Đánh giá đa dạng di truyền vi khuẩn streptomyces sp gây bệnh ghẻ củ khoai tây thu thập từ miền bắc việt nam

Bộ giáo dục và đào tạo
trờng đại học nông nghiệp hà nội
------------------

Nguyễn thị thủy

NH GI A DNG DI TRUYN VI KHUN
Streptomyces sp. GY BNH GH C KHOAI TY
THU THP T MIN BC VIT NAM

luận văn thạc sĩ nông nghiệp

Chuyên ngành

: CÔNG NGHệ SINH HọC

Mã số

: 60.42.80

Ngời hớng dẫn khoa học : ts. NGUYễN THị PHƯƠNG THảO

Hà Nội - 2012


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết quả
trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa từng công bố trong bất kỳ công
trình nào
Hà Nội, ngày 16 tháng 4 năm 2012
Học Viên

Nguyễn Thị Thủy

Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

i


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập, thực hiện luận văn tốt nghiệp, tôi đã nhận được
sự giúp đỡ tận tình của các đoàn thể, cá nhân trong và ngoài trường.
Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô giáo
TS. Nguyễn Thị Phương Thảo, giảng viên Bộ môn CNSHTV, Khoa Công nghệ
sinh học- Trường Đại học nông nghiệp Hà Nội là người đã hướng dẫn và tận
tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập và hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong Khoa Công nghệ sinh
học, các thầy cô giáo; cán bộ nghiên cứu của bộ môn CNSH Thực Vật, trường
ĐH Nông nghiệp Hà Nội đã tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn
tốt nghiệp.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới TS. Hà Viết CườngTrung tâm bệnh cây nhiệt đới, các cán bộ Viện Sinh học Nông nghiệp, GS.
Wanner- Trung tâm khoa học cây trồng Mỹ đã phối hợp, tư vấn, giúp đỡ tôi
trong thời gian thực tập tốt nghiệp.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, bạn bè luôn bên cạnh động viên,
giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực tập tốt nghiệp.
Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 16 tháng 4 năm 2012
Học Viên

Nguyễn Thị Thủy

Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

ii


MỤC LỤC
I. MỞ ĐẦU............................................................................................................ 1
1.1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................. 1
1.2. Mục đích, yêu cầu .......................................................................................... 2
1.2.1. Mục đích:..................................................................................................... 2
1.2.2. Yêu cầu:....................................................................................................... 2
1.3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn........................................................... 2
1.3.1. Ý nghĩa khoa học: ....................................................................................... 2
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn:........................................................................................ 3
II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................................. 4
2.1. Giới thiệu chung về bệnh ghẻ thường khoai tây ............................................ 4
2.1.1. Triệu chứng ................................................................................................. 4
2.1.2. Nguyên nhân gây bệnh và đặc điểm phát sinh............................................ 4
2.1.3. Đặc điểm của tác nhân gây bệnh................................................................ 5
2.1.4. Tương tác giữa tác nhân gây bệnh và kí chủ .............................................. 6
2.1.5. Biện pháp phòng trừ.................................................................................... 6
2.2. Cơ sở phân tử của tính gây bệnh và đa dạng di truyền của các chủng
Streptomyces spp gây bệnh ghẻ thường củ khoai tây........................................... 8
2.2.1. Cơ sở phân tử của tính gây bệnh................................................................. 8
2.2.2. Đa dạng di truyền của các chủng Streptomyces gây bệnh ghẻ thường củ
khoai tây .............................................................................................................. 11
III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................... 17
3.1. Vật liệu ......................................................................................................... 17
3.2. Phương pháp nghiên cứu............................................................................. 17
3.2.1. Phương pháp phân lập - làm thuần (Loria, 1988) ..................................... 17

3.2.2. Phương pháp đánh giá đặc điểm hình thái, sinh hoá: được tiến hành theo
phương pháp của Wanner (2006), Loria và Davis 1988..................................... 17
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

iii


3.2.3. Phương pháp đánh giá độc tính gây hại (Wanner, 2006).......................... 19
3.2.4. Phương pháp chiết tách DNA (Miniprep of bacteria genomic DNA
(molecular Cell Physiology, 2002) ..................................................................... 20
3.2.5. Phương pháp xác định các gen liên quan đến quá trình gây bệnh, định loài
các isolate và giải trình tự 16s rRNA. ................................................................. 21
IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 25
4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Streptomyces từ củ khoai tây bị bệnh ghẻ thường .. 25
4.2. Đặc điểm hình thái của các chủng phân lập................................................. 25
4.3. Đặc điểm nuôi cấy của các isolate phân lập................................................. 30
4.4. Khả năng tiết sắc tố của các isolate phân lập được khi nuôi trên môi trường ISP6. 35
4.5. Kết quả phân nhóm các isolate phân lập được............................................. 38
4.6. Đặc trưng phân tử của các isolate phân lập được ....................................... 42
4.6.1. Định loài một số chủng phân lập được ..................................................... 43
4.6.2. Kết quả giải trình tự 16s rRNA của các chủng phân lập được ................. 46
4.6.3. Kiểm tra sự có mặt của các gen liên quan đến quá trình lây bệnh ở các
isolate phân lập được........................................................................................... 51
4.7. Kết quả lây nhiễm nhân tạo.......................................................................... 55
IV. KẾT LUẬN.................................................................................................. 59
V. ĐỀ NGHỊ....................................................................................................... 61
Tài liệu tham khảo............................................................................................... 62

Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

iv


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. Thành phần phản ứng PCR cho kiểm tra các gen gây bệnh và định loài
các isolate phân lập. ............................................................................................ 21
Bảng 2. Thành phần phản ứng PCR cho nhân dòng gen 16s rRNA................... 23
Bảng 3. Trình tự các cặp mồi đặc trưng các gen trên PAI và các đoạn trên rRNA . 23
Bảng 4: Đặc điểm hình thái, hệ khuẩn ty của các isolate trên môi trường ISP2 26
Bảng 5: Đặc điểm hình thái các isolates trên môi trường ISP3................................. 31
Bảng 6: Đặc điểm hình thái các isolate trên môi trường ISP4 .................................. 33
Bảng 7: Khả năng tiết sắc tố của các isolate trên môi trường ISP6.................... 35
Bảng 8: Đặc điểm hình thái của các nhóm khi nuôi cấy trên môi trường ISP2.. 39
Bảng 9: Kết quả định loài và kết quả kiểm tra các gen thuộc đảo gây bệnh của
12 isolate phân lập được...................................................................................... 43

Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

v


DANH MỤC HÌNH
Hình 1: Hình thái khuẩn lạc và hệ khuẩn ty của Streptomyces spp...................... 6
Hình 2: Sơ đồ các gen thuộc đảo gây bệnh của S. turgidiscabies....................... 10
Hình 3: Các vùng biến động trên trình tự 16s rRNA của các chủng Streptomyces
gây bệnh ghẻ thường củ khoai tây (Wanner, 2006) ............................................ 14
Hình 3: Khuẩn lạc vi khuẩn Streptomyces trên môi trường thạch nước ........... 25
Hình 4: Khả năng tiết sắc tố của các isolate phân lập được khi nuôi trên môi
trường ISP6 ......................................................................................................... 37
Hình 5: Hình thái, bào tử của các nhóm phân lập được khi nuôi trên ................ 42

môi trường ISP2 .................................................................................................. 42
Hình 7: Kết quả nhân gen 16s RNA với cặp mồi 16sF1 và 16sR1 .................... 46
Hình 8: Kết quả nhân dòng 16s rRNA với cặp mồi 16sF1 và 16sR1................. 47
Hình 9: Kết quả kiểm tra sự có mặt gen TomA ở các isolate phân lập được, sử
dụng cặp mồi Tom3, Tom4. ................................................................................ 54
Hình 10: Kết quả kiểm tra gen sự có mặt gen TxtAB ở các isolate phân lập
được, sử dụng cặp mồi (TxtABF1, TxtABR1). .................................................. 55
Hình 11: Kết quả kiểm tra sự có mặt gen Nec1 ở các isolate phân lập được, sử
dụng cặp mồi (Nf, Nr). ........................................................................................ 55
Hình 12: Triệu trứng biểu hiện bệnh trên củ khoai tây sau 4 tháng lây nhiễm... 58

Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

vi


DANH MỤC CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT
ĐC (đối chứng).
ISP (international scab project): dự án nghiên cứu bệnh ghẻ quốc tế
Lad (ladder): Thang chuẩn
NST: nhiễm sắc thể
PAI (pathogenicity island): đảo gây bệnh
PYI (pepton yeast extract iron): môi trường pepton iron
WA (water agar): môi trường thạch nước
YME (yeast malt extract): môi trường cao mạch và cao nấm men

Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

vii

I. MỞ ĐẦU
1.1. Tính cấp thiết của đề tài
Bệnh ghẻ thường khoai tây do vi khuẩn gram dương sống trong đất thuộc
chi Streptomyces gây nên, là một trong những bệnh hại nghiêm trọng xuất hiện ở
tất cả các vùng trồng khoai tây trên thế giới bao gồm: Mỹ, Ấn Độ, Châu Á,
Châu Phi (Wanner, 2006). Ở Mỹ, bệnh ghẻ là bệnh hại nghiêm trọng thứ 4 trên
cây khoai tây (Hao và cộng sự, 2009). Bệnh cũng ảnh hưởng đến các cây trồng
có củ khác bao gồm, củ cải, cà rốt và khoai lang (Hill và Lazarovits, 2005).
Mức độ gây hại của bệnh ghẻ trên củ khoai tây biến động theo từng vùng,
từng năm do kết quả tác động giữa môi trường, kiểu gen và tác nhân gây bệnh
(Wanner, 2006). Trên củ khoai tây, các triệu chứng ghẻ thường biến động từ
đốm nâu nổi trên vỏ củ đến hố đen tối kéo dài vài milimet vào thịt củ khoai tây.
Các tổn thương có thể nhỏ và rời rạc, hoặc có thể kết lại phủ rộng trên bề mặt
của củ. Do đó bệnh phá hủy hình dạng, chất lượng và giá trị thương mại của củ
khoai tây, ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả kinh tế (Hao và cộng sự, 2009).
Trên thế giới, Streptomyces gây bệnh ghẻ củ khoai tây đã được phân loại
dựa trên mô tả đặc điểm hình thái các chủng phân lập từ mô bị bệnh kết hợp với
kiểm tra sự có mặt của các gen gây bệnh và giải trình tự 16s rRNA. Có 4 nhóm
loài gây bệnh lớn ở bắc Mỹ: S. scabies, S. acidiscabies, S. europaeiscabiei, và
S. stelliscabiei (Bouchek và cộng sự (2000); Healy và cộng sự (1991), Lambert
và Loria (1989). Nghiên cứu bệnh ghẻ trên khoai tây Pasco và cộng sự (2005)
cho rằng, có ít nhất 3 loài gây bệnh ghẻ củ khoai tây ở châu Âu: S. scabies, S.
europaeiscabies và S. stelliscabies.
Trong khi đó, ở Việt Nam, bệnh ghẻ khoai tây xảy ra ở tất cả các vùng
trồng khoai tây trên cả nước. Các nghiên cứu về bệnh ghẻ khoai tây chủ yếu tập
trung vào đánh giá tính mẫn cảm đối với bệnh, nguyên nhân phát sinh bệnh trên
đồng ruộng (Dang Thi Dung và cộng sự, 2003) mà chưa có một công trình
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

