Phân lập, đánh giá các đặc điểm sinh học và định danh phân tử các chủng vi khuẩn quang hợp tía phục vụ chế tạo chế phẩm vi sinh vật hữu hiệu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
====

====

NGUYỄN THỊ HƯƠNG GIANG

PHÂN LẬP, ðÁNH GIÁ CÁC ðẶC ðIỂM SINH HỌC
VÀ ðỊNH DANH PHÂN TỬ CÁC CHỦNG VI KHUẨN
QUANG HỢP TÍA PHỤC VỤ CHẾ TẠO
CHẾ PHẨM VI SINH VẬT HỮU HIỆU

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI – 2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
====

====

NGUYỄN THỊ HƯƠNG GIANG

PHÂN LẬP, ðÁNH GIÁ CÁC ðẶC ðIỂM SINH HỌC
VÀ ðỊNH DANH PHÂN TỬ CÁC CHỦNG VI KHUẨN
QUANG HỢP TÍA PHỤC VỤ CHẾ TẠO

CHẾ PHẨM VI SINH VẬT HỮU HIỆU

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyªn ngµnh

: Công nghệ sinh học

M· sè

: 60.42.80

Ng−êi h−íng dÉn khoa häc: GS.TS. NGUYÔN QUANG TH¹CH
TS. NGUYỄN THỊ HOÀI HÀ

HÀ NỘI – 2012


LỜI CAM ðOAN
Tôi xin cam ñoan rằng: số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn
là trung thực và chưa từng ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào.
Tôi xin cam ñoan rằng mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn
này ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược
ghi rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày tháng

năm 2012

Tác giả

Nguyễn Thị Hương Giang

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

i


LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành cảm ơn:
GS.TS Nguyễn Quang Thạch, TS. Nguyễn Thị Hoài Hà ñã tận tình
hướng dẫn, tạo mọi ñiều kiện cho em học tập, nghiên cứu và hoàn thành
báo cáo.
Các thầy, cô trong bộ môn Công nghệ Vi sinh – Khoa Công nghệ
sinh học – Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã giúp ñỡ và cho em
những ý kiến quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường.
Thầy cô và các anh chị, các bạn ñồng nghiệp trong Viện Sinh học
Nông nghiệp – ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tạo mọi ñiều kiện thuận lợi
cho em học tập và nghiên cứu trong suốt thời gian qua.
Gia ñình và bạn bè ñã ñộng viên, giúp ñỡ trong quá trình thực hiện
ñề tài.

Hà Nội, ngày tháng

năm 2012

Tác giả

Nguyễn Thị Hương Giang

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ðOAN ........................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................ii
MỤC LỤC ....................................................................................................iii
DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................ vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ...........................................................................viii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................... ix
I. MỞ ðẦU .................................................................................................... 1
1.1. ðặt vấn ñề ............................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu của ñề tài .................................................................................. 2
II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... 3
2.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn quang hợp tía............................................. 3
2.2. Một số ñặc ñiểm sinh học cơ bản của VKQH tía ..................................... 5
2.2.1. Sinh thái học VKQH tía........................................................................ 5
2.2.2. ðặc ñiểm phân loại VKQH tía.............................................................. 5
2.3. ðặc ñiểm của bộ máy quang hợp............................................................. 8
2.3.1 Màng quang hợp.................................................................................... 8
2.3.2. Sắc tố quang hợp .................................................................................. 9
2.3.3. Sự chuyển hóa các hợp chất vô cơ lưu huỳnh trong vi khuẩn tía......... 20
2.3.4. ðiều hòa quá trình trao ñổi chất ở vi khuẩn quang hợp tía .................. 21
2.4. Ứng dụng của VKQH tía ....................................................................... 22
2.4.1. Sản xuất protein ñơn bào .................................................................... 23
2.4.2. Sản xuất ubiquinone ........................................................................... 23
2.4.3. Sản xuất hoocmon thực vật................................................................. 24

2.4.4. Sản xuất các chất kháng sinh .............................................................. 24
2.4.5. Sử dụng vi khuẩn quang hợp tía trong xử lý nước thải....................... 24

