butanol là yếu tố
chính gây ức chế ngược lên sự tăng trưởng của tế bào làm ngừng quá trình lên men.

Trong thực tế, vi khuẩn khó có thể duy trì hoạt tính khi nồng độ butanol trong dịch lên
men xấp xỉ 10 gl-1. Kết quả là nồng độ butanol trong dịch lên men ABE thường xấp xỉ 13
gl-1. Do đó, việc sản xuất butanol từ quá trình lên men ABE truyền thống cho hiệu quả
kinh tế rất thấp. (Maddox, 1989).
Nội dung bài viết này sẽ giới thiệu chung về butanol cũng như các ứng dụng của nó
trong thực tiễn. Dựa trên các nghiên cứu gần đây về quá trình lên men tĩnh sản xuất
butanol sẽ trình bày một số chủng Clostridium đã được phân lập có khả năng sinh tổng
hợp và chịu được nồng độ butanol cao. Giới thiệu các nguồn cơ chất khác nhau mà vi
sinh vật có thể sử dụng để lên men cũng như các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men
tạo butanol, qua đó có thể so sánh hiệu suất sinh tổng hợp butanol. Trình bày một số kết
quả nghiên cứu đạt được khi lên men sử dụng tế bào vi khuẩn cố định trên một số chất
mang. Các phương pháp tách chiết butanol từ dịch sau lên men cũng sẽ được giới thiệu
trong bài viết này.

SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên

2


Đồ án chuyên ngành

GVHD: Lê Văn Việt Mẫn

CHƯƠNG 2: BUTANOL
2.1. Giới thiệu chung
Butanol (danh pháp IUPAC, 1-butanol; CAS no.71-36-3) còn được gọi là rượu
butylic, n-butanol hoặc methylolpropane, là một rượu gồm 4 cacbon có công thức phân tử
C4H9OH (KLPT = 74,12 g.mol-1). Butanol là một chất lỏng không màu, dễ cháy, kỵ lỏng,
có mùi thơm như chuối hương và có mùi cồn mạnh. Khi tiếp xúc trực tiếp nó có thể gây
kích ứng mắt và da.Hơi của nó có tác dụng kích thích vào niêm mạcmàng và có khả năng

gây mê khi hít phải ở nồng độ cao.Butanol hầu như hòa tan hoàn toànvới các dung môi
hữu cơ phổ biến, nhưng lại ít hòa tan trong nước (Lee và cộng sự, 2008a).

Hình 1: Cấu trúc không gian của butanol
Bảng 1: Tính chất vật lý của n- butanol

74.12 g mol-1
Dung dịch lỏng màu vàng
0.810– 0.812
−90 °C, 183 K, -130 °F
118 °C, 391 K, 244 °F
9.0 ml/100 ml (7.7 g/100 ml ở 20°C)
35–37 oC
343–345 oC
25–29 oC
43.8 kJ mol-1
198.2 kJ mol-1
0.63 kPa

Khối lượng phân tử
Dạng tồn tại
Tỷ trọng
Nhiệt độ nóng chảy
Nhiệt độ sôi
Độ tan trong nước
Nhiệt độ đánh lửa
Nhiệt độ tự bốc cháy
Flash point
Nhiệt hóa hơi
Nhiệt đốt cháy

Áp suất hơi ở 20oC

SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên

3


Đồ án chuyên ngành

GVHD: Lê Văn Việt Mẫn

2.2. Ứng dụng của butanol trong thực tiễn
Một trong những ứng dụng ưu việt lớn của biobutanol (butanol sinh học) là được sử
dụng để pha trộn vào xăng dầu làm nhiên liệu chính cho các động cơ. Trong khi ethanol
đã nhận được rất nhiều sự quan tâm như là một nguồn nhiên liệu hỗ trợ bởi nhiều lý do
(Hansen et al., 2005 và Niven, 2005) thì butanol lại cho thấy nó có thể là một lựa chọn tốt
hơnso với ethanol vì có các tính chất hóa học và vật lý phù hợp.
Bảng 2: Bảng so sánh tính chất của butanol với xăng và ethanol

Tính chất
Nhiệt độ sôi (oC)
Tỷ trọng ở 20°C (g/ml)
Khả năng tan trong 100g
nước
Mật độ năng lượng (MJ.l-1)
Nhiệt bay hơi (MJ/kg)
Nhiệt dung riêng
(kJ/kmol.ºK)
Chỉ số Octane
Độ nhớt (10-3 Pa.s)

Butanol
117–118
0.8098
Không tan

Xăng
27–221
0.7–0.8
Không tan

Ethanol
78
0.7851
Tan

27–29.2
0.43
178

32
0.36
160–300

19.6
0.92
112.3

96
2.593

91–99
0.24–0.32

129
1.078

Theo Shapovalop và Ashkinazi, (2008) và Dürre, (2007) butanol thể hiện nhiều ưu
điểm vượt trội hơn so với ethanol trong việc thay thế nguồn nhiên liệu xăng dầu, cụ thể:
- Giá trị năng lượng của butanol là 29.2 MJ/L trong khi giá trị năng lượng của
ethanol chỉ là 19.6 MJ/L và của xăng là 32 MJ/L thì năng lượng của butanol đã
nhiều hơn ethanol khoảng 25%.
- Dựa vào áp suất hơi có thể thấy butanol sử dụng an toàn hơn so với ethanol do
butanol ít bay hơi hơn ethanol và xăng.
- Butanol ít gây ăn mòn hơn so với ethanol, không ảnh hưởngđến các thiết bị
chứa đựng như bể chứa, đường ống, máy bơm… khi sử dụng lâu dài.
- Khả năng hòa tan thấp trong nước của butanol cho phép nó có thể được pha
trong xăng dầu ở nồng độ cao hơn bất kì loại nhiên liệu sinh học nào mà không
sợ bị tách pha làm xuất hiện nước, trong khi ethanol chỉ có thể được pha thêm
vào xăng khoảng 25% vàchỉ được giữ trong một thời gian ngắn để sử dụng. Áp
suất hơi của butanol (4 mmHg ở 20°C) là thấp hơn so với ethanol 11 lần (45
mmHg ở 20°C) cho phép nó có thể pha trực tiếp vào xăng mà không cần quan
tâm đến sự bay hơi.
- Trong quá trình đốt cháy, butanol không thải ra bất kì hợp chất khí nào chứa
sulphur và các oxit nitơ, đây là một ưu điểm vượt trội về môi trường so với các
nguồn nhiên liệu khác.
SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên

4

Đồ án chuyên ngành

GVHD: Lê Văn Việt Mẫn

Với những ưu điểm trên cùng với một nguồn cơ chất phong phú có thể được sử dụng
trong quá trình lên men ABE, biobutanol sẽ là một tiềm năng lớn trong việc thay thế
nguồn nhiên liệu xăng dầu đang cạn kiệt và góp phần làm giảm hiệu ứng nhà kính.
Bên cạnh vai trò là nhiên liệu sinh học cho động cơ, butanol thực sự là một hóa chất
quan trọng được sử dụng với lượng lớn trong các ngành công nghiệp. Gần một nửa sản
lượng butanol được sản xuất trên toàn thế giới được sử dụng làm dung môi ở dạng butyl
acrylate và este methacrylate trong sản xuất các loại sơn nhưenamel,nitrocellulose; keo
dán, chất đàn hồi, công nghệ dệt may, sản xuất sợi, nhựa, sản xuất kính an toàn, chất tẩy
rửa. Các hợp chất quan trọng có nguồn gốc từ butanol như butyl ete glycol,
butylacetate,amin butyl,nhựa amin và chất dẻo.
Nó cũng được sử dụng làm dung môi trong ngành công nghiệp mỹ phẩm như nước
hoa, các sản phẩm trang điểm cho mắt, sơn móng tay…và được dùng cho việc sản xuất
các loại thuốc kháng sinh, vitamin và hormone.

SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên

5


Đồ án chuyên ngành

GVHD: Lê Văn Việt Mẫn

CHƯƠNG 3: VI SINH VẬT TRONG LÊN MEN SẢN XUẤT
BUTANOL – CLOSTRIDIUM

3.1. Đặc điểm hình thái
Clostridium là một giống trực khuẩn Gram dương, thuộc ngành Firmicutes. Đây là
những vi khuẩn kỵ khí bắt buộc, có khả năng sinh nha bào khi môi trường sống bất lợi.
Đại diện tiêu biểu đó là loài Clostridium acetobutylicum có dạng hình que thẳng, kích
thước khác nhau từ 0,5-1,5 × 1,5-6 μm (Robinson, 2000). Clostridium acetobutylicum là
vi khuẩn Gram dương khi đang phát triển trong giai đoạn logarite trong canh trường,và
chuyển thành Gram âm khi bước sang giai đoạn ổn định và sinh bào tử, lên men dị
dưỡng, di động bằng roi. Trong quá trình hình thành bào tử, tế bào phình lên rõ rệt và tích
trữ các hạt, một polysaccharide cung cấp nguồn carbon và năng lượng trong giai đoạn
solventogenesis. Bào tử được hình thành có dạng bầu dục. Các vi sinh vật thuộc giống
Clostridium lên men thường được xếp thành bốn nhóm khác nhau dựa trên đặc tính sinh
hóa và di truyền của chúng (Woods, 1995) bao gồm: Clostridium acetobutylicum,
C.beijerinckii,C.saccharobutylicum, và C. saccharoperbutylacetonicum. Hai loài được
biết đến với nhiều ưu điểm vượt trội là C. acetobutylicum và C. beijerinckii (trước đây
gọi là C. butylicum) và hầu hết các tài liệu nghiên cứu về lên men ABE đều dựa trên hai
loài này.

Hình 2: Hình ảnh của C.acetobutylicum và C.beijerinckii trên kính hiển vi điện tử (SEM)

3.2. Đặc điểm sinh lý của vi khuẩn Clostridium
3.2.1. Nhu cầu dinh dưỡng
- Nguồn Carbon:
Quá trình tổng hợp acetone, butanol, and ethanol từ các loài thuộc giống Clostridium
đều bắt nguồn từ cơ chất là carbohydrate. Nhóm vi sinh vật này có khả năng sử dụng
nguồn dinh dưỡng rất đa dạng, có thể sử dụng gần như hoàn toàn các loại đường như
glucose, fructose, mannose, sucrose, lactose và sử dụng một phần các đường xylose,
SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên

6

Đồ án chuyên ngành

GVHD: Lê Văn Việt Mẫn

galactose, arabinose, raffinose… Nhiều nghiên cứu cho thấy glucose vẫn là loại đường
tốt nhất cho Clostridium sử dụng.
- Nguồn Nitơ:
Nitơ là thành phần quan trọng của protein và enzyme, có thể được cung cấp vào môi
trường nhân giống và lên men cho vi sinh vật sử dụng dưới dạng các muối NH 4+ và NO3hay các hợp chất hữu cơ phức tạp từ chất chiết nấm men, sản phẩm thủy phân từ đậu
nành… Việc bổ sung nitơ là cần thiết cho việc tạo sinh khối vi sinh vật, tuy nhiên nếu bổ
sung quá nhiều có thể làm ức chế việc sinh tổng hợp sản phẩm.
- Khoáng:
Sự phát triển tế bào của vi khuẩn phụ thuộc vào các muối khoáng trong môi trường
như Mg2+, Fe2+, Mn2+ và K+ . Chúng được cung cấp dưới dạng các muối như MgSO 4,
MnSO4, FeSO4, KCl, KH2PO4 và K2HPO4;…Nếu nồng độ của Mg2+ và Mn2+ trong môi
trường quá cao sẽ gây ức chế đến sự sinh trưởng của tế bào.
- Yếu tố sinh trưởng:
Cũng giống như các loài vi khuẩn khác, quá trình sinh trưởng và phát triển của
Clostridium đòi hỏi cung cấp một số yếu tố sinh trưởng như biotin, thiamine
hydrochloride, p-aminobenzoic, resazurin… Các yếu tố này hiện diện trong môi trường ở
nồng độ tương đối thấp từ 0.1-1 mg/L, nhưng ảnh hưởng nhiều đến hoạt động trao đổi
chất của vi khuẩn trong quá trình lên men.
Các loại môi trường thường được sử dụng để nuôi cấy và nhân giống vi khuẩn
Clostridium:
- Môi trường P2: là môi trường tối ưu cho tất cả các loài của Clostidium phát
triển, được sử dụng làm môi trường giữ giống và lên men với các nồng độ
glucose khác nhau.
Thành phần
Glucose

MgSO4.7H2O
MnSO4.H2O
FeSO4.7H2O
KCl
KH2PO4
K2HPO4
Ammonium acetate
p-aminobenzoic acid
Thiamin
Biotin
Dịch trích nấm men
SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên

7

Hàm lượng (g/L)
60
20
1
1
1
50
50
220
0.1
0.1
0.001
1

Đồ án chuyên ngành
-

GVHD: Lê Văn Việt Mẫn

Môi trường Tryptone-yeast extract-sucrose(TYS):
Thành phần
Sucrose
Na2SO4
K2HPO4
Dịch trích nấm men
Biotin
p-aminobenzoic acid
Tryptone
Antifoam C

-

Hàm lượng (g/L)
60
0.18
3.48
5.0
0.01
0.01
1.0
0.5 ml

Môi trường CAB: là môi trường được sử dụng làm môi trường giữ giống và
lên men tối ưu cho loài Clostridium acetobutylicum

Thành phần
Glucose
Dịch trích nấm men
Tryptone
K2HPO4
KH2PO4
DL-asparagine
MgSO4.7H2O
MnSO4.H2O
NaCl
FeSO4.7H2O
resazuin

Hàm lượng (g/L)
50
4
1
0.7
0.7
0.5
0.1
0.1
0.1
0.015
0.002

3.2.2. Điều kiện nuôi
Nhiệt độ hoạt động của Clostridium nằm trong khoảng từ 29-37oC, tùy thuộc vào
từng loài mà có nhiệt độ tối thích khác nhau.Clostridium acetobutylicum có nhiệt độ tối
thích nằm trong khoảng 35-37 oC, trong khi đó đối với loài Clostridium beijerinckii lại là

