Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây quao nước (dolichandrone spathaceae)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA HÓA HỌC



ĐỖ LỆ QUYÊN

N H ÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ
HOẠT TÍNH S NH HỌC CỦA CÂY QUAO NƯỚC
(DOLICHANDRONE SPATHACEAE)

KHÓA LUẬN TỐT N H ỆP ĐẠ HỌC
C u nn

n

H

ữu

N ười ướn dẫn k o
TS. TRẦN THỊ PHƯƠN

HÀ NỘ , 05/2015

ọ
THẢO


LỜ CẢM ƠN
Khóa luận tốt nghiệp này được hoàn thành tại phòng Tổng hợp Hữu cơ

Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới giáo viên hướng
dẫn TS. Trần T ị P ư n T ảo cùng với sự trợ giúp của thầy giáo ThS.
N u ễn Văn Tuấn - Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
Việt Nam đã trực tiếp quan tâm và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình
thực hiện đề tài nghiên cứu.
Tôi xin trân trọng cảm ơn các cán bộ phòng Tổng hợp Hữu cơ – Viện
Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã động viên, tạo
điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình thực nghiệm để hoàn thành khóa luận.
Tôi xin cảm ơn Quỹ phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia
NAFOSTED đã tài trợ kinh phí cho đề tài khóa luận tốt nghiệp của tôi.
Trong quá trình hoàn thành khóa luận tôi đã nhận được sự quan tâm,
giúp đỡ của cô giáo Trưởng khoa TS. Đ o T ị Việt An cùng toàn thể các
thầy cô giáo trong khoa Hóa học trường Đại học sư phạm Hà Nội 2. Tôi xin
chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu này!
Tôi xin chân thành cảm ơn!
H Nội, tháng 05 năm 2015
Sinh viên
Đỗ Lệ Qu n


LỜ CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan khóa luận tốt nghiệp này được hoàn thành dưới sự cố
gắng, nỗ lực của bản thân và sự giúp đỡ tận tình của TS. Trần Thị Phương
Thảo và Th.S Nguyễn Văn Tuấn. Các kết quả thu được trong khóa luận tốt
nghiệp không trùng với kết quả nghiên cứu của bất kì tác giả nào khác. Nếu
sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.
Tôi xin trân trọng cảm ơn!

H Nội, t án 05 năm 2015
Sinh viên

Đỗ Lệ Quyên


M CL C
Trang
LỜ CẢM ƠN
LỜ CAM ĐOAN
M CL C
DANH M C HÌNH VẼ
DANH M C SƠ ĐỒ VÀ BẢN
DANH M C CÁC KÍ H ỆU VÀ CHỮ V ẾT TẮT
MỞ ĐẦU
C ư n 1 TỔN

1
QUAN

3

1.1. Giới thiệu về họ Quao (Bignoniaceae)

3

1.2.Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài trong
chi Dolichandrone

4

1.3. Tình hình nghiên cứu cây Quao nước

7

1.3.1. Đặc điểm thực vật

8

1.3.2. Ứng dụng trong dân gian

9

1.3.3. Thành phần hóa học

10

1.3.4. Hoạt tính sinh học

11

C ư n 2 ĐỐ TƯỢN

VÀ PHƯƠN

PHÁP N H ÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu

12

12

2.1.1. Nguyên liệu

12

2.1.2. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu

12

2.2 Phương pháp nghiên cứu

13

2.2.1. Phương pháp chiết mẫu thực vật

13

2.2.2. Phương pháp tách và tinh chế chất

13

2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các chất

13

2.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm

14

định hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính gây độc tế bào
2.2.4.1. Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm
định

14

2.2.4.1.1. Các chủng vi sinh vật kiểm định

14

2.2.4.1.2. Môi trường nuôi cấy

15

2.2.4.1.3. Cách tiến hành

15

2.2.4.2. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa

16

2.2.4.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế sự phát triển
của tế bào ung thư thực nghiệm

17

2.2.4.3.1. Thiết bị nghiên cứu

17

2.2.4.3.2. Các dòng tế bào

17

2.2.4.3.3. Phương pháp

17

2.3. Các nghiên cứu thực nghiệm

18

2.3.1. Chiết mẫu với các dung môi có độ phân cực khác nhau

18

2.3.2. Phân lập các chất sạch từ cặn chiết n-hexan

19

C ư n 3 KẾT QUẢ N H ÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

23

3.1. Xác định cấu trúc chất QNL 1.7

23

3.2. Xác định cấu trúc chất QNL 1.10.19

28

3.3. Kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học của cặn chiết n-hexan

33

3.3.1. Kết quả xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

33

3.3.2. Kết quả xác định hoạt tính chống oxy hóa

35

3.3.3. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế sự phát triển của tế bào
ung thư thực nghiệm