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

iii


III. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............ 26
3.1. ðối tượng nghiên cứu............................................................................ 26
3.2. Hóa chất ................................................................................................ 26
3.2.1. Môi trường phân lập, làm thuần và cấy chuyển VKQH tía ................. 26
3.2.2. Môi trường khảo sát nhu cầu và khả năng sử dụng NaCl .................... 28
3.2.3. Môi trường khảo sát khoảng pH ......................................................... 28
3.2.4. Môi trường khảo sát nhu cầu vitamin.................................................. 28
3.2.5. Hóa chất dùng trong khuếch ñại và giải trình tự gen ........................... 29
3.3. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 30
3.3.1 Phương pháp làm giàu và phân lập vi khuẩn quang hợp tía ................. 30
3.3.2. Phương pháp ñịnh danh VKQH tía ..................................................... 30
IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................................ 35
4.1. Kết quả thu thập mẫu............................................................................. 35
4.2. Kết quả nuôi tích lũy và phân lập VKQH tía ......................................... 36
4.3. Kết quả tuyển chọn VKQH tía............................................................... 37
4.4. ðịnh danh các chủng VKQH tía chọn lựa.............................................. 39
4.4.1. Hình thái tế bào .................................................................................. 39
4.4.2. ðặc ñiểm sắc tố quang hợp................................................................. 39
4.4.3. Nhu cầu vitamin của các chủng VKQH tía lựa chọn........................... 41
4.4.4. Ảnh hưởng của pH ñến sinh trưởng của các chủng VKQH tía lựa chọn ....... 41
4.4.5. Ảnh hưởng nồng ñộ NaCl ñến sinh trưởng của các chủng VKQH tía lựa chọn ... 42
4.4.6. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến tích lũy sinh khối của các chủng lựa chọn.. 43

4.4.7. Khả năng sử dụng các nguồn cacbon của các chủng VKQH tía chọn
lựa, tổng hợp các ñặc tính sinh lý ñể dự kiến tên loài ................................... 44
4.4.8. Giải trình tự gen mã hóa rRNA 16S của chủng QN1 .......................... 46
4.5. Ứng dụng các chủng VKQH tía lựa chọn trong sản xuất chế phẩm sinh
học EMINA.................................................................................................. 48
4.5.1. Khả năng sử dụng sulfua của các chủng VKQH tía lựa chọn ............. 48
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

iv


4.5.2. Ứng dụng vi khuẩn quang hợp tía trong chế tạo chế phẩm sinh học
EMINA và ứng dụng trong xử lý ô nhiễm môi trường chăn nuôi ................. 50
V. KẾT LUẬN VÀ KIỄN NGHỊ ................................................................. 54
5.1. Kết luận................................................................................................. 54
5.2. Kiến nghị............................................................................................... 54
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................... 59

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

v


DANH MỤC CÁC BẢNG
STT

Tên bảng

Trang

Bảng 2.1. Một số ñặc ñiểm của vi khuẩn tía .................................................. 4
Bảng 2.2. Một số ñặc tính ñặc trưng ở vi khuẩn quang hợp tía không lưu
huỳnh ............................................................................................................. 7
Bảng 2.3. Phổ cực ñại hấp thu của bacteriochlorophyll ................................. 9
Bảng 2.4. Các nhóm carotenoid trong tế bào vi khuẩn quang hợp .............. 11
Bảng 2.5. Công thức hóa học của một số nhóm carotenoid trong tế bào loài
E. ramosum .................................................................................................. 12
Bảng 2.6. Thành phần Quinones trong VKQH tía ....................................... 16
Bảng 3.1. Trình tự các mồi sử dụng trong khuếch ñại và giải trình tự gen mã
hóa rRNA 16S.............................................................................................. 29
Bảng 4.1. Kết quả thu thập mẫu ................................................................... 35
Bảng 4.2. Phân nhóm VKQH tía phân lập ñược theo môi trường làm giàu... 37
Bảng 4.3. Thành phần ô nhiễm của một số nguồn nước thải......................... 38
Bảng 4.4. Khả năng sinh trưởng (theo tích lũy sinh khối OD660 ) của các
chủng VKQH tía trong các nguồn nước thải................................................. 38
Bảng 4.5. Phổ hấp thu cực ñại của sắc tố quang hợp của 4 chủng VKQH tía
lựa chọn........................................................................................................ 40
Bảng 4.6. Nhu cầu vitamin của các chủng VKQH tía lựa chọn..................... 41
Bảng 4.7. Khả năng sinh trưởng của các chủng VKQH tía trong khoảng pH
khác nhau ..................................................................................................... 42
Bảng 4.8. Khả năng sinh trưởng của các chủng VKQH tía trong các nồng ñộ
muối khác nhau ............................................................................................ 42
Bảng 4.9. Tổng hợp ñặc tính sinh lý của các chủng VKQH tía lựa chọn ...... 45
Bảng 4.10. Một số kết quả so sánh trình tự gen mã hóa rRNA 16S của chủng
QN1 với dữ liệu trên ngân hàng gen............................................................. 48

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

vi

Bảng 4.11. Sự tích lũy sinh khối (OD660) của các chủng VKQH tía lựa chọn
trong môi trường chứa sulfua với hàm lượng khác nhau............................... 49
Bảng 4.12. Khả năng sử dụng sulfua của các chủng VKQH tía .................... 50
Bảng 4.13. Hiệu suất xử lý khí H2S (mg/m3) của chế phẩm EMINA ở quy mô
thí nghiệm .................................................................................................... 51
Bảng 4.14. Hiệu suất xử lý khí NH3 (mg/m3) của chế phẩm EMINA ở quy
mô thí nghiệm .............................................................................................. 51
Bảng 4.15. Hiệu suất xử lý các khí ô nhiễm H2S, SO2, NH3 của chế phẩm
EMINA ngoài tự nhiên................................................................................. 52