31-32 oC và Clostridium saccharobutylicum là 30 oC. Đa số các quá trình nhân giống và
lên men sử dụng vi khuẩn Clostridium acetobutylicum đều được duy trì ở 35 oC.
pH là yếu tố quan trọng ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh trưởng và tạo sản phẩm
của Clostridium. Khoảng pH tối thích của các loài thuộc giống Clostridium nằm trong
khoảng từ 5.0-6.5, bất kì một sự thay đổi nào làm giảm pH dưới 4.5 đều có khả năng gây
ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn. Đa số các môi trường ban đầu đều được chỉnh về
pH=6.5, tuy nhiên cùng với quá trình sinh trưởng thì vi khuẩn lại sinh ra các hợp chất

SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên

8


Đồ án chuyên ngành

GVHD: Lê Văn Việt Mẫn

như axit butyric, propionic và acetic làm giảm pH môi trường. Vì vậy, cần kiểm soát và
điều chỉnh pH trong suốt quá trình sinh trưởng của vi khuẩn.

3.3. Các loài vi sinh vật được dùng trong sản xuất butanol
Như đã giới thiệu ở trên, các loài có khả năng sinh tổng hợp butanol bao gồm bốn
loài chính là: Clostridium acetobutylicum, C. beijerinckii, C. saccharobutylicum và
Clostridium saccharoperbutylacetonicum.
Clostridium acetobutylicum là loài có đặc tính di truyền khác biệt nhất và ít liên quan
đến ba loài còn lại. Những chủng thuộc loài này phát triển tốt trên các môi trường cơ chất
từ dịch thủy phân tinh bột nên được sử dụng phổ biến ở quy mô công nghiệp để sản xuất
dung môi. Clostridium acetobutylicum là loài được nghiên cứu trong sản xuất dung môi
nhiều nhất, nhiều chủng được phát triển từ loài này cho khả năng tổng hợp butanol khá
cao. Cho đến nay, một trong số những kết quả lên men tốt nhất là từ chủng C.

acetobutylicum PCSIR-10 có khả năng kháng butanol, sử dụng cơ chất là rỉ đường mía
được thực hiện bởi Syed (1994). Theo đó, tổng nồng độ dung môi đạt được là 19.2 g/L
với hiệu suất là 34%.
Loài Clostridium beijerinckii liên quan nhiều đến hai loài C. saccharobutylicum và
C. saccharoperbutylacetonicum. Cả ba được biết đến như là các vi sinh vật saccharolyticsử dụng các loại đường làm cơ chất lên men và hầu hết các chủng lên men đường ở quy
mô công nghiệp đều thuộc loài C. beijerinckii. Mặc dù C.acetobutylicum được nghiên
cứu nhiều nhất trong sản xuất dung môi nhưng C. beijerinckii lại cho thấy nhiều ưu điểm
và có tiềm năng trong việc ứng dụng sản xuất ở quy mô công nghiệp. C. beijerinckii có
một khoảng pH tối thích rộng trong việc sinh trưởng và tạo dung môi. Bên cạnh đó C.
beijerinckii là một đối tượng tiềm năng trong việc ứng dụng các kĩ thuật chuyển gene
nhằm tạo ra các chủng có khả năng sử dụng đa dạng các nguồn carbohydrate (Ezeji, et
al., 2004). Với C. beijerinckii, người ta cho rằng các chủng này có khả năng chịu được
tác động của acid ở nồng độ cao nên thích hợp trong các quá trình lên men liên tục hơn so
với các chủng từ C.acetobutylicum (theo Grube & Gapes, 2002; Zverlov và các cộng sự,
2006). Trong nghiên cứu của Ezeji và các cộng sự (2004), chủng C. beijerinckii BA101
sử dụng rất linh hoạt nhiều nguồn cơ chất khác nhau và cho nồng độ dung môi đạt từ
14.8-26.1 g/L với năng suất từ 37-50%.
Có khá ít nghiên cứu về hai loài C. saccharobutylicum và C.
saccharoperbutylacetonicum được sử dụng để lên men ABE. Shaheen và cộng sự (2000)
đã tập hợp những chủng đã được sử dụng để lên men và nhận thấy rằng chúng phát triển
tốt hơn trên môi trường glucose và rỉ đường mía so với trên môi trường dịch ngô. Kết quả
lên men tốt nhất được thực hiện trên chủng C. saccharobutylicum BAS/B3/SW/336(S),

SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên

9


Đồ án chuyên ngành

GVHD: Lê Văn Việt Mẫn

khi sử dụng mật rỉ mía với nồng độ dường lên men là 6.5%. Nồng độ trung bình đạt
19.6g/L với hiệu suất 30%.
Bảng 3: So sánh khả năng lên men của một số chủng đã được phân lập

Chủng

Môi
trường/cơ
chất
( 6%
đường lên
men)
C. acetobutylicum
PCSIR-10b
Rỉ đường
PCSIR-5b
Rỉ đường
a
ATCC 4259
Rỉ đường
a
ATCC 824
Rỉ đường
d
ATCC 824
Glucose
BA 101c
BA 101c

NCP P260a
NCP P260a

Glucose
Rỉ đường
Rỉ đường*
Rỉ đường

Nồng
độ các
dung môi
(g/L)

Hiệu suất
(%)

19.2
15.2
9.5
7.8
20.6

34.0
30.0
15.8
13.0
42.0
C. beijerinckii
24.2
42.0

22.8
39.0
21.9
33.4
18.9
31.5
C. saccharobutylicum
19.6
30.0

BAS/B3/SW/
Rỉ đường*
a
336(S)
NCP P108a
Rỉ đường*
18.6
a
NCP P258
Rỉ đường
18.3
C. saccharoperbutylacetonicum
N1-504a
Rỉ đường
15.6

*: 6.5% các loại đường có thể lên men
a: Shaheen và cộng sự (2000)
b: Syed (1994)
c: Ezeji và cộng sự (2004)

d: Roffler và cộng sự (1987)

SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên

10

Năng
suất
( g/L.h )