35

KẾT LUẬN VÀ K ẾN N HỊ

38

TÀ L ỆU THAM KHẢO

39

DANH M C HÌNH VẼ
Hìn vẽ
Hình 1.1

Tên hình
Cấu trúc của các chất phân lập được từ hạt và lá cây
D. falcata

Trang
5

Hình 1.2

Cấu trúc của các chất phân lập được từ cành của cây
D. serrulata

6

Hình 1.3

Cấu trúc của các chất phân lập được từ gỗ của cây
D. falcata

7

Hình 1.4

Cây Quao nước

8

Hình 1.5

Hoa, quả và hạt Quao nước

9

Hình 1.6

Các chất được phân lập từ dịch chiết ete dầu hỏa và etyl
axetat của vỏ cây Quao nước

10

Hình 3.1

Phổ 1H-NMR của QNL 1.7

24

Hình 3.2

Phổ giãn 1H-NMR của QNL 1.7

25

Hình 3.3

Phổ giãn 1H-NMR của QNL1.7

25

Hình 3.4

Phổ 13C-NMR của QNL1.7

26

Hình 3.5

Phổ giãn 13C-NMR của QNL 1.7

26

Hình 3.6

Phổ DEPT của QNL 1.7

27

Hình 3.7

Phổ giãn DEPT của QNL 1.7

27

Hình 3.8

Phổ IR của QNL 1.10.19

29

Hình 3.9

Phổ MS của QNL 1.10.19

29

Hình 3.10 Phổ 1H NMR của QNL 1.10.19

30

Hình 3.11 Phổ giãn 1H NMR của QNL 1.10.19

30

Hình 3.12 Phổ

13

C NMR của QNL 1.10.19

Hình 3.13 Phổ giãn

13

C NMR của QNL 1.10.19

31
31

Hình 3.14 Phổ DEPT của QNL 1.10.19

32

Hình 3.15 Phổ giãn DEPT của QNL 1.10.19

32


DANH M C SƠ ĐỒ VÀ BẢN
S đồ v
bản
S đồ 2.1
Bản 1.1

T n s đồ v bản
Phân lập các phân đoạn từ cặn chiết n-hexan của
cành và lá cây Quao nước
Hoạt tính ức chế enzyme sucrase và maltase trên
chuột của các bộ phận hoa, lá và vỏ cây Quao nước.

Trang
21

11

Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
Bản 3.1

của dịch chiết n-hexan từ cành, lá và vỏ thân của

34

cây Quao nước
Bản 3.2

Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết
n-hexan từ cành, lá và vỏ thân của cây Quao nước

35

Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế sự phát triển của
Bản 3.3

tế bào ung thư thực nghiệm của dịch chiết n-hexan
từ cành và lá cây Quao nước

35


DANH M C CHỮ V ẾT TẮT VÀ CÁC KÍ H ỆU
C ữ viết tắt
13

C-NMR

DEPT

Viết đầ đủ

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon 13
Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer - Phổ
DEPT

1

H-NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

IR

Infrared spectroscopy - Phổ hồng ngoại

ESI-MS

Electrospray Ionization Mass Spectrometry - Phổ khối
lượng phun mù điện tử

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond Correlation - Tương tác dị hạt
nhân qua nhiều liên kết

HSQC

Heteronuclear Single Quantum Coherence - Tương tác dị
hạt nhân qua một liên kết

COSY

Correlated Spectroscopy - Phổ tương quan

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

SKC

Sắc ký cột

S

Singlet

br s

Singlet tù

D

Doublet

T

Triplet

Dd

Doublet của doublet

M

Multiplet

J (Hz)

Hằng số tương tác tính bằng Hz

δ (ppm)

Độ chuyển dịch hóa học tính bằng ppm

EC50

Nồng độ có hiệu lực 50%


IC50

Nồng độ cần để ức chế 50%

MIC

Nồng độ ức chế tối thiểu

MBC

Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu

EtOAc

Etyl axetat

DCM

Điclometan

MeOH

Metanol

DMSO

Đimetyl sunfoxit

D. spathaceae Dolichandron spathaceae
D. falcata

Dolichandron falcata

D. serrulata

Dolichandron serrulata


MỞ ĐẦU
Việt Nam là quốc gia nằm ở vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, tạo điều
kiện cho các sinh vật phát triển và tạo ra sự phong phú của nhiều loài động
thực vật và nhiều hệ sinh thái khác nhau.