1


nghiên cứu nào về thành phần loài gây bệnh cũng như các đặc trưng hình thái,
hóa sinh, phân tử của các chủng gây bệnh này. Vậy thành phần loài gây bệnh
ghẻ củ khoai tây ở các vùng nghiên cứu của Việt Nam có đặc trưng như thế nào?
Nhằm cung cấp cơ sở dữ liệu về các đặc trưng hình thái, hóa sinh và phân tử của
các vi khuẩn Streptomyces gây bệnh ghẻ thường củ khoai tây ở Việt Nam cũng
như độc tính gây hại của chúng trên khoai tây chúng tôi thực hiện đề tài: “Đánh
giá đa dạng di truyền vi khuẩn Streptomyces sp. gây bệnh ghẻ củ khoai tây
thu thập từ miền Bắc Việt Nam”
1.2. Mục đích, yêu cầu
1.2.1. Mục đích:
- Phân loại phân tử các vi khuẩn Streptomyces gây bệnh ghẻ củ khoai tây thu
thập từ miền Bắc Việt Nam.
- Đánh giá đa dạng di truyền của chúng về hình thái, hóa sinh và phân tử (các
gen gây bệnh).
1.2.2. Yêu cầu:
- Phân lập được vi khuẩn Streptomyces gây bệnh ghẻ từ củ khoai tây bị bệnh.
- Phân loại các mẫu phân lập được dựa trên đặc điểm hình thái, hóa sinh và giải
trình tự 16s rRNA.
- Kiểm tra sự có mặt của các gen liên quan đến khả năng gây bệnh của các mẫu
phân lập bằng PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu.
- Đánh giá tính gây bệnh của các mẫu phân lập bằng lây nhiễm nhân tạo.
1.3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
1.3.1. Ý nghĩa khoa học:
Đề tài đã tạo ra được cơ sở dữ liệu tin cậy về các điểm hình thái, hóa sinh
và phân tử của vi khuẩn Streptomyces sp gây bệnh ghẻ thường trên khoai tây ở
Việt nam. Đây là một công trình nghiên cứu có hệ thống, sử dụng các phương
pháp nghiên cứu hiện đại về phân loại, đánh giá di truyền vi khuẩn Streptomyces

sp và là công trình lần đầu tiên được tiến hành ở nước ta.
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

2


1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn:
Cơ sở dữ liệu gồm các thông tin có tính hệ thống và chính xác ở mức
phân tử mà đề tài đã tạo ra sẽ là cơ sở để nghiên cứu và đề xuất các biện pháp
phòng chống và quản lý bệnh ghẻ thường khoai tây do vi khuẩn Streptomyces sp. một
cách hiệu quả hơn.

Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

3


II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu chung về bệnh ghẻ thường khoai tây
Bệnh ghẻ thường khoai tây là một trong những bệnh hại nghiêm trọng
xuất hiện ở tất cả các vùng trồng khoai tây trên thế giới. Hiện nay, bệnh đã trở
thành vấn đề toàn cầu thách thức nỗ lực để giảm tỷ lệ mắc bệnh và mức độ
nghiêm trọng của bệnh. Tuy không làm giảm năng suất nhưng bệnh ảnh hưởng
lớn đến mẫu mã cũng như chất lượng của củ. Do đó, bệnh làm giảm hiệu quả
kinh tế của các vùng sản xuất khoai tây.
2.1.1. Triệu chứng
Bệnh ghẻ thường gây nên rất nhiều triệu chứng khác nhau trên củ khoai
tây. Khi bệnh nhẹ, bệnh biểu hiện thành dạng lưới trên bề mặt củ. Nghiêm trọng
hơn bệnh gây ra những đám mô nổi, thô ráp. Vết bệnh cũng có thể sẽ hõm sâu
vài centimet. Tổn thương cũng khác nhau về kích thước và hình dạng: rải rác

hoặc bao trùm hầu hết bề mặt củ. Khi củ tăng kích thước, tổn thương do bệnh
ghẻ mở rộng và tăng mức độ nghiêm trọng của bệnh (Reiette Gouws, 2006). Nhìn
chung, tổn thương do ghẻ trên củ khoai tây có thể được phân thành 3 loại: một
lớp bần trên bề mặt – ghẻ nâu đỏ; ghẻ lồi với những vết lồi khoảng 1-2 mm; ghẻ
sao với những vết bệnh sâu đến 7mm (Hooker, 1981).
2.1.2. Nguyên nhân gây bệnh và đặc điểm phát sinh
Bệnh ghẻ thường củ khoai tây do vi khuẩn gram dương sống trong đất
thuộc chi Streptomyces gây nên. Tác nhân sinh học chủ yếu là Streptomyces
scabies. Tuy nhiên, có một số loài Streptomyces khác cũng gây ra bệnh ghẻ
thường trên những củ đang sinh trưởng và các cây trồng rễ cọc, bao gồm
S.turgidiscabies (Miyajima và cộng sự, 1998), S. acidiscabies (Lambert và
Loria, 1989) và S. europaeiscabiei và S. stelliscabiei (Bouchek và cộng sự,
2000)...

Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

4


Streptomyces scabies tồn tại trên các tàn dư cây bệnh trong đất và gây hại
ở các bộ phận của cây nằm dưới mặt đất. Chúng còn có thể sống sót qua bộ máy
tiêu hoá của động vật và tồn tại trong phân động vật. Bệnh lan truyền qua củ
giống và qua nước tưới. Tỷ lệ mắc và mức độ nghiêm trọng của bệnh ghẻ củ
khoai tây thay đổi từ năm này sang năm khác và từ vùng này đến vùng khác.
Bệnh gây hại mạnh ở những ruộng trồng khoai tây độc canh nhiều vụ liên tiếp.
2.1.3. Đặc điểm của tác nhân gây bệnh
Khuẩn lạc của Streptomyces rắn chắc, khô, dạng vôi, dạng nhung tơ. Bề
mặt của khuẩn lạc có thể nhẵn, có mấu lồi, có nếp nhăn hoặc sần sùi như vỏ cam
sành. Kích thước khuẩn lạc thay đổi tùy loại xạ khuẩn và tùy điều kiện nuôi cấy.
Đường kính khuẩn lạc trung bình từ 0,5 – 2mm. Khuẩn lạc của Streptomyces có

