thực hiện các thí nghiệm trong giáo trình thực tập hóa sinh học (tn364)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC

THỰC HIỆN CÁC THÍ NGHIỆM
TRONG GIÁO TRÌNH THỰC TẬP HÓA SINH HỌC
(TN364)
Cán bộ hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

Ts. ĐÁI THỊ XUÂN TRANG

NGUYỄN NGỌC HUỲNH

VÕ THỊ TÚ ANH

MSSV: 3092341
Lớp: SINH HỌC K35

Cần Thơ, 2013


LỜI CẢM TẠ
Trong suốt quá trình thực hiện luận văn, em luôn nhận được sự quan tâm,
giúp đỡ tận tình của quý Thầy cô, bạn bè cũng như từ gia đình.
Em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới cô Đái Thị Xuân Trang,

thầy Trần Thanh Mến và cô Võ Thị Tú Anh đã tận tình hướng dẫn, bổ sung kiến
thức và động viên em trong suốt thời gian học cũng như trong thời gian thực hiện
đề tài này.
Em xin chân thành cảm ơn quý Thầy Cô khoa Khoa Học Tự Nhiên nhất là
quý thầy cô thuộc Bộ môn Sinh học đã giảng dạy và truyền đạt kiến thức cho em
suốt khóa học.
Xin gửi lời cảm ơn đến thầy Phạm Quốc Nhiên và cán bộ phòng thí nghiệm
Hóa – Khoa Khoa Học Tự Nhiên – Trường Đại học Cần Thơ đã giúp đỡ và tạo
điều kiện tốt nhất cho em trong quá trình thực hiện đề tài.
Chân thành cảm ơn tập thể lớp Sinh Học K35 đã giúp đỡ em trong quá trình
học tập và hoàn thành luận văn này.
Xin cảm ơn gia đình, đặc biệt là mẹ, đã lo cho con ăn học và luôn là nguồn
động lực và động viên quý báu để con có thể vượt mọi khó khăn học tập tốt.
Em xin chúc quý Thầy Cô cùng các bạn sinh viên thành công và dồi dào sức
khỏe và công tác tốt.

Cần Thơ, ngày 20 tháng 05 năm 2013

Nguyễn Ngọc Huỳnh

i


LỜI CAM KẾT
Tôi xin cam kết Luận văn này được hoàn thành dựa trên kết quả nghiên cứu của
bản thân tôi. Các số liệu và kết quả có được trong luận văn là hoàn toàn trung
thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ luận văn nào trước đây.
Cán bộ hướng dẫn

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Ngọc Huỳnh

ii


MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ......................................................................................................1
LỜI CAM KẾT .................................................................................................. ii
MỤC LỤC......................................................................................................... iii
DANH SÁCH BẢNG....................................................................................... vii
DANH SÁCH HÌNH ....................................................................................... viii
DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................... viii
TÓM TẮT ...........................................................................................................x
PHẦN I: GIỚI THIỆU ........................................................................................1
PHẦN II: NỘI DUNG ...................................................................................... xii
Bài 1: Carbohydrate.......................................................................................... xii
1. Cơ sở lí thuyết ......................................................................................... xii
1.1 Carbohydrate......................................................................................xii
1.2 Glycogen..............................................................................................xii
1.3 Nguyên tắc thí nghiệm....................................................................... xiv
2. Nội dung bài thực hành...........................................................................xiv
2.1 Phương tiện, phương pháp thí nghiệm ............................................. xiv
2.1.1 Mẫu vật ..................................................................................... xiv
2.1.2 Hóa chất, dụng cụ, thiết bị ....................................................... xiv
2.2 Tiến trình thí nghiệm......................................................................... xiv
2.2.1 Chiết xuất glycogen .................................................................. xiv
2.2.2 Kiểm tra dịch glycogen chiết xuất và xác định thành phần cấu
tạo ....................................................................................................... xv

iii


3. Kết quả và thảo luận ................................................................................xv
Bài 2: Lipid ................................................................................................... xviii
1. Cơ sở lý thuyết...................................................................................... xviii
1.1 Sơ lược về lipid ................................................................................xviii
1.2 Lecithin ............................................................................................xviii
1.3 Nguyên tắc thí nghiệm....................................................................... xix
2. Nội dung bài thực hành............................................................................xx
2.1 Phương tiện, phương pháp................................................................. xx

