tuyển chọn dõng nấm mốc aspergillus niger sinh tổng hợp protease

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

TRẦN THỊ NHƢ HÀ

TUYỂN CHỌN DÕNG NẤM MỐC Aspergillus niger
SINH TỔNG HỢP PROTEASE
Luận văn tốt nghiệp
Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Cần Thơ, 2013


TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp
Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Tên đề tài:

TUYỂN CHỌN DÕNG NẤM MỐC Aspergillus niger
SINH TỔNG HỢP PROTEASE

Giáo viên hướng dẫn

Sinh viên thực hiện

PGs.Ts. Nguyễn Văn Mƣời

Trần Thị Nhƣ Hà

MSSV: 2101976
Lớp: CNTP K36

Cần Thơ, 2013


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường Đại học Cần Thơ

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi với sự hƣớng dẫn của PGs.
Ts. Nguyễn Văn Mƣời. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung
thực, do chính tôi thực hiện và chƣa từng công bố trƣớc đây.
Cần Thơ, ngày 08 tháng 12 năm 2013
Ngƣời hƣớng dẫn

PGs.Ts. Nguyễn Văn Mƣời

Ngƣời viết

Trần Thị Nhƣ Hà

Ngành Công nghệ Thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

i


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường Đại học Cần Thơ

LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Công
nghệ thực phẩm, mặc dù gặp không ít khó khăn nhƣng đến nay em đã hoàn thành
quá trình nghiên cứu và có đƣợc những kết quả nhƣ mong muốn. Những thành quả
có đƣợc là nhờ sự giúp đỡ của thầy cô, gia đình, bạn bè.
Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến Thầy Nguyễn Văn Mƣời và Cô
Trần Thanh Trúc, giảng viên Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Trƣờng Đại học Cần
Thơ. Những ngƣời đã trực tiếp hƣớng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực
hiện đề tài. Mặc dù bận rộn với công việc giảng dạy nhƣng thầy cô vẫn thƣờng
xuyên theo dõi, hƣớng dẫn và giúp đỡ em rất tận tình trong suốt quá trình nghiên
cứu, giúp em hoàn thành tốt đề tài luận văn.
Qua đây, em cũng xin chân thành cảm ơn đến quý thầy cô Trƣờng Đại học Cần
Thơ, đặc biệt là quý thầy cô trong bộ môn Công nghệ thực phẩm đã nhiệt tình giảng
dạy và truyền đạt những kiến thức hữu ích và những kinh nghiệm thực tế trong suốt
thời gian em học tập, rèn luyện tại trƣờng.
Con kính xin gửi lời biết ơn chân thành đến cha mẹ, ngƣời đã sinh ra và nuôi dạy
con. Và là ngƣời luôn mong những gì tốt đẹp nhất đến với con.
Sau cùng, em xin chân thành cảm ơn các anh chị Cao học Công nghệ thực phẩm
khóa 18, khóa 19, các anh chị Cao học Công nghệ Sinh học khóa 19 và các bạn sinh
viên lớp Công nghệ thực phẩm khoá 36 đã nhiệt tình đóng góp ý kiến và động viên
giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Cuối lời, xin kính chúc quý thầy cô, anh chị và các bạn luôn dồi dào sức khỏe và
thành công trong cuộc sống!
Xin chân thành cảm ơn!

Cần Thơ, ngày 08 tháng 12 năm 2013
Sinh viên thực hiện

Trần Thị Nhƣ Hà

Ngành Công nghệ Thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

ii


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường Đại học Cần Thơ

TÓM TẮT
Đề tài được thực hiện với mục tiêu tuyển chọn dòng Aspergillus niger đặc hiệu thông qua
phương pháp xác định đường kính vòng phân giải casein trên môi trường thạch, sử dụng
29 dòng Aspergillus niger đã được phân lập từ vỏ các loại quả citrus (cam, chanh, bưởi),
táo và sung và xác định tính chất, trữ mẫu tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ thực
phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ. Việc tuyển
chọn các dòng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp protease được thực hiện bằng cách đo
đường kính vòng phân giải casein trên môi trường agarose – casein với các thành phần
glycerol 0,5%, yeast extract 0,3%, NaCl 0,5% , agar 2% và casein 1%(w/v) ở pH 5. Kết
quả cho thấy tất cả 29 dòng đều có khả năng sinh tổng hợp protease với đường kính phân
giải casein khác nhau. Dựa trên kích thước vòng phân giảicasein của 29 dòng nấm mốc đã
tuyển chọn được 4 dòng có vòng phân giải casein trên môi trường thạch lớn và ổn định, ký
hiệu N1, R1, R4, Sa2 có nguồn gốc từ chanh núm, bưởi Năm roi và cam sành. Sự kết hợp
của 2 dòng R4 và Sa2 với tỷ lệ 1:3 cho kết quả sinh tổng hợp protease tốt nhất và hoạt tính
protease sau 2 ngày lên men lỏng trong môi trường Czapeck Dox có bổ sung 1% casein
làm cơ chất là 0,126±0,016 U/mL.

Từ khóa: Aspergillus niger, đường kính vòng phân giải, hoạt tính, protease,
tuyển chọn.

Ngành Công nghệ Thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

iii


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường Đại học Cần Thơ

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................................ ii
TÓM TẮT ............................................................................................................................ iii
MỤC LỤC iv
DANH SÁCH HÌNH ............................................................................................................ vi
DANH SÁCH BẢNG .......................................................................................................... vii
DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT ............................................................................................ viii
Chƣơng 1 ĐẶT VẤN ĐỀ .....................................................................................................1
1.1 TỔNG QUAN .............................................................................................................1
1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU .......................................................................................2
Chƣơng 2 LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU ....................................................................................3
2.1 TỔNG QUAN VỀ PROTEASE .................................................................................3
2.1.1 Lƣợc sử về protease ......................................................................................... 3
2.1.2 Protease ............................................................................................................ 4
2.1.3 Nguồn thu nhận protease ................................................................................. 8
2.1.4 Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật .............................................. 10
2.1.5 Tầm quan trọng của protease trong thực tiễn................................................. 11
2.2 TỔNG QUAN VỀ NẤM MỐC ASPERGILLUS NIGER .........................................14