nhiều màu sắc khác nhau như đỏ, da cam, vàng, hồng, lam, nâu, tím… Màu sắc
của Streptomyces cũng là một tiêu chuẩn quan trọng để xác định tên của các loài
Streptomyces.
Streptomyces có hệ khuẩn ti phát triển tốt, không có vách ngăn và không
tự đứt đoạn, bắt màu gram dương, hiếu khí, hoại sinh, không hình thành nha
bào, không có lông và giáp mô. Streptomyces là vi khuẩn đa hình thái như: Dạng
hình chùy, dạng phân nhánh hay dạng sợi dài gọi là khuẩn ti hay phân nhánh
thành chùm, thành bó gọi là khuẩn ti thể (Mycelium). Đường kính của khuẩn ti
từ 0,2 – 2,5µm. Kích thước và khối lượng của khuẩn ti thể thường không ổn định,
chúng phụ thuộc vào từng loài Streptomyces và từng điều kiện nuôi cấy.
Ở đa số các loài Streptomyces, khuẩn ty khí sinh phát triển theo hình
phóng xạ tạo thành nhiều vòng tròn đồng tâm. Khuẩn ty cơ chất có thể cắm sâu
vào môi trường từ 1 – 3 mm, chúng mọc thành một vòng nhỏ xung quanh khuẩn
lạc, khuẩn ty cơ chất có thể ví như bộ rễ của thực vật, chúng hút chất dinh dưỡng để
cung cấp cho toàn bộ cơ thể.

Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

5


Hình 1: Hình thái khuẩn lạc và hệ khuẩn ty của Streptomyces spp.

2.1.4. Tương tác giữa tác nhân gây bệnh và kí chủ
Không giống như hầu hết các vi khuẩn khác, Streptomyces gây bệnh có thể
xâm nhập trực tiếp vào bên trong tế bào thực vật. S. scabies nhiễm trên củ trưởng
thành thông qua khí khổng hoặc trực tiếp qua biểu bì và sinh trưởng bên trong lớp
tế bào. S.scabies cũng sử dụng một cấu trúc phân nhánh ngắn, được hình thành từ
sợi chính, vuông góc với sợi này để xâm nhiễm vào trong tế bào. Điều này chứng
tỏ rằng, cấu trúc thứ cấp được hình thành từ sợi chính là những cấu trúc đặc thù

cho sự xâm nhiễm. Chính khả năng xâm nhiễm trực tiếp vào tế bào thực vật có
thể giải thích một phần tại sao Streptomyces gây bệnh thành công trên cây có củ và các
cấu trúc dưới mặt đất khác mà các vi khuẩn khác không thể thực hiện được (Loria và
cộng sự, 2003).
2.1.5. Biện pháp phòng trừ
Bệnh ghẻ thường củ khoai tây gây tác hại lớn về kinh tế cho các vùng sản
xuất khoai tây. Vì thế, nhiều biện pháp phòng chống đã được áp dụng nhằm làm
giảm thiểu tác hại do bệnh gây ra: sử dụng vật liệu giống không mang mầm
bệnh, kiểm soát lý tính đất, sử dụng thuốc hóa học, sử dụng biện pháp sinh học
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

6


và tác động đến quá trình tổng hợp thaxtomin… Các biện pháp này nếu được sử
dụng phối hợp một cách thích hợp thì cũng có thể mang lại hiệu quả đáng kể.
Trong các biện pháp phòng trừ sâu bệnh nói chung, biện pháp hóa học
được sử dụng phổ biến hơn cả do thuốc hóa học rẻ tiền, khả năng tác động
nhanh và phổ tiêu diệt rộng của nó. Đối với bệnh ghẻ thường củ khoai tây thuốc
hóa học được sử dụng để phòng chống bệnh ghẻ bằng cách xử lý củ và xử lý đất.
Việc xử lý thuốc hóa học trên củ ít có tác dụng, do đó thường không được
khuyến cáo sử dụng. Trong khi đó, xử lý đất thường được sử dụng hơn: Boocdo
dùng với lượng 85kg/ha giảm được tác hại do bệnh ghẻ (Mader 1937; Dozokein,
1955), MnSO4 làm giảm ảnh hưởng của bệnh từ 70% còn 20% khi sử dụng
6kg/ha (Spatcz, 1955). Như vậy, có thể thấy thuốc hóa học có tác động hiệu quả
trong phòng chống bệnh ghẻ củ khoai tây. Tuy nhiên, biện pháp hóa học không
phải là hoàn hảo vì bên cạnh ưu điểm trên thì thuốc gây ô nhiễm môi trường,
mất cân bằng sinh thái do tiêu diệt cả các sinh vật có ích và điều nguy hiểm hơn
cả là gây ra hiện tượng kháng thuốc làm cho nhiều chủng gây bệnh mới xuất
hiện với độc tính cao hơn.

pH đất và độ ẩm đất là những nhân tố có ảnh hưởng lớn đến khả năng gây
hại do bệnh ghẻ thường gây ra trên củ khoai tây. Bệnh hại nặng trong điều kiện
nhiệt độ ấm áp, đất khô, pH trong khoảng 5.2- 8. Vì thế, việc kiểm soát độ ẩm
đất, duy trì pH đất trong khoảng từ 5.0- 5.2 sẽ giảm được mức độ gây hại do
bệnh ghẻ thường gây ra (Roger Osborn và Knoxfield, 1995).
Bên cạnh đó, biện pháp sinh học- một biện pháp được coi là bền vững và an
toàn đối với môi trường sinh thái bằng cách sử dụng các vi sinh vật đối kháng cũng
đã được áp dụng. Liu và cộng sự (1996); Ryan và cộng sự (1997), sử dụng các vi
khuẩn Streptomyces đối kháng để điều khiển bệnh ghẻ thường củ khoai tây nhờ sự
tổng hợp các kháng sinh ức chế sự sinh trưởng của tác nhân gây bệnh của các chủng
vi khuẩn này.
Các biện pháp kiểm soát bệnh ghẻ củ khoai tây bằng phương pháp hóa
học, điều khiển lý tính của đất, biện pháp sinh học đã mang lại những hiệu quả
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