2.1.1 Mẫu vật ...................................................................................... xx
2.1.2 Hóa chất, dụng cụ, thiết bị ........................................................ xx
2.2 Tiến trình thí nghiệm.......................................................................... xx
2.2.1 Chiết xuất lecithin ..................................................................... xx
2.2.2 Xác định thành phần cấu tạo ................................................... xxi
3. Kết quả và thảo luận ...............................................................................xxi
Bài 3: Xác định hoạt tính của enzyme amylase ................................................xxv
1. Cơ sở lý thuyết........................................................................................xxv
1.1 Sơ lược về enzyme............................................................................. xxv
1.2 Enzyme amylase ............................................................................... xxv
1.3 Nguyên tắc thí nghiệm..................................................................... xxvi
2. Nội dung bài thực hành.........................................................................xxvi
2.1 Phương tiện, phương pháp.............................................................. xxvi
2.1.1 Mẫu vật ................................................................................... xxvi
2.1.2 Hóa chất, dụng cụ, thiết bị .................................................... xxvii
2.2 Tiến trình thí nghiệm...................................................................... xxvii
2.2.1 Trích amylase và tinh khiết hóa............................................ xxvii
2.2.2 Xác định hoạt tính amylase................................................... xxvii

3. Kết quả và thảo luận ...........................................................................xxviii
iv


Bài 4: Phản ứng oxy hóa – khử .......................................................................xxix
1. Cơ sở lý thuyết: .....................................................................................xxix
1.1Phản ứng oxy hóa khử sinh học ....................................................... xxix
1.1.1 Gốc tự do................................................................................. xxix
1.1.2 Chất chống oxy hóa ................................................................. xxx
1.2DPPH và Trolox................................................................................. xxx
1.2.1 DPPH ....................................................................................... xxx
1.2.2 Trolox....................................................................................... xxx
1.3Nguyên tắc thí nghiệm...................................................................... xxxi
2.Nội dung bài thực hành ........................................................................xxxii
2.1 Phương tiện và phương pháp......................................................... xxxii
2.1.2 Hóa chất, dụng cụ, thiết bị .................................................... xxxii
2.1.2 Tiến trình thí nghiệm ............................................................ xxxii

3.Kết quả và thảo luận .............................................................................xxxii
Bài 5: Định lượng Vitamin C bằng phương pháp Muri ..................................xxxv
1.Cơ sở lý thuyết.......................................................................................xxxv
1.1 Vitamin C........................................................................................ xxxv
1.2 Nguyên tắc thí nghiệm................................................................... xxxvi
2. Nội dung bài thực hành......................................................................xxxvii
2.1 Phương tiện, phương pháp........................................................... xxxvii
2.1.1 Mẫu vật ................................................................................ xxxvii
2.1.2 Hóa chất, dụng cụ, thiết bị .................................................. xxxvii
2.1.3 Tiến trình thí nghiệm .......................................................... xxxvii
3. Kết quả và thảo luận ...........................................................................xxxix
PHẦN III: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................ xlii

1. Kết luận .................................................................................................. xlii
v


2. Đề nghị.................................................................................................... xlii
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................. xliii
PHỤ LỤC.........................................................................................................xlv

vi


DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1: Giá trị OD sau 3 lần thực hiện thí nghiệm xác định hoạt tính amylase .. 19
Bảng 2: Giá trị OD và khả năng chống oxy hóa trung bình của trolox .............. 23
Bảng 3: Thể tích 2,6 diclorophenol indophenol (ml) sau các lần định phân ....... 29
Bảng 4: Khối lượng vitamin C có trong mẫu vật ............................................... 29

vii


DANH SÁCH HÌNH
Hình 1. Cấu trúc glycogen ................................................................................xiii
Hình 2. Cấu trúc glycogen và amylopectin .......................................................xiii
Hình 3: Phản ứng màu của glycogen với iod..................................................... xvi
Hình 4: Màu phản ứng Fehling của glycogen.................................................... xvi
Hình 5: Màu phản ứng Fehling của dịch thủy phân glycogen........................... xvii
Hình 6: Công thức cấu tạo của lecithin ............................................................. xix
Hình 7: Phản ứng thủy phân lecithin................................................................xxii
Hình 8: Giọt mỡ trên bề mặt dung dịch thủy phân lecithin. ..............................xxii
Hình 9: Tinh thể choline periodide dưới kính hiển vi (vật kính E20)...............xxiii