2.2.1 Giới thiệu chung ............................................................................................ 14
2.2.2 Đặc điểm hệ sợi của nấm Aspergillus niger .................................................. 15
2.2.3 Cấu tạo cơ quan sinh sản ............................................................................... 15
2.2.4 Phƣơng pháp tuyển chọn dòng nấm mốc Aspergillus niger có khả năng sinh
tổng hợp protease ........................................................................................................ 16
2.3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN ............................................................17
Chƣơng 3 PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................19
3.1 PHƢƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM ...............................................................................19
3.1.1 Địa điểm, thời gian thí nghiệm ...................................................................... 19
3.1.2 Dụng cụ thí nghiệm........................................................................................ 19
3.1.3 Hóa chất sử dụng ........................................................................................... 19
3.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................20
3.2.1 Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu ............................................................................ 20
3.2.2 Phƣơng pháp phân tích và đo đạc kết quả ..................................................... 20
3.2.3 Phƣơng pháp phân tích và xử lý số liệu ......................................................... 22
3.2.4 Phƣơng pháp thu thập và xử lý kết quả ......................................................... 22
3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .....................................................................................22
3.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát .................................................................. 22
3.3.2 Thí nghiệm 1: Khảo sát sơ bộ dòng nấm mốc A. niger đặc hiệu cho quá trình
sinh tổng hợp protease................................................................................................. 22

Ngành Công nghệ Thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

iv


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường Đại học Cần Thơ

3.3.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng kết hợp của các dòng nấm mốc A. niger
đặc hiệu có khả năng sinh tồng hợp protease cao. ...................................................... 23
3.3.4 Thí nghiệm 3: Khảo sát sự ảnh hƣởng của tỷ lệ kết hợp hai dòng nấm mốc
đặc hiệu đến khả năng sinh tổng hợp protease ............................................................ 25
3.3.5 Thí nghiệm 4: Khảo sát sơ bộ hoạt tính protease của các tỷ lệ kết hợp tối
ƣu………..................................................................................................................... 25
Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...........................................................................26
4.1 Tuyển chọn dòng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp protease hoạt tính cao .......26
4.2 Khả năng kết hợp dòng nấm mốc đặc hiệu đến hiệu quả thu nhận protease ............29
4.3 Đánh giá khả năng kết hợp hai dòng Sa2 và R4 đặc hiệu theo tỷ lệ khác nhau đến
hiệu quả sinh tổng hợp protease .......................................................................................32
4.4 Hoạt tính protease ở các tỷ lệ kết hợp Sa2 và R4 tốt nhất ..........................................34
Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ................................................................................35
5.1 KẾT LUẬN...............................................................................................................35
5.2 ĐỀ NGHỊ ..................................................................................................................35
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................................36
PHỤ LỤC 1 HÓA CHẤT, DUNG DỊCH ĐỆM SỬ DỤNG ........................................... ix
PHỤ LỤC 2
CÁC DÕNG NẤM MỐC SỬ DỤNG TRONG QUÁ TRÌNH TUYỂN
CHỌN…………… .................................................................................................................x
PHỤ LỤC 3
XÂY DỰNG ĐƢỜNG CHUẨN TYROSINE THEO PHƢƠNG PHÁP
ANSON CẢI TIẾN (1938) ................................................................................................... xi
PHỤ LỤC 4
KẾT QUẢ THỐNG KÊ ............................................................................ xii
PHỤ LỤC 5
MỘT SỐ HÌNH ẢNH ............................................................................ xxvi

Ngành Công nghệ Thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

v


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường Đại học Cần Thơ

DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1. Cấu trúc của aspergillopepsin II ............................................................................ 4
Hình 2.2. Cơ chế xúc tác của enzyme .................................................................................... 8
Hình 2.3. Hình thái Aspergillus sp. ...................................................................................... 15
Hình 3.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát ........................................................................ 22
Hình 3.2. Sơ đồ thí nghiệm kết hợp của các dòng nấm mốc A. niger đặc hiệu có khả năng
sinh tồng hợp protease cao ................................................................................................... 24
Hình 4.1: Vòng phân giải protease trên môi trƣờng casein - agarose sau 24 giờ ủ ở 30°C và
nhận diện với thuốc thử Coomassie Brilliant Blue R-250 1%............................................. 29
Hình 4.2: Vòng phân giải casein của 2 dòng A. niger R1+R4 và R1, R4 riêng lẻ. ................ 31
Hình 4.3: Vòng phân giải casein ứng với các tỷ lệ khác nhau của hai dòng Sa2 và R4 ....... 33

Ngành Công nghệ Thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

vi


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường Đại học Cần Thơ

DANH SÁCH BẢNG
Bảng 2.1 Phân loại enzyme protease ..................................................................................... 5

Bảng 2.2 Đặc tính chung của bốn loại protease ..................................................................... 6
Bảng 2.3 Nguồn thu nhận enzyme protease ......................................................................... 9
Bảng 2.4 Một số tính chất của protease vi sinh vật ........................................................... 11
Bảng 4.1: Các dòng Aspergillus niger có hiệu quả thủy phân casein trung bình và thấp ... 27
Bảng 4.2: So sánh hiệu quả thủy phân casein của các dòng A. niger mạnh ........................ 28
Bảng 4.3: Ảnh hƣởng của dòng nấm mốc Aspergillus niger kết hợp đến hiệu quả thủy
phân casein ........................................................................................................................... 30
Bảng 4.4: Ảnh hƣởng của tỷ lệ kết hợp hai dòng Sa2 và R4 đến hiệu quả sinh tổng hợp
protease hoạt tính cao .......................................................................................................... 32
Bảng 4.5: Hoạt tính protease sinh ra từ sự kết hợp Sa2 và R4 .............................................. 34

Ngành Công nghệ Thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

vii


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường Đại học Cần Thơ

DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT
A.

