Nghiên cứu sự đa dạng duy truyền của các dòng hoa cúc được tạo ra bằng phương pháp chiếu xạ gây đột biến giống Saphia Vàng

Nguyễn Thị Thanh Tú

Khóa luận tốt nghiệp

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA: SINH - KTNN

-------***-----NGUYỄN THỊ THANH TÚ

NGHIÊN CỨU SỰ ĐA HÌNH DI
TRUYỀN CỦA CÁC DÒNG HOA CÚC
ĐƯỢC TẠO RA BẰNG PHƯƠNG PHÁP
CHIẾU XẠ GÂY ĐỘT BIẾN GIỐNG
SAPHIA VÀNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Di truyền học

Người hướng dẫn khoa học
TS. KHUẤT HỮU TRUNG
ThS. NGUYỄN VĂN LẠI

Hà Nội - 2011

Khoa Sinh - KTNN

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Nguyễn Thị Thanh Tú

Khóa luận tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được khóa luận này tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ từ
các thầy cô.
Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Khuất
Hữu Trung, ThS. Kiều Thị Dung và tập thể cán bộ thuộc Bộ môn Kỹ thuật Di
truyền – Viện Di truyền Nông nghiệp đã hướng dẫn tận tình và tạo điều kiện
tốt nhất giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới ThS. Nguyễn Văn Lại và các thầy cô
giáo trong Khoa Sinh – KTNN Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã giúp đỡ
và dạy bảo tôi trong quá trình học tập.
Trong quá trình hoàn thành bản khóa luận này không tránh khỏi những
thiếu sót, rất mong được sự đóng góp ý kiến của các thầy cô để bản khóa luận
được đầy đủ hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2011
Sinh viên

Nguyễn Thị Thanh Tú

Khoa Sinh - KTNN

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Nguyễn Thị Thanh Tú

Khóa luận tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan khóa luận được hoàn thành là kết quả nghiên cứu của
riêng tôi, những số liệu trong luận văn là trung thực, không sao chép, không
trùng lặp với các kết quả nghiên cứu trước.
Nếu sai tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm.

Hà Nội, tháng 5 năm 2011
Sinh viên

Nguyễn Thị Thanh Tú

Khoa Sinh - KTNN

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Nguyễn Thị Thanh Tú

Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT
STT

Kí hiệu

1

bp

Base pair (cặp bazơ nitơ)

2

CN

Công nguyên

3

CTAB

Cetyl trimethylammonium bromide

4

DNA

Deoxyribonucleic acid

5

dNTP

Deoxynucleotide Triphosphates

6

EDTA

Ethylen Diamine Tetra Acetic acid

7

EtBr

Ethidium Bromide

8

Gy

Gray

9

HPLC

High-performance liquid chromatography

10

Krad

Kilorad

11

Kb

Kilobase

12

mRNA

Messenger Ribonucleic acid

13

PCR

Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

14

SDS

Sodium Dodecyl Sulphate

15

TBE

Tris - boric acid - EDTA

16

TE

Tris - EDTA

Khoa Sinh - KTNN

Tên đầy đủ

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Nguyễn Thị Thanh Tú

Khóa luận tốt nghiệp

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU..................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài...................................................................................... 1
2. Mục tiêu của đề tài ................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 3
4. Ý nghĩa của đề tài..................................................................................... 3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................... 4
1.1. Sơ lược về cây hoa cúc .......................................................................... 4
1.1.1. Nguồn gốc và phân bố của hoa cúc..................................................... 4
1.1.2. Tên khoa học và vị trí của cây hoa cúc trong hệ thống phân loại ........ 4
1.1.3. Điều kiện sinh thái và đặc điểm hình thái của hoa cúc ........................ 5
1.2. Vai trò của hoa cúc trong đời sống ........................................................ 7
1.3. Tình hình sản xuất và tiêu thụ hoa cúc trên thế giới và ở Việt Nam ....... 8
1.3.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ hoa cúc trên thế giới ............................ 8
1.3.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ hoa cúc ở Việt Nam............................. 8

1.4. Khái quát chung về lĩnh vực chọn tạo giống đột biến thực vật............... 9
1.4.1. Khái niệm về chọn tạo giống đột biến thực vật ................................... 9
1.4.2. Các tác nhân gây đột biến ................................................................... 10
1.5. Các phương pháp nghiên cứu, đánh giá đa dạng di truyền ở thực vật .... 15
1.5.1. Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền dựa vào chỉ thị hình thái ..... 15
1.5.2. Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền dựa vào các chỉ thị phân tử 16
1.5.2.1. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) ................................... 16
1.5.2.2. Kỹ thuật RAPD (Randon Amplified Polymorphism ADN) ............... 19
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............ 21
2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 21
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................... 21

Khoa Sinh - KTNN

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Nguyễn Thị Thanh Tú

Khóa luận tốt nghiệp

2.1.2. Dụng cụ và hoá chất thí nghiệm.......................................................... 21
2.1.2.1. Dụng cụ dùng trong mô tả hình thái................................................. 21
2.1.2.2. Các hoá chất sinh học phân tử cần thiết ........................................... 22
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu........................................................................... 24
2.1.4. Thời gian nghiên cứu.......................................................................... 24
2.2. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 24
2.2.1. Phương pháp mô tả hình thái .............................................................. 24
2.2.2. Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền bằng kỹ thuật PCR – RAPD 24
2.2.2.1. Tách chiết và tinh sạch ADN theo phương pháp CTAB................... 24

2.2.2.2. Phương pháp nhân gen bằng kỹ thuật PCR ...................................... 26
2.2.2.3. Phương pháp điện di trên gel agarose .............................................. 26
2.2.2.4. Tính hệ số đồng dạng di truyền theo công thức của Nei và Li.......... 27
2.2.2.5. Phân tích và xử lý số liệu................................................................. 28
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................. 29
3.1. Kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền ở mức hình thái .......................... 29
3.1.1. Kết quả khảo sát, ghi nhận đặc điểm của giống gốc............................ 29
3.1.2. Kết quả khảo sát, phát hiện và thu thập các thể đột biến ..................... 29
3.2. Kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền các dòng cúc ưu tú ở mức phân
tử bằng kỹ thuật PCR – RAPD .................................................................... 37
3.2.1. Kết quả tách chiết ADN từ các mẫu hoa cúc....................................... 37
3.2.2. Kết quả phản ứng PCR – RAPD ......................................................... 38
3.3. Hệ số tương đồng di truyền giữa các mẫu hoa cúc................................ 45
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................ 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................... 49