7


nhất định trong việc làm giảm thiểu tác hại do bệnh ghẻ gây ra trên củ khoai tây.
Tuy nhiên, các biện pháp này vẫn tồn tại những nhược điểm dẫn đến hiệu quả
phòng trừ không triệt để. Một hướng giải quyết có hiệu quả bền vững là sử dụng
giống kháng bệnh. Hướng này đã và đang được nghiên cứu phát triển.
Kobayashi và cộng sự, 2002 đã sử dụng những dòng khoai tây chỉ biểu hiện
những vết ghẻ lồi nhỏ trên bề mặt để phát triển chương trình lai giống và đã
chọn tạo được một giống được cho là có khả năng kháng bệnh cao, phẩm chất
nông sinh học tốt. Wilson và cộng sự (2009) đã sử dụng phương pháp chọn lọc
tế bào, dùng thaxtomin A như là yếu tố chọn lọc để chọn ra các dòng mang tính
kháng cao. Các cây tái sinh đều biểu hiện tính kháng đối với bệnh ghẻ cao hơn
rõ rệt so với cây không được chọn lọc. Tuy cơ sở di truyền về tính kháng vẫn
chưa được làm sáng tỏ nhưng tạo giống kháng bệnh vẫn là một hướng đi mang

tính chiến lược trong việc làm giảm thiểu tác động của bệnh ghẻ cho các vùng
trồng khoai tây.
2.2. Cơ sở phân tử của tính gây bệnh và đa dạng di truyền của các chủng
Streptomyces spp gây bệnh ghẻ thường củ khoai tây
2.2.1. Cơ sở phân tử của tính gây bệnh
Khả năng gây bệnh ghẻ củ khoai tây của các loài thuộc chi Streptomyces
có liên quan đến một nhóm gen gây bệnh thuộc đảo gây bệnh PAI (pathogenic
island). PAI của Streptomyces được mô tả từ S. turgidiscabies. Đó là một vùng
trình tự giới hạn 425kb chứa các gen tổng hợp protein gây bệnh được tìm thấy
trên vùng NST liền kề của S. acidiscabies và S. scabies. Các gen này bao gồm:
TxtAB, txtC, nos, txtR (Joshi và cộng sự, 2007b). Chúng lần lượt mã hóa cho sự
tổng hợp thaxtomin A, cytochrom P450 monooxygenase và nitric oxide. Vùng
này cũng bao gồm các gen: TomA mã hóa cho enzyme Tomatinase thuộc họ
enzyme saponinase có vai trò ức chế phản ứng phòng thủ của cây (Vanetten và
cộng sự, 1994) và Nec1 có liên quan tới việc tạo ra kiểu hình chết hoại trên bề
mặt củ khoai tây (Xinshun và cộng sự, 2008). Bản chất sản phẩm của các gen
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

8


này là các phytoxin có vai trò chủ chốt trong quá trình phát triển bệnh thông qua
việc làm tổn thương cấu trúc thành tế bào sơ cấp của thực vật. Bên cạnh đó, các
gen liên quan đến quá trình tương tác của tác nhân gây bệnh với kí chủ (gen
esterase….), đặc biệt là sự hình thành các enzyme ngoại bào và các toxin
(Lawrence và cộng sự, 1990; Healy và cộng sự, 1991 ) cũng đã được tìm thấy.
Các nghiên cứu của Bukhalid và cộng sự (1998); Lawrence và cộng sự
(1990) chỉ ra một mối tương quan chặt giữa tính gây bệnh và việc sản sinh
thaxtomin. Đột biến của S. scabies với việc giảm hoặc không nhận thấy được
mức độ tổng hợp thaxtomin đều là các chủng không gây bệnh hoặc tính độc bị

giảm (Bukhalid và cộng sự, 1998; Lawrence và cộng sự, 1990; Loria và cộng sự,
1997).
Trong khi đó, kết quả kiểm tra gen TxtAB- tổng hợp thaxtomin có vai trò
chủ chốt trong quá trình gây bệnh của Streptomyces phân lập từ 6 bang nước Mỹ
cho thấy, tất cả các chủng có TxtAB đều là các chủng gây bệnh và không có
chủng nào gây bệnh nếu không có TxtAB (Wanner, 2006). S. scabies được phân
lập từ Nam Phi có gen TxtA- tổng hợp thaxtomin A nhưng không có gen Nec1
(Bukhalid và cộng sự, 1998). Trong khi đó, S. luridiscabiei và S. puniscabiei là
các chủng gây bệnh nhưng không tạo thaxtomin (Park và cộng sự, 2003).
Phân tích sự sản sinh thaxtomin A, Reinette Gouws (2006) cũng cho rằng
có một sự liên quan chặt chẽ giữa khả năng gây bệnh của các isolate phân lập
được và khả năng sản sinh thaxtominA. Tuy nhiên, nghiên cứu này cũng chỉ ra
rằng 14% các chủng gây bệnh không tổng hợp thaxtomin A, trong khi có 6% số
chủng không gây bệnh được kiểm tra tạo toxin. Park và cộng sự (2003) tìm ra 2
loài gây bệnh ở Hàn Quốc là S. luridiscabiei và S. puniscabiei nhưng không tạo
thaxtomin.
Gen Nec1 mã hóa cho một protein gây chết hoại (Joshi và cộng sự, 2007)
và có tính bảo thủ cả về cấu trúc và chức năng giữa các chủng Streptomyces spp.
gây bệnh (Park và cộng sự, 2003). Các chủng gây bệnh S. scabies, S.
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

9


acidiscabies, S. turggidiscabies có thể có cả gen tổng hợp Nec1 và thaxtominA
nhưng Nec1 không cần thiết cho sự tổng hợp thaxtomin A (Bukhalid và cộng sự
1997, 1998). Joshi và cộng sự (2007) cho rằng, Nec1 cần thiết cho tính gây bệnh
nhưng một vài nghiên cứu khác lại chỉ ra rằng Nec1 có vai trò phụ trong tính
gây bệnh vì một số chủng Streptomyces gây bệnh khác không có mặt của Nec1
(Bukhalid và cộng sự, 1998).