Hình 10: Phản ứng tạo acrolein của glycerol trong dịch thủy phân lecithin (bên
trái), và glycerol nguyên chất (bên phải). ........................................................ xxiv
Hình 11: Phương trình phản ứng giữa phosphoric acid ................................... xxiv
Hình 12: Cấu trúc phân tử của trolox (a) và -tocopherol (b) ......................... xxxi
Hình 13: Độ hấp thụ quang phổ trong thí nghiệm .........................................xxxiii
Hình 14: Khả năng làm sạch DPPH của trolox ở các nồng độ được đo ở bước
sóng 517nm .................................................................................................. xxxiv
Hình 15: Dạng gốc tự do (1) và dạng sau khi phản ứng (2) của DPPH........... xxxv
Hình 16: Dạng khử và oxy hóa của vitamin C (acid ascorbic)....................... xxxvi
Hình 17: Phản ứng oxy hóa khử giữa ascorbic acid và 2,6 DCIP .......................xli

viii


DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
OD: optical density
ROS: reactive oxygen species
RNS: reactive nitrogen species
RSS: reactive sulfua species
DNA: Deoxyribonucleic acid
RNA: Ribonucleic acid
DPPH: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl
Trolox: 6-hydroxy- 2, 5, 7, 8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid
DPPH-H: diphenyl-picrylhydrazine
DCIP: 2,6-diclorophenol indophenol

ix


TÓM TẮT

Hóa sinh học là môn học nghiên cứu về sự sống dưới gốc độ phân tử, đóng
vai trò quan trọng trong việc cung cấp kiến thức nền tảng cho sinh viên về lĩnh
vực hóa sinh, môn thực tập hóa sinh không những giúp cũng cố kiến thức mà còn
rèn luyện cho sinh viên kỹ năng thực hành và hướng đến nghiên cứu khoa học
sau này. Đề tài tập trung thực hiện các thí nghiệm trong giáo trình thực tập hóa
sinh học (TN364) nhằm hoàn thiện giáo trình hơn. Có 5 bài thí nghiệm đã được
thực hiện, thuộc các mảng kiến thức về carbohydrate, lipid, enzyme, vitamin và
phản ứng oxy hóa khử.

x


PHẦN I: GIỚI THIỆU
Hóa sinh học là một môn học nghiên cứu về sự sống dưới gốc độ phân tử.
Mục tiêu của môn học là nghiên cứu, tìm hiểu thành phần, cấu tạo, chức năng và
bản chất hóa học của các chất và các quá trình chuyển hóa trong cơ thể sống.
Môn Thực tập hóa sinh học được giảng dạy giúp sinh viên củng cố phần
kiến thức lý thuyết đã được học và nắm vững các phương pháp nghiên cứu cơ
bản trong phòng thí nghiệm hóa sinh, qua đó giúp sinh viên bước đầu tiếp cận
các kỹ thuật cơ bản và áp dụng để thực hiện một đề tài nghiên cứu hoàn chỉnh
hay áp dụng vào thực tiễn trong một số lĩnh vực có liên quan.
Từ học kì 1 năm học 2011-2012 bộ môn Sinh học thuộc Khoa Khoa Học Tự
Nhiên bắt đầu giảng dạy môn Thực tập hóa sinh học, tuy nhiên giáo trình chưa
được hoàn chỉnh. Do đó, việc “Thực hiện các thí nghiệm trong giáo trình thực
tập hóa sinh học (TN364)” để hoàn thiện giáo trình là rất cần thiết nhằm đạt được
chất lượng tốt nhất trong giảng dạy.
Nội dung giáo trình vẫn đi vào tìm hiểu những hợp chất quan trọng của tế
bào và cơ thể sống như carbohydrate, lipid, protein, vitamin.
Nội dung nghiên cứu của đề tài bao gồm việc thực hiện những thí nghiệm
thuộc các bài:

- Carbohydrate: chiết xuất glycogen từ động vật và xác định thành phần cấu tạo.
- Lipid: chiết xuất lecithin từ lòng đỏ trứng và xác định thành phần cấu tạo.
- Xác định hoạt tính của enzyme amylase: trích và tinh khiết hóa amylase mầm
lúa và xác định hoạt tính.
- Phản ứng oxy hóa - khử: khảo sát khả năng chống oxy hóa của trolox.
- Định lượng vitamin C bằng phương pháp Muri.