Khoa Sinh - KTNN

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Nguyễn Thị Thanh Tú

Khóa luận tốt nghiệp

MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài:
Hoa đóng vai trò quan trọng trong cuộc sống của con người, là sản phẩm
vừa đem lại hiệu quả kinh tế vừa mang giá trị tinh thần cao. Là mặt hàng xuất

khẩu đem lại lợi nhuận cao cho nhiều nước như: Hà Lan, Trung Quốc, Mỹ…
Ngoài việc làm đẹp và tô điểm cho đời sống con người hoa còn có nhiều tác
dụng khác như: chữa bệnh, dùng làm thức ăn cho người, gia súc, nuôi ong…
Ở Việt Nam, cây hoa cũng đóng một vai trò quan trọng trong nền kinh tế sản
xuất Nông nghiệp, đem lại hiệu quả kinh tế cao. Các tỉnh có diện tích trồng
hoa lớn như: Hà Nội, Vĩnh Phúc, Đà Lạt…
Trong các loài hoa phổ biến hiện nay không thể không nói tới hoa cúc,
tên khoa học là (chrysanthemum), một loài hoa được trồng ở rất nhiều nơi và
đem lại giá trị kinh tế cao cho người trồng nó. Ở Việt Nam hoa cúc được
trồng ở khắp mọi nơi từ núi cao đến đồng bằng, từ nông thôn đến thành thị,
nhưng được trồng tập chung ở các vùng trồng hoa truyền thống: Ngọc Hà,
Nhật Tân, Quảng An, Đà Lạt…
Tuy nhiên, việc sản xuất hoa cúc còn gặp rất nhiều hạn chế về diện tích
canh tác cũng như năng suất và chất lượng hoa. Các giống hoa cúc có giá trị
thương mại ở Việt Nam chủ yếu là các giống được nhập nội, rất đa dạng
phong phú về chủng loại và màu sắc. Bên cạnh đó các giống hoa do được
trồng tràn lan, theo kinh nghiệm của nông dân mà không có tác động của chọn
lọc và phục hồi giống dẫn đến năng suất chất lượng hoa chưa cao.
Vì vậy, việc tạo ra các giống hoa cúc có chất lượng cao, đa dạng về màu
sắc và kiểu hình, có khả năng chống sâu bệnh và chịu được những điều kiện
bất lợi của môi trường là yêu cầu đặt ra cho các nhà khoa học.

Khoa Sinh - KTNN

1

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Nguyễn Thị Thanh Tú

Khóa luận tốt nghiệp

Để tạo ra các giống cây trồng đáp ứng những nhu cầu trên các nhà chọn
tạo giống đã sử dụng nhiều phương pháp như: chuyển gen, gây đột biến thực
vật bằng các tác nhân vật lý và hóa học. Trong những năm gần đây, phương
pháp chiếu xạ gây đột biến đã được sử dụng rộng rãi trong việc cải tạo nâng
cao chất lượng các giống cây trồng, nhằm phát triển các giống cây với những
đặc điểm sinh học được cải tiến. Bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp với kỹ
thuật nhân giống in vitro đã tạo ra các giống cây trồng mới có chất lượng tốt.
Chọn tạo giống đột biến có vai trò quan trọng trong việc cải tiến các
giống cây trồng nói chung và hoa cúc nói riêng. Nhận dạng và xác định đặc
tính các giống cây trồng rất quan trọng đối với các nhà vườn để bảo hộ các
nhà chọn giống thực vật. Trước đây, các giống cây mới được xác định dựa
trên các đặc tính nông sinh học và cảm quan của các nhà chọn giống nên rất
khó đánh giá chính xác nguồn gốc và đặc điểm của cây. Gần đây, các kỹ thuật
sinh học phân tử phát triển đã giúp cho việc đánh giá đa dạng di truyền của
các giống cây trồng được dễ dàng thuận lợi và chính xác hơn.
Để tuyển chọn và phát triển những dòng cúc ưu tú phục vụ cho công tác
chọn tạo giống mới đòi hỏi phải có những nghiên cứu cơ bản về đánh giá
nguồn gen của giống cúc đang được lưu giữ và các giống được tạo ra bằng
phương pháp chiếu xạ gây đột biến.
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu
sự đa hình di truyền của các dòng hoa cúc được tạo ra bằng phương pháp
chiếu xạ gây đột biến giống saphia vàng”.
2. Mục tiêu của đề tài

Đánh giá đa dạng di truyền ở mức hình thái và mức phân tử của
các dòng cúc được tạo ra bằng phương pháp chiếu xạ gây đột biến
phục vụ khai thác và sử dụng có hiệu quả những dòng cúc này.

Khoa Sinh - KTNN

2

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Nguyễn Thị Thanh Tú

Khóa luận tốt nghiệp

Xác định được một số marker đặc trưng để nhận dạng chính xác
các dòng cúc triển vọng phục vụ cho công tác chọn tạo giống, nhân
giống và đăng ký bản quyền.
3. Nội dung nghiên cứu
- Phân tích và đánh giá đa dạng di truyền ở mức hình thái của
các dòng cúc sau chiếu xạ;
- Chọn lọc các dòng cúc đột biến ưu tú;
- Phân tích và đánh giá đa dạng di truyền của các dòng cúc đột
biến ưu tú bằng kỹ thuật PCR - RAPD.
4. Ý nghĩa của đề tài
- Dựa vào sự đa dạng di truyền ở mức hình thái và mức phân tử
của các dòng cúc được tạo ra bằng phương pháp chiếu xạ gây đột
biến làm cơ sở để chọn tạo ra các dòng cúc ưu tú phục vụ cho công
tác chọn tạo giống mới.
- Kết quả của đề tài có ý nghĩa lớn trong việc xây dựng quy
trình chọn tạo giống mới bằng phương pháp chiếu xạ gây đột biến.

