nghiên cứu bệnh do potyvirus gây ra trên cây hoa trồng bằng củ tại hà nội

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

---------

---------

NGUYỄN THỊ THU

NGHIÊN CỨU BỆNH DO POTYVIRUS GÂY RA
TRÊN CÂY HOA TRỒNG BẰNG CỦ TẠI HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: BẢO VỆ THỰC VẬT
Mã số: 60.62.10

Người hướng dẫn khoa học: TS. HÀ VIẾT CƯỜNG

HÀ NỘI - 2011


LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan!
Bản luận văn tốt nghiệp này ñược hoàn thành bằng sự nhận thức chính
xác của bản thân.
Số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực, chưa
ñược sử dụng và công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác.
Mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cám ơn và các
thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược chỉ rõ nguồn gốc.

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Thu

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………

i


LỜI CẢM ƠN

Tôi xin trân trọng cám ơn sự hướng dẫn tận tình, với tinh thần trách
nhiệm cao của Tiến sĩ Hà Viết Cường, Giáo viên bộ môn Bệnh cây- Khoa
Nông học, trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội. Trân trọng cám ơn các Giảng
viên bộ môn Bệnh cây, Khoa Nông học; các cán bộ công nhân viên của Trung
tâm Bệnh cây nhiệt ñới trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tạo ñiều kiện
giúp ñỡ về mặt kỹ thuật, dụng cụ, trang thiết bị phục vụ cho quá trình ñiều tra,
tiến hành các thí nghiệm và giúp ñỡ tôi hoàn thành luận văn này.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn của mình ñến tất cả các bạn bè,
người thân và gia ñình ñã luôn ñộng viên và tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi
hoàn thành bản luận văn này.
Hà Nội, ngày 15 tháng 9 năm 2011
Tác giả

Nguyễn Thị Thu

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………

ii

MỤC LỤC

Lời cam ñoan

i

Lời cảm ơn

ii

Mục lục

iii

Danh mục viết tắt

v

Danh mục bảng biểu

vii

Danh mục các hình

vii

1

MỞ ðẦU

i

1.1

ðặt vấn ñề

1

1.2

Mục ñích - Yêu cầu

2

2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

2.1

Cây hoa ñược trồng bằng củ

3

2.2

Potyvirus

4

2.3

Các phương pháp cơ bản dùng trong xác ñịnh virus

10

2.4

Bệnh virus hại cây hoa có củ

12

2.5

Tính kháng tập nhiễm hệ thống

17

2.5.1

ðịnh nghĩa

17

2.5.2

Tác nhân gây kích kháng

18

3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

21

3.1

ðối tượng, vật liệu, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu

21

3.2

Phương pháp nghiên cứu

23

4

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

34

4.1

Bệnh virus trên cây hoa trồng bằng củ

34

4.1.1

Mô tả triệu chứng

34

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………

iii


4.1.2

ðiều tra tình hình bệnh virus trên hoa trồng bằng củ vụ ñông
xuân 2011

4.2

36

Kết quả kiểm tra virus (TMV và CMV) trên một số mẫu bệnh
cây hoa trồng bằng củ.

37

4.3

Xác ñịnh virus bằng RT-PCR dùng mồi ñặc hiệu chi Potyvirus

39

4.3

Xác ñịnh LMoV trên hoa bằng RT-PCR dùng mồi ñặc hiệu

42

4.4

Xác ñịnh potyvirus gây bệnh khảm lá hoa loa kèn ñỏ

44

4.4.1

RT-PCR nhân vùng 3’ bộ gen potyvirus

44

4.4.2

Kết quả dòng hóa sản phẩm RT-PCR

46

4.4.3

Kết quả giải trình tự

50

4.4.4. Kết quả tìm kiếm chuỗi tương ñồng trên ngân hàng gien

54

4.4.5

Phân tích gen CP

56

4.4.6

Phân tích phả hệ dựa trên vùng CP

57

4.4.7

Kết quả xác ñịnh phổ ký chủ của virus mới

63

4.5

Kết quả ñánh giá hiệu lực phòng trừ LMoV của chất kích kháng
trên cây loa kèn trắng.

64

5

KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ

69

5.1

Kết luận

69

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………

71

iv


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ðHNNHN
NCBI

:

ðại học Nông nghiệp Hà Nội

:

National Center for Biotechnology Information

OD

Optical density
Reverse Transcriptional – Polymerase Chain

RT-PCR

:

KHT

:

Kháng huyết thanh

LKð

:

Loa kèn ñỏ

LKT

Reaction

Loa kèn trắng

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………

v


DANH MỤC BẢNG BIỂU
STT

Tên bảng

Trang

3.1

Các mồi dùng trong nghiên cứu

4.1

Triệu chứng chính của 3 bệnh giống bị nhiễm virus trên 3 cây

25

hoa trồng bằng củ

34

4.2

Tỷ lệ bệnh virus trên một số cây hoa trồng bằng củ.