xi


PHẦN II: NỘI DUNG
Nội dung của nghiên cứu bao gồm 5 đơn vị bài, lần lượt được trình bày sau
đây:
Bài 1: Carbohydrate
1. Cơ sở lí thuyết
1.1 Carbohydrate
Carbohydrate là nhóm chất hữu cơ phổ biến khá rộng rãi trong cơ thể sinh
vật. Carbohydrate có nhiều vai trò quan trọng trong cơ thể sống như cung cấp
năng lượng cho cơ thể, cấu trúc tạo hình (cellulose, peptidoglycan,...), bảo vệ
(mucosaccharide), góp phần đảm bảo tương tác đặc hiệu của tế bào
(polysaccharide trên mạng tế bào hồng cầu, thành tế bào một số vi sinh vật,...)
(Phạm Thị Trân Châu et al., 2010).
Thông thường người ta chia carbohydrate thành 2 nhóm lớn là
monosaccharide và polysaccharide (bao gồm từ 2 gốc monosaccharide trở lên).
Một trong những polysaccharide quan trọng được biết đến nhiều đó là
glycogen.
1.2 Glycogen
Glycogen là một polysaccharide phân nhánh, tương tự như amylopectin, là
polymer của các -D-Glucopyranose, kết hợp với nhau qua liên kết (14)
glycoside, liên kết (16) glycoside ở điểm phân nhánh, nhưng mức độ phân

nhánh nhiều hơn amylopectin ở khoảng cách 8 - 12 gốc (Phạm Thị Trân Châu et
al., 2010).

xii


CH2OH
O
1

Liên kết (16) glycoside
O

O

CH2OH

6 CH2

O

O
1

4

O

O

O

Liên kết (14) glycoside

Hình 1. Cấu trúc glycogen

Hình 2. Cấu trúc glycogen và amylopectin
Nguồn: Phạm Thị Trân Châu et al., (2010)
Vai trò của glycogen trong cơ thể là dự trữ năng lượng, glycogen giúp dự
trữ glucose cho cơ thể, khi đói hàm lượng glycogen giảm nhanh chóng, có thể bị
sử dụng toàn bộ, nhưng cũng có thể nhanh chóng được tổng hợp lại từ các
carbohydrate mới được hấp thụ vào.
Glycogen có trong hầu hết các tế bào động vật và có trong một số nguyên
sinh động vật và tảo. Ở người và các động vật có xương sống khác, glycogen tập
trung chủ yếu trong gan, trong tế bào mô cơ (Phạm Thị Trân Châu et al., 2010).
Do đó, trong thí nghiệm này gan động vật được chọn làm nguyên liệu để chiết
xuất glycogen.

xiii


1.3 Nguyên tắc thí nghiệm
Nguyên tắc của thí nghiệm chiết xuất glycogen là sau khi phá hủy mô gan
hoặc cơ bằng môi trường kiềm mạnh và nhiệt độ cao, glycogen sẽ được giải
phóng. Sau khi được kết tủa bằng alcol ở nhiệt độ lạnh, glycogen được hòa tan
bằng nước cất nóng 60 (Nguyễn Nghiêm Luật, 2003).
Trong thí nghiệm này kali hydroxide (KOH) được sử dụng như là yếu tố
kiềm mạnh để phá hủy mô gan, phù hợp với điều kiện sẵn có của phòng thí
nghiệm. Hóa chất này cũng đã được sử dụng nhiều để chiết xuất glycogen trong
một số nghiên cứu Nutter (1940), Seifter et al. (1949), Aklujkar et al. (2008)...

2. Nội dung bài thực hành
2.1 Phương tiện, phương pháp thí nghiệm
2.1.1 Mẫu vật
Gan heo tươi
2.1.2 Hóa chất, dụng cụ, thiết bị
Hóa chất:

Dụng cụ, thiết bị:

Kali hydroxide 30%

Cối, chày sứ

Sodium sulphate bão hòa

Đèn cồn

Ethanol 96

Máy ly tâm

Acid sunfuric 5N

Bếp, cân phân tích

Dung dịch Lugol

Ống nghiệm, giá ống nghiệm

Các thành phần thuốc thử Fehling

Cốc thủy tinh, kẹp ống nghiệm

Natri hydroxide 5N

Micropipette

2.2 Tiến trình thí nghiệm
2.2.1 Chiết xuất glycogen
Gan tươi được cân bằng cân phân tích vừa đủ 4 g, được nghiền nhuyễn
trong cối sứ và được cho vào ống nghiệm. Sau khi 6 ml dung dịch KOH 30%
được thêm vào, hỗn hợp được đun sôi trên ngọn lửa đèn cồn, vừa đun vừa lắc cho
đến khi tổ chức gan tan hết trong dung dịch KOH, các bước này nhằm tạo môi
trường kiềm và nhiệt độ cao để glycogen được giải phóng. Sau khi được làm lạnh
trong nước đá 10 phút, hỗn hợp tiếp tục được thêm vào 0,4 ml dung dịch Na2SO4
bão hòa và lắc đều có vai trò tăng hiệu suất của quá trình tủa glycogen. Hỗn hợp
xiv