Gen TomA mã hóa cho protein Tomatinase , được phiên mã đồng thời
cùng với một họ gen glycosyl hydrolase. Tomatinase tác động đến sợi khí sinh
mà không tác động đến sợi dinh dưỡng. Điều này chứng tỏ rằng, mục tiêu của
Tomatinase không xuất hiện trong pha sinh trưởng dinh dưỡng. Tuy nhiên, sự
bảo thủ về trình tự của TomA trên đảo gây bệnh của S.cabies, S. acidiscabies, S.
turgidiscabies cho thấy TomA có một vai trò trong quá trình tương tác giữa tác
nhân gây bệnh và cây trồng (Ryan và cộng sự, 2008).
Mặt khác, Schottel và cộng sự (1992) đã tìm thấy sự xuất hiện của hoạt
tính esterase trong dịch chiết nuôi cấy của một số chủng S. scabies gây bệnh.
Điều này chứng tỏ rằng, esterase có thể có vai trò trong việc phá vỡ lớp bảo vệ
của bề mặt củ khoai tây (suberin, cutin) tạo điều kiện cho sự xâm nhiễm của tác
nhân gây bệnh (Beauséjour và cộng sự, 1999).
Như vậy, có rất nhiều sản phẩm của gen tham gia vào quá trình tương tác
gây bệnh của các chủng Streptomyces gây bệnh ghẻ thường trên củ khoai tây.

Hình 2: Sơ đồ các gen thuộc đảo gây bệnh của S. turgidiscabies
(Kerset và cộng sự, 2005 )
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

10


2.2.2. Đa dạng di truyền của các chủng Streptomyces gây bệnh ghẻ thường củ
khoai tây
Nguyên nhân gây bệnh ghẻ thường củ khoai tây được mô tả lần đầu tiên
vào cuối thế kỉ 19 ở Bắc Mỹ (Thaxter, 1892). Nhiều nghiên cứu gần đây chỉ ra
rằng, bệnh này xảy ra ở khắp các vùng trồng khoai tây trên thế giới, trong đó tác
nhân gây bệnh chủ yếu là S.scabies. Các loài gây bệnh thuộc chi này có khả
năng tiết sắc tố melanin trên môi trường nuôi cấy, tạo ra dạng bào tử xoắn với
sợi khí sinh màu xám tro. Cơ sở hình thái, hóa sinh và khả năng sử dụng các

nguồn cabon cũng như sự có mặt của các gen gây bệnh, đặc điểm trình tự 16s
RNA của các loài thuộc chi Streptomyces đã được sử dụng để phân loại các loài
thuộc chi này. Ngoài ra, các chủng Streptomyces khác cũng được tìm thấy là
nguyên nhân gây bệnh ghẻ thường (Beaulieu, 2008).
Nghiên cứu đặc điểm hình thái của các chủng Streptomyces phân lập được
từ mẫu củ khoai tây bị bệnh từ 6 bang của nước Mỹ trên môi trường YME và
PYI cho thấy, nhiều isolates có đặc điểm hình thái tương tự S. scabies. Trên môi
trường YME, bào tử có màu xám, sợi cơ chất có màu nâu vàng đến nâu vàng
nhạt và tiết sắc tố màu nâu cam. Chủng gây bệnh có màu sắc sợi cơ chất biến
động từ màu kem đến màu vàng sáng và màu nâu caramel, bào tử từ màu trắng
đến màu xám sáng đến xám tối hoặc gần như màu đen. Màu sắc của sợi khí sinh
và sắc tố tiết ra trên môi trường YME biến động giữa các chủng không gây bệnh
(Wanner, 2006). S. scabies gây bệnh có khả năng sinh sắc tố màu nâu, chuỗi bào
tử màu xám, bào tử nhẵn, dạng xoắn (Thaxter, 1890). Cũng nghiên cứu về các
chủng S. scabies gây bệnh ghẻ thường ở Bắc Mỹ, Canada và Hungary, Lambert
và cộng sự, 1989 đã mô tả rất cụ thể về đặc điểm hình thái, sinh hóa của các
chủng này. Trên môi trường aga cơ bản, sợi khí sinh phân nhánh từ gốc, chuỗi
bào tử xoắn rời nhau, bào tử màu xám, nhẵn và có dạng gai. Thành tế bào của
một số chủng có chứa LL- diaminopimenlyc acid isomer. Tất cả đều có khả
năng tiết melanin trên môi trường tyrosine agar và sắc tố màu đen trên môi
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

11


trường peptone yeast extract aga (PYI). Một loài khác S. acidiscabies cũng gây
bệnh ghẻ thường củ khoai tây, có khả năng chịu được acid, gây ra các triệu
chứng bệnh tương tự như triệu chứng do S. scabies tuy nhiên loài này có sự khác
biệt với S. scabies về hình thái, sinh hóa. S. acidiscabies sinh chuỗi bào tử gấp
khúc, bào tử màu trắng đến hồng, sinh sắc tố màu đỏ đến vàng. Một số chủng

Streptomyces gây bệnh khác được tìm thấy ở Nhật Bản có khả năng sử dụng tất
cả các loại đường trên môi trường ISP, sinh chuỗi bào tử nhẵn, xám, gấp khúc
(Loria và cộng sự, 1997). Các chủng Streptomyces gây bệnh ghẻ thường củ
khoai tây ở Algeria có đặc điểm: khuẩn lạc lồi, nhẵn màu kem trên môi trường
YME, sợi khí sinh sau đó chuyển sang màu nâu, có khả năng đồng hóa Larabinose, D- fructose và rhamnose. Đồng thời, chúng có khả năng phân giải
xylose và tinh bột và tạo melanin trên môi trường PYI (Bencheikh và cộng sự,
2007). Nghiên cứu bệnh ghẻ thường khoai tây ở Nam Phi, Reinette Gouws
(2006) đã phân lập được 145 isolates từ củ khoai tây biểu hiện các triệu chứng:
vết bệnh sâu, nổi và trên bề mặt. Dựa trên các đặc điểm hình thái, sinh hóa, 145
isolates này đã được phân làm 6 nhóm với các đặc điểm: Nhóm 1 (52% tổng số)
có dạng khuẩn lạc màu nâu, chuỗi bào tử dạng xoắn, bào tử màu xám, sinh sắc
tố trên môi trường PYI và TY; sử dụng 9 loại đường ISP. 12% thuộc nhóm 2 có
các đặc điểm giống nhóm 1 nhưng điểm khác biệt là không sinh sắc tố. Nhóm 3
(6%) và nhóm 4 (10%) có khuẩn lạc màu nâu, bào tử xám, chuỗi bào tử gấp
khúc. Các isolates thuộc nhóm 3 có khả năng tạo sắc tố trên môi trường PYI
trong khi nhóm 4 không có khả năng này. Khuẩn lạc thuộc nhóm 5 (12%) màu
nâu vàng, bào tử màu xanh xám trong chuỗi bào tử xoắn hoặc gấp khúc, sử dụng
tất cả các nguồn đường nhưng không tạo sắc tố. Nhóm 6 (8%) bao gồm các
isolates với dạng bào tử màu đen, chuỗi bào tử gấp khúc, sử dụng tất cả các
nguồn đường nhưng không tạo sắc tố. Streptomyces DS3024 có những khác biệt
về hình thái, sinh lý so với các chủng gây bệnh đã được mô tả: chuỗi bào tử gấp
khúc, bào tử hình trụ, ráp; sợi khí sinh biến động từ màu trắng đến màu đen trên
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