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

vii


DANH MỤC CÁC HÌNH
STT

Tên hình

Trang

Hình 2.1. Cấu trúc hóa học carotenoid cực cao nhóm iv của loài
R.thiosulfatophilus (A) và

Erythroxanthin sulfate trong tế bào của loài

E.ramosum, E. longus, and E. litoralis. ........................................................ 13
Hình 2.2, 2.3, 2.4. Hệ thống vận chuyển quang ñiện tử ở cây xanh, vi khuẩn

lam và vi khuẩn quang hợp tía...................................................................... 19
Hình 2.5. Hệ thống Sox trong vi khuẩn tía không lưu huỳnh (A) và vi khuẩn
tía lưu huỳnh (B) ......................................................................................... 20
Hình 4.1. Ảnh ñiện di DNA tổng số ............................................................. 46
Hình 4.2. Ảnh ñiện di sản phẩm PCR ........................................................... 46
Hình 4.3. Khuẩn lạc chủng HN5 thuộc loài Rhodopseudomonas palustris ... 55
Hình 4.4. Khuẩn lạc chủng QN1 thuộc loài Rhodobacter sphaeroides ......... 55
Hình 4.5. Tế bào hình que chủng HN5 ......................................................... 56
Hình 4.6. Tế bào hình que chủng QN1 ......................................................... 56

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

viii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
1. Vi khuẩn quang hợp

: VKQH

2. Bacteriochlorophyll

: Bchl

3. Cytoplasma

: CM

4. Intracytoplasma

: ICM

5. bacteriochlorophyll

: bchl

6.cytochrome

: cyt

7. Kính hiển vi

: KHV

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

ix


I. MỞ ðẦU

1.1. ðặt vấn ñề
Nhóm vi sinh vật quang tự dưỡng bao gồm các vi tảo, vi khuẩn lam và
các vi khuẩn quang hợp không thải oxy là những vi sinh vật có khả năng sử
dụng năng lượng trực tiếp từ bức xạ mặt trời làm nguồn năng lượng ñể sinh
trưởng và phát triển. Nhóm vi khuẩn quang hợp không thải Oxy (bao gồm các
vi khuẩn quang hợp tía và xanh) là nhóm vi khuẩn sống kị khí, chúng ñồng
hóa H2S, CO2 ñể xây dựng tế bào, ñồng thời với ñó chúng làm mất mùi và
màu do H2S hoặc sulfua kim loại gây ra, làm giảm tính ñộc cho môi trường.
Ở một số nước trên thế giới như Nhật Bản, Ấn ðộ, Nga…những

nghiên cứu về vi khuẩn quang hợp tía ñã ñược chú trọng từ lâu. Các ñặc
ñiểm về dinh dưỡng của chúng ñã ñược ứng dụng thành công trong nhiều
lĩnh vực trong cuộc sống như y tế, nông nghiệp, nuôi trồng thủy sản, và ñặc
biệt là trong công nghệ môi trường. Ở Việt Nam, ñã có những kết quả
nghiên cứu cho thấy: khi bổ sung vi khuẩn tía vào thức ăn chăn nuôi hoặc
nước nuôi tôm sẽ tăng khả năng phát triển của tôm, có thể loại trừ nhanh
chóng NH3, H2S, axit hữu cơ và những chất có hại, cải thiện chất lượng
nước, cân bằng ñộ pH. Với những vai trò này mà nhóm vi khuẩn quang hợp
tía ñã trở thành một trong những nhóm vi sinh vật không thể thiếu trong các
chế phẩm sinh học, trong ñó có chế phẩm EMINA do Viện Sinh học Nông
nghiệp nghiên cứu và chế tạo.
Tuy nhiên, vi khuẩn quang hợp tía là nhóm vi sinh vật khó trong việc
phân lập và ñánh giá sâu sắc các ñặc ñiểm sinh học của chúng. Do vậy, ñề tài:
“Phân lập, ñánh giá các ñặc ñiểm sinh học và ñịnh danh phân tử các chủng
vi khuẩn quang hợp tía phục vụ chế tạo chế phẩm vi sinh vật hữu hiệu”
ñược tiến hành thực hiện.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

1


1.2. Mục tiêu của ñề tài
- Phân lập ñược một số chủng vi khuẩn quang hợp tía
- ðánh giá ñược một số ñặc ñiểm sinh học cơ bản các chủng vi khuẩn
quang hợp tía phân lập.
- Xác ñịnh ñược trình tự gen mã hoã rRNA 16S của một số chủng vi
khuẩn quang hợp tía ñược phân lập.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