Aspergillus

Asp

Aspartic

aa

acid amin

cfu

colony forming unit (mật số bào tử hình thành)

PDA

Potato Dextrose Agar

U/g

Units per weight (gram) of substrate

U/mL

Units per volume (mL) of substrate

v/v

volume/volume (tỷ lệ thể tích/thể tích)

v/w

volume/weight (tỷ lệ thể tích/khối lƣợng)

w/w

weight/weight (tỷ lệ khối lƣợng/khối lƣợng)

Ngành Công nghệ Thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

viii


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

CHƢƠNG 1
1.1

Trường Đại học Cần Thơ

ĐẶT VẤN ĐỀ

TỔNG QUAN

Enzyme là chất xúc tác sinh học đang đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành
công nghiệp khác nhau. Do đó, nhu cầu về enzyme ngày càng tăng do hiệu quả
của chúng đem lại. Năm 1995, ƣớc tính ngành công nghiệp enzyme thế giới thu
đƣợc 1 tỷ USD, năm 2005 khoảng 1,7÷2 tỷ USD. Châu Âu sản xuất 60% tổng số
enzyme trên thế giới, số còn lại do Mỹ và Nhật Bản sản xuất. Trong các loại
enzyme công nghiệp thì hydrolase chiếm lƣợng lớn nhất (75%), tiếp đến là
carbohydrolase (Gerritse et al., 2007).
Enzyme vi sinh vật có nhiều ƣu điểm hơn enzyme động vật và thực vật do chúng
có hoạt tính thủy phân cao hơn và sản lƣợng lớn hơn. Bên cạnh đó, nguồn cung
cấp enzyme này ổn định, không phụ thuộc theo mùa và vi sinh vật sinh trƣởng
nhanh trên môi trƣờng đơn giản, rẻ tiền (Nguyễn Thị Thảo và Quyền Đình Thi,
2004). Khoảng 2% vi sinh vật trên thế giới đã đƣợc thử nghiệm là có enzyme
(Padmavathi, 2013).

Protease (còn gọi là proteinase hoặc peptidase) là nhóm enzyme xúc tác cho
phản ứng thủy phân liên kết peptide (-CO-NH-) của chuỗi polypeptide. Quá
trình này cần thiết cho sự tổng hợp, kiểm soát kích thƣớc, thành phần, hình dạng
của các phân tử protein và cuối cùng là phân hủy chúng. Protease chiếm khoảng
60% thị trƣờng enzyme công nghiệp (Rao et al., 1998), trong đó, protease từ vi
sinh vật chiếm khoảng 40% tổng số enzyme đƣợc bán trên toàn thế giới
(Godfrey và West, 1996). Protease đƣợc thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau nhƣ
động vật (gan, dạ dày…), thực vật (đu đủ, khóm…) và vi sinh vật (vi khuẩn,
nấm…). Trong đó, enzyme vi sinh vật có vai trò to lớn trong các ngành sản xuất
công nghiệp. Sử dụng enzyme trong sản xuất sẽ nâng cao chất lƣợng, hạ giá
thành sản phẩm, cải thiện lao động và giảm thiểu ô nhiễm môi trƣờng. Nghiên
cứu tổng hợp protease từ vi sinh vật ở Việt Nam vẫn đang đƣợc tiến hành hơn
thập niên qua, tuy nhiên những kết quả đạt đƣợc trong lĩnh vực này vẫn chƣa
đáp ứng đƣợc việc mở rộng qui mô sản xuất và ứng dụng của nhóm enzyme này
trong đời sống. Việc tuyển chọn và cải thiện hoạt tính protease của dòng vi sinh
vật bản địa, thăm dò các điều kiện nuôi cấy tối ƣu cho quá trình tổng hợp
enzyme này là vấn đề cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn to lớn.
Aspergillus niger (A. niger) là dòng nấm sợi phân bố rất rộng rãi trên nhiều loại
cơ chất tự nhiên và trong các sản phẩm nông công nghiệp (Pansear et al., 2010),
đƣợc biết đến với khả năng sinh tổng hợp protease (Paranthaman et al., 2009) và

Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

1


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường Đại học Cần Thơ

đƣợc biết đến là nguồn cung cấp nhiều enzyme, trong đó có protease. Tuy nhiên,
tùy thuộc vào nguồn phân lập, đặc tính của từng dòng nấm mốc mà hiệu quả
sinh các enzyme khác nhau. Chính vì vậy, việc nghiên cứu tuyển chọn dòng
Aspergillus niger phù hợp cho quá trình lên men sinh tổng hợp enzyme mong
muốn – trƣờng hợp khảo sát là protease chính là điều đầu tiên cần đƣợc thực
hiện nhằm gia tăng hiệu quả tổng hợp enzyme đặc hiệu.
1.2

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Mục tiêu khảo sát chính của đề tài là tuyển chọn dòng A. niger đặc hiệu cho quá
trình sinh tổng hợp đạt hiệu quả.
Trên cơ sở đó, đề tài tiến hành nghiên cứu 3 nội dung chính :
(1) Tuyển chọn dòng Aspergillus niger đơn lẻ có khả năng sinh protease dựa trên
đƣờng kính vòng phân giải casein.
(2) Nghiên cứu khả năng kết hợp của các dòng Aspergillus niger giúp tăng khả
năng sinh tổng hợp protease.
(3) Khảo sát tỷ lệ kết hợp của hai dòng nấm mốc Aspergillus niger đã tuyển
chọn giúp hiệu quả thu nhận protease đạt cao nhất.

Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

2


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

CHƢƠNG 2
2.1

Trường Đại học Cần Thơ

LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU

TỔNG QUAN VỀ PROTEASE

2.1.1 Lƣợc sử về protease
Protease đƣợc nghiên cứu đầu tiên là các enzyme tiêu hóa ở động vật. Từ đầu
thế kỷ 18, nhà tự nhiên học ngƣời Pháp Reomur phát hiện dạ dày chim ăn thịt có
khả năng tiêu hóa thịt. Năm 1836, Swann quan sát đƣợc hoạt động phân giải
protein của dịch vị. Nhƣng mãi đến hơn 20 năm sau 1857, Corvisart mới tách
đƣợc trypsin từ dịch tụy. Đây là protease đầu tiên đƣợc thu nhận dạng chế phẩm
tuy còn lẫn nhiều enzyme và protein khác. Năm 1862, Danilevxki dùng phƣơng
pháp hâp phụ trên colodion đã tách đƣợc trypsin và amylase của tụy tạng. Năm
1861, Brucke đã tách đƣợc pepsin dạng tƣơng đối tinh khiết từ dịch dạ dày chó.
Năm 1872, Hommarsten đã tách đƣợc chế phẩm chymosin (rennet). Cùng thời
gian, Schmidt (1869-1872) nêu lên giả thiết trong máu có fibrin (còn gọi là
trombin) tham gia quá trình đông máu. Ông đã tiến hành tạc và tủa bằng cồn.
Năm 1874, Group-Besanenzyme công bố thu nhận đƣợc protease từ hạt loại đậu.
Tác giả cũng nhận thấy dịch chiết từ hạt đại mạch, bông, lanh đều có hoạt tính
phân giải protein. Đến năm 1879, Wurtz cho biết từ mọi bộ phận trên cây đu đủ
(Carica papaya) đều chứa protease và khi tủa bằng cồn thu nhận dạng chế phẩm
không tinh khiết gọi là papain (Lê Ngọc Tú et al., 2002).
Đến nửa đầu thế kỷ 20, ngƣời ta mới phát hiện thêm nhiều loại protease khác
nhƣ bromelin-p có trong các bộ phận ở dứa (Willstatter et al., 1926); catepsinprotease của mô cơ động vật (Willstatter and Bamann, 1929); calicare-peptidylprotease của tuyến tụy và nƣớc bọt (Kraut et al., 1933); ficin-protease có trong
cây thuộc giống ficus (Walti, 1938).
Năm 1950 trở về sau, nhờ sử dụng đƣợc một số phƣơng pháp mới tinh chế
protease, ngƣời ta thu nhận đƣợc những chế phẩm protease tinh khiết hơn và
cũng từ đấy các nhà khoa học bắt đầu nghiên cứu protease từ vi sinh vật, mặc dù
từ 1918-1919, Waksman đã phát hiện đƣợc khả năng phân giải protein của xạ

khuẩn. Nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease. Các enzyme này
có thể có trong thế bào (protease nội bào) hoặc tiết vào trong môi trƣờng nuôi
cấy (protease ngoại bào). Các protease ngoại bào đƣợc nghiên cứu kỹ hơn, đƣợc
ứng dụng để sản xuất ở quy mô công nghiệp và đƣợc sử dụng trong nhiều ngành
kỹ nghệ khác nhau (Lê Ngọc Tú et al., 2002).

Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

3


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường Đại học Cần Thơ

2.1.2 Protease
2.1.2.1 Giới thiệu chung
Protease là enzyme phân giải protein, nằm trong lớp của các enzyme thủy phân
hydrolase. Các enzyme này gây cắt protein thành các peptide nhỏ hơn và các
acid amin thông qua phá vỡ các liên kết peptide. Protease là hỗn hợp của các
enzyme nhƣ proteinase, peptidase và amidase. Các proteinase thủy phân các
phân tử protein nguyên vẹn để tạo thành proteose, peptone và một số acid amin.
Peptidase thủy phân peptone thành các acid amin và amidase thủy phân acid
amin để tạo thành amoniac (Mukhtar và Ikram, 2009).

Hình 2.1. Cấu trúc của aspergillopepsin II
Nguồn: />
Trong cơ thể, các protease đảm nhiệm nhiều chức nǎng sinh lý nhƣ: hoạt hóa
zymogen, đông máu và phân hủy sợi fibrin của cục máu đông, giải phóng
hormone và các peptide có hoạt tính sinh học từ các tiền chất, vận chuyển

protein qua màng... (Lƣơng Đức Phẩm, 2004). Ngoài ra, các protease có thể hoạt
động nhƣ các yếu tố phát triển của cả tế bào ác tính và tế bào bình thƣờng đó là
tǎng sự phân chia tế bào, sinh tổng hợp ADN... (Nguyễn Trọng Cẩn et al., 1998).
2.1.2.2

Phân loại protease

Thông thƣờng protease đƣợc chia thành hai nhóm chính: exopeptidase và
endopeptidase (Rao et al., 1998).
+ Exopeptidase tách liên kết peptide ở gần cuối của chuỗi polypeptide. Dựa theo
vị trí hoạt động của các enzyme này là ở các gốc C hoặc N, exopeptidase đƣợc
phân loại tƣơng ứng thành aminpeptidase và carboxypeptidase.
+ Endopeptidase cắt các liên kết peptide ở vùng bên trong của chuỗi
polypeptide. Tùy theo động học cơ chế xúc tác, endopeptidase đƣợc chia thành 4
nhóm: serine protease, protease aspartic, protease cystein, metalloprotease.

Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

4


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường Đại học Cần Thơ

Bảng 2.1 Phân loại enzyme protease

Protease

EC No

Exopeptidase
Aminopeptidase

3.4.11

Dipeptidyl peptidase

3.4.14

Tripeptidyl peptidase

3.4.14

Carboxypeptidase

3.4.16-3.4.18

-

Serin type protease

3.4.16

-

Metalloprotease

3.4.17

-

Cysteine type protease

3.4.18

-

Peptidyl dipeptidase

3.4.15

-

Dipeptidases

3.4.13

-

Omega peptidases

3.4.19

Endopeptidase
Serin protease

3.4.21

Cysteine protease

3.4.22

Aspartic protease

3.4.23

Metalloprotease

3.4.24

(Rao et al., 1998)

Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

5


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường Đại học Cần Thơ

Bảng 2.2 Đặc tính chung của bốn loại protease

Loại
protease

Khối
lƣợng
phân

tử(kDa)

pH
tối
ƣu

Aspartic

30-45

Cysteine
or thiol

Nhiệt
độ tối

Trung tâm
hoạt động

Nguồn thu nhận
chính

Nguồn
tham khảo

3 – 5 40 – 55

Aspartic
acid

Aspergillus,
Mucor,
Endothia,
Rhizopus,
Penicillium,
Neurospora,
Mô động vật
(nội tạng)

North,
1982; Rao
et al.,
1998;
Kovaleva
et al., 1972

34-35

2-3

40-45

Aspartate
hoặc
cysteine

Aspergillus,
thân, cuống dứa,
nhựa cây
Figureure, đu

đủ,
Streptococcus,
Clostridium

Keay and
Wildi,
1970; Keya
et al.,
1972;
Gripon et
al., 1980

Metallo

19-37

5-7

65-85

Phenylalanine
hoặc
leucine

Bacillus,
Aspergillus,
Penicillium,
Pseudomonas,
Streptococcus

Aunstrup,
1980

Serine

18-35

6-11

50-70

Serine,
histidine
và
aspartate

Bacillus,
Aspergillus, mô
động vật,
Tritirachium
album

Boyer,
1970;
Nakagawa,
1970

ƣu (C)