Khoa Sinh - KTNN

3

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Nguyễn Thị Thanh Tú

Khóa luận tốt nghiệp

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Sơ lược về cây hoa cúc
1.1.1. Nguồn gốc và sự phân bố của cây hoa cúc
Nói về nguồn gốc, theo tài liệu ngành thực vật học ta thấy cúc xuất xứ từ
Trung Hoa. Khoảng 500 năm trước CN Khổng Tử đã đề cập đến việc trồng
hoa cúc. Ở Nhật vào thế kỷ thứ VIII sau CN mới có sự hiện diện của hoa cúc.
Riêng Châu Âu, cúc được mang vào Hà Lan năm 1688, nhưng sự trồng hoa
cúc thời này ở đây không thành công. Đến năm 1789 M. Blancard ở
Marseilles đem ba loại cúc từ Trung Hoa về Pháp, nhưng chỉ có một trong ba
loại này sống được, đó là cúc ''Old Purple'' và vì vậy đã được ghi trong lịch sử
hoa cúc. Ở Anh cuối thế kỷ XVIII người ta thấy có 8 loại cúc được nhập cảng,
đến năm 1824 có 24 loại và năm 1826 lên tới 48 loại. Vào năm 1860, nhân
dịp thăm viếng Nhật Bản, ông Robert Fortune đã đem về nhiều loại cúc mới
về Châu Âu. Trong sự phát triển hoa cúc, chính sự lai giống tiếp của các loại
cúc này mà người ta được thêm nhiều giống mới nữa. Ở Châu Úc, hoa cúc
được trồng tại Tasmania vào năm 1836, New South Wales 1843, Victoria
1855 và ở New Zealand 1860 [12].
1.1.2. Tên khoa học và vị trí của cây hoa cúc trong hệ thống phân loại

Cây hoa cúc có tên khoa học là (Chrysanthemum) do nhà thực vật học
người Thụy Điển Carl Linné đặt tên vào năm 1793. Chrysanthemum bắt
nguồn từ tiếng Hy Lạp: Chrysos có nghĩa là vàng (gold) và Anthemom có
nghĩa là bông hoa. Theo hệ thống phân loại thực vật cây hoa cúc thuộc lớp hai
lá mầm (Dicotyledoneae), phân lớp hoa cúc (Asterydae), bộ cúc (Asterales),
họ cúc (Asteraceae), phân họ hoa cúc (Asteroidae) và chi hoa cúc
(Chrysanthemum). (Võ Văn Chi, Dương Đức Tiến, 1978) [3].

Khoa Sinh - KTNN

4

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Nguyễn Thị Thanh Tú

Khóa luận tốt nghiệp

Qua hai cuộc hội thảo quốc tế về họ Asteraceae năm 1994 đã có sự thống
nhất tương đối về hệ thống học của họ này. Họ cúc trên thế giới được xếp
trong 2 phân họ, 13 tông (K. Bremer; 1994). Họ cúc có khoảng 1550 chi với
23000 loài (Takhtajan., 1997) [2].
Ở Việt Nam, họ cúc có khoảng 125 chi và trên 350 loài, phân bố rộng rãi
từ vùng ven biển đến vùng núi cao tới 3000 m so với mặt nước biển [4].
1.1.3. Điều kiện sinh thái và đặc điểm hình thái của hoa cúc
* Điều kiện sinh thái:
- Nhiệt độ: Cúc ưa khí hậu mát mẻ, nhiệt độ dao động từ 15 – 200C
(thích hợp với vụ đông), một số giống chịu nhiệt cao hơn (30 – 350C).
- Ánh sáng: Cúc được xếp vào loại cây ngắn ngày, thời gian chiếu sáng

là 11h ánh sáng/ngày chất lượng hoa cúc tốt nhất.
- Độ ẩm: Cúc là cây trồng cạn, không chịu được úng. Độ ẩm thích hợp từ
60 - 70%.
- Độ pH phù hợp trên đất trồng cúc từ 6 - 6,5 [13].
* Đặc điểm hình thái:
- Rễ: rễ của cây hoa cúc là loại rễ chùm, phần lớn phát triển theo chiều
ngang, phân bố ở tầng đất mặt từ 5 – 20 cm. Kích thước các rễ trong bộ rễ cúc
chênh lệch nhau không nhiều, số lượng rễ rất lớn do vậy khả năng hút nước
và dinh dưỡng rất mạnh. Cúc chủ yếu trồng bằng nhân vô tính nên các rễ
không phát sinh từ mầm rễ của hạt mà từ những rễ mọc ở mấu của thân (gọi là
mắt) ở những phần ngay sát mặt đất.
- Thân: cây thuộc thân thảo nhỏ, có nhiều đốt giòn dễ gãy càng lớn càng
cứng, cây dạng đứng hoặc bò. Kích thước thân phụ thuộc vào từng giống và
thời vụ trồng. Những giống nhập nội thân thường to mập, thẳng và giòn,

Khoa Sinh - KTNN

5

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Nguyễn Thị Thanh Tú

Khóa luận tốt nghiệp

ngược lại những giống cúc dại hay giống cổ truyền Việt Nam thân nhỏ mảnh
và cong. Thân có ống tiết nhựa mủ trắng, mạch có bản ngăn đơn.
- Lá: Thường là lá đơn không có lá kèm, mọc so le nhau, bản lá xẻ thùy
lông chim, phiến lá mềm mỏng có thể to hay nhỏ, màu sắc xanh đậm hay

nhạt phụ thuộc vào từng giống. Mặt dưới phiến lá bao phủ một lớp lông tơ,
măt trên nhẵn gân hình mạng. Trong một chu kỳ sinh trưởng cây có từ 30 –
50 lá trên thân.
- Hoa: hoa cúc chủ yếu có hai dạng
+ Dạng lưỡng tính: trong hoa có cả nhị đực và nhụy cái
+ Dạng đơn tính: trong hoa chỉ có nhị đực hoặc nhụy cái, đôi khi có loại
vô tính (không có cả nhị và nhụy, hoa này thường ở phía ngoài đầu). Mỗi hoa
gồm rất nhiều hoa nhỏ gộp lại trên một cuống hoa, hình thành hoa từ đầu
trạng mà mỗi đầu trạng là một bông hoa. Trong thực tế tùy theo mục đích sử
dụng mà người ta để một bông trên một cành hay nhiều bông trên một cành.
Màu sắc của hoa cúc rất khác nhau, hầu như có tất cả các màu tự nhiên:
trắng, vàng, đỏ, tím, hồng, nâu, xanh. Trong đó trên mỗi hoa có thể có một
màu duy nhất, có thể có vài màu riêng biệt hoặc có rất nhiều màu pha trộn,
tạo nên một thế giới màu sắc vô cùng phong phú và đa dạng.
Tùy theo cách sắp xếp của cánh hoa mà người ta phân ra thành nhóm hoa
kép (có nhiều vòng hoa sắp xếp trên bông) và nhóm hoa đơn (chỉ có một
vòng hoa trên bông). Những cánh hoa nằm ở phía ngoài có màu sắc đậm hơn,
xếp nhiều tầng, sít nhau, chặt hay lỏng tùy từng giống, cánh hoa có nhiều
hình dáng khác nhau: cong hoặc thẳng, có loại cánh ngắn, có loại cánh dài,
cuốn ra ngoài hay cuốn vào trong.
Đường kính bông hoa phụ thuộc vào giống, giống hoa to có đường kính
10 – 12 cm, loại trung bình 5 – 7 cm và loại nhỏ 1 – 2 cm.