sau đó được cho thêm 10 ml ethanol 96, lắc đều và được đặt trong nước đá 5
phút nhằm tạo điều kiện tủa glycogen. Sau khi ly tâm (3000 vòng/phút trong 5
phút), phần tủa được sử dụng. Tủa được rửa bằng cách cho vào 6 ml ethanol 96,
sau đó ly tâm lại. Việc rửa tủa được lặp lại lần 2. Cuối cùng phần tủa glycogen
được hòa tan bằng 6 ml nước cất nóng 60C. Quy trình này dựa theo tài liệu của
Nguyễn Nghiêm Luật (2003) và đã được điều chỉnh để phù hợp với điều kiện
phòng thí nghiệm.
2.2.2 Kiểm tra dịch glycogen chiết xuất và xác định thành phần cấu tạo
Dịch glycogen sau khi chiết ra được kiểm tra và xác định thành phần cấu tạo
bằng những thí nghiệm được trình bày như sau:
- Phản ứng với iod: 10 giọt dịch glycogen chiết xuất cùng với 1 giọt dung dịch

H2SO4 5N được cho vào ống nghiệm, lắc đều, thêm 2 giọt dung dịch Lugol và lắc
đều.
- Phản ứng Fehling: 1 ml thuốc thử Fehling, 10 giọt dịch glycogen chiết xuất
được cho vào ống nghiệm, lắc đều. Sau đó đun sôi cách thủy trong 5 phút.
- Xác định thành phần cấu tạo: 1,5 ml dịch glycogen chiết xuất và 1,5 ml dung
dịch H2SO4 5N được cho vào ống nghiệm. Sau khi được lắc đều và đun sôi cách
thủy trong 30 phút dịch thủy phân được trung hòa bằng NaOH 5N.
Thuốc thử Fehling 1 ml và dịch thủy phân đã trung hòa 20 giọt được cho
vào ống nghiệm. Sau đó được lắc đều và đun sôi trên đèn cồn trong 5 phút.
3. Kết quả và thảo luận
- Phản ứng với iod
Lugol là dung dịch có chứa iod thường được dùng làm thuốc thử định tính
các polysaccharide. Cách pha dung dịch Lugol được trình bày ở phần phụ lục
(trang 34).
Sau khi cho tác dụng với dung dịch Lugol dịch glycogen được chiết ra cho
màu đỏ nâu (Hình 3).
Ở nhiệt độ bình thường, các polysaccharide kết hợp với iod tạo ra các màu
khác nhau tùy thuộc vào mức độ phân nhánh và trọng lượng phân tử của chúng
(Nguyễn Nghiêm Luật, 2003). Trong khi tinh bột cho màu xanh với iod thì
glycogen khi kết hợp với iod cho màu đỏ nâu (Phạm Thị Trân Châu et al., 2010).
xv


Hình 3: Phản ứng màu của glycogen với iod
- Phản ứng Fehling
Do glycogen là một polysacharide không có tính khử nên sẽ không cho
phản ứng với thuốc thử Fehling. Màu của dung dịch vẫn là màu của thuốc thử
Fehling (Hình 4).

Hình 4: Màu phản ứng Fehling của glycogen

- Xác định thành phần cấu tạo
Dung dịch glycogen tinh khiết không có tính khử, nhưng sau khi thủy phân
tạo thành các thành phần có tính khử. Trong môi trường acid, dưới tác dụng của
nhiệt độ, các liên kết glycoside trong phân tử polysacchride bị thủy phân, làm
cho phân tử polysaccharide bị phân tách nhỏ dần và khi quá trình thủy phân hoàn
thành, phân tử polysaccharide bị thủy phân hoàn toàn thành các thành phần cấu
tạo nên chúng là glucose (Nguyễn Nghiêm Luật, 2003). Do đó, dịch thủy phân
glycogen cho phản ứng với thuốc thử Fehling, dung dịch có màu đỏ gạch đặc
trưng của kết tủa oxid đồng (I), Cu2O (Hình 5).