36

4.3

Kiểm tra ELISA một số Virus trên các mẫu bệnh thu thập

38

4.4

Kết quả phản ứng RT-PCR với mồi ñặc hiệu Potyvirus

40

4.5

Kết quả kiểm tra RT-PCR với mồi ñặc hiệu LMoV trên các mẫu
hoa loa kèn ñỏ và hoa loa kèn trắng

43

4.6

Kết quả RT-PCR nhân vùng 3’ bộ gen potyvirus trên hoa loa kèn ñỏ

45

4.7

Kiểm tra PCR khuẩn lạc của 2 mẫu LKð-1 và 4

47

4.8

Kiểm tra sản phẩm Miniprep bằng enzyme cắt giới hạn

49

4.9

Kết quả giải trình tự sản phẩm RT-PCR

50

4.10

Kết quả tìm kiếm trên ngân hang gen bằng phần mềm Blast

54

4.11

So sánh trình tự gen CP của mẫu virus dòng LKð-1-3 với các
mẫu virus gần gũi nhất trên ngân hàng gen

58

4.12

Danh tính các potyvirus ñược sử dụng trong phân tích phả hệ

59

4.13

Kết quả lây nhiễm nhân tạo bệnh virus trên hoa loa kèn ñỏ

63

4.14

Tỉ lệ bệnh trước và sau khi xử lý chất kích kháng

66

4.15

Hiệu lực phòng trừ của các chất kích kháng

67

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………

vi

DANH MỤC CÁC HÌNH
STT

Tên hình

Trang

2.1

Hình thái virion của potyvirus ( />
5

2.2

Tổ chức bộ gien và chiến lược dịch mã của potyvirus

6

3.1

Bản ñồ giới hạn Vector pTZ57R/T

4.1

Bệnh khảm lá hoa loa kèn trắng (1, 2), biến dạng lá hoa ly (3)
khảm lá hoa loa kèn ñỏ (4)

4.2

22
35

Kết quả kiểm tra virus CMV và TMV trên cây hoa Loa kèn
trắng, loa kèn ñỏ, Ly bằng ELISA

39

4.3

Sơ ñồ bộ gen potyvirus và vị trí tương ñối của 2 cặp mồi

39

4.4

RT-PCR phát hiện potyvirrus trên loa kèn trắng và loa kèn ñỏ
dùng cặp mồi chung CIFor/CIRev.

41

4.5

Vị trí cặp mồi ñặc hiệu LMoV trên bộ gen potyvirus

42

4.6

Phát hiện LMoV bằng RT-PCR trên các mẫu loa kèn trắng và loa

kèn ñỏ bị bệnh khảm lá.

4.7

Sơ ñồ tổ chức bộ gen potyvirus và vị trí tương ñối của 3 mồi
NIbFor1, N1 và mồi N1T.

4.8

43
45

Kết quả RT-PCR nhân vùng 3’ bộ gien potyvirus trên hoa loa
kèn ñỏ

46

4.9

Nuôi tế bào vi khuẩn E.coli ñã ñược biến nạp plasmid tái tổ hợp

47

4.10

Kiểm tra PCR khuẩn lạc bằng cặp mồi Vector SeqFor/Vector
SeqRev

4.11

48

Kiểm tra sản phẩm miniprep bằng cắt kép với BamHI và ECoRI.
M là thang DNA (GeneRuler 1 kp, Fermentas) với các băng tham
khảo ñược chỉ rõ bằng mũi tên.

4.12

49

Trình tự sản phẩm RT-PCR và minh họa một phần ñồ thị trình tự 53

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………

vii


4.13

Trình tự amino acid của protein CP của 3 mẫu virus và motif
DAG ở ñầu N cần cho lan truyền qua vector

4.15

Cây phả hệ dựa trên trình tự gen CP của các potyvirus. Chỉ trình
bày giá trị boostrap > 50% (1000 lần lặp).

4.16

64

Thí nghiệm ñánh giá hiệu lực phòng trừ LMoV của chất kích
kháng trên ruộng cây loa kèn trắng

4.18

62

Triệu chứng lây nhiễm nhân tạo bệnh virus trên cây hoa loa kèn
ñỏ

4.17

57

65

So sánh triệu chứng ở cây ñược xử lý chất kích kháng Salicylic
acid 1.0 mM (1) và cây ở công thức ñối chứng (2)

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………

67

viii


1. MỞ ðẦU

1.1. ðặt vấn ñề

Hoa ñóng vai trò quan trọng trong cuộc sống của con người, là sản
phẩm vừa mang giá trị tinh thần vừa mang giá trị kinh tế. Hiện nay ở nước ta,
trong chương trình chuyển dịch cơ cấu cây trồng, cây hoa lại càng ñược quan
tâm. Hàng năm có nhiều giống hoa ñược lai tạo và nhập nội, nhiều tiến bộ kỹ
thuật mới ñược nghiên cứu và áp dụng trong sản xuất nên diện tích trồng hoa
ngày càng ñược nâng cao.
Hoa ñược trồng lâu ñời và tập trung một số vùng trồng hoa truyền
thống như Ngọc Hà, Quảng An, Tây Tựu (Hà Nội), ðằng Hải, ðằng Lâm
(Hải Phòng), Hoành Bồ, Hạ Long (Quảng Ninh), Triệu Sơn (Thanh hoá), Gò
Vấp, Hóc Môn (TP. Hồ Chí Minh)...với tổng diện tích trồng khoảng 3500 ha.
Trong các loại hoa tươi ñược tiêu thụ ở Việt Nam thì hoa ly, lily trắng,
lay ơn là những loại hoa trồng bằng củ ñược ưa chuộng nhất. ðây có thể ñược
coi là những loài hoa cao cấp không chỉ bởi vẻ ñẹp, sự sang trọng mà còn bởi
chi phí ñầu tư cho sản xuất cũng như chăm sóc vô cùng tốn kém. Chủng loại
của chúng ngày càng ña dạng và phong phú theo thị hiếu của người tiêu dùng
.Ngày nay, việc sản xuất hoa trồng bằng củ chịu nhiều thiệt hại ñáng kể do
virus gây ra. Hầu hết các virus gây bệnh thuộc chi Potyvirus - chi lớn nhất
trong sáu chi của họ Potyviridae. Bệnh do Potyvirus gây thiệt hại nghiêm
trọng ñến thẩm mỹ và kinh tế cho nhà trồng hoa. Chi virus này xuất hiện phổ
biến ở các nước nhiệt ñới và cận nhiệt ñới như Việt Nam. Virus có thể gây ra
nhiều triệu chứng khác nhau ở cây ký chủ như khảm, ñốm, sáng gân, lùn cây,
héo, còi cọc….
Tại Việt Nam, chưa có nhiều công trình nghiên cứu về Potyvirus trên
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………