Tổng số loài thực vật đã ghi nhận ở Việt Nam là 10.500 loài, ước đoán
hệ thực vật Việt Nam có khoảng 12.000 loài. Trong số này, nguồn tài nguyên
làm thuốc chiếm khoảng 30%. Kết quả điều tra nguồn tài nguyên dược liệu ở
Việt Nam giai đoạn 2001-2005 của Viện Dược liệu (2006) cho biết ở Việt
Nam có 3.948 loài thực vật bậc cao, bậc thấp và nấm lớn được dùng làm
thuốc. Ngoài sự phong phú về thành phần chủng loại, nguồn dược liệu Việt
Nam còn có giá trị to lớn vì được sử dụng rộng rãi để chữa nhiều các chứng
bệnh khác nhau. Hiện nay người ta có xu hướng quay trở về với các loại thuốc
có nguồn gốc từ thiên nhiên, đi sâu nghiên cứu xác minh y học cổ truyền, tìm
kiếm các hợp chất tự nhiên có thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cao
để làm thuốc từ dược liệu.
Họ Quao hay họ Núc Nác (Bignoniaceae) là một họ lớn thuộc vùng
nhiệt đới và cận nhiệt đới, trong đó có nhiều loài như Đào tiên, Đạt phước,
Cây dồi, Đang tiêu… được sử dụng trong y học dân gian để trị ho, sốt, làm
lành vết thương, đau đầu, lợi tiểu, hạ nhiệt. Ở Việt Nam, cây Quao nước
(Dolichandrone spathacea) là một loài cây rất đặc trưng trong họ Quao
thường gặp ở một số tỉnh ven biển, vùng rừng ngập mặn Nam Bộ. Loài cây
này có khá nhiều công dụng, được sử dụng trong y học cổ truyền để khử trùng
vết thương, làm thuốc điều kinh, bổ huyết, nhuận gan, trị hen suyễn, tiêu độc
[3]. Mặc dù có nhiều công dụng thiết thực nhưng cho đến nay trên thế giới
cũng như ở Việt Nam chỉ có một công trình nghiên cứu về thành phần hóa
học của cây Quao nước.

1


Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn trên, tôi đã chọn đề tài khóa luận tốt
nghiệp: “N

i n ứu t

n p ần

ọ v

oạt tín sin

ọ

ủ

â

Quao nướ (Dolichandrone spathacea)’’ nhằm đóng góp vào việc tìm hiểu
hóa thực vật của loài cây này và cung cấp mẫu chất cho các thử nghiệm sinh
học về sau.
Khóa luận tập trung nghiên cứu thành phần hóa học của cặn chiết
n-hexan của cành và lá cây Quao nước bao gồm những nội dung chính sau:
1. Thu mẫu cành, lá và vỏ thân cây Quao nước (Dolichandrone
spathacea), xử lý mẫu và tạo các dịch chiết.
2. Phân lập một số chất từ cặn chiết n-hexan của cành và lá cây Quao nước.
3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được.
4. Thử hoạt tính sinh học của cặn chiết n-hexan từ cành và lá cây Quao nước.

2


C ư n 1
TỔN
1.1.