12


các loại môi trường khác nhau; sợi cơ chất màu vàng đến màu nâu; có khả năng
tiết sắc tố melanin trên môi trường ISP6. Chủng này có thể tồn tại ở pH 4.5 (Hao
và cộng sự, 2009).

Như vậy có thể thấy, đặc điểm hình thái, sinh hóa là các tiêu chí quan
trọng trong việc phân loại các chủng Streptomyces gây bệnh ghẻ thường trên củ
khoai tây. Tuy nhiên, công cụ phân tử gần đây đã đóng một vai trò quan trọng
trong việc nhận diện và phân loại các chủng Streptomyces gây bệnh. Bằng việc
phân tích trình tự 16s rRNA và đã thành công trong việc nhận diện các chủng
Streptomyces ở mức độ loài.
Trong khi đó, từ mẫu củ khoai tây bị bệnh thu thập từ 6 bang của nước
Mỹ, Wanner (2006) đã phân lập và xếp các chủng Streptomyces phân lập được
thành 4 nhóm: S. scabies, S. europaeiscabiei, S. stelliscabiei hoặc nhóm mới X.
Phân tích trình tự 16s rRNA, ba vùng trình tự biến động trong gen 16s rDNA đã
được nhận diện hữu ích cho việc mô tả các chủng Streptomyces gây bệnh ghẻ
thường củ khoai tây. Đó là các vùng α, γ và 1435 (Wanner, 2006). Để đánh giá
đa dạng di truyền của các chủng Streptomyces phân lập từ 6 bang nước Mỹ,
PCR được sử dụng để khuếch đại đặc trưng của các chủng S. scabies, S.
europaeiscabiei,

S.

stelliscabiei,

S.

acidiscabies,

S.

bottropensis,

S.turgidiscabies và S. aureofaciens. Các cặp mồi được thiết kế dựa trên sự khác
nhau của vùng biến động 16s rDNA để xác định các chủng gây bệnh được phân

lập là thuộc chi Streptomyces. Các nhà nghiên cứu đã thiết kế cặp mồi đặc hiệu
cho S.aureofacient và S.turgidiscabies cũng như là cặp mồi dùng để nhân một
sản phẩm từ S.scabies. Cặp mồi này (scabI và scabII) được cải biến cho vùng
biến động γ tương đồng hoàn toàn với vùng trình tự 16s rDNA và mồi tương
đồng cho vùng biến động 1435 có chứa một nucleotid đơn trong trình tự của S.
scabies và S. europaeiscabiei nhưng không có mặt trong mồi gốc scabII. Các
cặp mồi đặc hiệu cho bảy chủng Streptomyces và ba marker cho PAI được sử
dụng để mô tả đặc điểm của các chủng phân lập được ở Mỹ. Dựa trên trình tự
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

13


rDNA có 49 chủng thuộc S. scabies và S. europaeiscabiei được tìm thấy ở cả 6
bang và ở Ohio, Mchigan, Wisconsin và Marin là các chủng chiếm ưu thế. Để
xác định có hay không cả S. scabies và S.europaeiscabiei ở Mỹ, gen 16s rRNA
đã được nhân dòng và giải trình tự trên 9 chủng gây bệnh và một chủng không
gây bệnh S.scabies hoặc S. europaeiscabiei. Hai chủng này có cùng vùng trình
tự 1435 và α nhưng khác nhau bởi G hoặc A ở vị trí 172 trong vùng biến động γ.
Bảy isolates thuộc S. scabies và ba thuộc S. europaeiscabiei.

Hình 3: Các vùng biến động trên trình tự 16s rRNA của các chủng
Streptomyces gây bệnh ghẻ thường củ khoai tây (Wanner, 2006)
Kết quả nghiên cứu tác nhân gây bệnh ghẻ thường trên khoai tây của các
tác giả Lambert (1989); Healy (1991); Bouchek (2000); Bukhalid (2002) đã tìm
ra ít nhất 4 loài gây bệnh thuộc Bắc Mỹ, trong đó có 3 loài có đặc điểm tương tự
như S. scabies là: S. scabies, S. europaeiscabiei, S. stelliscabiei và một loài
khác là S. acidiscabies.
Cũng nghiên cứu bệnh ghẻ thường trên củ khoai tây, Bouchek và cộng sự
(2000) cho rằng, có ít nhất 13 chủng Streptomyces spp. khác nhau đã được tìm

thấy là nguyên nhân gây ra bệnh ghẻ thường ở khắp các vùng trồng khoai tây
trên thế giới. Trong đó, có 4 nhóm loài gây bệnh lớn ở Bắc Mỹ là: S. scabies, S.
acidiscabies, S. europaeiscabie, và S. stelliscabiei (Bouchek và cộng sự, 2000;
Lambert and Loria, 1989). Tác nhân gây bệnh phổ biến nhất là Streptomyces
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