1


cây hoa trồng bằng củ .Vì vậy, ñể có thể góp phần cung cấp thêm thông tin về
loài virus này ñể từ ñó có biện pháp phòng trừ hợp lý, ñạt hiệu quả cao, dưới

sự hướng dẫn của TS. Hà Viết Cường, bộ môn Bệnh cây, khoa Nông học
chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: “Nghiên cứu bệnh do Potyvirus gây
ra trên cây hoa trồng bằng củ tại Hà Nội”.
1.2. Mục ñích - Yêu cầu
1.2.1. Mục ñích
ðiều tra bệnh do Potyvirrus trên cây hoa trồng bằng củ.
Tìm hiểm khả năng phòng trừ bệnh khảm lá hoa loa kèn trăng
(Lily mottle virus, LMoV) bằng chất kích kháng.
1.2.2. Yêu cầu
ðiều tra xác ñịnh virus trên cây hoa trồng bằng củ (hoa Loa kèn
trắng, hoa loa kèn ñỏ, hoa Ly) tại Hà Nội.
Kiểm tra ELISA trên các mẫu bệnh trên cây hoa Loa kèn trắng,
hoa loa kèn ñỏ, hoa Ly.
Kiểm tra RT-PCR, PCR trên một số mẫu bệnh trên cây hoa Loa
kèn trắng, cây hoa loa kèn ñỏ.
Nhân dòng và giải trình tự mẫu loa kèn ñỏ phản ứng RT-PCR
dương tính.
Phân tích trình tự.
ðánh giá khả năng lây nhiễm virus trên một số cây kí chủ.
ðánh giá hiệu quả phòng trừ LMoV bằng chất kích kháng.

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………

2


2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Cây hoa ñược trồng bằng củ
Cây hoa trồng bằng củ thuộc hơn 800 chi khác nhau, rất ña dạng về

hình thái, có thể thuộc nhiều họ thực vật khác nhau như: Liliaceae (white lily,
easter lily, tulip, hoa hiên), Iridaceae (lay ơn, diên vĩ, nghệ tây - Crocus spp.),
Agavaceae (hoa huệ, thùa), Amaryllidaceae (loa kèn ñỏ, thủy tiên, náng, ngọc
trâm), Asteraceae (thược dược), Cannaceae (chuối hoa)…
Cây hoa trồng bằng củ ñược ñánh giá là loài hoa sang trọng, có giá trị
thẩm mỹ cao nên ñược nhiều người tiêu dùng ưa chuộng. Cây hoa trồng bằng
củ có ñóng góp ñáng kể cho ngành công nghiệp trang trí toàn cầu, ñược sử
dụng ñể sản xuất thương mại hoa và củ. Các cây hoa có thể ñược dùng làm
hoa cắm lọ trong gia ñình, văn phòng, ñược sử dụng nhiều trong các ngày lễ
tết, trang trí hội trường, làm quà tặng,… Ngoài giá trị thưởng thức, nhiều loài
còn có tác dụng chữa bệnh. Chẳng hạn như, hoa hiên có vị ngọt, tính mát,
thường dùng làm thuốc lợi tiểu, giảm ñau, chữa sốt, thân thể bị vàng, tiểu tiện
khó khăn, lỵ, chảy máu cam, sưng ñau khớp xương, nôn ra máu…(Võ Văn
Chi, 1999).
Trên thế giới, giá trị của ngành công nghiệp sản xuất hoa ước tính trên
1 tỷ ñô la, và loài phổ biến là tulip và lily. Việc nhập khẩu và sử dụng hoa
trồng bằng củ ñóng một vị trí ñáng kể trong sản xuất hoa cắt toàn cầu. Hà
Lan, nước ñứng ñầu thế giới về sản xuất củ hoa, năm 2005 ñã ñạt 29.491 ñôla
Mỹ/ha, giá trị xuất khẩu là 34.048 ñô la/ha. Tổng giá trị xuất khẩu năm 2005
ñạt 756 tỷ ñô la/ha, tron khi tổng giá trị xuất khẩu có các nước liên minh Châu
Âu ñạt trên 837 tỷ ñô la.
Có ít nhất là 15 quốc gia sản xuất củ tulip, vùng sản xuất lớn nhất là Hà
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………

3


lan với 10. 800 ha (chiếm 88 % diện tích toàn thế giới). Củ tulip cũng ñược
sản xuất ở Nhật bản (300 ha), Pháp (293 ha), ðức (155 ha), New Zealand
(122 ha).