2


II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn quang hợp tía
VKQH tía là các tế bào gram âm, ñơn bào, có các dạng cầu, xoắn, hình
que ngắn, hình phẩy… ñứng riêng rẽ hoặc thành chuỗi. Các loài vi khuẩn
quang hợp tía ñều sinh sản bằng cách phân ñôi, một số loài sinh sản bằng cách
nẩy chồi.
Chúng có khả năng chuyển hóa năng lượng mặt trời thành năng lượng
hóa học bởi quá trình quang hợp kị khí. VKQH tía thường có màu hồng ñến
màu ñỏ tía, sắc tố quang hợp chính là bacteriochlorophyll a hoặc b. Cơ quan
quang hợp là màng quang hợp ñược gắn với màng tế bào [31].
Năm 1907, Molisch là người ñầu tiên phát hiện ra các vi khuẩn có sắc
tố màu ñỏ và có khả năng quang hợp, nên ông gọi chung là vi khuẩn quang
hợp này là Rhodobacteria Molisch 1907. Nhóm này gồm hai họ là
Thiorhodaceae (là những vi khuẩn tía có khả năng hình thành giọt “S” bên
trong tế bào) và Athiorhodaceae (là những vi khuẩn tía không có khả năng
hình thành giọt “S” bên trong tế bào). Nhóm vi khuẩn tía bao gồm hai họ này
sau này ñược ñổi tên là bộ Rhodospirillales và hai họ Choromatiaceae và
Rhodospirillaceae.
Năm 1984, Imhoff chia nhóm vi khuẩn quang hợp tía lưu huỳnh thành
hai họ là Choromatiaceae, Ecthiorhodospiriaceae và họ vi khuẩn quang hợp
tía không lưu huỳnh thành họ Rhodospirillaceae [16].
Một số ñặc ñiểm của vi khuẩn quang hợp tía ñược trình bày ở bảng 2.1:

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

3

Bảng 2.1. Một số ñặc ñiểm của vi khuẩn quang hợp tía [7]
ðặc ñiểm

Ví dụ
- Vi khuẩn tía lưu huỳnh (gammaproteobacteria)

Nhóm/loài

- Vi khuẩn tía không lưu huỳnh(alpha- hoặc betaproteobacteria)

Một số loài chính

Vi khuẩn tía lưu huỳnh: Allochromatium vinosum, Thiocapsa
roseopersicina
Vi khuẩn tía không lưu huỳnh: Rhodobacter capsulatus,
Rhodobacter sphaeroides, Rhodospirillum rubrum,
Rhodopseudomonas palustris

Sắc tố/ màu sắc của - BChl a or b; carotenoids chính : spirilloxanthin, spheroidene,
huyền phù tế bào

lycopene, rhodopsin và dẫn xuất của chúng
- Màu sắc huyền phù tế bào: tía, ñỏ tía, ñỏ, tía – tím, cam, nâu, vàng
nâu (với những loài chứa Bchl a), xanh hoặc vàng (với những loài
chứa Bchl b)

Vị trí của sắc tố trong tế Nằm trong lớp màng sinh chất, ñược sắp xếp thành dạng ống, dạng
bào

màng, dạng túi hoặc dạng phiến lamellae

Phổ hấp thu cực ñại của - Những loài chứa BChl a: gần 800 nm, và những vùng có bước
tế bào sống

sóng từ 815 – 960 nm; - Với những loài chứa BChl b: 835–850 nm
và 1010 –1 040 nm

Chất cho Electron/ giọt - H2S, S0, S2O32-,H2, Fe2+
lưu huỳnh

- Nếu S0 ñược hình thành từ quá trình oxy hóa slulfide, thìS0 ñược
tích lũy bên trong tế bào, và ñiều này chỉ xảy ra ở loài vi khuẩn tía
có lưu huỳnh

Quang tự dưỡng/hô hấp - Vi khuẩn tía lưu huỳnh bị hạn chế về số lượng
tối

- Vi khuẩn tía không lưu huỳnh ña dạng về số lượng

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

4


2.2. Một số ñặc ñiểm sinh học cơ bản của VKQH tía
2.2.1. Sinh thái học VKQH tía
VKQH tía là nhóm vi khuẩn quang dưỡng, sống kị khí hoặc kị khí tùy
tiện trong môi trường có ánh sáng chiếu rọi. Chúng là các vi sinh vật ñiển