Ngoài ra, protease còn đƣợc phân loại theo khoảng pH hoạt động, và đƣợc chia

thành: protease ƣa acid: pH 2 – 4 ; protease trung tính: pH 7 – 8 ; Protease kiềm:
pH 9 – 11 (Ahmed et al., 2011).
-

Protease acid : Protease ƣa acid còn đƣợc gọi là aspartic acid protease.
Đây là một endopeptidase. Enzyme này có khả năng hòa tan trong nƣớc
và hoạt động tối ƣu ở độ pH thấp (Vishwanatha et al., 2009). Protease ƣa
acid thƣờng đƣợc tiết ra bởi nấm (Tremacoldi et al., 2004). Một số

Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

6


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường Đại học Cần Thơ

protease ƣa acid tiết ra từ các dòng Aspergillus gọi aspergillopepsin và có
hoạt động tối đa ở pH 3 – 4 (Rao et al., 1998)
-

Protease trung tính : Đây là loại protease có khoảng pH hoạt động hẹp 78, không bền ở nhiệt độ cao và mất hoạt tính khi có sự hiện diện của
protease kiềm. Đƣợc thu nhận từ những loài nấm mốc khác nhau, nhƣng
chủ yếu là các loài nấm mốc vàng nhƣ Aspergillus oryzae, Aspergillus
flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus tericola (Nguyễn Hữu Chấn,
1996 ; Nguyễn Đức Lƣợng, 2002).

-

Protease kiềm : Hoạt động trong khoảng pH 9 – 11, đƣợc thu nhận từ nấm
mốc, nấm men và vi khuẩn Bacillus subtilis. Những protease kiềm là
nhóm đƣợc quan tâm khá nhiều gần đây vì có thể sử dụng chúng nhƣ
những chất phụ gia trong quá trình thuộc da, trong chất giặt rửa, xử lý
chất thải môi trƣờng (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002).

Trong ba loại protease : acid, trung tính và kiềm, protease trung tính là enzyme
có trung tâm hoạt động là kim lọai chứa kẽm, kém bền nhiệt nhất trong ba loại.
Trái lại, protease acid từ nấm mốc có khả năng chịu nhiệt tốt nhất và chịu đƣợc
pH thấp (Keay, 1971).
2.1.2.3 Cấu trúc trung tâm hoạt động (TTHĐ) của protease
Trong TTHĐ của protease vi sinh vật ngoài gốc acid amin đặc trƣng cho từng
nhóm còn có một số gốc acid amin khác. Các kết quả nghiên cứu chung về
TTHĐ của một số protease vi sinh vật cho phép rút ra một số nhận xét chung
nhƣ sau:
TTHĐ của protease đủ lớn và bao gồm một số gốc acid amin và trong một số
trƣờng hợp còn có cả cofactor kim loại.
+ Các protease kim loại có TTHĐ lớn hơn vào khoảng 210A, có thể phân biệt
thành sáu phần dƣới TTHĐ (subsite), mỗi phần dƣới TTHĐ tƣơng ứng với mỗi
gốc acid amin trong phân tử cơ chất.
+ Đối với các protease acid, theo nhiều nghiên cứu cấu trúc TTHĐ của các tinh
thể protease acid của Rhizopus chinenis và Endothia parasilica đã cho thấy phân
tử các protease này gồm có hai hạt, giữa chúng có khe hở vào khoảng 200A. Khe
hở này là phần xúc tác của các enzyme, các gốc Asp-35 và Asp-215 xếp đối diện
nhau trong khe ấy.
Đối với các protease không chứa cysteine, TTHĐ của chúng có tính mềm dẻo
hơn vì cấu trúc không gian của chúng không đƣợc giữ vững bởi các cầu
disulfide.

Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

7


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường Đại học Cần Thơ

Mặc dù TTHĐ của các protease vi sinh vật có khác nhau nhƣng các enzyme này
đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide theo cùng một cơ chế chung
nhƣ sau:
E+S

 [E – S]

 E – S + P1



E + P2

Hình 2.2. Cơ chế xúc tác của enzyme
Trong đó: E: enzyme, S: cơ chất, E- S: Phức chất enzyme- cơ chất, P1: Là sản phẩm đầu tiên
của phản ứng, P2: Là sản phẩm thứ hai của phản ứng.
(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.1.3 Nguồn thu nhận protease
Protease còn tham gia vào nhiều quá trình sinh lý phức tạp của tế bào, mô, cơ
quan đến cơ thể. Chúng đƣợc phân bố rộng rãi trên nhiều đối tƣợng từ động vật
(Sielecki et al., 1991; Mohanty et al., 1999), thực vật (Schechler và Berger,

1967; Lê Đức Ngọc et al., 1996; Kaul et al., 2002) cho tới vi sinh vật (Rao et al.,
1998). Trong đó, protease từ vi sinh vật đƣợc nghiên cứu nhiều nhất để sản xuất
ở quy mô thƣơng mại.
So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm
khác biệt. Trƣớc hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao
gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lƣợng và hình dạng phân tử
nên rất khó tách ra dƣới dạng tinh thể đồng nhất. Phức hệ gồm nhiều enzyme
khác nhau nên protease vi sinh vật thƣờng có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản
phẩm thủy phân triệt để và đa dạng (Lƣơng Đức Phẩm, 2004).
- Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật. Tuy nhiên nguồn enzyme ở
vi sinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật nhƣ vi khuẩn, nấm mốc
và xạ khuẩn… Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lƣợng lớn
protease đƣợc ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm nhƣ các chủng:
Aspergillus oryzae, Aspergillus terricola, A. fumigatus, A. niger, Penicillium
chysogenum… các loại nấm mốc này có khả năng tổng hợp cả ba loại protease:
acid, kiềm và trung tính. Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các protease acid, có
khả năng thủy phân protein ở pH 2,5 – 3. Một số nấm mốc khác nhƣ: A.
candidatus, P. cameberti, P. roqueforti… cũng có khả năng tổng hợp protease
có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất phomat (Nguyễn Trọng Cẩn et
al., 1998). Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất
enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống.
- Enzyme protease từ nguồn động vật và thực vật đƣợc loài ngƣời khai thác và
ứng dụng hàng ngàn năm để sản xuất và phục vụ trong cuộc sống. Hiện nay
lƣợng enzyme thu nhận từ thực vật và động vật đƣợc thay thế dần bằng enzyme

Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

8

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường Đại học Cần Thơ

vi sinh vật. Enzyme thu nhận từ các nguồn này thƣờng rất khó và hiệu quả kinh
tế không cao (Nguyễn Thị Thảo và Quyền Đình Thi, 2004). Nguồn enzyme từ vi
sinh vật dần dần thay thế enzyme từ động vật và thực vật do hàng loạt những ƣu
điểm về sinh lý vi sinh vật và về kỹ thuật sản xuất đƣợc liệt kê nhƣ sau:
+ Vi sinh vật có khả năng chuyển hóa một khối lƣợng cơ chất lớn hơn khối
lƣợng cơ thể chúng hàng ngàn lần sau một ngày đêm. Enzyme thu nhận từ vi
sinh vật có hoạt tính cao. Tốc độ sinh sản của vi sinh vật mạnh, trong thời gian
ngắn có thể thu đƣợc lƣợng sinh khối vi sinh vật rất lớn, giúp trong một thời
gian ngắn thu đƣợc một lƣợng enzyme nhiều hoặc lƣợng các sản phẩm trao đổi
chất cao (Nguyễn Thị Thảo và Quyền Đình Thi, 2004).
+ Một đặc điểm riêng có của vi sinh vật đó là cơ thể nhỏ bé nên việc vận hành,
kiểm soát thiết bị lên men trong quá trình sản xuất đơn giản hơn rất nhiều. Vi
sinh vật là giới sinh vật thích hợp cho sản xuất theo quy mô công nghiệp. Trong
sản xuất, quá trình sinh trƣởng, phát triển và sinh tổng hợp enzyme của vi sinh
vật hoàn toàn không phụ thuộc vào khí hậu bên ngoài. Trong khi đó, sản xuất
enzyme từ nguồn thực vật và động vật không thể đƣa vào quy mô công nghiệp
đƣợc (Lƣơng Đức Phẩm, 2004).
+ Nguồn cơ chất dùng sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp rẻ tiền và dễ
kiếm nhƣ các phế liệu, phế phẩm. Điều này không chỉ có ý nghĩa về mặt kinh tế
mà còn có ý nghĩa rất lớn về mặt môi trƣờng sống (Nguyễn Thị Thảo và Quyền
Đình Thi, 2004). Vi sinh vật không đòi hỏi quá khắt khe những yếu tố dinh
dƣỡng của môi trƣờng, nhất là những vi sinh vật tổng hợp enzyne. Chính vì thế
enzyme đƣợc sản xuất từ vi sinh vật thƣờng rẻ tiền hơn enzyme từ các nguồn
khác (Lƣơng Đức Phẩm, 2004). Ngoài ra, quá trình tách chiết, chế biến các
enzyme từ vi sinh vật khá dễ dàng, hiệu suất thu hồi và lợi nhuận cao (Quyền
Đình Thi và Trần Thị Quỳnh Anh, 2007).

Bảng 2.3 Nguồn thu nhận enzyme protease

Nguồn thu nhận

Một số enzyme

Thực vật

Papain, Bromelain
Keratinase
Ficin

Động vật

Trypsin
Chymotrypsin
Pepsin, Rennin

Vi sinh vật

Acid proteases
Rennets

(Nguồn: Vishwanatha, 2009)

Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

9

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường Đại học Cần Thơ

2.1.4 Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật
Các công trình nghiên cứu protease vi sinh vật ngày càng nhiều. Các kết quả
nghiên cứu cho thấy ngay cả các protease của cùng một loài vi sinh vật cũng có
thể khác nhau về nhiều tính chất. Căn cứ vào cơ chất phản ứng, pH hoạt động
thích hợp,… các nhà khoa học đã phân loại các protease vi sinh vật thành bốn
nhóm protease serine; protease thiol; protease kim loại; protease acid.
Trong bốn protease kể trên, các protease serine và protease thiol có khả năng
phân giải liên kết este và liên kết amide của các dẫn xuất acid của acid amin.
Ngƣợc lại, các protease kim loại, protease acid thƣờng không có hoạt tính
esterase của các dẫn xuất của acid amin. Nhiều protease ngoại bào của vi sinh
vật đã đƣợc nghiên cứu tƣơng đối kỹ về cấu tạo phân tử, một số tính chất hóa lý
và cơ chế tác dụng. Kết quả nghiên cứu cho thấy trọng lƣợng phân tử của các
enzyme này tƣơng đối bé, nhất là các protease serine.
Các protease serine có khối lƣợng phân tử thấp vào khoảng 20.000 – 27.000
Dalton. Tuy nhiên, cũng có một số protease serine có trọng lƣợng phân tử lớn
hơn nhƣ các enzyme của Pelicillium cyoneo-fulvum (44.000), Aspergillus oryzae
OUT 5038 (52.000). Khối lƣợng phân tử của các protease kim loại lớn hơn so
với protease-serine (vào khoảng 33.800 - 48.400). Protease thiol và nhiều
protease acid cũng có trọng lƣợng phân tử vào khoảng 30.000-40.000 Dalton.
Có thể tóm tắt những đặc tính của các nhóm proteinase này ở bảng 2.4.

Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

10

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường Đại học Cần Thơ

Bảng 2.4 Một số tính chất của protease vi sinh vật

Nhóm

Nguồn enzyme

Chất kìm hãm

Đặc điểm
TTHĐ

pH tối
thích

Protease
serine

Bacillus subtilis
Bacillus pumilus
Streplococcus
griseus
Streplococcus
fradiae
Aspergillus oryzae
Aspergillus flavus
Aspergillus sojae

Escherichia coli

DFP+

serin

Kiềm

Protease
thiol

Streplococcus
Clostridium histoly-ticum

Indoaxetamit
Ps.cloromercurbenzoat

-SH

7,5
7,0

Protease
kim loại

Bacillus subtilus
Bacillus subtilus
NRRL B3411
Bacillus subtilisamy
Losaccarilicis

Bacillus megaterium
Psuedomonasaeruginoa
Atreptomeces naraensis
Aspergillus oryzae
Acremonium kiliense
Clostridium histtolytium

EDTA++
1,10octafenantrolin

Kim loại hóa
trị hai

Trung
tính

Protease
acid

Aspergillus niger
Aspergillus awamori
Janthinellum
Rhizopus chinensis
Mucor pucillus
Endothia parasilica

Dizoaxetil
Dlnorloxinmetil este

COOH

Acid

(Nguồn: Nguyễn Đức Lƣợng, 2004)