A:B:E

0.42
0.24
0.58

1.8:95.3:2.9
5.3:79:15.7
20.6:66.5:26.2

0.34
0.19
-

17.8:81:1.2
18.4:80.3:1.3
-

-

-

28.6
30.5

-

-

26.0

-

-


Đồ án chuyên ngành

GVHD: Lê Văn Việt Mẫn

CHƯƠNG 4: QUÁ TRÌNH LÊN MEN ACETON-BUTANOLETHANOL
4.1. Sự trao đổi chất trong quá trình lên men của vi khuẩn Clostridium
Trong quá trình lên men của Clostridium, hai giai đoạn sinh trưởng riêng biệt xảy ra:
giai đoạn acidogenic và giai đoạn solventogenic. Giai đoạn acidogenic xảy ra đầu tiên,
khi Clostridium thực hiện quá trình lên men butyrat điển hình và phát triển trên môi
trường cơ chất là tinh bột hoặc đường. Các sản phẩm chính trong giai đoạn này là butyrat
(butyric acid), acetate (acid acetic), carbon dioxide và hydrogen. Ethanol và acetone được
hình thành với một lượng nhỏ. Việc sinh ra các hợp chất có tính acid đã làm giảm pH của
môi trường lên men xuống thấp, có thể làm chết tế bào vi khuẩn. Để tránh bị tiêu diệt, vi
khuẩn đã bắt đầu một sự thay đổi chuyển hóa diễn ra ở cuối giai đoạn tăng trưởng theo

cấp số nhân. Điều này cũng đánh dấu sự kết thúc của giai đoạn acidogenic và bắt đầu giai
đoạn solventogenic. Các acid bài tiết được sử dụng trong giai đoạn này và được chuyển
đổi thành các sản phẩm trung tính, bao gồm aceton và butanol (theo tỷ lệ thông thường là
1:2). Sự chuyển đổi butyrate và acetate thành dung môi làm tăng pH trở lại, nghĩa là các
tế bào có thể trở lại hoạt động trao đổi chất trong một thời gian dài hơn. Tuy nhiên, các
dung môi này lại cũng gây ức chế các tế bào vi khuẩn, đặc biệt là butanol. Dung môi gây
bất hoạt các protein màng tế bào và phá hủy các màng của tế bào, do đó có một giới hạn
về nồng độ dung môi tối đa có thể đạt được trong quá trình lên men (khoảng 2% về khối
lượng). Quá trình trao đổi chất diễn ra cụ thể theo sơ đồ như sau:

SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên

11


Đồ án chuyên ngành

GVHD: Lê Văn Việt Mẫn

Hình 3: Sơ đồ trao đổi chất trong quá trình lên men của Clostidium

Quá trình tiền xử lý sinh khối chứa lignocellulosic hoặc thủy phân tinh bột được thực
hiện nhờ các enzyme α-amylase, β-amylase, pullulanase, enzym glucoamylase, αglucosidase do vi khuẩn tiết ra, (1,2). Sự thủy phân cellulose nhờ enzyme cellulase, βglucosidase tạo ra glucose . Glucose được hấp thu bởi hệ enzyme phophotransferase
(PTS) và chuyển đổi thành pyruvate theo con đường EMP (Embden-Meyerhof-Parnas),
(3,6). Sự thủy phân hemixenlulose tạo ra các đường xylose / arabinose được hấp thu,
dưới tác dụng của enzyme transketolase-transaldolase tạo thành fructose 6-phosphate và
glyceraldehydes 3-phosphate theo con đường EMP, (4,5). Sau đó pyruvate được
ferrodoxin oxidoreductase chuyển hóa thành Acetyl-CoA, chất này sau đó được chuyển
hóa thành Acetoacetyl- CoA nhờ enzyme thiolase, (7,10). Sự tạo thành acetate từ AcetylCoA được thực hiện nhờ các enzyme phosphate acetyltransferase và acetate kinase, (8)
và tạo ethanol nhờ các enzyme là acetaldehyde dehydrogenase và ethanol dehydrogenase,

(9). Dưới tác dụng của enzyme Acetoacetyl-CoA transferase, Acetoacetyl-CoA đươc
chuyển hóa thành acetoacetic. Sự loại bỏ CO 2 của acetoacetic khi được xúc tác bởi
enzyme acetoacetic decaboxylase dẫn đến sự tạo thành acetone ở pH tối ưu vào khoảng
5.0. Sự tạo thành acetone qua acetoacetyl-CoA không tiêu thụ NADPH nên vi khuẩn chỉ
có thể tạo acetone ở một mức độ giới hạn, (11).
SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên

12


Đồ án chuyên ngành

GVHD: Lê Văn Việt Mẫn

Từ nhánh acetoacetyl-CoA nhận H2 nhờ enzyme β- Hydroxibutiryl CoA hydrogenase
tạo thành β- Hydroxibutiryl CoA . Sau đó loại H 2O dưới tác dụng của enzyme crotanase
tạo thành crotonyl-CoA. Nhờ enzyme butyryl-CoA hydrogenase chuyển thành ButyrylCoA, (12).
Butyryl-CoA chuyển nhóm Co-A tạo thành Butyric nhờ enzyme Butyric transferase,
(13). Mặt khác butyryl-CoA vừa nhận H 2 và đồng thời tách nhóm Co-A tạo thành
Butyraldehit, chất này sau đó nhận H2 tạo thành butanol, (14).

4.2. Lên men của vi khuẩn tự do
4.2.1. Khả năng sử dụng các nguồn cơ chất trong lên men
a. Khảo sát khả năng sử dụng các loại đường đơn pentose và hexose
Để khảo sát khả năng sử dụng các loại đường khác nhau của Clostridium, Nasib
Qureshi và các cộng sự (2006) đã thực hiện các quá trình lên men với các loại đường là
glucose, xylose, arabinose, galactose sử dụng chủng Clostridium acetobutylicum P260.
Trong thí nghiệm này, 60g mỗi loại đường trên sẽ được pha vào 1L môi trường P2 thực
hiện lên men song song trong vòng 72h ở nhiệt độ 35 oC. Kết quả thu được sau 72h lên
men, canh trường đã tổng hợp được 21.37, 11.12, 10.09, và 15.18 g/L ABE tương ứng

với các dịch lên men của glucose, xylose, galactose và arabinose (bảng 4).
Bảng 4: Các thông số của quá trình lên men ABE trong 72h sử dụng các loại đường glucose,
xylose, galactose và arabinose

Nồng độ ABE (g/L)
Nồng độ acid (g/L)
Sự tiêu thụ đường (g/L)
Hiệu suất
Nồng độ tế bào (g/L)
Năng suất tổng hợp ABE
(g/L.h)

Glucose
21.37
3.74
59.4
0.36
2.50
0.30

Xylose
11.12
4.08
36.2
0.31
1.41
0.15

Galactose
10.09

4.34
31.9
0.32
1.88
0.14

Arabinose
15.18
3.30
37.0
0.41
1.94
0.21

Trong suốt quá trình lên men, lượng glucose, xylose, galactose và arabinose được sử
dụng tương ứng là 59.4, 36.2, 31.9 và 37.0 g/L. Mặc dù Clostridium acetobutylicum P260
có thể sử dụng được cả bốn loại đường nhưng kết quả đã cho thấy canh trường vi sinh vật
đã sử dụng glucose nhiều hơn những loại đường khác. Glucose hầu như không còn trong
dịch sau lên men, trong khi galactose được sử dụng ít nhất trong bốn loại đường (37.0
g/L). Tuy nhiên, hiệu suất lần lượt đạt 0.36, 0.31, 0.32 và 0.41 tương ứng của các dung
dịch glucose, xylose, galactose và arabinose. Như vậy, arabinose dù không lên men được
hoàn toàn nhưng lại cho hiệu suất sinh butanol cao nhất. Nồng độ tế bào vi sinh vật từ
SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên

13


Đồ án chuyên ngành

GVHD: Lê Văn Việt Mẫn

dịch lên men của glucose cũng cho kết quả cao nhất (2.50 g/L), điều này cho thấy glucose
tạo môi trường thuận lợi nhất cho sự phát triển của tế bào vi khuẩn.
Để đánh giá tốc độ sử dụng glucose, xylose, galactose và arabinose trong quá trình lên
men, Nasib Qureshi và các cộng sự đã thực hiện lên men hỗn hợp 15g mỗi loại đường
trên pha trong 1L môi trường P2 ở 35oC. Kết quả được biểu diễn trên đồ thị hình 4:

Hình 4: Quá trình lên men từ hỗn hợp chứa 15 g/L các loại đường glucose, xylose, galactose
và arabinose sử dụng Clostridium acetobutylicum P260. (A): nồng độ sản phẩm của quá trình lên
men ở các thời điểm khác nhau, (♦) Acetone, (■): butanol, (▲): ethanol, ( ): acid acetic, (□):
acid butylic. (B): nồng độ đường còn lại trong dịch lên men ở các thời điểm khác nhau, (♦):
glucose, (■): xylose, (▲): arabinose, (●): galactose.