Trong các nước sản xuất củ Lily, vùng lớn nhất là Hà Lan với 4. 280 ha
chiếm 77%, tiếp ñó là Pháp (401 ha), Chi Lê (205 ha), Mỹ (200 ha), Nhật Bản
(189 ha) và New Zealand (110 ha). (Benschop , 2010)
Tại Việt Nam hiện có nhiều vùng trồng hoa như: ðà Lạt (Lâm ðồng),
Mê Linh (Vĩnh Phúc), Tây Tựu, ðằng Hải (Hải Phòng), Sapa (Lào Cai)... ðà
Lạt là nơi hiện ñang có diện tích trồng Lily nhiều nhất so với các ñịa phương
khác trên cả nước (chiếm khoảng 8% trong tổng diện tích trồng hoa), còn ở
Hà Nội, Hải Phòng chỉ mới trồng mang tính chất thử nghiệm. Tình hình phát
triển hoa Lily ở ðà Lạt khá thuận lợi, một phần do thiên nhiên ưu ñãi cho sự
phát triển của các giống hoa nói chung và cho hoa Lily nói riêng, một phần
do kỹ thuật trồng Lily của ðà Lạt tương ñối cao nên hoa sinh trưởng phát
triển khá tốt. Lily, trong ñó hoa loa kèn (Lilium longiforum var Rairan) là
giống hoa mới có nguồn gốc tại Hà Lan. Hiện nay cây hoa loa kèn trồng khá
phổ biến ở Việt Nam. ðây là giống loa kèn cho hoa to, màu trắng, có mùi
thơm dịu, thích hợp với các ñiều kiện ñất ñai, khí hậu thời tiết ở các tỉnh phía
Bắc nước ta, ñặc biệt là vùng ñồng bằng sông Hồng. Thời gian từ trồng ñến
thu hoạch ngắn, chỉ từ 80 ñến 90 ngày tùy theo từng thời vụ. Giống ưa cường
ñộ ánh sáng trung bình; có khả năng chịu nóng khá, ưa khí hậu lạnh và ẩm,
nhiệt ñộ thích hợp ban ngày 20-28oC, ban ñêm 13-17oC (có khả năng chịu
ñược tới 32-35oC).
2.2. Potyvirus
2.2.1. Giới thiệu
Chi Potyvirus là chi lớn nhất trong họ Potyviridae với khoảng 200 loài.
Như vậy, cùng với chi Begomovirus (họ Geminiviridae), Potyvirus là chi
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………

4


virus thực vật lớn nhất, chiếm khoảng 20% tổng số virus thực vật.

Nhiều potyvirus là các tác nhân gây bệnh cây có ý nghĩa kinh tế. Ví dụ:
• Papaya ringspot virus (PRSV) là bệnh virus số 1 hại ñu ñủ và bầu bí.
• Turnip mosaic virus (TuMV) hại cây rau họ thập tự và ñược xem là
virus quan trọng thứ 2 trên cây rau.
• Bean common mosaic virus (BCMV) trên cây họ ñậu.
• Potato virus Y (PVY) trên cây khoai tây và các cây họ cà khác.
• Plum pox virus (PPV) là virus quan trọng nhất trên cây quả hạch như
ñào, táo, lê, mận.
Phần lớn virus trong họ có phổ ký chủ hẹp hoặc rất hẹp nhưng một số ít
lại có phổ ký chủ rất rộng, nhiễm cả trên cây 1 và 2 lá mầm.
2.2.2. ðặc ñiểm phân tử virus (virion)
Phân tử potyvirus có hình sợi mềm, kích thước 11-15 x 650-950 nm
(Dougherty, 1988). Mỗi phân tử virion ñược cấu tạo từ 1700-2000 tiểu phần
protein sắp xếp theo kiểu xoắn ñối xứng xung quanh phân tử RNA genome
(Shukla et al., 1998).

Hình 2.1: Hình thái virion của potyvirus ( />Acid nucleic: Tất cả các potyvirus có chứa 1 phân tử RNA genome sợi ñơn,
cực (+), kích thước khoảng 10 kb (Shukla et al., 1998). Tổ chức bộ gen của
các potyvirus giống nhau, tính từ trái sang phải là:
ðầu 5’ chứa 1 vùng không dịch mã (5’UTR).
Một khung ñọc mã ORF (open reading frame) ñơn, lớn gọi là
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………

5


ORF chính (major ORF).
ðầu 3’ chứa 1 vùng không dịch mã (3’UTR) và 1 chuỗi polyA
(Hari, et al., 1979; Takahashi, et al., 1997).

Hình 2.2: Tổ chức bộ gien và chiến lược dịch mã của potyvirus
( />Protein:
Bộ gen virus chứa 1 ORF lớn, mã hóa 1 polyprotein.
Polyprotein sẽ ñược xử lý sau dịch mã thành 10 protein chức năng:
protein P1, protein bổ trợ (Helper component protein, HC-Pro), protein P3,
protein 6K1, protein thể vùi tế bào chất (CI), protein 6K2, protein VPg (viral
protein genome-linked, Hari, 1981; Siaw et al., 1985; Riechmann et al., 1989;
Murphy et al., 1990), protein NIa-pro (major protease of small nuclear
inclusion protein - NIa), protein NIb (large nuclear inclusion protein) và
protein vỏ (coat protein, CP) (Shukla et al., 1998). Protein VPg gắn vào ñầu
5’ của RNA genome.
Thể vùi: các potyvirus thường tạo các thể vùi ñặc trưng.

Tất cả các potyvirus ñều hình thành thể vùi trong tế bào chất hình trụ.
Thể vùi tế bào chất hình thành từ protein CI (cytoplasmic
inclusions, CI), có hình dạng ñặc trưng (hình vòng bánh xe, hình phiến,…)
cho potyvirus và do ñó có giá trị chẩn ñoán.
Một số virus lại hình thành thể vùi trong nhân gọi là thể vùi nhân
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………