2.1.5 Tầm quan trọng của protease trong thực tiễn
Protease là một nhóm enzyme thủy phân protein đƣợc ứng dụng rộng rãi trong
nhiều lĩnh vực. Yêu cầu trên toàn thế giới về enzyme này gia tăng ngày càng

Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

11


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường Đại học Cần Thơ

nhanh chóng (Vishwanatha et al., 2009). Trong công nghiệp thực phẩm (Phạm
Thị Trân Châu et al., 1991; Braudo et al., 2001; Kaul et al., 2002) và thức ăn gia
súc (Hoffman, 1974; Ghazi et al., 2003), protease đƣợc sử dụng để sản xuất
phomat từ sữa (Mohanty et al., 1999), nƣớc giải khát giàu protein (Rao et al.,
1998), chế biến thịt cá (Phạm Thị Trân Châu, 1993), sản xuất thức ăn gia súc
giàu đạm (Hoffman, 1974), sản xuất bia, nƣớc mắm (Kristinsson và Rasco,
2000), sản xuất vật liệu gia vị, thủy phân protein, quá trình lên men của nƣớc
tƣơng (Rao et al., 1998).
Protease đƣợc sử dụng trong quá trình lên men rƣợu. Với sự trợ giúp của
enzyme này, quá trình sản xuất rƣợu trở nên hiệu quả hơn và tốn ít thời gian
hơn. Ngoài ra, protease còn đƣợc sử dụng nhƣ một chất phụ gia trong sản phẩm
có chứa tinh bột cao nhƣ bánh mì, hoặc các sản phẩm có chứa protein cao nhƣ

xúc xích. Chất phụ gia thêm vào giúp nâng cao chất lƣợng sản phầm bằng cách
thay đổi hàm lƣợng tinh bột và tăng cƣờng hƣơng vị của thực phẩm. Trong sản
xuất nƣớc tƣơng, protease giúp làm tăng nồng độ của các acid amin. Protease
đƣợc bổ sung vào hệ tiêu hóa của các vật nuôi còn nhỏ nhằm tăng cƣờng tiêu
hóa và tăng khả năng hấp thụ thức ăn ( />20517.html).
Trên thế giới, ngành công nghiệp sản xuất xà phòng và các chất tẩy rửa sử dụng
tới 50 – 60 ngàn tấn protease mỗi năm (chủ yếu là protease kiềm). Ngoài ra,
protease cũng đƣợc sử dụng nhiều trong công nghiệp thuộc da (Riffel và
Brandelli, 2002), sản xuất mỹ phẩm, y học và công nghiệp xử lý rác thải.
Protease đƣợc coi là một trong ba nhóm enzyme công nghiệp lớn nhất, chiếm
60% tổng lƣợng enzyme trên thế giới (Rao et al., 1998).
-

Trong công nghiệp da, protease đƣợc dùng trong công nghiệp làm mềm
da, làm sạch, tách lông,… nhờ sự thủy phân một phần protein của da.
Chúng ta đã biết, chất quan trọng của da là collagen. Phân tử của nó gồm
những acid amin kết hợp với nhau thành mạch dài vì vậy làm cho da bị
cứng. Dƣới tác dụng của protease các chất nhờn bị tách ra và một liên kết
trong sợi collagen bị phá hủy. Kết quả của sự làm mềm da là loại bỏ khỏi
da các chất nhớt và làm cho da có độ mềm dẻo nhất định, tính chất đó
đƣợc hoàn thiện hơn sau khi thuộc da (Lê Ngọc Tú et al., 2002). Quá
trình chế biến da bao gồm một số công đoạn nhƣ ngâm ƣớt, tẩy lông, làm
mềm da và thuộc da. Thông thƣờng, các phƣơng pháp thuộc da dùng các
hóa chất độc hại nhƣ sodium sulfite, làm ảnh hƣởng rất nghiêm trọng đến
môi trƣờng khi nƣớc thải của nhà máy này thải ra sông. Việc sử dụng
enzyme để thay thế hóa chất đã rất thành công trong việc nâng cao chất

Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

12

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường Đại học Cần Thơ

lƣợng da và làm giảm ô nhiễm môi trƣờng. Protein là một thành phần cơ
bản của da và lông nên protease đã đƣợc sử dụng để thủy phân một số
thành phần phi collagen của da và loại bỏ các protein phi fibrin nhƣ
albumin, globulin trong quá trình thuộc da rất có hiệu quả (Varela et al.,
1997).
-

Trong sản xuất tơ tằm, quá trình làm tơ tự nhiên tƣơng đối phức tạp và
khó khăn. Tơ là sợi ngoại bào đƣợc nhả ra bởi cặp tuyến trùng của con
tằm. Sợi tơ gồm hai sợi fibroin sơ cấp dính lại với nhau nhờ lớp vỏ bằng
xerixin. Sau khi tách hết xerixin thì sẽ đƣợc sợi fibroin tinh khiết. Sợi thu
đƣợc khi kéo ở kén ra thƣờng có chứa 30% xerixin. Muốn tách xerixin thì
phải nấu tơ tằm trong dung dịch xà phòng trong thời gian từ 1,5 – 2 giờ.
Chỉ sau khi có sự gia công này tơ mới bắt đầu kéo chỉ. Một lƣợng nhỏ
xerixin nằm lại trên lụa làm giảm độ đàn hồi của lụa, làm cho lụa bắt màu
không đồng đều và khó trang trí trên lụa. Ngƣời ta đã sử dụng chế phẩm
protease từ nấm mốc, vi khuẩn để tách lƣợng xerixin còn lại này (Lê
Ngọc Tú et al., 2002).

-

Trong hƣơng phẩm và mỹ phẩm, dƣới tác dụng của protease trong kem,
các biểu bì của da chết đƣợc tách ra, da non sẽ xuất hiện trên bề mặt,
đồng thời sự phát triển lông (tóc) cũng chậm lại. Trong công nghiệp y

học, các chế phẩm protease cũng đƣợc sử dụng để sản xuất các môi
trƣờng dinh dƣỡng hỗn hợp có protein dùng trong môi trƣờng cấy vi
khuẩn và các vi sinh vật khác. Chẳng hạn, môi trƣờng dinh dƣỡng để nuôi
các vi sinh vật sản xuất ra các kháng sinh kháng độc. Dĩ nhiên, các
protein có trong môi trƣờng phải ở dạng dễ đồng hóa đối với vi sinh vật.
Do đó phải thủy phân sơ bộ các protein bằng protease để cô đặc và tinh
khiết các huyết thanh kháng độc để chữa bệnh (Lê Ngọc Tú et al., 2002).