hình, rất phổ biến ở nước ngọt cũng như nước mặn, thường cư trú nhiều trên
bề mặt bùn các ao ñầm tù, có nhiều bùn cặn các xác ñộng, thực vật [46].
Họ vi khuẩn quang hợp tía lưu huỳnh thường ñược tìm thấy trong các
thủy vực nước ngọt hoặc nước mặn có chứa hàm lượng sulfua cao. Ở các ñộ
sâu khác nhau có thể thu nhận ñược các loài khác nhau. Ngoài ra còn có thể
gặp họ vi khuẩn này ở một số thủy vực có ñiều kiện cực trị như các thủy vực
kiềm hóa hoặc các suối nước nóng.
Hệ sinh thái của họ vi khuẩn quang hợp tía không lưu huỳnh rất ña
dạng, có thể gặp chúng trong các ao hồ tù ñọng, các vùng ñầm nước lợ hoặc
mặn. Nơi sống của chúng thường là các thủy vực có chứa hàm lượng chất hữu
cơ cao, hàm lượng oxy hòa tan thấp. Ở một số vùng ñất axit có thể gặp các
chủng thuộc loài Rhodopseudomonas acidophila, Rhodopseudomonas
palustris [30].
2.2.2. ðặc ñiểm phân loại VKQH tía
Các ñặc tính hình thái, thành phần hóa học tế bào và ñặc tính sinh lí ñều
rất quan trọng trong việc ñịnh danh vi khuẩn quang dưỡng [35]. Phổ hấp thu
cực ñại của huyền phù tế bào nguyên vẹn cho thông tin về loại diệp lục khuẩn
chính. Sự hiện hiện ña dạng của bacterichlorophyl (bcl) là yếu tố hữu ích
trong phân loại vi khuẩn quang hợp. Hầu hết các loài vi khuẩn quang hợp tía
ñều chỉ có bchl a.
Ở nhiều loài, màu sắc huyền phù tế bào cho phép xác ñịnh các loại
carotenoid chính. Spirilloxanthin là thành phần chính cho màu sắc ñỏ và

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

5


hồng, nếu có them rhodopin thì màu chuyển sang sắc nâu, okenon màu ñỏ tía,
và rhodoinal tạo màu tím tía. Carotenoid loại spheroiden cho gam màu từ nâu

vàng ñến ñỏ nâu. (màu ñược hình thành tùy thuộc vào các dẫn xuất bị oxy hóa
khi có sự hiện diện của oxy) và màu nâu xanh khi trong môi trường có thể
oxy hóa khử mạnh [17, 18]. Kết quả phân tích ñịnh lượng sắc tố của một mẫu
tự nhiên có thể phản ánh mối liên hệ khá quan trọng của nhiều nhóm vi sinh
vật quang dưỡng trong môi trường [22].
Isoprenoid Quinone có vai trò quan trọng trong chuỗi truyền ñiện tử.
VKQH tía tổng hợp nhiều loại Quinone khác nhau ở chiều dài và ñộ bão hòa
của chuỗi polypreinyl. ðặc ñiểm ña dạng này của quinone ở nhóm vi khuẩn
tía không lưu huỳnh có giá trị cao trong phân loại.
Nhu cầu về vitamin và ñặc tính biến dưỡng nguồn cacbon là yêu cầu rất
quan trọng trong việc ñịnh danh một chủng thuộc họ Rhodospirillaceae.
Giống và loài thường ñược phân biệt dựa trên sự so sánh nhiều ñặc tịnh
về hình dang, kích thước tế bào, kiểu tiêm mao, cấu trúc màng trong tế bào
chất, thành phần sắc tố, tỉ lệ các base của DNA và các ñặc tính sinh lí (như
khả năng sử dụng hợp chất nito, cabon, khả năng hô hấp hiếu khí và kị khí
trong tối, tính mẫn cảm với sulfide, nhu cầu NaCl, nhiệt ñộ, pH), ñặc tính sinh
thái (môi trường tự nhiên mà vi sinh vật thường phân bố) [34].
Những thông tin về kích thước và trình tự cytochrome c, cấu trúc
lipopolysaccharid và trình tự gen mã hóa rRNA 16S ñược dùng ñể xác ñịnh
mối quan hệ tiến hóa giữa các loài. Lai phân tử DNA –DNA là tiêu chí quan
trọng ñể phân biệt các loài gần nhau [8]. Việc xác ñịnh thành phần GC của
DNA có vai trò quan trọng ñể mô tả loài mới.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

6


Bảng 2.2. Một số ñặc tính ñặc trưng ở vi khuẩn quang hợp
tía không lưu huỳnh [18]

Loài

Rhodospirillum
rubrum
photometricum
molischianum
Fulvum
salexigens
slinarum
mediosalinum
Rhodophila
globioformis
Rhodomicrobium
vannielii
Rhodobacter
blastica
capsulatus
velkampii