QUAN

iới t iệu về ọ Qu o

Họ Quao (Bignoniaceae) là một trong những họ thực vật thuộc ngành Mộc
lan (Magnoliophyta), với khoảng hơn 107 chi và 900 loài [4], phân bố chủ yếu
ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở Việt Nam, họ Quao có khoảng 8 chi với
22 loài và taxon dưới loài [7] phân bố rộng khắp từ Bắc vào Nam, từ vùng ven
biển đến núi cao. Trong đó, nhiều loài có giá trị làm thuốc, làm cảnh, cho gỗ,
làm rau….Riêng vùng Nam bộ Việt Nam có 7 chi với 8 loài và 1 taxon dưới
loài. Nhiều loài họ Quao có tác dụng trị bệnh, đã được nghiên cứu từ rất sớm.
Núc nác (Oroxylon indicum) được biết từ lâu với các tính năng: gỗ sắc
uống trị dị ứng; vỏ rễ bổ, trị kiết, chống viêm, trị tê thấp; lá trị ăn không ngon,
đau dạ dày, ho lâu ngày. Hoa, quả, và hột non thường được xào ăn như rau.
Rễ trị đau ngực và đau đầu; vỏ bổ lợi tiểu, trị đau dạ dày, đau gan, suyễn, sốt
rét; hoa, rễ, lá hạ nhiệt. Lapachol thu được từ cây Núc nác có khả năng chống
tế bào ung thư Walker 256 [3].
Vỏ cây Hồng kỳ (Spathodea campanulata) dùng đắp hay sắc uống trị viêm
loét dạ dày, tiểu đường, sưng đường tiểu, sốt rét do Plasmodium berghei [3].
Kén tim (Tabebuia rosea): trái và vỏ có tác dụng lợi tiểu [3].
Đào tiên (Crescentia cujete): Nạc của quả trị ho, sốt, lợi tiểu. Vỏ sắc rửa
vết thương, lá đắp trị nhức đầu. Trái chứa nhiều iridoid [3].
Đạt phước (Millingtonia hortensis): Lá trị lao, viêm mũi, suyễn. Lá có
chứa Hispidulin làm nở cuống phổi ở chuột [3].
Cây dồi (Kigelia africana): Nạc của quả lợi sữa, trị ung nhọt, đau bao tử,
trị tê thấp. Trái chứa lapachol chống ung thư da và ung thư thận. Quả có chứa

3

6 – metoxymelein, kigelin, stigmasterol và một số steroit mà cơ cấu giống
hormon nữ. Gỗ chứa kigelol, vanilin, kigelinon (gây độc tế bào).
Đang tiêu (Campsis radicans): Rễ làm lành vết thương [3].
Huỳnh liên (Tecoma stans): Rễ lợi tiểu, bổ; hoa trị đau bụng ở mexico, trị
đái đường (do tecostanin, tecomanin, tác động vào quá trình tiết insulin); trị
nọc bò cạp, rắn [3].
Quao núi (Stereospermum colais): Rễ trị đau ngực và đầu; vỏ bổ, lợi tiểu,
trị đau người, đau dạ dày, đau gan, hen suyễn, sốt rét; hoa, rễ và lá hạ nhiệt.
1.2. T

n p ần

ọ v

oạt tín sin

ọ

ủ một số lo i tron

i

Dolichandrone
Trên thế giới có khoảng 10 loài thuộc chi Dolichandrone. Ở Việt Nam có
ba loài là Quao cột (Dolichandrone columnaris), Quao răng (Dolichandrone
serrulata), Quao nước (Dolichandrone spathacea). Cả ba loài Quao này
thường được tìm thấy nhiều ở các tỉnh Bình Thuận, Bình Phước, Đồng Nai.
Riêng loài Quao nước còn được phân bố rải rác ở một số tỉnh từ miền Bắc tới
miền Trung như Quảng Ninh, Đà Nẵng, Huế, Quảng Nam [6].

Dolichandrone falcata có nhiều đặc tính chữa bệnh và đã được dân gian
dùng làm thuốc [8, 9]. Ở Philippin, lá cây dùng làm thuốc đắp vết thương và vỏ
cây được dùng trị sự đầy hơi của phụ nữ sau khi sinh [10]. Ngoài ra lá còn có
tác dụng trị tiểu đường [11]. Năm 1955, từ vỏ của D. falcata, Kincl đã tìm thấy
chrysin (1) và sapogenin (2) [12]. Đến năm 1956, từ hạt của cây này, Kincl và
Gedeo tiếp tục tìm thấy saponin (3) và một số sapogenin [13]. Năm 1972,
Subramanian và cộng sự xác định được một flavonoid là chrysin (1) cùng với
hai dẫn xuất glycosid của chrysin từ lá cây D. falcata (Hình 1.1) [14].

4


Hình 1.1: Cấu trúc của các chất phân lập được từ hạt và lá cây D. falcata

5


Hình 1.2: Cấu trúc của các chất phân lập được từ cành của cây D. serrulata
6


Năm 2006, Sinaphet và cộng sự phân lập được từ cành của cây D.
serrulata một phenol triglycosit mới là dolichandrosit (9) cùng với 6 phenol
triglycosit đã biết là 2′′-O-apiosylverbascosit (10), luteosit B (11), markhamiosit
A (12), verbascosit (5), decaffeoyl-verbascosit (13), isoverbascosit (14) và một
hợp chất iridoit glucosidt là ixosit (15) (Hình 1.2) [15].
Năm 2009, từ cao etyl axetat của gỗ cây D. falcata, Aparna và cộng sự phân
lập được một phenylpropanoid glycosid mới là dolichandrosit A (4) cùng với
7 hợp chất là verbascosit (5), aloesaponarin II (6), α-lapachon (7),
lapachol(8),

β-sitosterol,

8-hydroxydehydroiso-α-lapachon

và

3,8-

dihydroxydehydroiso-α-lapachon (Hình 1.3) [16].