6


(nuclear inclusion, NI). Thể vùi nhân ñược cấu tạo bởi 2 protein là NIa và
NIb. Một số virus cũng hình thành thể vùi trong nhân nhưng hình dạng thể vùi
không xác ñịnh gọi là thể vùi vô ñịnh hình (amorphor inclusion, AI) ñược cấu
tạo bởi protein HC-Pro.
2.2.3. Chức năng các protein
P1
P1 là 1 proteinase. P1 là vùng biến ñộng nhất của bộ gen. P1 có hoạt

tính proteinase và sẽ tự cắt liên kết P1/HC-Pro sau dịch mã ñể giải phóng P1.
P1 tương tác với RNA. P1 có khả năng liên kết với RNA của virus,
do vậy nó có vai trò trong quá trình vận chuyển virus.
P1 tham gia ức chế phản ứng phòng thủ của tế bào ký chủ (thông
qua cơ chế câm gen).
HC-Pro
HC-Pro cần thiết cho sự lan truyền qua vector. Vai trò này của
protein HC-Pro ñược thể hiện qua cơ chế bắc cầu. HC-Pro ñóng vai trò là một
phân tử cầu nối, trong ñó phần ñầu N của nó (thông qua motif bảo thủ cao
KITC) sẽ liên kết với receptor ở bề mặt phía trong của vòi aphid, còn phần
trung tâm của nó (thông qua motif PTK) sẽ liên kết với protein vỏ của virion.
Nhờ cầu nối này mà phân tử virus ñược giữ lại ở phần vector.
HC-Pro cần cho virus di chuyển hệ thống và di chuyển giữa các tế
bào. HC-Pro là một protein vận chuyển (MP) của potyvirus. HC-Pro làm tăng
kích thước giới hạn (size exclusion limit, SEL) của sợi liên bào và do ñó cho
phép RNA của virus có thể di chuyển giữa các tế bào.
HC-Pro có hoạt tính proteinase. ðầu C của HC-Pro có hoạt tính
proteinase, cho phép nó tự cắt khỏi liên kết giữa HC-Pro và P3.
HC-Pro cần cho sự tái bản (thông qua motif IGN).
HC-Pro có thể ức chế bộ máy câm gen của tế bào. ðây là một chức
năng quan trọng của potyvirus chống lại phản ứng phòng thủ của cây.
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………

7


P3
P3 cũng là vùng biến ñộng và ít ñược nghiên cứu chức năng. P3 ñược
biết là quy ñịnh tính gây bệnh của virus thông qua tương tác với các protein
khác của virus.

CI
CI là thành phần chính của phức hợp tái bản virus. CI có hoạt tính
helicase, hoạt tính liên kết RNA, hoạt tính thủy phân ATP. Tất cả các hoạt
tính này ñều cần thiết cho CI tháo xoắn cấu trúc trung gian sợi kép của RNA
virus trong quá trình tái bản.
CI cần cho sự di chuyển của virus giữa các tế bào. Quá trình di
chuyển giữa các tế bào yêu cầu năng lượng. Do CI có hoạt tính ATPase nên
nó ñảm nhận vai trò cung cấp năng lượng cho quá trình vận chuyển virus qua
các tế bào. Ngoài ra, CI tương tác trực tiếp với plasmodesmata và phức hợp
ribonucleoprotein của virus ñể tạo ñiều kiện thuận lợi cho quá trình di chuyển.
6K1 và 6K2
6K1 tương tác với P3 ñể quy ñịnh tính gây bệnh của virus.
6K2 là một protein mỏ neo giúp liên kết bộ máy tái bản của virus
vào mạng lưới nội chất – nơi thực hiện quá trình tái bản.
VPg
VPg chính là phần ñầu N của NIa. VPg cũng là một protein cấu trúc
vì ngoài protein CP, nó có mặt trong phân tử virus. VPg liên kết vào ñầu 5’
của RNA virus và bảo vệ phân tử RNA khỏi bị phân hủy.
VPg cần cho quá trình tái bản bộ gen virus, di chuyển hệ thống của
virus trong cây.
VPg tương tác với yếu tố khởi ñầu dịch mã của tế bào như eIF4E và
eIF(iso)4E, do ñó cho phép ribosome có thể tiếp cận RNA virus ngay sau khi
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………

8


tháo vỏ ñể thực hiện quá trình dịch mã. Cần chú ý là potyvirus có bộ gen
RNA sợi ñơn cực (+), phân tử RNA genome của virus không ñược mũ hóa
nên quá trình dịch mã ORF trên bộ gen virus là một quá trình dịch mã ñộc lập

mũ CAP.
VPg là một protein Avr cho potyvirus. Nhiều gen kháng của thực vật
ñối với potyvirus ñã ñực chứng minh là các gen lặn, ví dụ như pvr1 (ớt), mo1
(rau diếp), sbm1 (ñậu) và rym4/5 (lúa miến). Các gen này thực chất mã hóa
yếu tố khởi ñầu dịch mã eIF4E. Khi các gen này (ở trạng thái ñồng hợp tử),
mang các ñột biến phá vỡ tươnng tác VPg - eIF4E ñã dẫn tới kiểu hình kháng.
NIa-Pro
NIa-Pro là phần ñầu C của protein NIa. Nó là một protease chính của
virus. ðầu C của NIa-Pro có hoạt tính protease cho phép nó cắt các liên kết
P3/6K1, 6K1/CI, CI/6K2, 6K2/VPg, VPg/NIa-Pro, NIa-Pro/NIb và NIb/CP ñể
giải phóng ra các protein chức năng ñơn lẻ.
Nib
NIb là một RNA dependent RNA polymerase (RdRp). ðây là một chức
năng quan trọng cho phép bộ gen virus ñược tái bản từ sợi (+) sang sợi (-) và
ngược lại.
CP
CP của potyvirus ñã ñược nghiên cứu rất kỹ. Protein CP có thể ñược
chia làm 3 phần (ñầu N, trung tâm và ñầu C). ðầu N là phần nhô lên bề mặt
phân tử, khá biến ñộng về trình tự và chứa các epitope ñặc hiệu cho virus ở
mức loài và mức chủng. Phần trung tâm và ñầu C bảo thủ hơn và mức biến
ñộng của 2 phần này tương ñương mức biến ñộng chung trên toàn bộ bộ gen.
Chính vì vậy, CP, ñặc biệt phần ñầu C và trung tâm hay ñược sử dụng trong
ñánh giá ña dạng virus.
CP có vai trò quan trọng trong lan truyền qua vector. ðầu N của CP
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………