xvi


Thuốc thử Fehling là hỗn hợp (1:1) của hai dung dịch: dung dịch đồng
sulfate gọi là Fehling A và dung dịch kiềm của muối Seignette (kali natri tartrate)
gọi là Fehling B.
Khi trộn hai dung dịch Fehling lại với nhau thì xảy ra phản ứng gồm hai giai
đoạn. Đầu tiên tạo thành kết tủa đồng hydroxide [Cu(OH)2] màu xanh da trời:
CuSO4 + 2NaOH  Cu(OH)2 + Na2SO4
Sau đó Cu(OH)2 tác dụng với muối kali natri tartrate tạo thành muối phức
hòa tan, dung dịch có màu xanh thẵm.
O CH COONa

HO CH COONa
Cu(OH)2

Cu

+

2 H2O

O CH COOK

HO CH COOK
Đồng hydroxide

+

Đồng tartrate

Kali natri tartrate

Muối phức trên là hợp chất không bền. Các đường có chứa nhóm aldehyde
hoặc cetone dễ dàng khử Cu2+ thành Cu+ tạo ra kết tủa oxid đồng (I) màu đỏ gạch
và đường bị oxy hóa khi tác dụng với dung dịch Fehling (Nguyễn Văn Mùi,
2001).
CHO

O CH

(CHOH)4 + 2Cu
CH2OH

Glucose

COOH

COONa
+ 2H2O

(CHOH)4

O CH COOK

Đồng tartrate

CH2OH

Acid gluconic

HO CH

COONa
+Cu2O

+ 2
HO CH COOK

Oxid đồng (I)

Hình 5: Màu phản ứng Fehling của dịch thủy phân glycogen

xvii


Bài 2: Lipid
1. Cơ sở lý thuyết
1.1 Sơ lược về lipid
Lipid là hợp chất hữu cơ phổ biến trong tự nhiên và trong cơ thể động vật,

thực vật và vi sinh vật. Lipid có đặc tính không hoà tan trong nước, chỉ hoà tan
trong các dung môi hữu cơ như chloroform, benzen, cồn, acetone...nhưng không
phải mọi lipid đều hoà tan như nhau trong tất cả các dung môi nói trên, mà mỗi
lipid hoà tan trong dung môi tương ứng của mình, nhờ đặc tính này người ta có
thể phân tích riêng từng loại. Về mặt hoá học lipid là những este giữa alcol và
acid béo (Trần Tố et al., 2008).
Lipid đối với cơ thể sinh vật có nhiều chức năng quan trọng như: Dự trữ
năng lượng, cấu tạo màng tế bào, là dung môi hoà tan vitamin, bảo vệ cơ học,..
Dựa vào thành phần hoá học người ta chia lipid ra làm 2 lớp:
- Lớp lipid đơn giản: là những este của alcol và acid béo.
- Lớp lipid phức tạp: ngoài alcol và acid béo còn có chứa các dẫn xuất phospho,
azot, sulfua... Một lipid phức tạp quan trọng và phổ biến là lecithin (Trần Tố et
al., 2008).
1.2 Lecithin
Lecithin còn được gọi là phosphatidylcholine, là một diester của acid
phosphoric. Một phía acid phosphoric liên kết với glycerol, phía kia liên kết với
cholin, có công thức cấu tạo được trình bày trong Hình 6 (Đỗ Quý Hai et al.,
2004).

xviii


H3C
H

O

O
O

H3C

O
P
H3C
H3C

CH3

O O O

N

Hình 6: Công thức cấu tạo của lecithin
Qua cấu tạo ta nhận thấy lecithin gồm 2 phần:
- Phần phân cực bao gồm acid phosphoric và base nitrogen ưa nước.
- Phần không phân cực bao gồm các gốc acid béo, glycerol kị nước.
Lecithin có mặt phổ biến trong tế bào sống, đặc biệt là trong lòng đỏ, trong
hồng cầu, tinh trùng,...(Nguyễn Quang Vinh et al., 2007).
Cơ thể động vật phần nhiều chứa α - lecithin. Khi phân lập ra, lecithin là
chất kết tinh trắng, thể sáp, ra ngoài không khí dễ hoá sẫm vì acid béo không bão
hoà bị oxy hoá (Trần Tố et al., 2008).
Về mặt ứng dụng, lecithin được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực
phẩm như sản xuất chocolate, maragin đóng vai trò là chất chống oxy hóa (Trần
Tố et al., 2008).
1.3 Nguyên tắc thí nghiệm
Lecithin hòa tan tốt trong ethanol nóng nhưng không tan trong acetone. Vì
vậy dễ nhận được lecithin khi dùng ethanol nóng để chiết lecithin khỏi nguyên
liệu, kết tủa lecithin bằng acetone (Nguyễn Quang Vinh et al., 2007).
Lòng đỏ trứng là một nguồn phong phú phospholipid, chiếm khoảng 10%