Hình 1.3: Cấu trúc của các chất phân lập được từ gỗ của cây D. falcata
1.3. Tình hình nghiên cứu cây Quao nước
Cây Quao nước có tên khoa học là Dolichandrone spathacea (L.f.) K.
Schum., thuộc họ Quao hay còn gọi là họ Núc nác (Bignoniaceae).
7


1.3.1. Đặc điểm thực vật
Cây đại mộc, cao 15-20m, thân không thẳng, với nhiều cành nhánh. Lá
kép lông chim một lần, lẻ, lá phụ không lông, mỏng, phiến không đối xứng,
thường có 7-9 lá chét. Lá chét hình trứng mác, dài 7-16 cm, rộng 3-7 cm,
nhẵn cả hai mặt, màu đen khi khô [1].

Hình 1.4. Cây Quao nước (Dolichandrone spathacea)
Cụm hoa chùm rất ngắn ở đầu cành, mang 2–8 hoa. Hoa màu trắng, mùi
thơm nhẹ; sớm dụng; tràng màu trắng, dài 10–18 cm, có 5 thùy cong , khía tai
bèo; nhị 4, thụt vào trong ống tràn. Mùa hoa là tháng 4–6. Hoa nở vào lúc
bình minh và rụng trước khi mặt trời mọc. Cần có loài bướm co vòi dài ăn
đêm mới thụ phấn được. Thường trong một chùm hoa chỉ có một cụm hoa nở

vào một thời điểm nhất định [1].

8


Hình 1.5. Hình hoa, quả và hạt Quao nước
Trái là manh nang, thòng dài, tròn, nhọn. Quả khô tự nở, gân hình trụ, dài
40–60 cm, mang nhiều hạt dẹt, rộng 1,5–2,3 cm [1].
Cây tái sinh bằng hạt.
Cây có ở Ấn Độ, Campuchia, Malaisia, Inđônêsia, quần đảo Nuven Calêđôni.
Ở nước ta, cây có ở Quảng Nam–Đà Nẵng (Hòa Vang, Nam Ô), Lâm
Đồng, Bình Thuận, Đồng Nai, Thành phố Hồ Chí Minh, Long An (Cần Đước,
Rạch Cát), Đồng Tháp, An Giang [2].
Cây mọc trên bùn, dựa rạch có triều và rừng sác, sau rừng sú vẹt và dọc
dừa, thường có dạng cây bụi và có khi cũng gặp ở những nơi gần bãi biển. Ở
vùng sau sú vẹt thường là cây gỗ, có khi chỉ mang lá trong một thời gian ngắn
(vào mùa khô); cũng có lúc cây có cả lá và hoa quanh năm [2].
1.3.2. Ứng dụng trong dân gian
Hạt có tác dụng khử trùng.
Dân gian thường dùng lá Quao nước phối hợp với ích mẫu, ngải cứu, cỏ
gấu, muồng hoe để làm thuốc điều kinh, bổ huyết. Lá còn dùng cho phụ nữa
sau khi sinh uống vào cho khỏe người, ăn ngon cơm.
Vỏ và lá dùng làm thuốc nhuận gan. Lá dùng trị hen suyễn. Vỏ, rễ dùng
làm thuốc tiêu độc.
Người ta dùng rễ và lá quao nước phối hợp với rễ hoặc cây Ô rô chế thành
biệt dược Ô rô – Quao làm thuốc giải độc nhuận gan.
9