9


chứa 1 motif bảo thủ cao (DAG). Thông qua motif này, phân tử virus sẽ liên

kết với HC-Pro theo lý thuyết bắc cầu ñể lan truyền qua vector rệp muội.
CP có vai trò quan trọng trong di chuyển hệ thống và di chuyển
giữa các tế bào. CP cùng với HC-Pro là 2 protein vận chuyển (MP) của
potyvirus. Cả 2 protein này ñều làm tăng kích thước giới hạn (SEL) của lỗ
liên bào và do ñó cho phép virus di chuyển giữa các tế bào.
CP là một protein cấu trúc tạo virion.
CP ñiều khiển quá trình tái bản RNA virus.
2.2.4. Lan truyền
Lan truyền ngoài tự nhiên bằng rệp muội theo kiểu không bền vững.
Nhiều virus truyền qua vật liệu giống như củ giống (PVY - khoai tây;
OYDV, LYSV, SYSV - hành tỏi), hạt (BCMV - ñậu ñỗ), qua phấn hoa
(BCMV - ñậu ñỗ).
Có thể truyền qua tiếp xúc cơ học.
2.3. Các phương pháp cơ bản dùng trong xác ñịnh virus
2.3.1. Chiết tách acid nucleic tổng số
Hiện nay có rất nhiều quy trình chiết tách acid nucleic tổng số khác
nhau nhưng nói chung ñều gồm các bước cơ bản sau:
Bước 1: phá vỡ màng tế bào cũng như màng nhân nhằm giải phóng
acid nucleic.
Bước 2: ức chế hoạt ñộng của các enzym thủy phân acid nucleic bằng
EDTA. EDTA sẽ liên kết với các ion hóa trị 2 như: Mg2+, Cu2+, Mo2+, …là
những ion cần thiết cho sự hoạt ñộng của enzym.
Bước 3: kết tủa protein, lipid và các tạp chất bằng hóa chất hoặc ly tâm.
Bước 4: kết tủa acid nucleic tổng số.
Bước 5: rửa tủa bằng cồn tuyệt ñối hoặc cồn 75%, ñể khô và hòa tan
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………

10

tủa bằng nước cất vô trùng, bảo quản trong tủ -20°C.
2.3.2. Tinh chiết phân tử virus
Nguyên lý cơ bản của tinh chiết phân tử virus là ly tâm ở các tốc ñộ
khác nhau.
Các loài virus khác nhau có quy trình tinh chiết khác nhau.
2.3.3. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
Phương pháp PCR ñược Kary Mullis và cs phát minh vào năm 1985, là
một phương pháp phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuếch ñại một ñoạn
DNA bên ngoài cơ thể sống trong thời gian ngắn.
Thành phần phản ứng PCR gồm có:
1. DNA mẫu (template): ñoạn DNA cần khuếch ñại.
2. Cặp mồi (primer): nhân tố khuếch ñại, xác ñịnh ñiểm bắt ñầu và kết
thúc vùng cần khuếch ñại.
3. DNA-polymerase chịu nhiệt: tổng hợp DNA.
4. Nucleotides - dNTPs (A, T, G, C): là nguyên liệu ñể tổng hợp
DNA mới.
5. Dung dịch ñệm, MgCl2: môi trường cho DNA-polymerase hoạt
ñộng.
Phản ứng PCR ñược thực hiện theo một chu trình nhiệt ñịnh sẵn tròng
máy PCR. Quy trình phản ứng PCR khoảng từ 20 - 30 chu kỳ nhiệt. Mỗi chu
kỳ gồm 3 bước:
1. Giai ñoạn biến tính (denaturation): nhiệt ñộ tăng lên 94 - 96°C ñể
tách hai sợi DNA ra. Thời gian: 1-2 phút.
2. Giai ñoạn gắn mồi (annealing): nhiệt ñộ giảm xuống 45 – 60°C ñể
mồi có thể gắn vào sợi DNA ñơn. Thời gian: 30 - 60s.
3. Giai ñoạn tổng hợp (elongation): nhiệt ñộ tăng lên 70 - 72°C thích
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………