Hình 4B cho thấy, glucose được sử dụng nhanh hơn các loại đường còn lại, tất cả 15g
glucose được sử dụng hết trong 35h lên men. Sự tiêu thụ arabinose ngừng lại sau 53h lên
men và còn sót lại hơn 0.6 g/L. Quá trình sử dụng xylose và galactose diễn ra khá chậm,
sau 70h lên men 8.7 g/L xylose và 9.4 g/L galactose vẫn chưa được sử dụng hết. Nồng độ
ABE đạt được sau 70h lên men từ hỗn hợp đường trên là 16.25 g/L với nồng độ butanol
đạt xấp xỉ 12 g/L, năng suất là 0.23g/L.h và hiệu suất là 0.40. Với những kết quả này cho
thấy Clostridium acetobutylicum P260 tuy có thể sử dụng được nhiều loại đường khác
nhau nhưng việc tiêu thụ các loại đường xylose và galactose diễn ra khá chậm, hàm
lượng đường sót còn nhiều làm giảm nồng độ butanol. Phát triển các chủng mới từ loài
Clostridium acetobutylicum có khả năng sử dụng đường xylose và galactose tương đương
với glucose và arabinose sẽ mang lại hiệu quả cao hơn trong lên men.
Một nghiên cứu khác trên loài Clostridium beijerincki, đã khảo sát khả năng sử dụng
các loại đường đơn khác nhau. Ezeji và cộng sự (2007) đã sử dụng chủng Clostridium
beijerinckii BA101 để lên men các loại đường glucose, xylose, cellobiose, mannose,
arabinose và galactose. Dịch lên men được chuẩn bị trong môi trường P2, 55g mỗi loại

SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên

14


Đồ án chuyên ngành

GVHD: Lê Văn Việt Mẫn

đường sẽ được pha vào 1L môi trường P2 ở 35 oC không kiểm soát pH trong suốt quá
trình lên men. Kết quả được biểu diễn trên hình 5:

Hình 5: Nồng độ dung môi ABE đạt được khi lên men các đường đơn (55g/L: glucose,
xylose, cellobiose, mannose, arabinose và galactose) sử dụng Clostridium beijerinckii BA101.
Quá trình lên men được thực hiện sau 60h thì Clostridium beijerinckii ngừng tạo sản phẩm.
Nồng độ dung môi ABE đạt được cao nhất trong dịch lên men của cellobiose 19.1 g/L, đạt hiệu
suất 0.35. Trong khi đó, dịch lên men từ glucose cho nồng độ dung môi cuối là 17.8 g/L đạt năng
suất 0.30 g/L.h, nồng độ các acid trong dịch lên men chỉ còn 2.5 g/L. Năng suất tạo dung môi
của các loại đường còn lại dao động trong khoảng 0.23-0.32 g/L.h. Galactose tiếp tục thể hiện là
loại đường cho hiệu suất thấp khi được sử dụng để lên men ABE khi cho nồng độ dung môi thấp
nhất. Nồng độ acid trong dịch lên men của galactose khá cao (>7 g/L), điều này cho thấy sự giảm
khả năng hấp thu và chuyển hóa các acid của vi khuẩn trong dịch lên men của galactose, từ đó
làm giảm nồng độ dung môi ABE cuối.
Để đánh giá khả năng lên men hỗn hợp các loại đường khác nhau của Clostridium
beijerinckii, Ezeji và cộng sự đã thực hiện quá trình lên men hỗn hợp đường gồm glucose,
mannose, arabinose và xylose bổ sung vào dịch lên men với tỉ lệ tương ứng là 5:1:2:4. Sau 84h
lên men (khi quá trình lên men dừng lại), nồng độ dung môi ABE đạt được là 17.9 g/L với nồng
độ butanol đạt tối đa là 13.9 g/L ( hình 6). Mặc dù lượng butanol và tổng lượng ABE được tạo ra
xấp xỉ như trong quá trình lên men từ đường glucose nhưng thời gian lên men lại dài hơn ( 84h
so với 60h của glucose), do đó dẫn tới kết quả là tốc độ sinh tổng hợp sản phẩm tương đối thấp
(0.21 g/L.h).

SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên

15


Đồ án chuyên ngành

GVHD: Lê Văn Việt Mẫn

Hình 6: Lên men ABE từ hỗn hợp đường glucose, mannose, arabinose và xylose với tỉ lệ
5:1:2:4 bởi Clostridium beijerinckii BA101. (A): nồng độ các sản phẩm đạt được trong suốt quá
trình lên men. (B): nồng độ các loại đường còn lại. HAc: acid acetic, HBu: acid butylic, HAB:
tổng acid acetic vả acid butylic.

Trong suốt quá trình lên men, nồng độ các acid trong dịch lên men tương đối thấp
(hình 6A), điều này cho thấy quá trình lên men cho hiệu quả tốt. Tất cả các loại đường
được sử dụng đồng thời trong suốt quá trình lên men mặc dù tốc độ sử dụng là khác nhau
(hình 6B). Khả năng sử dụng đường glucose nhanh tiếp tục được thể hiện ở loài
Clostridium beijerinckii, điều này cho thấy glucose là cơ chất ưa thích trong quá trình
trao đổi chất của hầu hết các loài. Khi nồng độ glucose dần cạn kiệt, loại đường tiếp theo
được Clostridium beijerinckii sử dụng nhiều hơn là xylose. Có thể sắp xếp thứ tự ưu tiên
sử dụng các loại đường trong hỗn hợp của Clostridium beijerinckii theo thứ tự là glucose
> xylose > arabinose > mannose. Kết thúc quá trình lên men, nồng độ các loại đường còn
lại không được sử dụng trong dịch lên men là 0 g/L glucose, 4.0 g/L xylose, 3.3 g/L
arabinose và 1.7 g/L mannose. Như vậy, sự khác nhau về khả năng sử dụng các loại
đường giữa hai loài C.acetobutylicum và C.beijerincki đã được ghi nhận: sau glucose thì
SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên

16

Đồ án chuyên ngành

GVHD: Lê Văn Việt Mẫn

C.acetobutylicum thể hiện khả năng sử dụng đường arabinose tốt hơn nhiều so với đường
xylose.
Để so sánh rõ hơn về khả năng sử dụng đường glucose và đường pentose (xylose) trên
loài Clostridium beijerinckii, N. Qureshi và cộng sự (2008) đã tiến hành hai thí nghiệm
lên men. Chủng C.beijerinckii BA101 được sử dụng, hai môi trường lên men lần lượt
chứa 25 g/L glucose và 25 g/L xylose. Sau 60 giờ lên men, tất cả đường glucose đã được
sử dụng và tạo ra 9.9 ± 0.4 g/L ABE trong đó có 6.1 g/L butanol. Nồng độ acetone và
ethanol lần lượt là 3.9 và 0.4 g/L. Năng suất đạt được là 0.17 ± 0.006 g/L.h và hiệu suất
là 0.39 ± 0.025. Trong khi đó quá trình lên men từ đường xylose cho nồng độ ABE đạt
9.6 ± 0.4 g/L với năng suất trong 60 giờ lên men đạt 0.16 ± 0.01 g/L.h và hiệu suất là
0.39 ± 0.011.