Dân gian thường dùng vỏ cây, rễ và lá sao qua sắc nước uống, hoặc dùng

các bộ phận của cây nấu thành cao lỏng để dùng.
Hoa, trái non ăn được; gỗ, vỏ trị dị ứng; hạt + gừng: trấn luyến súc [3].
Ở Ấn Độ, hạt còn được dùng phối hợp với gừng trị đau co thắt.
Ngoài ra cây còn cho gỗ, tham gia cố định các bãi cát bùn sau thảm cây sú
vẹt ở ven biển, cửa sông.
1.3.3. Thành phần hóa học
Năm 2007, Thạc sĩ Lê Minh Trí – Đại học Quốc Gia thành phố Hồ Chí
Minh đã công bố kết quả phân lập được 6 chất từ vỏ cây Quao nước [5].
Từ cao ete dầu hỏa đã phân lập được 3 hợp chất là stigmasta-4-en-3-on (16),
axit (E) 9-oxooctadec-10-enoic (17) và metyl-3,4-dimetoxycinnamat (18).
Từ cao etyl axetat của vỏ cây Quao nước đã thu được 3 hợp chất là
stigmasta-1,4-dien-3-on (19), axit ferulic (20) và axit p-hydroxycinnamic (21).

Hình 1.6: Các chất phân lập từ dịch chiết ete dầu hỏa và etyl axetat của vỏ
cây Quao nước

10


1.3.4. Hoạt tính sinh học
Năm 2007, một nhóm nhà khoa học Thái Lan khi sàng lọc hoạt tính ức chế
enzym sucrase và maltase trên chuột của một số cây thuốc dân tộc ở Thái Lan
đã công bố kết quả về hoạt tính hạ đường huyết của cây Quao nước
(Dolichandrone spathacea). Hoạt tính hạ đường huyết từ các bộ phận của cây
Quao nước được chỉ ra ở bảng 1.1.
Bản 1.1. Hoạt tính ức chế enzyme sucrase và maltase trên chuột của các bộ
phận hoa, lá và vỏ cây Quao nước
Bộ p ận

Enzym sucrase

(% ứ

ế)

Enzym maltase
(% ứ

Hoa

7

5

Lá

0

26

Vỏ

3

10

ế)

Kết quả cho thấy dịch chiết từ lá có hoạt tính ức chế enzyme maltase mạnh
hơn các bộ phận hoa và vỏ. Hoạt tính ức chế enzyme sucrase của cả 3 bộ phận
hoa, lá và vỏ đều không đáng kể [17].

Năm 2012, một nhóm nhà khoa học Thái Lan khác cũng đã công bố kết
quả sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào, hoạt tính chống oxy hóa, hoạt tính ức
chế lipase và hoạt tính kháng khuẩn của một số cây thuốc dân tộc ở Thái Lan
trong đó có cây Quao nước. Kết quả cho thấy dịch chiết etanol của lá cây
Quao nước cho hoạt tính chống oxy hóa tốt với giá trị EC50 = 5,17 μg/ml (chất
chuẩn ascorbic axit có giá trị EC50 = 10 μg/ml. Các hoạt tính khác được thử
nghiệm đều cho kết quả âm tính [18]. Kết quả sàng lọc về hoạt tính kháng
khuẩn và kháng nấm của một số loài cây ngập mặn ở Sudan cũng cho thấy
cây Quao nước không có hoạt tính đối với các chủng vi khuẩn và nấm được
thử [19].Cho đến nay theo tra cứu tài liệu, ở Việt Nam hiện chưa có công
trình khoa học nào công bố về hoạt tính sinh học của cây Quao nước
(Dolichandronre spathacea).

11


C ư n 2
THỰC N H ỆM VÀ PHƯƠN
2.1. N u n liệu,

ất v t iết bị n

PHÁP N H ÊN CỨU
i n ứu

2.1.1. Nguyên liệu
Cành, lá và vỏ thân cây Quao nước được thu hái tại Sóc Trăng vào tháng
04/2014 do Thạc sĩ Nguyễn Thế Anh xác định có tên khoa học là
Dolichandrone spathacea (L.f.) K. Schum., thuộc họ Núc nác (Bignoniaceae).
Mẫu tiêu bản QN.1 (vỏ thân) và QNL.1a và QNL.1b (cành và lá ) được lưu