11

hợp cho enzym DNA polymerase bám vào và hoạt ñộng dọc theo sợi DNA.
Thời gian của bước này phụ thuộc vào cả DNA polymerase và chiều dài mảnh
DNA cần khuếch ñại.
2.3.4. Phương pháp RT-PCR (Reverse Transcriptase - Polymerase Chain
Reaction)
RT-PCR là phương pháp nhân một ñoạn DNA mục tiêu dựa trên khuôn
là RNA. Phương pháp này gồm 2 bước:
1. Tổng hợp cDNA (DNA bổ sung) từ khuôn ARN nhờ enzym phiên
mã ngược, ngoài ra còn cần có mồi (mồi ngẫu nhiên – Random hexamer
primer hoặc mồi ñặc hiệu).
2. Khuếch ñại ñoạn cADN bằng PCR sử dụng cặp mồi ñặc hiệu.
2.4. Bệnh virus hại cây hoa có củ
2.4.1. Hippeastrum mosaic virus (HiMV)
Hippeastrum là một chi trong họ Amaryllidaceae, có khoảng 90 loài
với hơn 600 giống cây trồng và cây lai (Stevens, 2001), có nguồn gốc từ vùng
nhiệt ñới và cận nhiệt ñới của châu Mỹ từ phía Bắc Argentina tới Mexico và
vùng Caribbean. Chi này gồm các loài cây thân thảo sống lâu năm, mọc ra
từ thân hành, thường có hoa sặc sỡ và nhiều loài ñược trồng làm cảnh.
HiMV là một potyvirus. Bệnh do HiMV gây ra ñược mô tả lần ñầu tiên
bởi Kunkel vào năm 1922 trên cây Hippeastrum hybridum (Kunkel, 1922).
Dọc theo phiến lá và cuống hoa của cây bệnh xuất hiện những vết khảm sọc,
ñứt quãng (Brunt et al., 1973). Phân tử HiMV có hình sợi mềm, kích thước
782 x 12 nm. Mỗi phân tử virion ñược cấu tạo từ các tiểu phần protein sắp
xếp theo kiểu xoắn ñối xứng xung quanh 1 phân tử RNA genome (Brunt,
1973; Jayasinghe & Dijkstra, 1979).
HiMV không truyền qua hạt giống, không truyền qua phấn hoa. Virus
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………

12

ñược truyền bằng tiếp xúc cơ học nhưng ñây không phải là con ñường lan
truyền ngoài tự nhiên của virus. Ngoài tự nhiên, virus lan truyền qua rệp như
Myzus persicae, Aphis fabae, A. gossypii theo kiểu không bền vững.
Virus có thể ñược xác ñịnh bằng phương pháp RT-PCR sử dụng cặp
mồi chung cho Potyvirus. Ngoài ra, có thể xác ñịnh virus bằng cách quan sát
thể vùi trong tế bào cây bệnh với hình dạng ñặc trưng cho potyvirus như hình
trụ, hình vòng bánh xe, hình phiến. Hầu hết các tế bào bệnh ñều có chứa 1 thể
vùi, nằm gần hoặc áp sát vào nhân tế bào và lục lạp của những tế bào này
thường nhỏ hơn so với các tế bào bình thường.
Ký chủ tự nhiên của HiMV mới chỉ tìm thấy trên các cây họ thuộc
Amaryllidaceae, nhưng thông qua phương pháp nhiễm bệnh bằng tiếp xúc cơ
học thì virus có thể gây bệnh trên một số cây thuộc các họ Amaranthaceae,
Chenopodiaceae và Solanaceae.
2.4.2.Vallota speciosa virus
Cây Vallota speciosa (Scarborough Lily) thuộc chi Cyrtanthus, họ
Amaryllidaceae, là cây thân thảo sống lâu năm, mọc ra từ thân hành, có
nguồn gốc từ Nam Phi, hoa thường nở vào cuối mùa hè ñầu mùa thu (Stevens,
2001). Hoa hình phễu, có nhiều màu sắc khác nhau như ñỏ tươi, cam, vàng,
hồng trắng.
Vallota speciosa virus là một potyvirus mới ñược công bố gần ñây vào
năm 2006 tại New Zealand (Wei et al., 2006). Ký chủ tự nhiên của virus này
mới chỉ ñược phát hiện trên cây hoa thủy tiên (chi Narcissus) (Wei et al.,
2006; Nixon et al., 2008; Wylie et al., 2010).
2.4.3. Lily mottle virus (LMoV)
LMoV là một potyvirus. LMoV ñược xem là virus phổ biến và nguy
hiểm nhất trên cây hoa trồng bằng củ. Virus còn ñược gọi dưới một số tên như
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………

13


Lily streak mottle virus (Brierley & Smith, 1944) và cho ñến năm 1990 vẫn
ñược gọi là Tulip breaking virus (TBV) (Dekker et al., 1993; Derks et al.,
1994, dẫn theo Asjes, 2000).
Triệu chứng của LMoV trên lily biến ñổi theo tính mẫn cảm của cây.
Triệu chứng có thể biến ñổi từ sáng gân, ñốm lá, khảm lá, vệt vàng hoặc xanh
nhạt, xoăn và co rút lá, những vết ñốm chết hoại màu hơi ñỏ nâu cho ñến các
dạng nhẹ hơn của triệu chứng lá hay thậm chí là sự nhiễm không biểu hiện
triệu chứng ở một số giai ñoạn phát triển trên ñồng ruộng. Một số cây có thể
biểu hiện vệt trên màu sắc hoa và hoa bị dị hình, không ñối xứng, trong khi
những cây khác có thể biểu hiện các ñốm hình nhẫn chết hoại màu nâu trên
các vảy của củ. Cây thường thấp hơn và chết sớm, hoa cắt nhanh tàn.
Việc phát hiện virus ở những cây bị nhiễm bệnh phụ thuộc vào virus,
ñộ mẫn cảm của cây trồng và ảnh hưởng của ñiều kiện trồng . Mức ñộ ña
dạng về triệu chứng của LMoV khiến cho việc loại bỏ các cây bị bệnh trên
ñồng ruộng không dễ dàng.
Trong những năm gần ñây, kỹ thuật RT-PCR và ELISA ñã ñược sử
dụng ñể nhận biết những chủng virus trên các cây trồng. LMoV ñược phát
hiện bằng kỹ thuật RT-PCR với mồi ñặc hiệu. Gen quy ñịnh protein vỏ ñã
ñược giải trình tự sau khi phân lập dòng cDNA phần ñầu 3’ của bộ gen virus
(Brierley & Smith, 1944 dẫn theo Derks et al., 1994). So sánh phương pháp
ELISA và RT-PCR, Yoshiji (2002) chỉ ra rằng RT-PCR nhạy hơn là ELISA
trong việc xác ñịnh sự có mặt của virus trong các cây lily. ðộ tin cậy của các
thử nghiệm thay ñổi rất ít khi tiến hành vào giữa tháng 11 và tháng 3. Sự khác
nhau về mức ñộ tập trung của virus ñược xác ñịnh ở các vảy ñơn riêng rẽ của
các củ (van Schadewijk, 1986).
Sự phát hiện ra virus trong củ của các cây thuộc họ Liliaceae phụ thuộc
vào virus, ký chủ và ñiều kiện bảo quản. Bảo quản củ của các cây lai Châu Á