Hình 7: Nồng độ các sản phẩm thu được trong quá trình lên men ABE từ chủng
C.beijerinckii BA101, (A): Glucose, (B): Xylose

SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên

17


Đồ án chuyên ngành

GVHD: Lê Văn Việt Mẫn

Kết quả lên men đã cho thấy nồng độ ABE thu được từ glucose và xylose xấp xỉ bằng
nhau, N. Qureshi và cộng sự đã kết luận khả năng sử dụng đường xylose của
C.beijerinckii là tương đương so với glucose.
Những kết quả trên cho thấy các loài Clostridium đều có khả năng sử dụng đa dạng
nhiều loại đường khác nhau (hexose và pentose) đặc biệt phát triển rất tốt trên cơ chất là
đường glucose. Trên môi trường là hỗn hợp nhiều loại đường khác nhau, Clostridium
cũng cho thấy khả năng lên men khá tốt. Điều này chứng tỏ việc sử dụng các nguồn phế
phẩm nông nghiệp có chứa sinh khối lignocellulosic (biomass) làm cơ chất cho quá trình
lên men ABE là khả thi. Khi thủy phân các nguồn sinh khối chứa lignocellulosic sẽ cho
ra hỗn hợp nhiều loại đường, việc thủy phân có thể tách riêng hoặc thực hiện đồng thời
với quá trình lên men. Nhiều nghiên cứu đã thực hiện trên các nguồn cơ chất khác nhau
với mục đích làm giảm chi phí cho quá trình lên men tổng hợp butanol. Việc xử lý các
nguồn biomass trước khi sử dụng làm dịch lên men là khá phức tạp, có thể ảnh hưởng và
làm giảm nồng độ dung môi đạt được. Vì vậy, việc tối ưu hóa các điều kiện lên men với
từng loại cơ chất để đạt hiệu quả cao nhất là tương đối phức tạp.
b. Lên men từ bột sắn (cassava flour CF)
Trong một nghiên cứu của Leonardo và cộng sự (2010), bột sắn được sử dụng làm cơ
chất cho quá trình lên men sử dụng chủng Clostridium beijerinckii BA101. Bột sắn sẽ
được xử lý bằng hai phương pháp sử dụng enzyme (α-amylase và β-glucoamylase)và
acid (HCl). Bột sắn được pha vào nước cất thành dung dịch huyền phù ở các nồng độ 60,
80 g/L. Với phương pháp xử lý bằng acid (CT: acid chemical treatment), dung dịch HCl
1M được bổ sung vào dung dịch CF đến khi pH đạt 1.5. Quá trình thủy phân thực hiện
trong 2h ở nhiệt độ 121oC, sau đó được làm lạnh đến 4 oC để ngừng quá trình thủy phân.
Với phương pháp xử lý bằng enzyme (E1), CaCl 2 (1g/L) được bổ sung vào dung dịch
huyền phù để đạt 40 mgCa/L, điều chỉnh pH đến 6.5 bằng NaOH 1M. α-amylase được bổ
sung vào ( 1ml/kg bột) và thực hiện quá trình hồ hóa ở 93 oC trong 2h. Sau đó, bổ sung βglucoamylase (1.7 ml/kg bột) thực hiện quá trình dịch hóa ở 60 oC, tốc độ khuấy đảo 150
rpm trong 1h. Cuối cùng hỗn hợp được đưa về 40oC giữ trong 39h trước khi lên men. Quá
trình lên men được thực hiện ở các nhiệt độ 35 và 40 oC với nồng độ CF là 60 và 80 g/L.
Kết quả thu được thể hiện trong bảng 5:

SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên

18


Đồ án chuyên ngành

GVHD: Lê Văn Việt Mẫn

Bảng 5: Kết quả lên men ABE của chủng Clostridium beijerinckii BA101 trên cơ chất bột
sắn ở các điều kiện khác nhau.

Nhiệt độ
(oC)

Nồng độ
CF (g/L)

Phương
pháp thủy
phân

Butanol
(g/L)

Ethanol
(g/L)

Acetone
(g/L)

35
40
35
40
35
40
35
40
35
40
35
40
35
40
35
40

60
60
80
80
60
60
80
80
60
60
80
80

60
60
80
80
Trung bình

CT
CT
CT
CT
ET
ET
ET
ET
CT
CT
CT
CT
ET
ET
ET
ET

21.87
26.73
27.54
17.82
12.53
31.59
19.44

22.68
19.44
25.92
20.25
18.63
16.20
24.30
11.34
18.63
20.81

14.58
1.70
20.25
6.32
2.75
10.21
8.91
2.84
1.54
3.56
9.72
0.01
12.15
7.70
0.01
0.01
6.39

0.01

7.19
0.01
0.01
0.01
2.69
0.01
8.14
6.87
11.85
8.69
5.14
0.01
0.01
8.69
7.51
4.18

Tổng
lượng
dung môi
(g/L)
36.46
35.62
47.80
24.15
13.29
44.49
28.36
33.66
27.85

41.33
38.66
23.78
28.36
32.01
20.04
26.15
31.38

Như vậy, với kết quả thu được từ bảng 5, nồng độ butanol đạt được cao nhất là 31.59
g/L ứng với quá trình lên men ở 40 oC sử dụng nồng độ CF là 60g/L xử lý bằng enzyme.
Nồng độ butanol đạt được thấp nhất là 11.34 g/L khi lên men ở 25 oC, nồng độ CF là 80
g/L xử lý bằng enzyme. Kết quả này chứng tỏ, quá trình xử lý cơ chất trước khi lên men
cũng như nồng độ cơ chất ban đầu sử dụng có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng sinh tổng
hợp butanol của vi khuẩn. Khi thủy phân bằng phương pháp acid, các tạp chất lẫn trong
dung dịch HCl có thể gây ức chế khả năng hoạt động của vi khuẩn làm giảm hiệu suất
tổng hợp butanol. Nồng độ butanol trung bình đạt 20.81 g/L sau 96h lên men, tốc độ sinh
tổng hợp butanol tương ứng là 0.22 g/L.h.
c. Lên men từ Xơ bắp ( corn fiber)
Xơ bắp là phụ phẩm từ trái bắp, không có giá trị về mặt kinh tế được sử dụng làm
thức ăn gia súc. Tuy nhiên trong xơ bắp chứa tới 60-70 % các thành phần carbohydrate,
30% trong số đó là arabinoxylan hoặc hemicellulose. Nhiều nghiên cứu đã sử dụng xơ
bắp như là nguồn cơ chất cho quá trình lên men sản xuất butanol. Trong nghiên cứu của
N. Qureshi và cộng sự (2008) sử dụng chủng Clostridium beijerinckii BA101, xơ bắp
trước khi lên men được thủy phân bằng hai phương pháp sử dụng enzyme và acid
SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên

19

Đồ án chuyên ngành

GVHD: Lê Văn Việt Mẫn

sulfuric. Các tác giả đã so sánh khả năng tổng hợp butanol từ dịch thủy phân của hai
phương pháp trên. Kết quả thu được từ quá trình lên men dịch thủy phân bằng acid
sulfuric ( nồng độ đường đạt được sau quá trình thủy phân là 29.8 g/L; glucose chiếm 4.3
g/L) cho bởi bảng sau:
Bảng 6: Nồng độ sản phẩm tạo thành trong quá trình lên men ABE từ xơ bắp được thủy phân
bằng acid sulfuric.

Thời gian
(h)
0
24
54
72
96

Nồng độ tế
bào (g/L)
0.02
0.58
0.75
0.60
0.31

Acetone
(g/L)
0.0

0.2
0.1
0.1

Butanol
(g/L)
0.1
1.4
1.0
0.9

Ethanol
(g/L)
0.1
0.1
0.2
0.2

Tổng ABE
(g/L)
0.2
1.7
1.3
1.2

Nồng độ tế bào đạt được tối đa trong dịch lên men là 0.75 g/L ứng với lượng ABE đạt
được là 1.7 ± 0.2 g/L. Kết quả trên cho thấy vi khuẩn bị ức chế mạnh bởi một số sản
phẩm của quá trình thủy phân làm tế bào không thể phát triển. Việc sử dụng acid để thủy
phân đã tạo ra nhiều yếu tố gây ức chế lên canh trường.
Trong khi đó, quá trình lên men từ dịch thủy phân xơ bắp được thủy phân bằng

enzyme cho kết quả tốt hơn. Nồng độ đường đạt được sau quá trình thủy phân là 25 g/L.
Sau 72 giờ lên men 24.6 g/L đường đã được sử dụng.

Hình 8: Nồng độ sản phẩm tạo thành trong quá trình lên men ABE từ dịch thủy phân xơ bắp
bằng enzyme.

Tổng nồng độ ABE đạt được là 8.6 ± 1.0 g/L trong đó butanol đạt 6.5 g/L tương ứng
với tốc độ sinh tổng hợp 0.1 ± 0.011 g/L.h và hiệu suất 0.35. Kết quả đã cho thấy phương
SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên

20


Đồ án chuyên ngành

GVHD: Lê Văn Việt Mẫn

pháp thủy phân xơ bắp bằng enzyme đã hạn chế các chất ức chế so với phương pháp thủy
phân bằng acid. Nồng độ tế bào đạt được trong dịch lên men là 1.65 ± 0.40 g/L. Hàm
lượng đường sót chỉ còn 0.4 g/L cho thấy sơ bắp được thủy phân bằng enzyme là nguồn
cơ chất tiềm năng cho sản xuất butanol ở quy mô lớn.
Trong một nghiên cứu khác của Xin-Liang Li và cộng sự (2006), xylan lấy từ xơ bắp (
corn fiber xylan) được tiến hành đường hóa và lên men đồng thời sử dụng chủng
C.acetobutylicum P260. Mục đích của nghiên cứu là xác định khả năng tự thủy phân các
hợp chất carbohydrate phức tạp thành đường đơn của C.acetobutylicum.Thí nghiện tiến
hành với môi trường ban đầu chứa 60 g xylan trong 1 lít môi trường P2, lên men ở 35 oC.
Tuy nhiên, quá trình lên men đã không diễn ra, canh trường vi sinh vật không phát triển
và không tổng hợp được bất cứ dung môi nào. Điều này chứng tỏ C.acetobutylicum
không có khả năng thủy phân xylan. Xin-Liang Li và cộng sự (2006) tiếp tục quá trình
lên men như trên có bổ sung 0.5 ml enzyme xylanase hỗ trợ cho quá trình thủy phân. Kết

quả cho thấy vẫn không có sự phát triển của tế bào trong canh trường, điều này được giải
thích là do enzyme thủy phân xylan không đủ nhanh và đủ lớn để vi sinh vật sử dụng. Thí
nghiệm tiếp theo, 5 g/L xylose được bổ sung vào môi trường trên nhằm cung cấp cơ chất
cho vi sinh vật có thể sống sót trong quá trình xylanase thủy phân xylan trong môi
trường. Kết quả là vi khuẩn đã phát triển và tổng hợp được 9.6 g/L ABE (hình 9).

Hình 9: Nồng độ các sản phẩm đạt được trong quá trình lên men ABE chứa
60 g/L xylan + 5g xylose + 0.5ml xylanase.

SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên

21


Đồ án chuyên ngành

GVHD: Lê Văn Việt Mẫn

c. Lên men từ dịch bo bo ( sweet sorghum juice)
A.Areesirisuk và cộng sự (2010) đã sử dụng dịch đường lấy từ việc thủy phân thân
cây bo bo làm cơ chất cho quá trình lên men sản xuất butanol. Hạt và thân cây của bo bo
có thể được sử dụng để sản xuất đường, ethanol, syrup, nhiên liệu, giấy…(Rajvanshi và
Nimbkar, 2005). Mục đích nghiên cứu của A.Areesirisuk và cộng sự (2010) là khảo sát
khả năng phát triển và tổng hợp butanol của C.beijerinckii JCM 1390 từ dịch bo bo mà
không cần bổ sung thêm các nguồn dinh dưỡng từ đường đơn khác.
Dịch thủy phân từ thân cây bo bo sẽ được ly tâm, bổ sung vào môi trường P2 điều
chỉnh pH về 6.0 bằng dung dịch NaOH 1.0M. Quá trình lên men được thực hiện trong
thiết bị lên men yếm khí 2-L chứa 1500ml dịch lên men ở 37 oC. Các thông số trong suốt
quá trình lên men được biểu diễn trên đồ thị hình 10:

Hình 10: Các thông số của quá trình lên men từ dịch bo bo do chủng C.beijerinckii JCM
1390 thực hiện.