Khoa Sinh - KTNN

6

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Nguyễn Thị Thanh Tú

Khóa luận tốt nghiệp

Hoa có 4 – 5 nhị đực dính vào nhau làm thành 1 ống bao xung quanh vòi
nhụy, bao phấn nở phía trong theo khe nứt dọc, khi phấn nhị đực chín, bao
phấn nở tung hạt phấn ra ngoài nhưng lúc này nhụy chưa đến tuổi trưởng
thành, chưa có khả năng tiếp nhận hạt phấn vì vậy sự thụ phấn, thụ tinh
không thành, dẫn đến quả không hạt, muốn có hạt giống phải thụ phấn nhờ
sâu bọ hoặc thụ phấn nhân tạo cho hoa.
- Quả: quả bế, đóng, chứa một hạt, quả có chùm lông do đài tồn tại để
phát tán hạt, có phôi thẳng mà không có nội nhũ [11].
1.2. Vai trò của hoa cúc trong đời sống
Hoa cúc không chỉ có giá trị về trang trí, làm đẹp cho cuộc sống mà nó
còn có giá trị trong y dược. Ở Trung Quốc một loại cúc nổi tiếng có tên gọi là
Hangbai với hoa nhỏ như đồng xu, màu trắng ngà được sử dụng như một
dược phẩm và theo ngành y học cổ truyền thì tắm với nước hoa cúc Hangbai
sẽ chữa được bệnh dị ứng da, uống trà hoa cúc thường xuyên làm giảm bệnh
nhức đầu và làm mắt sáng hơn. Y học hiện đại đã phân tích và xác định trong
lá và hoa cúc Hangbai có trên 20 hoạt chất khác nhau có thể chữa trị các bệnh
gây ra bởi siêu vi khuẩn, huyết áp cao và các bệnh về mắt. Giống hoa cúc
(Chrysanthemum grandiflorum Ramat) được sử dụng để sản xuất một loại trà
thảo dược và cũng được sử dụng để tạo ra các loại thuốc trừ sâu thân thiện với
môi trường. Tinh dầu và các hoạt chất có hoạt tính chiết xuất từ các loài hoa
cúc được cho là có tính kháng khuẩn và có thể là chất chống virus HIV. Một
số giống cúc còn được sử dụng làm thực phẩm.
Ở Việt Nam hoa cúc cũng được trồng từ lâu đời và rất được coi trọng.
Hoa cúc xuất hiện ở khắp các nơi như vườn hoa, công viên, trong phòng
khách, bàn làm việc... Không những thế hoa cúc còn đem lại những lợi nhuận
kinh tế đáng kể cho người nông dân. Kim ngạch xuất khẩu hoa cúc quý 3 năm

2008 của Việt Nam đã đạt hơn 1.400 nghìn USD [14].

Khoa Sinh - KTNN

7

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Nguyễn Thị Thanh Tú

Khóa luận tốt nghiệp

1.3. Tình hình sản xuất và tiêu thụ hoa cúc trên thế giới và ở Việt Nam
1.3.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ hoa cúc trên thế giới
Hoa cúc là một trong những loài hoa hàng năm phổ biến nhất trên thế
giới, do đặc điểm của hoa cúc có thể điều khiển được sự ra hoa của cây nên
người ta có thể tạo ra nguồn sản phẩm liên tục và ổn định quanh năm. Chính
vì thế mà ở Bắc Mĩ, Tây Âu và Nhật Bản hoa cúc đang đứng ở vị trí thương
mại thứ hai sau cây hoa hồng. Quốc gia xuất khẩu hoa cúc dẫn đầu là Hà Lan,
phục vụ cho thị trường tiêu thụ rộng lớn gồm 80 nước trên thế giới với diện
tích trồng hoa cúc chiếm tới 30% tổng diện tích trồng hoa tươi. Sau Hà Lan,
Colombia là nước đứng thứ hai trên thế giới về xuất khẩu hoa cúc, mỗi năm
xuất khẩu 600 triệu cành tiếp theo là Italia, mỗi năm sản xuất được 500 triệu
cành và Mỹ là 300 triệu cành [10].
Ở Châu Á, Nhật Bản cũng đang là nước dẫn đầu về xuất khẩu hoa cúc,
mỗi năm Nhật Bản sản xuất được khoảng 200 triệu cành phục vụ cho tiêu
dùng nội địa và xuất khẩu. Ngoài ra cũng phải kể đến Thái Lan, hoa cúc được
trồng quanh năm với sản lượng cành cắt/ năm là 50.841.500 cành. Ở Trung
Quốc, theo hiệp hội sản xuất hoa sản lượng hoa cúc năm 2007 đạt hơn 35

triệu bông. Diện tích trồng hoa cúc phát triển ở Quảng Đông, Thượng Hải, và
Bắc Kinh bao gồm các giống ra hoa vào mùa hè, mùa thu, đông sớm và xuân
muộn, màu được ưa chuộng nhất là màu vàng, kế đến là màu trắng, đỏ [10].
1.3.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ hoa cúc ở Việt Nam
Việt Nam có điều kiện khí hậu và thổ nhưỡng thuận lợi có thể trồng được
rất nhiều loại hoa và cây cảnh. Hiện nay diện tích trồng hoa cây cảnh của
nước ta trên 15.000 ha và diện tích trồng hoa cúc chiếm 30% tổng diện tích
trồng hoa cây cảnh trên cả nước. Nhiều chủng loại hoa cúc đã được trồng phổ
biến khắp nước ta, vùng sản xuất chính là Hà Nội, Hải Phòng, Sa Pa, thành
phố Hồ Chí Minh và Lâm Đồng, trong đó Đà Lạt là nơi lý tưởng cho việc