giữ tại phòng Tổng hợp Hữu cơ, Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam, số 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội.
2.1.2. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu
Sắc kí lớp mỏng sử dụng bản mỏng nhôm tráng sẵn silica gel 60GF254, độ
dày 0,2 mm.
Phân lập các chất bằng phương pháp sắc kí cột với chất hấp phụ là silica
gel cỡ hạt 0,040 – 0,063 mm Merck và Sephadex LH – 20.
Các thiết bị xác định cấu trúc chất: Phổ khối HP 5989B MS Engine,
LC/MSD Agilent. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H–NMR, 13C-NMR đo trên
máy Bruker Avance – 500 MHz. Phổ hồng ngoại (FT – IR) đo dưới dạng
viên nén KBr trên máy quang phổ IMACT 410 của hãng Nicolet, Hoa Kì.
Đèn tử ngoại (UV BIOBLOCK) bước sóng λ = 254 nm và 365 nm dùng để
soi bản mỏng.
Ngoài ra còn dùng một số trang thiết bị khác như máy quay cất chân
không, máy sấy, máy siêu âm, các dụng cụ thủy tinh, vv…
Thuốc thử phun lên bản mỏng chủ yếu sử dụng vanilin 1% trong dung dịch
metanol – H2SO4 đặc, sau đó sấy ở nhiệt độ khoảng 110oC.
Dung môi dùng chạy cột và triển khai sắc kí lớp mỏng bao gồm n-hexan,
DCM, EtOAC và MeOH tinh khiết đã được cất lại qua cột Vigereux trước khi
sử dụng để loại bỏ tạp chất, chất làm mềm.
12


2.2 P ư n p áp n

i n ứu

2.2.1. Phương pháp chiết mẫu thực vật
Mẫu cành và lá cây Quao nước (Dolichandrone spathacea (L.f.) K.
Schum.) được làm sạch sấy khô ở nhiệt độ 40 - 45°C xay nhỏ thành bột và

chiết lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần là n-hexan,
điclometan, axeton, metanol và nước. Mẫu được chiết ba lần với mỗi loại
dung môi. Gộp các dịch chiết của từng loại dung môi, lọc và cất loại dung
môi dưới áp suất thấp thu được các cao chiết tương ứng.
Mẫu vỏ thân cây Quao nước (Dolichandrone spathacea (L.f.) K. Schum.)
được làm sạch, cắt nhỏ. Phơi khô mẫu dưới nắng tự nhiên trong hai ngày, sấy
khô một lần nữa bằng tủ sấy công nghiệp ở nhiệt độ 45 oC. Mẫu được xay nhỏ
thành bột và chiết lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần là nhexan, EtOAc, MeOH/H2O. Mẫu được chiết ba lần với mỗi loại dung môi.
Gộp các dịch chiết của từng loại dung môi, lọc và cất loại dung môi dưới áp
suất thấp thu được các cao chiết tương ứng.
2.2.2. Phương pháp tách và tinh chế chất
Các cao chiết trong các dung môi khác nhau thu được được tách và tinh chế
bằng phương pháp sắc khí cột kết hợp với sắc kí lớp mỏng với các hệ dung môi
thích hợp. Sắc khí cột gồm sắc khí cột thường và sắc khí cột nhanh (flash
chromatography) sử dụng silica gel. Đối với các chất phân cực cao có thể sử
dụng Sephadex LH–20 hoặc ngược pha RP–18. Trường hợp cần thiết có thể
chạy cột lặp lại nhiều lần hoặc dùng phương pháp kết tinh phân đoạn, kết tinh
lại để tinh chế chất. Kiểm tra độ tinh khiết của các chất cũng như theo dõi quá
trình tách chất trên cột bằng sắc kí lớp mỏng với hệ dung môi thích hợp.
2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các chất
Việc xác định cấu trúc hóa học của các chất sạch được thực hiện thông qua
việc kết hợp các phương pháp phổ hiện đại như phổ hồng ngoại (FT- IR), phổ
khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (1D và 2D NMR)
13


như 1H – NMR, 13C – NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC. Các loại phổ được
đo tại Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định, hoạt
tính chống oxy hóa và hoạt tính gây độc tế bào.

2.2.4.1. Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện dựa trên phương
pháp pha loãng đa nồng độ. Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh
vật kiểm định và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh hay yếu của
các mẫu thử thông qua các giá trị thể hiện hoạt tính là MIC (Minium inhibitor
concentration – nồng độ ức chế tối thiểu), IC50 (50% inhibitor concentration
– nồng độ ức chế 50%), MBC (Minium bactericidal concentration – nồng độ
diệt khuẩn tối thiểu).
2.2.4.1.1. Các chủng vi sinh vật kiểm định
Bao gồm những vi khuẩn và nấm kiểm định gây bệnh ở người:
- Bacillus subtilis: là trực khuẩn gram (+), sinh bào tử, thường không
gây bệnh.
- Staphylococcus aureus: cầu khuẩn gram (+), gây mủ các vết thương,
vết bỏng, gây viêm họng, nhiễm trùng có mủ trên da và các cơ quan nội tạng.
- Lactobacillus fermentum: vi khuẩn gram (+), là loại vi khuẩn đường ruột
lên men có ích, thường có mặt trong hệ tiêu hoá của người và động vật.
- Escherichia coli: vi khuẩn gram (-), gây một số bệnh về đường tiêu
hoá như viêm dạ dày, viêm đại tràng, viêm ruột, viêm lỵ trực khuẩn.
- Pseudomonas aeruginosa: vi khuẩn gram (-), trực khuẩn mủ xanh, gây
nhiễm trùng huyết, các nhiễm trùng ở da và niêm mạc, gây viêm đường tiết
niệu, viêm màng não, màng trong tim, viêm ruột.