Sản
Màng
Hình dạng
Carotenoid phẩm
tế bào
tế bào
chính
oxy hóa
ICM
sulfide

Nhân tố
tăng
trưởng

Môi
trường ðặc tính
nước phân biệt
thích
khác
hợp
Ngọt
-

Xoắn

Túi

Sp,rv

S0

b

Xoắn
Xoắn
Xoắn
Xoắn
Xoắn
Xoắn

Cầu

Cụm
Cụm
Cụm
Phiến
Túi
Túi
Túi

Rv, rh
Ly, rh
Ly, rh
sp
sp
sp
kts

S0
-

YE
AA
p-aba
glutamat
YE
T,p-a,ba, n
B, p-aba

Ngọt

Ngọt
Ngọt
Mặn
Mặn
Mặn
Ngọt

Cần NaCl
Cần NaCl
Cần NaCl
pH axit

Gậy ngắn

Phiến

Rh, ly, sp

+

Không

Ngọt

pH axit

Gậy

Phiến

Sn, se

-

B12, b, n, t

Ngọt

-

Gậy
Gậy

Túi
Túi

Sn, se
An, se

S0
S0/sul

T, b, n
B, t, p-aba

Ngọt
Ngọt

Túi
Túi

Túi
Túi
ống

Sn, se
Sn, se
se
Sn, se
Ra, rh

S0/sul
-

B,t,n
B,t,n,paba
B,t,n,p-aba
B12

Ngọt
Biển
Biển
Biển
Ngọt

ống
ống
Phiến

Ly, rh. Ra
Sn, se

Sp,rv,rh

sul

Không
B,t
p-aba, b

Ngọt
Ngọt
Ngọt

Không di
ñộng
Cần NaCl
Cần NaCl
Cần NaCl
Không di
ñộng
-

Phiến
Phiến
Phiến
Phiến
Phiến

Neu*, ly*
Neu,sp
Rh,rg,rag

Sp,rv
sp

+
+

p-aba,b
p-aba, b
Không
Không
o

Ngọt
Ngọt
Ngọt
Ngọt
Biển

Bchlb
Bchlb
pH axit
Cần NaCl

sphaeroidis
Gậy ngắn
sulfidophilus
Gậy
euryhalinus
Gậy
aduriatacus

Gậy
Rhodocyclus
Bán vòng
purpureus
Tenuis
Xoắn
Rubriviax gelatinosa
Gậy
Gậy
Rhodopseudomonas
palustris
Viridis
Gậy
Sulfidoviridis
Gậy
Acidophila
Gậy
Rutila
Gậy
Marina
Gậy

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

7


Chú thích:
O:

Không xác ñịnh

B:

Biotin

Neu

Neurosporene

Bchlb:

Bacteriochlorophyll

T:

Thiamin

rag

Rhodopinal
glucoside

ICM:

Cấu trúc hệ thống bên trong

p-aba

Para aminobenzoic acid

rh

Rhodopin

màng tế bào chất
S

0:

Chỉ có lưu huỳnh nguyên tố

YE

Cao nấm men

se

Spheroidense

0

Sulphat và lưu huỳnh nguyên

aa

Amino axit

sp

Spirilloxanthin

S /sul:

tố bên ngoài tế bào
-:

Không ocid hóa sulfide

kts

Ketocarotenoids

ra

Rhodopinal

+:

Sulphide ñược ocid hóa thành

ly

lycopene

rg

Rhodopin

nhiều sản phẩm khác nhau

*

Neu :

1,2-lihydroneurosporen

Sn

spheroidenone

glucoside
*

ly

1,2-dihydrolycopene

rv

rhodovibrin

2.3. ðặc ñiểm của bộ máy quang hợp
2.3.1 Màng quang hợp
Ở vi khuẩn quang hợp tía ngoài màng cytoplasma (CM) còn có thêm hệ
thống màng Intracytoplasma (ICM) có hình thái ñặc biệt [10, 27]. Người ta
cho rằng ICM có nguồn gốc từ CM và ñược gắn với CM.[10,37,38]. Hầu hết
trong vi khuẩn quang hợp kí khí, ánh sáng và hàm lượng oxy có liên quan ñến
sự hình thành ICM, ví dụ ICM ñược cảm ứng hình thành khi có hàm lượng
oxy thấp, ICM sẽ phát triển rộng khắp trong pha sinh trưởng kị khí. Sắc tố
quang hợp của vi khuẩn quang hợp ñược gắn vào trong màng ICM hoặc trong

màng CM. Khi tế bào chứa hàm lượng các sắc tố quang hợp cao, màng gập
sâu vào phía trong vùng sinh chất. Các kiểu gập khác nhau mang tính chất ñặc
trưng cho loài và ñược chia thành các dạng: màng, dạng ống, dạng túi [9,31].

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

8


2.3.2. Sắc tố quang hợp
2.3.2.1. Bacteriochlorophyll
ðây là nhóm sắc tố quang hợp chính ở vi khuẩn quang hợp tía. Hiện
nay, bacteriochlorophyll ñược chia thành 5 nhóm: a, b,c d, e dựa vào sự khác
nhau về cấu trúc phân tử và cực ñại của phổ hấp thu trong vùng ánh sáng ñỏ.[
Bảng 1] Nhóm vi khuẩn quang hợp tía có chứa hai loại bacteriochlorophyll a
or b, nhóm vi khuẩn quang hợp màu xanh chứa chủ yếu nhóm
bacteriochlorophyll c, d or e. trong khi ñó, ở vi khuẩn tía không lưu huỳnh
Rhodospirillum chỉ có bacteriochlorophyll a.
Bảng 2.3. Phổ cực ñại hấp thu của bacteriochlorophyll [47]
Bacteriochlorophyll