Khoa Sinh - KTNN

8

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Nguyễn Thị Thanh Tú

Khóa luận tốt nghiệp

trồng và nhân giống của hầu hết các loại cúc. Vùng hoa công nghệ cao Đà
Lạt, hoa hồng và hoa cúc là hai loại hoa chủ đạo, hoa cúc có 40 loại khác
nhau, chia thành ba nhóm lớn là cúc đại đoá, cúc giống nhỏ và cúc tia có
muỗng, với diện tích trồng hoa cúc là 160 ha [5]. Tại vùng trồng hoa Tây
Tựu, Từ Liêm, Hà Nội hoa hồng và hoa cúc là hai loại hoa có diện tích trồng
và sản lượng cao nhất. Thành phố Hồ Chí Minh là thị trường tiêu thụ hoa lớn
ở Việt Nam, tuy nhiên các vùng chuyên canh hoa ở thành phố như quận Gò
Vấp, Thủ Đức, Củ Chi… chỉ cung cấp được một phần nhỏ. Hiện nay thành

phố vẫn phải nhập một số lượng lớn hoa cắt trong đó có hoa cúc từ Hà Nội,
Hà Lan, Đài Loan và Singapo. Tại các tỉnh trung du và miền núi phía Bắc
diện tích trồng hoa diện tích trồng hoa cúc đã có 14,5 ha với sản lượng 5 triệu
cành/ năm [14].
1.4. Khái quát chung về lĩnh vực chọn tạo giống đột biến thực vật
1.4.1. Khái niệm về chọn tạo giống đột biến thực vật
Để có nhận thức rõ hơn về chọn tạo giống đột biến, có một số khái
niệm liên quan cần làm rõ:
- Hiện tượng đột biến (mutation): là một thay đổi đặc tính một cách bất
thường đột ngột trong gene hay nhiễm sắc thể có khả năng di truyền của một
cơ thể sinh vật không do hiện tượng phân ly hay tái tổ hợp tự nhiên.
- Thay đổi do đột biến (mutated): Các gene hay cấu trúc nhiễm sắc thể
bị thay đổi.
- Thể đột biến (mutant): một cơ thể sinh vật mới mang gene đột biến
hay các nhiễm sắc thể được sắp xếp lại.
- Đột biến tự nhiên (Spontaneous mutation): là hiện tượng do các yếu tố
tự nhiên trong môi trường sống (tia bức xạ mặt trời, tia cực tím; các sản phẩm

Khoa Sinh - KTNN

9

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Nguyễn Thị Thanh Tú

Khóa luận tốt nghiệp

do phản ứng hoá học trong tự nhiên, đột biến tự phát trong nội bào và mô như

các rối loạn của quá trình sao chép DNA…).
- Đột biến nhân tạo (Artificial/Intentional mutation): là hiện tượng đột
biến thực nghiệm do con người chủ định tạo ra dưới sự tác động của các tác
nhân vật lí và hóa học.
- Chọn giống đột biến (mutation breeding): việc cải thiện di truyền đặc
điểm cây trồng ở một hay nhiều tính trạng khác nhau thông qua sử dụng các
thể đột biến được tạo ra [7].
1.4.2. Các tác nhân gây đột biến
Đột biến có thể xảy ra ở mọi cơ quan, mọi thời kỳ sinh trưởng của cây
trồng, theo nhiều hướng khác nhau và mức độ tần số cũng khác nhau, đột biến
có thể xảy ra bất cứ lúc nào do những thay đổi nội tại trong cấu trúc vật chất
di truyền, do môi trường thay đổi đột ngột cũng như những tác động vật lý,
hóa học… của con người. Đột biến thường có hại là gây dị dạng, gây chết…
nhưng cũng xuất hiện dạng có lợi như năng suất cao, chống chịu tốt với điều
kiện môi trường, xuất hiện các tính trạng mới, khắc phục các nhược điểm của
giống vật liệu khởi đầu.
Trong tự nhiên đột biến luôn xảy ra nhưng lại xảy ra với tần số thấp, chỉ
ở mức 1/10.000.000 đến 1/10.000. Do vậy, việc tạo đột biến nhân tạo tỏ ra có
hiệu quả và được sử dụng rộng rãi trong công tác chọn tạo giống. Các tác
nhân được sử dụng trong tạo đột biến nhân tạo: tác nhân vật lý (phóng xạ ion
hóa, phóng xạ không ion hóa), sốc nhiệt, tác nhân hóa học. Tác nhân vật lý
hoặc hóa học tác động vào tế bào làm biến đổi cấu trúc hoặc ion hóa phân tử
DNA hoặc protein, chất vô cơ, nước làm thay đổi phản ứng sinh lý, hóa sinh
trong tế bào, thay đổi cấu trúc và thành phần hóa học của DNA gây đột biến
gene và hệ quả của nó có thể là sai khác kiểu hình.

Khoa Sinh - KTNN

10

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Nguyễn Thị Thanh Tú

Khóa luận tốt nghiệp

* Tác nhân hóa học:
Số lượng các chất hóa học gây đột biến là rất nhiều và số lượng các chất
như vậy được phát hiện ngày càng nhiều. Tuy nhiên, trong thực tiễn, công tác
chọn tạo giống đột biến ở cây trồng chỉ một số ít được sử dụng và tỏ ra hữu
ích, hầu hết trong số đó thuộc về nhóm alkyl hóa, như là: ethyl methane
sulhonate (EMS), diethyl sulfate (DES), ethyleimine (EI), ethyl nitroso
urethane (ENU), dimethyl sunfat (DMS), ethyl nitroso urea (ENH), methyl
nitroso urea (MNH),… Đây là nhóm quan trọng nhất của các tác nhân hóa
học được sử dụng cho quá trình gây đột biến các chủng nông nghiệp. Chúng
có một hoặc nhiều nhóm alkyl linh động vốn có thể được chuyển sang cho các
phân tử khác. Chúng phản ứng với DNA bằng cách alkyl hóa

nhóm

phosphate cũng như các base purine và pyrimidine, do vậy nên cực kỳ cẩn
thận trong việc sử dụng chúng vì hầu hết là chất gây ung thư tiềm năng, chẳng
hạn như EI, EMS, MNH và nên được sử dụng ở mức các lượng nhỏ.
Nhóm chất oxy hóa khử như: HNO3, H2O2, aldehyde và một số muối kim
loại nặng xâm nhập vào làm thay đổi nhóm NH2 trong nucleotide, trong
protein và tế bào.
Nhóm chất kháng sinh (antibiotics) như là azaserine, mitomycin C,
streptonigrin và actinomycin D đã được nhận thấy là có tính chất làm đứt gẫy
nhiễm sắc thể, nhưng tính hữu dụng của chúng bị hạn chế.

Azide: Azide là một tác nhân gây đột biến hiệu quả trong những điều
kiện xử lý nào đó. Nó cho phép nhận được các thể đột biến với tần suất cao.
Phần lớn các đột biến ghi nhận được là các đột biến gene, bên cạnh đó còn có
các hiệu ứng làm thay đổi cầu trúc nhiễm sắc thể. Hóa chất này tương đối an
toàn hơn các hóa chất khác, mau phân hủy và không đắt, tuy nhiên cũng phải
nhìn nhận rằng nó mang tiềm năng gây ung thư.