14


- Salmonella enterica: vi khuẩn gram (-), vi khuẩn gây bệnh thương hàn,
nhiễm trùng đường ruột ở người và động vật.
- Candida albicans: là nấm men, thường gây bệnh tưa lưỡi ở trẻ em và
các bệnh phụ khoa.
2.2.4.1.2. Môi trường nuôi cấy

MHB (Mueller-Hinton Broth), MHA (Mueller-Hinton Agar); TSB
(Tryptic Soy Broth); TSA (Tryptic Soy Agar) cho vi khuẩn; SDB (Sabouraud2% dextrose broth) và SA (Sabouraud-4% dextrose agar) cho nấm men.
2.2.4.1.3. Cách tiến hành
 Pha loãng mẫu thử:
Mẫu ban đầu được pha loãng trong DMSO và nước cất tiệt trùng thành
một dãy 05 nồng độ theo yêu cầu và mục đích thử. Nồng độ thử cao nhất đối
với dịch chiết là 256 g/ml và với chất sạch là 128 g/ml.
 Thử hoạt tính
Lấy 10 l dung dịch mẫu thử ở các nồng độ vào đĩa 96 giếng, thêm 200 l
dung dịch vi sinh vật kiểm định có nồng độ 5.105 CFU/ml, ủ ở 37oC/24h.
 Xử lý kết quả
- Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất ức chế
sự phát triển của vi sinh vật.
- Giá trị IC50 được tính toán dựa trên số liệu đo độ đục của môi trường
nuôi cấy bằng máy quang phổ TECAN và phần mềm raw data.
- Giá trị MBC được xác định bằng số khuẩn lạc trên đĩa thạch.
 Chất tham khảo

15


IC50
(g/ml)

STT

Loài

C ủn

1

Staphylococcus
aureus

ATCC 13709

Ampicillin

0,0015

2

Bacillus subtilis

ATCC 6633

Ampicillin

0,0078

3

Lactobacillus
fermentum

Lp B14

Ampicillin

1,11

4

Salmonella enterica

ATCC 13076

Ampicillin

0,138

5

Escherichia coli

ATCC 25922

Streptomycin

0,186

6

Pseudomonas
aeruginosa

ATCC 15442

Streptomycin

15,56

7

Candida albicans

ATCC 10231

Amphotericin B

0,263

C ất t

m k ảo

2.2.4.2. Phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa DPPH
Nguyên tắc của phương pháp là sử dụng 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
(DPPH) tạo ra gốc oxy hóa tự do được dùng để sàng lọc các chất chống oxy
hóa. Hoạt tính chống oxy hóa của mẫu thử được đánh giá dựa trên khả năng
loại bỏ gốc tự do thông qua việc làm giảm màu của DPPH, được xác định
bằng độ hấp thụ của dung dịch sau phản ứng đo tại bước sóng  = 517 nm.

 Cách thử hoạt tính DPPH
Được tiến hành trên đĩa 96 giếng. Chuẩn bị dung dịch DPPH nồng độ
0,5 mM trong metanol và đưa vào các giếng. Bổ sung chất thử (pha trong
DMSO 100%) sao cho nồng độ cuối cùng trong phản ứng là 256; 64; 16; 4; 1
g/ml. Ủ đĩa ở 370 C trong 30 phút để phản ứng diễn ra. Xác định độ hấp thụ
của dung dịch sau phản ứng trên máy quang phổ Tecan Genios ở bước sóng

517 nm (Absorption). Khả năng trung hòa gốc tự do DPPH của mẫu thử ở các
nồng độ khác nhau được tính theo công thức:
SC % = (ODđối chứng âm – ODmẫu thử)/ ODđối chứng âm x100%
SC: Scavenge capacity - khả năng bẫy gốc tự do

16