Phổ cực ñại hấp thu (nm)
Trong tế bào

Chiết trong aceton

Bchl a

375, 590, 805, 830-911

358, 579, 680*, 771

Bchl b

400, 605, 835-850, 986-1035

368, 407, 582, 795

Bchl c

457-460, 745-755

433, 663

Bchl d

450, 715-745

425, 654

Bchl e

460-462, 710-725

459, 648

Giống như cholorphyll ở thực vật, Bchl bao gồm một vòng pyrol và 7
gốc hydrocacbon. Sự khác biệt giữa các gốc R dẫn ñến sự khác biệt giữa các
loại Bchl.
Khi so sánh hàm lượng của Bchl trong hai nhóm vi khuẩn quang

hợp kị khí và vi khuẩn quang hợp hiếu khí thì hàm lượng Bchl trong
nhóm vi khuẩn quang hợp kị khí luôn cao hơn. Ví dụ, trong tế bào của
loài vi khuẩn quang hợp tía R. sphaeroides có chứa khoảng 20 nmol
Bchl/mg trọng lượng khô tế bào. Trong khi ñó, hàm lượng Bchl ở các loài

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

9


vi khuẩn quang hợp hiếu khí như: E.longus là 2.0 nmol/mg trọng lượng
khô của tế bào, R.hydrolyticum là 1 – 4 nmol/mg protein, A.rubrum là 0,7
nmol/mg trọng lượng khô tế bào [14,33, 39,42]
Tạo nên màu sắc của các chủng vi khuẩn quang hợp không chỉ do
bacteriochlorophyll mà còn do carotenoid trong tế bào của chúng.
2.3.2.2. Carotenoids
Carotenoid bao gồm một lớp các sắc tố ñược tìm thấy trong các thể
prokaryote quang và không quang tự dưỡng, và các sinh vật eukaryote. Chức
năng của carotenoid là bảo vệ tế bào không bị phá hủy bởi phản ứng quang
oxy hóa, hấp thụ ánh sáng và là một thành phần cấu trúc sắc tố quang hợp
trong vi khuẩn quang hợp [1,6].
Sự phân biệt màu sắc của các chủng vi khuẩn quang hợp trong tự nhiên
là do sự khác nhau về thành phần các bacteriochlorophyll và carotenoid.
Carotenoid ñược chia thành 5 nhóm dựa vào cấu trúc phân tử và quang phổ
hấp thụ. Các nhóm carotenoid trong tế bào vi khuẩn quang hợp:

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

10

Bảng 2.4. Các nhóm carotenoid trong tế bào vi khuẩn quang hợp [48]
Nhóm
1

Tên

Thành phần chính

Normal Spirilloxanthin Series

Lycopene
Rhodopin
Spirilloxanthin

2

Alternative Spirilloxanthin Series Spheroidene
and Ketocarotenoids

Hydroxyspheroidene
Spheroidene
Hydroxyspheroidene

3

Okenone Series

Okenone

4

Rhodopinal Series

Lycopenal
Lycopenol
Rhodopin
Rhodopinal
Rhodopinol

5

Chlorobactene Series

Chlorobactene
Hydroxychlorobactene
Beta-Isorenieratene
Isorenieratene

Khoảng 20 carotenoids khác nhau ñã ñược tìm thấy trong loài E.
ramosum màu ñỏ cam, trong ñó có 10 loại ñã ñược tinh khiết và cấu trúc ñặc
trưng (Bảng 2.4) [41].
Tất cả các carotenoids tinh khiết này ñược xác ñịnh là C40 carotenoids,
ñược phân loại thành bốn nhóm: (i) Các carotenoid bicyclic (β-carotene và
các chất dẫn xuất hydroxyl như zeaxanthin, adonixanthin, caloxanthin, và
nostoxanthin),

(ii)

monocyclic

bacteriorubixanthinal

carotenoid,

(iii)

spirilloxanthin mạch hở, và (iv) carotenoid sulfate erythroxanthin (Hình 2.1).
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

11


Bảng 2.5. Công thức hóa học của một số nhóm carotenoid trong tế bào
loài E. Ramosum [48]
Carotenoid

STT.
1

Β,β-Carotene

Tên thường gọi
β-Carotene

Công thức
hóa học
C40H56

1,1′-Dimethoxy-3,4,3′4′2

tetradehydro-1,2,1′,2′-tetrahydro- Spirilloxanthin

C42H60O2

ψ,ψ-carotene
3-Hydroxy-1′-methoxy-3′,4′3

didehydro-1′,2′-dehydro-β,ψ-

Bacteriorubixanthinal C41H56O3

caroten-19′-al
4
5
6
7

8

9

10

3,3′-Dihydroxy-β,β-carotene
3,3′-Dihydroxy-β,β-carotene-4one
2,3,3′-Trihydroxy-β,β-carotene
3,2′,3′-Trihydroxy-β,β-carotene4-one (probable structure)
2,3,2′,3′-Tetrahydroxy-β,βcarotene
2,3,2′,3′-Tetrahydroxy-β,βcarotene-4-one