Khoa Sinh - KTNN

11

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Nguyễn Thị Thanh Tú

Khóa luận tốt nghiệp

Trước đây và ngay cả đến nay, người ta còn dùng Conchicine để gây ra
hiện tượng đa bội là vì khi thấm vào mô đang phân bào, Conchicine cản trở
sự hình thành thoi vô sắc, làm cho nhiễm sắc thể không phân li.
Do có những loại hoá chất chỉ phản ứng với một loại nucleotide xác
định, người ta hy vọng có thể gây đột biến theo ý muốn. Tùy vào đối tượng
nghiên cứu và mục tiêu mong muốn, có nhiều phương thức xử lý hóa chất để
làm phát sinh các thể đột biến. Người ta tạo ra các đột biến và các thể đa bội
bằng cách ngâm các vật liệu ban đầu như hạt khô hay hạt nảy mầm…. Trong
một thời gian nhất định trong dung dịch hoá chất với nồng độ thích hợp hoặc
tiêm dung dịch vào bầu nhụy, quấn bông tẩm dung dịch hoá chất vào đỉnh
sinh trưởng [7].
* Tác nhân vật lý:

Các tác nhân vật lý có thể tác động làm thay đổi cấu trúc DNA, nhiễm
sắc thể một cách hiệu quả so với các nhân tố hóa học là điều đã được chứng
minh thông qua lịch sử chọn tao giống đột biến. Các tác nhân vật lý ấy bao
gồm:
- Việc gây sốc nhiệt: sự tăng hoặc giảm nhiệt độ môi trường một cách
đột ngột có khả năng gây đột biến là vì nó làm cho tế bào không khởi động
kịp các cơ chế đáp ứng, gây chấn thương trong bộ máy di truyền hoặc làm tổn
thương thoi vô sắc, gây rối loạn sự phân bào. Sốc nhiệt thường gây đột biến
số lượng nhiễm sắc thể.
- Các tác động gây bức xạ ion hóa các cặp base nitrogen trong chuỗi
DNA xảy ra trong quá trình sinh tổng hợp DNA có khả năng gây ra các đột
biến. Trong trường hợp này, chúng làm nảy sinh sự tồn tại của các cặp base
nitrogen bất thường và hình thành nên các thay đỗi hỗn biến trong cấu trúc
các cặp base. Hệ quả của việc này là trình tự các base trong chuỗi DNA được

Khoa Sinh - KTNN

12

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Nguyễn Thị Thanh Tú

Khóa luận tốt nghiệp

sinh tổng hợp mới bị sai lệch, một thay đổi rời rạc có khả năng duy trì, di
truyền được có thể được hình thành. Những thay đổi như vậy cũng giống với
những gì xảy ra một cách tự nhiên, chỉ có điều là tần suất của chúng tăng lên
đáng kể. Bên cạnh tác động ion hóa các base của DNA, sự thay đổi base hay

loại bớt base cũng như các hiệu ứng làm thay đổi trình tự giới hạn các base
cũng có thể xảy ra. Nếu một lượng ion hóa đủ lớn xảy ra ở một hay một vài
base hay nếu sự tương tác với gốc tự do làm thay đổi cấu trúc của các base thì
chúng có thể bị loại khỏi phân tử DNA (base deletion).
Có một số các loại bức xạ và nguồn bức xạ đã được các nhà chọn giống
sử dụng. Ngoài tia cực tím (ultraviolet), một vài kiểu bức xạ ion hóa như tia
X, tia Gamma, các tiểu phần beta và alpha, proton và neutron thông thường có
khả năng hình thành nên sự phát năng lượng rời rác được gọi là sự ion hóa khi
chúng xuyên qua vật chất. Tia X cũng như tia Gamma hay ánh sáng cực tím là
các bức xạ điện từ phát ra lượng tử (với bước sóng 10 0.001nm đối với tia X và
tia Gamma, khác với ánh sáng cực tím khoảng 2.000 – 3.000nm). Trong việc
sản sinh ra các đột biến, máy phát tia X với bước sóng ngắn có khả năng
xuyên thấu cao là thích hợp hơn bước sóng dài.
Tia Gamma: tia Gamma có bước sóng ngắn hơn và do vậy có mức năng
lượng photon cao hơn tia X. Khác với tia X, tia Gamma thường được tạo ra từ
các đồng vị phóng xạ. Để làm sản sinh đột biến, các thiết bị chiếu xạ Gamma
về căn bản cũng như các máy phát tia X trong trường hợp ứng dụng kỹ thuật
chiếu xạ cấp tính và bán cấp tính, tuy nhiên một lợi thế hiển nhiên của nguồn
bức xạ Gamma là có thể kéo dài thời gian chiếu xạ nếu đặt nguồn gamma
trong nhà kính hay trên đồng ruộng, theo đó cây trồng có thể được chiếu xạ
trường diễn. Cobalt 60 (60Co) và Cesium 137 (137Cs) là nguồn đồng vị phóng
xạ chính tạo ra tia gamma được sử dụng trong nhân giống đột biến. Chúng

Khoa Sinh - KTNN

13

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Nguyễn Thị Thanh Tú

Khóa luận tốt nghiệp

được che chắn trong các khoang chứa bằng chì khi không sử dụng và được
vận hành bởi các cơ chế điều khiển từ xa để chiếu xạ vật liệu thực vật.
Tia cực tím (UV) có khả năng xuyên thấu vật chất rất giới hạn, vì thế
chúng chỉ được sử dụng một cách hạn chế để xử lý các vật liệu có kích thước
nhỏ như bào từ, hạt phấn, các tế bào hạt và mô nuôi cấy. Dải bước sóng
khoảng 2.500 – 2.800nm mang lại hiệu ứng sinh học cao nhất bởi đây là vùng
hấp thụ ánh sáng cao nhất của acide nucleic.
Các tiểu phần beta: Các tiểu phần beta hình thành từ nguồn đồng vị
Phosphorus 32 (32P) hoặc Sulfur 35 (35S) gây hiệu ứng lên các mô tương tự
như tia X và tia Gamma tuy nhiên khả năng xuyên thấu của các tiểu phần beta
là thấp hơn. Khả năng đó cho phép đưa các đồng vị phóng xạ này vào dung
dịch và cho xâm nhập vào vật liệu thực vật. 32P và 35S có thể kết hợp trực
tiếp vào trong nhân tế bào nên do đó định vị tốt hơn trong việc gây các hiệu
ứng, tuy nhiên do sự biến động giữa các mô và các tế bào nên rất khó xác
định chính xác liều hấp thụ của các nhân tố phát xạ bên trong vật liệu thực vật
và có thể gây nguy hiểm cho nhà chọn giống khi tiếp xúc các vật liệu này [7].
Tia Neutron: chùm tia neutron chậm và chùm neutron nhanh từ việc phân
hủy hạt nhân nguyên tử Uranium trong các lò phản ứng hạt nhân cũng có thể
được sử dụng để chiếu xạ gây đột biến vật liệu thực vật. Tia Neutron được
đánh giá là gây hiệu ứng tạo đột biến cao, tuy nhiên chúng gây ra mức độ hỗn
loạn cao trong giai đoạn sớm của thí nghiệm và các kỹ thuật do liều thích
đáng là còn thiếu.
Tia điện tử (Electron beam): hình thành từ máy gia tốc hạt điện tử,
phương pháp này bị hạn chế và cấm sử dụng trong việc chiếu xạ tạo đột biến
để đảm bảo tính an toàn cho nhà chọn giống, người vận hành chiếu xạ bởi vật