-

Trong sản xuất bia, nƣớc giải khát chế phẩm protease có ý nghĩa quan
trọng trong việc làm tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc.
Protease của Aspergillus oryzae đƣợc dùng để thủy phân protein trong hạt
ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn (Lê Xuân Phƣơng, 2001). Ứng
dụng protease để làm trong và ổn định chất lƣợng nƣớc quả và rƣợu vang
- một trong những nguyên nhân chính gây khó khăn cho việc làm trong
nƣớc quả và gây đục nƣớc quả là protein (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).

Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

13


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

2.2

Trường Đại học Cần Thơ

TỔNG QUAN VỀ NẤM MỐC ASPERGILLUS NIGER

2.2.1 Giới thiệu chung
Aspergillus niger là loài phổ biến nhất trong chi Aspergillus, phân bố rộng rãi
trên các cơ chất tự nhiên, trong các sản phẩm nông công nghiệp và ở nhiều vùng
địa lý khác nhau trên thế giới. Hiện nay, A. niger đƣợc sử dụng chủ yếu trong
công nghiệp sản xuất enzyme (điển hình nhƣ α - amylase, glucoamylase,
pectinase, protease, cellulase), trong công nghiệp chế biến thực phẩm, công
nghiệp sản xuất một số acid hữu cơ nhƣ acid citric, acid gluconic,… (Pansear et
al., 2010). Trong đó, Aspergillus niger đƣợc biết đến trong việc sản xuất đến
năm endopeptidase khác nhau (Van den Hombergh et al., 1997), hai
carboxypeptidase (Dal Degan et al., 1992) và một aminopeptidase (Basten et al.,
2001).
Nấm mốc là vi sinh vật có thay đổi đáng kể trong lịch sử phân loại. Các nghiên
cứu khởi đầu đã phân chia nấm thuộc ngành Thallophyta thuộc giới phụ
Cryptogamae, giới Plantae (thực vật). Các khảo sát về đặc tính cấu trúc dƣới
kính hiển vi tiếp theo đã chứng minh nấm không thuộc thực vật lẫn động vật
(Sumbali, 2005). Samson và van Reenen-Hoekstra (1988) đã phân chia nấm thật
thành 4 lớp: Phycomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes và Deuteromycetes.
Hệ thống phân loại này đã tồn tại một thời gian dài và dòng A. niger đƣợc phân
loại thuộc giới nấm (Fungi), ngành phụ nấm bất toàn Deuteromycotina, lớp
Deuteromycetes, bộ Moniliales, họ Moniliaceae, chi Aspergillus và loài
Aspergillus niger (Samson và van Reenen-Hoekstra, 1988).
Tuy nhiên, với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, các nghiên cứu ở thập niên 70
của thế kỷ XX, bắt đầu từ nghiên cứu phân chia nhóm của Whittaker (1969, trích
dẫn bởi Sumbali, 2005), đến giới (Alexopolous và Mims, 1979; trích dẫn bởi
Sumbali, 2005) đã đề nghị khóa phân loại mới cho giới nấm nói chung và A.
niger nói riêng thuộc:
Ngành: Amastigomycota
Ngành phụ: Ascomycotina
Lớp: Ascomycetes

Lớp phụ: Plectomycetidae
Bộ: Eurotiales
Họ: Eurotiaceae
Giống: Aspergillus
Loài: Aspergillus niger
(Nguồn: Sumbali, 2005)

Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

14


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường Đại học Cần Thơ

Với đặc điểm chính trong họ Eurotiaceae là bào tử đính ở dạng thể bình (Cao
Ngọc Điệp và Nguyễn Văn Thành, 2010).
2.2.2 Đặc điểm hệ sợi của nấm Aspergillus niger
Khuẩn ty của nấm chỉ tăng trƣởng ở ngọn và có vách ngăn, gồm hai loại:
- Khuẩn ty dinh dƣỡng: khuẩn ty phát triển trong cơ chất, có kích thƣớc nhỏ,
màu trắng. Các khuẩn ty bện chặt thành một khối rất dai, ăn sâu vào môi trƣờng
nuôi cấy để hút dƣỡng chất. Khi già hệ sợi ngã sang màu vàng.
- Khuẩn ty sinh sản: khuẩn ty phát triển trong không khí, có kích thƣớc lớn hơn
khuẩn ty dinh dƣỡng rất nhiều, trong suốt. Khuẩn ty sinh sản hƣớng vào không
khí để lấy oxy, có khả năng tạo bào tử khi già.
Tóm lại, khi già hệ sợi có nhiều biến đổi: một số khuẩn ty dinh dƣỡng tạo thành
các hạch nấm làm hệ sợi ngã sang màu vàng. Trong khi đó, khuẩn ty sinh sản
hình thành các bào tử đính làm cho bề mặt khuẩn lạc có màu đen.
(Nguồn: Klich, 2002; Samson et al., 2007)

2.2.3 Cấu tạo cơ quan sinh sản
Aspergillus niger là loại nấm không có giai đoạn sinh sản hữu tính,
A. niger sinh sản vô tính chủ yếu bằng bào tử đính (Gams, 1985) (Hình 2.2).

Hình 2.3. Hình thái Aspergillus sp.
(a) khối bào tử đính, (b) bào tử đính, (c) tế bào gốc , (d) cuống thể bình và thể bình
(Nguồn: Onion et al., 1981)

Cơ quan sinh sản có dạng nhƣ hoa cúc, gồm các phần: bào tử đính phát triển từ
một tế bào có đƣờng kính lớn hơn, màng dày hơn các đoạn lân cận của hệ sợi
nấm gọi là tế bào gốc. Từ tế bào gốc tạo thành sợi cuống không vách ngăn, kéo
dài với phần đỉnh phồng to tạo thành túi hình cầu, không màu cho đến vàng nhạt.
Xung quanh bề mặt túi là các cuống thể bình màu nâu, dài 10 ÷15µm, là nơi sinh
ra các thể bình. Thể bình có một tầng hoặc hai tầng. Các bào tử đính đƣợc tạo

Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

15