Zeaxanthin

C40H56O2

Adonixanthin

C40H54O3

Caloxanthin

C40H56O3

None

C40H54O4

Nostoxanthin

C40H56O4

None

C40H54O5

3,2′,3′-Trihydroxy-β,β-carotene-

Erythroxanthin

4-one-3-sulfate

sulfate

C40H54O7S

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

12


Hình 2.1. Cấu trúc hóa học carotenoid cực cao nhóm iv của loài
R.thiosulfatophilus (A) và Erythroxanthin sulfate trong tế bào của loài

E.ramosum, E. longus, and E. litoralis [48]
Bicylic carotenoid như β-caroten và các chất dẫn xuất hydroxyl của nó
ñã ñược tìm thấy ở loài Erythrobacter và Erythromicrobium, và màu sắc của
loài Erythromonas và Sandaracinobacter chỉ ra rằng các vi khuẩn này cũng
có chứa carotenoids carotene. Trong khi ñó ở các loài vi khuẩn quang hợp tía
hiếm khi xuất hiện loại carotenoid này trong tế bào của chúng (chỉ có một
lượng nhỏ β-carotene ñược phát hiện trong R. vannielii [2, 28]. Thành phần
carotenoid của các loài Roseococcus màu hồng ñỏ không phong phú như của
loài Erythrobacter và Erythromicrobium (ngoại trừ một số trường hợp không
bình thường). Ví dụ loài R. thiosulfatophilus chứa chủ yếu là hai sắc tố ñỏ
phân cực là C30 carotene-dioate t (4,4 '-diapocarotene-4, 4'-dioate) và ester
diglucosyl tương ứng (di [β-d-glucopyranosyl] -4,4 - diapocarotene-4, 4'dioate). Chúng chiếm tới 95% trong

tổng số

carotenoid của tế bào.

Carotenoid ñược tìm thấy chủ yếu trong loài vi khuẩn quang hợp tía
Rhodobacter là spheroidenone. . Carotenoid nhóm spirilloxanthin ñược tìm
thấy chủ yếu trong loài Rhodospirillum rubrum và một số vi khuẩn quang hợp
tía khác [40].

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

13


Như vậy: Các sắc tố hấp thụ ánh sáng chính trong tế bào vi khuẩn
quang hợp là Bchl và carotenoids. Những sắc tố này ñược gắn proteins màng
bằng liên kết không cùng hóa trị tạo thành trung tâm phản ứng quang hóa
(photochemical reaction center) và hệ thống thu nhận ánh sáng (LH – light
harvesting) [6].
Các vi khuẩn quang hợp tía có một hệ thống LH tương ñối ñơn giản
bao gồm một loại protein ăng – ten (LHI) liên kết chặt chẽ với trung tâm phản
ứng RC, và ở nhiều loài một hoặc nhiều khu phức hợp ăng-ten ngoại vi
(LHII) tất cả ñều ñược nằm trong ICM [45]. Lượng tử ánh sáng ñược tế bào
thu nhận qua hệ thống ăng ten. Từ ñây năng lượng ánh sáng ñược chuyển vào
trung tâm phản ứng. Trung tâm phản ứng của vi khuẩn quang hợp tía ñược
cấu tạo từ 3 tiểu phần protein (L, M và H), cùng với các cofactors: 4 phân tử
Bchls, 2 phân tử bacteriopheophytins, 2 phân tử quoinones, và một phân tử
nonheme – high spin Fe2+. Tâm phản ứng nằm trong mạch vận chuyển ñiện
tử. Trong mạch chuyển ñiện tử này xuất hiện dòng ñiện tử khi ánh sáng gây ra
quá trình tách ñiện tích ở tâm phản ứng [10]
2.3.2.3. Hệ thống vận chuyển ñiện tử quang hợp
Ở vi khuẩn quang hợp chỉ có một hệ thống quang hóa với một tâm phản
ứng. ñiều này hoàn toàn khác biệt so với ở thực vật, có ít nhất hai hệ thống
quang hóa với hai tâm phản ứng. Hệ thống vận chuyển ñiện tử ở VKQH ñược

thực hiện thông qua: quinones và cytochromes.
Quoinones:
Quoines ñược tìm thấy trong tế bào của vi khuẩn, cây trồng và ñộng
vật. Nó là hợp chất oxy hóa khử trong hệ thống vận chuyển ñiện tử của quá
trình trao ñổi chất bên trong tế bào như là quá trình hô hấp hiếu khí, kị khí và
quang hợp [20, 36, 44].

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

14