Khoa Sinh - KTNN

14

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Nguyễn Thị Thanh Tú

Khóa luận tốt nghiệp

liệu thực vật sau chiếu xạ vẫn duy trì tình trạng hoạt hóa trong một thời gian
dài.
Chùm tia ion (Ion beam): Chùm tia Ion được tạo ra từ các máy gia tốc
mang một năng lượng lớn với mức năng lượng truyền qua (LET – Linear
Energy Transfer) cao đến các vị trí trong mô. Do đó, có thể trông đợi những
hiệu ứng sinh học tác động lên vật liệu thực vật khác biệt khi so sánh với các
loại bức xạ có mức năng lượng truyền qua thấp như tia gamma, tia X. Chùm
tia Ion thể còn có thể gây ra sự thay đổi lớn về cấu trúc nhiễm sắc thể và
DNA. Tần suất gây đột biến của chùm tia Ion trong việc tạo các đột biến khác
nhau là cao hơn tia Gamma và tia X, tuy nhiên các nghiên cứu căn bản và
thực hành còn phải được tiến hành và chi phí cho việc chiếu chùm tia Ion là
tương đối cao [7].
1.5. Các phương pháp nghiên cứu, đánh giá đa dạng di truyền ở thực vật
1.5.1. Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền dựa vào chỉ thị hình thái
Phương pháp đánh giá đa dạng ở mức hình thái là phương pháp truyền
thống được nhà phân loại học đầu tiên là Larmark sử dụng. Phương pháp này
bao gồm việc miêu tả những đặc điểm, cấu tạo hình thái bên ngoài, cụ thể là:
- Đặc điểm của hoa: màu sắc, số lượng hoa trên bông, số lượng bông trên
thân, cách sắp xếp của cánh hoa, kích thước, mùi hương của hoa, thời gian ra

hoa, thời gian hoa tồn tại.
- Đặc điểm của lá: màu sắc, số lượng của lá trung bình của một cây,
chiều dài và chiều rộng của lá, hình dáng của lá, cấu tạo lá.
- Đặc điểm của bộ rễ: màu sắc, cấu tạo, hình dáng, kích thước (chiều dài
và đường kính).
- Đặc điểm của thân: màu sắc, cấu tạo, hình dáng, kích thước (chiều dài
và đường kính) [1].

Khoa Sinh - KTNN

15

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Nguyễn Thị Thanh Tú

Khóa luận tốt nghiệp

1.5.2. Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền dựa vào các chỉ thị phân tử
Bên cạnh phương pháp sử dụng các đặc điểm hình thái để phân tích đa
dạng di truyền, ngày nay sinh học phân tử đã cung cấp các công cụ hỗ trợ đắc
lực là các kỹ thuật phân tử như: RELP, PCR , RAPD, AFLP, SSR… Trong
đó, kỹ thuật RAPD được sử dụng phổ biến trên khắp thế giới và cả ở Việt
Nam.
1.5.2.1. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
Kỹ thuật PCR cho phép khuyếch đại, tạo một số lượng rất lớn bản sao của
gen (hay một đoạn ADN) trong một thời gian ngắn. Nguyên tắc PCR dựa trên
cơ sở tính chất biến tính, hồi tính của ADN và nguyên lý tổng hợp ADN. Trên
cơ sở của đoạn ADN khuôn, đoạn mồi tự do (primer), các nucleotid tự do

(dNTP) và enzym ADN polymerase có thể tổng hợp được đoạn ADN giới hạn
bởi các đoạn mồi. Lặp lại nhiều lần chu trình nhân gen, trong một thời gian
ngắn số lượng bản sao ADN tạo thành tăng theo cấp số nhân [6].
* Nguyên lý
PCR là một chuỗi phản ứng liên tục, gồm nhiều chu kỳ kế tiếp nhau,
mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn:
- Giai đoạn biến tính: ở nhiệt độ cao 90 - 95°C (cao hơn nhiệt độ biến
tính (Tm) của khuôn), làm đứt các liên kết hydro của phân tử ADN, hai mạch
phân tử ADN tách rời nhau. Đoạn khuôn ADN có các đoạn dài gồm nhiều
nucleotid giống nhau, hoặc tỉ lệ G - C càng cao, có nhiệt độ biến tính cao hơn.
Do vậy cần căn cứ đặc điểm của ADN khuôn để lựa nhiệt độ biến tính phù
hợp. Giai đoạn này kéo dài 1 - 2 phút.
- Giai đoạn gắn mồi: ở nhiệt độ khoảng 55 - 56°C để các mồi bắt cặp
với các mạch đơn ADN khuôn ở các đầu 3’ theo nguyên lý Chargaff. Giai
đoạn này khoảng 30 - 60 giây.

Khoa Sinh - KTNN

16

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Nguyễn Thị Thanh Tú

Khóa luận tốt nghiệp

- Giai đoạn tổng hợp: nhiệt độ 70 - 72°C thích hợp với điều kiện hoạt
động của enzym ADN polymerase. Enzym ADN polymerase xúc tác hoạt
động tổng hợp gắn thêm các nucleotid vào cuối đoạn mồi, các mồi được kéo