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………

14


ở nhiệt ñộ 0-2 °C trong thời gian ít nhất từ 2-3 tuần trước khi ñem kiểm tra
ELISA sẽ phát hiện ñược Lily symptomless virus (LSV) và LMoV một cách
ñáng tin cậy. Nhưng nếu áp dụng qui trình này cho các cây Lilium
longiflorum thì hầu như không phát hiện ñược LMoV. Việc phát hiện virus
này ñược cải thiện rõ rệt sau khi bảo quản vảy ở 20°C trong 2-3 tuần dưới ánh
sang huỳnh quang trắng (12 – 16 giờ/ngày, 13- 16 W/ m2 ). Qui trình này
không áp dụng ñược cho các giống lai phương ðông. ðể khắc phục khó khăn
này có thể tiến hành thử nghiệm lá của những cây lai phát triển từ các củ bị
bệnh từ vụ trước vào những thời ñiểm thích hợp (P. Narayanasamy , 2010 dẫn
theo Derks, 1997).
LMoV truyền theo kiểu không bền vững bởi rệp muội Myzus persicae ,
Aphis gossypii, Macrosiphum euphorbiae. Virus ñược truyền qua dịch cây và
không qua hạt giống của lily (Brierley và Smith, 1944 dẫn theo Derks, 1997).
Nghiên cứu về mối quan hệ giữa vectơ và virus LMoV, Sharma ( 2005) thấy
rằng rệp ñào Myzus persicae là vectơ có hiệu quả, quá trình truyền virus chỉ
trong 2-3 phút. Cây lily sử dụng trong thí nghiệm xuất hiện triệu chứng khảm,
ñốm và sáng gân chỉ trong 27-30 ngày .
Những cá thể rệp có cánh bi bắt trong khi bay trên những cây lily
truyền LMoV vào các cây thử nghiệm lây nhiễm với tỷ lệ 5.9, 4.8, 3.0%
tương ứng với các năm 1990, 1991 và 1992. LMoV ñược truyền bởi 18 trong
số 76 loài rệp khác nhau bắt ñược bằng bẫy từ tháng 5 ñến tháng 10. Số lượng
rệp bị bắt bằng bẫy tăng dần vào tháng tư và tháng năm. Vào tháng 6 và tháng
7 thì số lượng tăng nhanh hơn, trong khi ñó vào tháng tám và tháng chín lại
xuống khá thấp ngoại trừ một khoảng thời gian ngắn vào cuối tháng chín ñầu
tháng mười. Do vậy, sự khác nhau về mùa ñối với việc lan truyền virus có thể

dự tính ñược như ảnh hưởng của số lượng rệp có cánh và hoạt ñộng của
chúng. Sự lan truyền virus giảm vào tháng tám và tháng 9 là do số lượng rệp
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………

15


có cánh ít ñi và ñộ mẫn cảm với virus của cây ký chủ giảm như tuổi cây. ðiều
này kết hợp với việc tạo thành các lá non, có ñộ mẫn cảm cao cho ñến khi ra
hoa vào ñầu tháng bảy so với các lá già giảm dần ñộ mãn cảm hình thành sau
ñó (Asjes et al, 1996)
2.4.4. Lily symptomless virus (LSV)
LSV là một virus thuộc chi Carlavirus, họ Flexiviridae. LSV gây hại
chủ yếu trên 3 loài thực vật thuộc 2 họ khác nhau là cây Alstroemeria (họ
Alstroemeriaceae), hoa ly (Lilium spp.) và cây hoa tulip (Tulipa) (họ
Liliaceae).
LSV lan truyền theo kiểu không bền vững nhờ các loài rệp như Myzus
persicae (Mowat & Stefanac, 1974), Macrosiphum euphorbiae (Derks &
Abeele, 1980), Aphis gossypii, A. fabae và Aulocorthum solani (Mowat &
Stefanac, 1974; Derks & Asjes, 1975). Bên cạnh ñó LSV có thể lan truyền
bằng con ñường tiếp xúc cơ học.
2.4.5. Tulip breaking virus (TBV)
TBV là một potyvirus. TBV nhiễm tự nhiên trên cây các cây Tulipa
spp, Lilium spp. Virus này gây hại nghiêm trọng trên cây hoa Tulip. Truyền
bệnh nhờ véc tơ truyền bệnh là côn trùng: Myzus persicae, Aphis gosypii,
Aphis fabae, Macrosiphum euphorbiae, Dysaphis tulipae, Aphididae.Virus
truyền không theo một cách thức cụ thể. Virus truyền bệnh qua việc ghép
cành, kỹ thuật cơ học gây xát thương, không truyền bệnh bằng tiếp xúc giữa
các cây với nhau, không truyền qua hạt giống, không truyền qua phấn hoa.
Phạm vi phân bố: Có thể Phân bố trên toàn thế giới (Brierley & Smith

1944).
2.4.6. Lily virus X (LVX)
LVX là virus thuộc chi Potexvirus. Theo CABI, 2007, LVX chỉ gây hại
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………

16