trọng lượng tươi của lòng đỏ trứng, tương đương với khoảng 22% tổng chất rắn
của lòng đỏ trứng gà (Palacios et al., 2005).
Hai thành phần chính của lecithin lòng đỏ trứng là phosphatidylcholine
(80,5%) và phosphatidylethanolamine (11,7%) (Palacios et al., 2005). Lecithin
xix


lòng đỏ trứng cũng chứa một lượng nhỏ lysophosphatidylcholine, sphingomyelin,
và các chất béo trung tính. Theo một số tài liệu, lecithin lòng đỏ trứng chủ yếu
được chiết xuất bằng các dung môi như diethyl ether, hexane, chloroform, và
ethanol. Tuy nhiên, một trong số các dung môi này ảnh hưởng đến vấn đề sức
khỏe và môi trường. Ethanol là dung môi được sử dụng nhiều vì phù hợp với
điều kiện phòng thí nghiệm thông thường (Palacios et al., 2005).
2. Nội dung bài thực hành
2.1 Phương tiện, phương pháp
2.1.1 Mẫu vật
Trứng gà
2.1.2 Hóa chất, dụng cụ, thiết bị
Hóa chất:

Dụng cụ, thiết bị:

Acetone

Bếp, cân phân tích

Acid nitric đặc

Đèn cồn

Acid sunfuric 10%

Cốc thủy tinh

Amoni molypdate

Đũa thủy tinh

Ethanol 95

Giấy lọc, phiễu lọc

Dung dịch Lugol

Ống nghiệm

Glycerol

Ống hút có chia độ

Natri hydroxide 10%

Ống nhỏ giọt

Kali hydrogen sulfate

Kẹp ống nghiệm

Các thành phần thuốc thử Fehling

Kính hiển vi, lame kính

2.2 Tiến trình thí nghiệm
2.2.1 Chiết xuất lecithin
Để bắt đầu thí nghiệm, một lòng đỏ trứng và 40 ml ethanol 95 nóng được
cho vào cốc thủy tinh và khuấy đều bằng đũa thủy tinh trong 5-10 phút. Lecithin
và các lipid khác tan trong ethanol còn protein sẽ bị kết tủa. Sau đó, hỗn hợp
được lọc qua giấy lọc và dịch lọc được cô lại trên bếp điện, để ethanol được bốc
hơi cho đến khi dịch sánh lại. Tiếp theo đó, 10 ml acetone được thêm vào để kết
tủa lecithin vì lecithin không tan trong acetone còn các lipid khác tan. Tủa được
gạn lấy và hòa tan trong 20 ml ethanol nóng, ta được dung dịch lecithin.
xx


2.2.2 Xác định thành phần cấu tạo
Hỗn hợp gồm 1,5 ml dịch chiết lecithin và 1,5 ml H2SO4 10% được cho vào
ống nghiệm. Sau đó, đun sôi cách thủy trong 20 phút, ta được dịch thủy phân
lecithin.
- Nhận biết choline
Trung hòa 4 giọt dịch thủy phân lecithin với 4 giọt NaOH 10%. Nhỏ 1 giọt
dung dịch đã trung hòa trên lên một miếng kính mang vật; sau đó, thêm 1 giọt
dung dịch iod, đậy kính đậy vật lại và quan sát dưới kính hiển vi quang học (vật
kính E20).
- Nhận biết acrolein bằng mùi mỡ cháy
Mười giọt dịch thủy phân lecithin được cho vào ống nghiệm và đun sôi cách
thủy để bốc hơi dung dịch. Ống đối chứng được thực hiện tương tự bằng cách
thay dung dịch thủy phân lecithin bằng 4 giọt glycerol chuẩn. Sau đó, 200 mg
kali hydrogen sulfate (KHSO4) được cho vào ống nghiệm và đun đến khi có khói
trắng bốc lên.
- Nhận biết acid phosphoric