Từ đồ thị có thể thấy sau 60 giờ lên men, khả năng sử dụng cơ chất của vi khuẩn bắt
đầu giảm dần, sau 80 giờ thì quá trình lên men gần như không còn xảy ra. pH trong suốt
quá trình lên men có sự thay đổi không đáng kể, điều này chứng tỏ các acid sinh ra trong
giai đoạn acidogenesis đã được vi khuẩn chuyển hóa thành dung môi. Nồng độ các sản
phẩm đạt được sau quá trình lên men được biểu diễn trên hình 11:

SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên

22


Đồ án chuyên ngành

GVHD: Lê Văn Việt Mẫn

Hình 11: Nồng độ dung môi trong suốt quá trình lên men dịch bo bo của
C.beijerinckii JCM 1390

Như vậy nồng độ butanol đạt được sau 60 giờ lên men là 8.0 g/L và tối đa là 8.8 g/L
sau 120 giờ lên men, hiệu suất đạt 0.30. Như vậy so với kết quả từ nghiên cứu của N.
Qureshi và cộng sự (2008) trên cơ chất là dịch thủy phân xơ bắp ( nồng độ butanol đạt
được sau 60 giờ lên men là 6.5 g/L, hiệu suất 0.35), dịch bo bo có khả năng cho nồng độ
butanol cao hơn. Tuy nhiên, hàm lượng đường sót trong dịch sau lên men của bo bo lại
khá cao làm cho hiệu suất sinh tổng hợp sản phẩm giảm đáng kể. Tốc độ tổng hợp dung
môi chỉ đạt 0.09 g/L.h.
d. Lên men từ bã nho (grape pomace)
Bã nho là một phế phẩm trong các ngành công nghiệp sản xuất rượu vang, cứ 100 kg

nho sẽ cho khoảng 18-20 kg bã nho sau quá trình ép lấy dịch. Ngoài các ứng dụng trong
thực tiễn khá phổ biến để sản xuất acid tartaric, trích ly chất màu anthocyan, làm thức ăn
gia súc… bã nho còn chứa một lượng đường sót khá lớn 7.81-10.81 % w/w (Hang và
Woodams 2008) có thể được sử dụng làm cơ chất cho các quá trình lên men từ vi sinh
vật. Laurent Law (2010) đã tiến hành nghiên cứu khả năng lên men tổng hợp butanol từ
bã nho lấy từ giống nho trắng Chardonnay sử dụng giống vi khuẩn Clostridium
acetobutylicum P262. Để chuẩn bị cho dịch lên men, bã nho sẽ được pha vào nước cất
theo tỷ lệ 12.5% w/v, bổ sung dung dịch đệm kali phosphate 1M. Toàn bộ môi trường sẽ
được thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. Quá trình lên men sẽ được thực hiện ở 35 oC, pH
môi trường ban đầu 5.5.

SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên

23


Đồ án chuyên ngành

GVHD: Lê Văn Việt Mẫn

Hình 12: Nồng độ đường và nồng độ tế bào trong quá trình lên men từ bã nho sử dụng chủng
Clostridium acetobutylicum P262

Có thể thấy trong 24 giờ đầu của quá trình lên men, khả năng sử dụng cơ chất của vi
sinh vật còn tương đối thấp, nồng độ tế bào tăng không đáng kể. Có thể đây là quá trình
thích nghi với môi trường của vi khuẩn, canh trường chưa bước vào giai đoạn sinh
trưởng. Tuy nhiên, trong 48 giờ lên men tiếp theo, tốc độ sử dụng cơ chất của vi khuẩn
tăng rất nhanh. Sau 72 giờ lên men, 97.6% hàm lượng đường trong dịch lên men đã được
sử dụng, nồng độ tế bào tăng đều trong 72 giờ lên men và đạt nồng độ 0.81 g/L. Như vậy,
Clostridium acetobutylicum P262 phát triển khá tốt trên môi trường lên men từ bã nho,

nồng độ đường sót còn lại khá thấp ( 2.4%).
Nồng độ dung môi đạt được trong quá trình lên men được biểu diễn trên hình 13:

Hình 13: Nồng độ các dung môi đạt được trong quá trình lên men bã nho sử dụng chủng
Clostridium acetobutylicum P262

SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên

24


Đồ án chuyên ngành

GVHD: Lê Văn Việt Mẫn

Tốc độ sinh tổng hợp các acid acetic và butylic trong 24 giờ đầu lên men tăng khá cao
0.59 g/L.h, chứng tỏ canh trường đang trong giai đoạn acidogenesis chủ yếu tổng hợp
acid. Sau đó nồng độ các acid giảm nhanh trong 48 giờ tiếp theo, nghĩa là canh trường đã
bước sang giai đoạn solventogenesis, vi khuẩn bắt đầu sử dụng các acid sinh ra trong giai
đoạn trước để tổng hợp nên dung môi. Nồng độ các dung môi đạt được trong suốt quá
trình lên men được tóm tắt trong bảng sau:

Thời
gian lên
men (h)
0
24
48
72

Bảng 7: Nồng độ các dung môi đạt được trong quá trình lên men từ bã nho
pH
Acetone
Butanol
Ethanol
Acid
Acid
Nồng độ
(g/L)
(g/L)
(g/L)
Acetic
butylic
tế bào
(g/L)
(g/L)
(g/L)
5.49
0
0
0
0
0
0.59
5.06
0
0.53
1.55
6.13
3.39

0.65
4.67
0.87
2.99
0.93
5.7
2.98
0.80
4.75
2.83
5.96
0.51
3.03
2.49
0.81

Sau 24 giờ lên men, acetone và butanol mới bắt đầu được hình thành và đạt nồng độ
lần lượt là 2.83 và 5.96 g/L sau 72 giờ lên men. Như vậy tỷ lệ nồng độ các dung môi là
6:3:1 (butanol:acetone:ethanol), kết quả này tương tự với kết quả đạt được trong nghiên
cứu của Jones và Woods (1986). Tổng nồng độ dung môi đạt được là 9.08 g/L, hiệu suất
và tốc độ tổng hợp sản phẩm lần lượt là 0.36 g/g và 0.16 g/L.h. Hiệu suất đạt được khá
cao gần bằng với hiệu suất đạt được khi lên men bằng đường glucose ( 0.40 g/g) theo
Nasib Qureshi và các cộng sự (2006). Kết quả này đã chứng minh bã nho là một nguồn
cơ chất đầy tiềm năng cho quá trình lên men sản xuất butanol.
Bảng 8: Bảng tổng hợp một số nghiên cứu thực hiện trên các chất mang khác có nguồn gốc
tự nhiên
Cơ chất

Chủng vi sinh vật

Gỗ thông
Cây hoàn diệp
( Aspen)
Xác mía

C. acetobutylicum P262
C. acetobutylicum P262

Vỏ lúa gạo
Vỏ lúa mì
Rơm từ thân
bắp

C. saccharoperbutylacetonicum
ATCC 27022
C. saccharoperbutylacetonicum
ATCC 27022
C. acetobutylicum IFP 921

Nồng
độ ABE
(g/L)
17.6
20.1–
24.6
18.1

Hiệu
suất
(g/g)

0.36
0.31–
0.34
0.33

Năng
suất
(g/L.h)
0.73
0.84–
1.03
0.30

13.0

0.28

0.15

Soni et al. (1982)

17.7

0.18

0.47

25.8

0.34

1.08

Marchalet al.
(1984)
Parekh et al.(1988)

C. acetobutylicum P262

4.2.2. Điều kiện lên men
SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên

25

Thực hiện
Parekh et al.(1988)
Parekh et al.(1988)
Soni et al. (1982)