dài trên cơ sở bắt cặp với mạch khuôn, tạo nên các mạch đơn ADN mới, giai
đoạn này gọi là giai đoạn polymer hoá. Thời gian giai đoạn này từ 30 giây đến
vài chục phút, tuỳ thuộc vào kích thước của đoạn ADN. Thông thường với
thời gian 2 phút, tổng hợp được những đoạn ADN kích thước dưới 2 kb.
Một phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ liên tục, sản phẩm tạo ra ở chu
kỳ trước lại được làm khuôn ở chu kỳ kế tiếp, nên số lượng bản sao tạo thành
tăng theo cấp số nhân. Một phản ứng PCR thường thực hiện 20 - 40 chu kỳ,
từ mỗi đoạn ADN khuôn có thể tạo nên 220- 240 bản sao ADN. Trong quá
trình thực hiện phản ứng PCR, cần lưu ý ở những chu kỳ sau lượng khuôn
tăng, lượng mồi và dNTP tự do giảm, enzym ADN polymerase hoạt động yếu
dần. Do đó, cần tính toán hàm lượng mồi dNTP, enzym để bảo đảm phản ứng
PCR có kết quả tốt nhất [6].
* Các yếu tố cần thiết cho phản ứng PCR
- ADN khuôn: Đoạn khuôn ADN tinh sạch là một yếu tố quan trọng,
đảm bảo kết quả phản ứng PCR tạo được các sản phẩm PCR chính xác. Kích
thước đoạn khuôn nhỏ hơn 3kb cho kết quả nhân gen tốt nhất. PCR có thể
khuyếch đại được ADN từ những mẫu sinh học đang bị phân huỷ như vết
máu, vết tinh dịch để lâu ngày, tóc và xương của người chết....[6].
- Các nucleotid tự do (dNTP): Nucleotid tự do (dNTP) cần thiết cho
phản ứng PCR bao gồm dATP, dTTP, dGTP và dCTP. Trong mỗi phản ứng
PCR cần chú ý đến tỉ lệ G - C trong đoạn khuôn để xác định hàm lượng mỗi
đoạn ADN phù hợp. Nồng độ dNTP mỗi loại, thường sử dụng trong các phản
ứng PCR khoảng 50 – 200 M. Khi hàm lượng các loại dNTP tự do quá ít,
tạo sản phẩm PCR không đủ để phát hiện, ngược lại nồng độ dNTP tự do quá

Khoa Sinh - KTNN

17

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Nguyễn Thị Thanh Tú

Khóa luận tốt nghiệp

cao thì phản ứng PCR khó thực hiện. Do đó, tuỳ theo kích thước đoạn gen và
số chu kỳ PCR thực hiện để tính toán nồng độ dNTP thích hợp [6].
- Mồi: Mồi là các đoạn oligonucleotid ngắn khoảng 14 - 35 nucleotid,
có vai trò quan trọng quyết định thành công của phản ứng PCR. Để thực hiện
nhân một đoạn ADN bằng phản ứng PCR, cần có một cặp mồi thích hợp. Một
cặp mồi trong PCR gồm mồi xuôi F (Foward) và mồi ngược R (Revert). Mồi
có vai trò tạo các nhóm 3’ OH tự do, cần thiết cho phản ứng polymer hoá.
Mồi xuôi phải có trình tự tương đồng với trình tự của mạch ADN mang mã di
truyền, mồi ngược bắt cặp với mạch ADN mang mã di truyền ở đầu 3’ của
mạch [6].
- Emzym ADN polymerase: Emzym ADN polymerase là yếu tố quan
trọng, có vai trò quyết định hiệu quả của phản ứng PCR. Mỗi loại enzym ADN
polymerase có đặc tính và vai trò khác nhau trong phản ứng PCR, sử dụng các
loại enzym ADN polymerase khác nhau thu được sản phẩm PCR có tính đặc
hiệu khác nhau. Hàm lượng enzym ADN polymerase cũng ảnh hưởng rất lớn
đến hiệu quả PCR. Do đó, trong các phản ứng PCR, tuỳ theo mục đích cụ thể
của các nghiên cứu để lựa chọn loại enzym với hàm lượng thích hợp [6].
- Dung dịch đệm cho PCR: Dung dịch đệm cho PCR là một trong
những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng và hiệu quả của phản ứng
PCR. Dung dịch đệm của phản ứng PCR cần đảm bảo thành phần các chất
cần thiết cho hoạt động của enzym ADN polymerase như MgCl2, KCl, Tris...
Trong dung dịch đệm, ion Mg2+ là thành phần có ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu
quả của phản ứng PCR, do Mg2+ ảnh hưởng đến khả năng bắt cặp và gắn các
mồi với mạch khuôn [6].

- Thiết bị thực hiện phản ứng PCR: Phản ứng PCR là một chuỗi các
chu kỳ tuần hoàn nhiệt, do vậy có thể thực hiện phản ứng PCR trong các thiết
bị chuyên dụng là các máy PCR. Ngoài ra, phản ứng PCR có thể thực hiện

Khoa Sinh - KTNN

18

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Nguyễn Thị Thanh Tú

Khóa luận tốt nghiệp

trong các bể ổn nhiệt, có bộ đếm giờ với dụng cụ thông dụng trong phòng thí
nghiệm [6].
* Các ứng dụng chủ yếu của PCR
- Sử dụng PCR trong tách dòng gen, xây dựng ngân hàng gen, lập các
loại bản đồ gen và giải trình tự gen, bộ gen.
- PCR được ứng dụng trong các nghiên cứu chuẩn đoán sớm các bệnh
nhiễm virus, vi khuẩn và các đột biến gây rối loại di truyền.
- PCR được sử dụng trong tạo đột biến in vitro, và trong một số kỹ
thuật chuyển gen nhằm tạo ra các giống vật nuôi, cây trồng và vi sinh vật mới.
- PCR có vai trò quan trọng trong nghiên cứu nguồn gốc các loài sinh
vật và trong phân loại phân tử [6].
1.5.2.2. Kỹ thuật RAPD (Randon Amplified Polymorphism ADN)
* Nguyên lý
Sử dụng cùng một số cặp mồi ngẫu nhiên nhất định (thường sử dụng từ 10 40 cặp mồi) để thực hiện phản ứng PCR, nhằm nhân các đoạn ADN đặc trưng
của các mẫu nghiên cứu. Nếu các mẫu nghiên cứu có bộ gen giống nhau hoàn

toàn, sản phẩm PCR thu được gồm các đoạn ADN hoàn toàn giống nhau về kích
thước và cấu trúc. Khi bộ gen của các mẫu nghiên cứu có sự khác biệt nhau, kết
quả PCR nhân được các đoạn khác biệt nhau. Mồi ngẫu nhiên là các đoạn
oligonucleotid gồm khoảng 8 - 20 nucleotid đặc trưng với mỗi loài sinh vật [6].
* Các bước thực hiện
- Tách chiết và tinh sạch ADN bộ gen của các mẫu nghiên cứu, và thực
hiện phản ứng PCR nhân các đoạn ADN với các cặp mồi đã lựa chọn (trong
cùng điều kiện giống nhau).
- Xác định tính hệ số đồng dạng di truyền hoặc mức độ khác nhau giữa các
mẫu nghiên cứu bằng các phần mềm phân tích sinh học thông dụng hoặc tính

Khoa Sinh - KTNN

19

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2