Dịch thủy phân lecithin 10 giọt và dung dịch molypden 3 giọt được cho vào
ống nghiệm và đun trên ngọn lửa đèn cồn.
3. Kết quả và thảo luận
Lecithin có thể bị thuỷ phân bằng acid, kiềm hay enzyme. Khi thuỷ phân
lecithin bằng acid tất cả liên kết ester đều bị cắt đứt. Khi thuỷ phân lecithin bằng
kiềm sản phẩm tạo ra gồm acid béo ở dạng muối, glycerophosphate và choline;
nhưng choline bị phân hủy để cho trimetylamin. Với kiềm nhẹ chỉ có thể cắt liên
kết ester giữa rượu và acid béo. Lecithin bị thuỷ phân bằng enzyme lecithinase
tác động lên các liên kết ester khác nhau phụ thuộc vào 4 loại enzyme lecithinase
A, B, C hoặc D (Đỗ Quý Hai et al., 2004).
Lecithin sau khi được thủy phân bằng H2SO4 sẽ cho ra các thành phần:
choline, acid phosphoric, acid béo và glycerol (Nguyễn Nghiêm Luật, 2003).
Phản ứng thủy phân lecithin bằng H2SO4 được trình bày trong Hình 7.

xxi


Choline
Acid phosphoric
Acid béo

Glycerol
Lecithin

Hình 7: Phản ứng thủy phân lecithin
Sau khi dung dịch thủy phân lecithin nguội, trên bề mặt xuất hiện những
giọt mỡ, điều này cho thấy trong thành phần lecithin có chứa acid béo. Theo Trần
Tố et al., (2008), các acid béo thường gặp trong lecithin lòng đỏ trứng là
palmitic, oleic, linoleic, arachidic...

Giọt mỡ

Hình 8: Giọt mỡ trên bề mặt dung dịch thủy phân lecithin.
- Nhận biết Choline
Trong thí nghiệm nhận biết choline, dưới kính hiển vi ta thấy có tinh thể
dạng mãnh cắt màu nâu, đó là tinh thể choline periodide (Hình 9). Điều này
chứng tỏ trong dịch thủy phân có chứa choline (Nguyễn Nghiêm Luật, 2003).

xxii


Hình 9: Tinh thể choline periodide dưới kính hiển vi (vật kính E20)
- Nhận biết glycerol
Khi đun nóng với chất khử nước, gốc glycerol trong phân tử lecithin chuyển
thành glycerol tự do. Sau đó glycerol bị mất nước và tạo thành aldehyde không
no là aldehyde acrilic (acrolein), chất này có mùi khét đặc trưng, dễ nhận biết
(Nguyễn Quang Vinh et al., 2007).
CH2OH
CHOH

CHO
KHSO4

CH

to

CH2OH

CH2

Glycerol

Acrolein

+

H2O

Phản ứng mất nước của glycerol xảy ra khi đun lipid với kali hydrogen
sulfate (KHSO4) hay natri hydrogen sulfate (NaHSO4) có tác dụng lấy nước.
Những lipid không chứa glycerol thì sẽ không có phản ứng tạo thành acrolein
(Nguyễn Quang Vinh et al., 2007).
Ở thí nghiệm này, sau khi đun, ống đối chứng xuất hiện hợp chất màu nâu,
hiện tượng xảy ra tương tự với ống chứa dịch thủy phân lecithin, sau khi đun với
KHSO4, glycerol được tạo ra sau đó sẽ bị mất 2 phân tử H2O, biến thành acrolein.
Sau khi có khói trắng bốc lên, phản ứng tạo nên chất có màu nâu được nhận biết
bằng mùi khét đặc trưng, đó chính là acrolein (Nguyễn Quang Vinh et al., 2007).
Điều này chứng tỏ thành phần lecithin có chứa gốc glycerol (Hình 10).

xxiii


Hình 10: Phản ứng tạo acrolein của glycerol trong dịch thủy phân
lecithin (bên trái), và glycerol nguyên chất (bên phải).
- Nhận biết acid phosphoric:
Theo Nguyễn Nghiêm Luật (2003), H3PO4 tác dụng với ammonium
molypdate và acid nitric sẽ tạo thành ammonium phosphomolypdate có màu
vàng chanh.
Ở thí nghiệm nhận biết phosphoric acid, sau khi dịch thủy phân lecithin

được đun với dung dịch molypden, dung dịch dần dần chuyển sang màu vàng
chanh. Phản ứng này được thể hiện bằng phương trình ở Hình 11.

Amonium
molypdate

Ammonium
phosphomolypdate

Hình 11: Phương trình phản ứng giữa phosphoric acid
và ammonium molypdate

xxiv