14


scabies phân bố khắp thế giới. Hai loài tiếp theo có một số đặc điểm hình thái
giống với S.scabies nhưng khác biệt về di truyền là S. europaeiscabiei và S.
Stelliscabiei. Chúng được tìm thấy ở Pháp, Đông Mỹ và Canada (BouchekMechiche và cộng sự, 2000; Bukhalid và cộng sự, 2002). Một loài thứ tư cũng
có các đặc điểm hình thái giống với các loài trên là S. bottropensis được phát
hiện ở Ai Cập (Bukhalid và cộng sự, 2002).
Ngoài ra, các loài Streptomyces khác là nguyên nhân gây bệnh ghẻ thường
củ khoai tây cũng đã được tìm thấy. S. caviscabies gây bệnh ghẻ thường ở
Quebec, Canada (Goyer và cộng sự., 1996), S. aureofaciens, S. griseus, S.
europaeiscabiei, S. reticuliscabiei và S. stelliscabiei ở Pháp (Corbaz, 1964;
Bouchek-Mechiche và cộng sự., 2000), S. cinereus, S. collinus và S.
longisporoflavus được tìm thấy ở Ấn Độ (Dey & Singh, 1983), S. exofoliatus, S.
rochei và S. violaceus gây bệnh ở Israel (Doering-Saad và cộng sự., 1992).
Trong khi đó S. flaveolus ở Bắc Mỹ (Millard & Burr, 1926). Các loài gây bệnh ở
Washington là: S. atrolivaceus, S. cinerochromogenes, S. corchorussi, S.
diastatochromogenes, S. lidicus và S. resistomycificus (Archuleta & Easton,
1981). S. turgidiscabies được mô tả ở Nhật Bản, Hàn Quốc, Phần Lan và Thụy
Điển (Kreuze và cộng sự 1999; Lehtonen và cộng sự 1998; Park và cộng sự
2003); S. aureofaciens tìm thấy ở Phần Lan (Kreuze và cộng sự 1999); ba loài
mới được phát hiện ở Hàn Quốc là Streptomyces luridiscabiei sp. nov.,
Streptomyces puniciscabiei sp. nov. và Streptomyces niveiscabiei sp. nov (Park
và cộng sự, 2003); S. reticuliscabiei gây ra bệnh ghẻ lưới được tìm thấy ở châu

Âu (Bouchek-Mechiche, 2000); S. reticuliscabiei và S. aureofaciens phát hiện
gây ra bệnh ghẻ lưới và ghẻ nâu đỏ ở Canada và Phần Lan (Faucher, 1992;
Kreuze,1999).
Số lượng các chủng Streptomyces gây bệnh ghẻ củ khoai tây có thể tăng
lên do sự chuyển gen ngang. Do sự tương đồng giữa các gen gây bệnh ở các loài
khác nhau cho thấy, có một cơ chế chuyển gen ngang giữa các loài gây bệnh
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

15


sang các loài không gây bệnh để hình thành nên một loài mới (Bukhalid và cộng
sự, 2002). Phân tích di truyền chỉ ra rằng: sự chuyển gen ngang độc lập từ
S.scabies sang các chủng hoại sinh đã tạo ra S.acidiscabes và S.turgdiscabies
(Wanner, 2006).
Mặt khác, Streptomyces gây bệnh ghẻ thường đa dạng về loại hình triệu
chứng bệnh gây ra trên bề mặt củ khoai tây. Rất nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng
có nhiều nhóm hoặc loài Streptomyces khác nhau trong việc tạo ra các triệu
chứng bệnh ghẻ như: vết hõm (pitted), đốm nổi (raised) hoặc dạng lưới (netted)
(Bouchek-Mechiche và cộng sự, 2000). S.scabies gây ra các triệu chứng bệnh
điển hình như: vết bệnh hõm sâu trên bề mặt và một số các triệu chứng khác.
Trong khi đó S.turgidiscabies tạo ra các vết bệnh hóa bần, S.reticuliscabies là
nguyên nhân gây các vết ghẻ lưới. Tuy nhiên, các nghiên cứu gần đây chỉ ra
rằng tác nhân gây bệnh ghẻ có thể được tìm thấy trên cùng một cánh đồng, cùng
một giống khoai tây, cùng một củ và thậm chí là trên cùng một vết bệnh
(Lehtonen và cộng sự, 2004).

Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

16

III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Vật liệu
- Các mẫu khoai tây bị bệnh ghẻ củ được thu thập từ các địa phương trồng
khoai tây ở miền Bắc Việt Nam.
Địa phương

Giống

Vụ

Tiên Lãng- Hải Phòng

Atlantic

Đông

Tràng Định- Lạng Sơn

Hà Lan

Xuân

Diamond

Xuân

Văn Chấn- Yên Bái

Atlantic

Xuân

Yên Phong- Bắc Ninh

Diamond

Xuân

- DNA chủng đối chứng ATCC49173 (Wanner, trung tâm khoa học cây
trồng Mỹ)
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Phương pháp phân lập - làm thuần (Loria, 1988)
- Củ khoai tây bị bệnh được khử trùng bề mặt bằng 1.5% NaOCl, rửa lại
bằng nước cất vô trùng.
- Lấy lớp mô ngay dưới vết bệnh, nghiền trong 5ml nước vô trùng hoặc hỗn
hợp phenol: nước (1:140) thành dung dịch đồng nhất, sau đó để yên trong vòng 10
phút. Một giọt của huyền phù này được cấy trải trên môi trường water agar.
- Nuôi ở 280 trong 10- 14 ngày để thu được khuẩn lạc riêng rẽ.
- Mỗi khuẩn lạc đơn sẽ được cấy chuyển sang môi trường YME.
3.2.2. Phương pháp đánh giá đặc điểm hình thái, sinh hoá: được tiến hành
theo phương pháp của Wanner (2006), Loria và Davis 1988
- Nuôi cấy các isolates trên môi trường ISP2, ISP3, ISP4, ISP6 ở 280C, trong
điều kiện tối (3 tuần theo dõi)

Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

17