Tổng hợp enzyme cellulase

TỔNG HỢP ENZYME CELLULASE
LỜI MỞ ĐẦU
Sự phát triển nhanh chóng của công nghệ thực phẩm trong hai thập niên gần đây
đòi hỏi sự hiểu biết toàn diện về khả năng phân tích các chất trong thực phẩm và
phương pháp sản xuất thực phẩm mà Enzyme là loại protein, Enzyme rất quan
trọng với cơ thể con người, nếu không có enzyme thì mọi sự chuyển hóa trong cơ
thể con người bị đình trệ và không thể sống được.
Ngoài ra nó còn đóng vai trò rất quan trọng trong công nghiệp chế biến thực
phẩm,trong y học,trong bảo vệ môi trường... Công nghệ sản xuất enzyme đã đem
lại lợi nhuận rất lớn cho nhiều nước.Trong tương lai,đây sẽ là một ngành công
nghiệp được đầu tư phát triển rộng bởi những ứng dụng và tính tiện lợi của nó
trong nhiều lĩnh vực và đời sống.
Enzyme cellulase là một trong những enzyme có vai trò quan trọng trong
chuyển hóa chất hữu cơ có trong thiên nhiên, và có ý nghĩa rất lớn trong công
nghiệp thực phẩm (rựơu, bia, ), bảo vệ môi trường
I.

Lịch sử, nguồn gốc, những nghiên cứu phát triển của enzyme cellulose:
1.
Lịch sử nghiên cứu của enzyme:
Do enzyme học được coi như cột sống của hóa sinh học nên phần

lớn các nghiên cứu hóa sinh từ trước đến nay đều liên quan nhiều đến enzyme.
Về sự phát triển của học thuyết enzyme, có thể chia thành 4 giai đoạn:
- Giai đoạn 1: trước thế kỷ thứ XVII
- Giai đoạn 2: từ thế kỷ XVII đến nửa đầu thế kỷ XIX
- Giai đoạn 3: từ giữa thế kỷ XIX đến 30 năm đầu của thế kỷ XX
- Giai đoạn 4: từ những năm 30 của thế kỷ XX đến nay
1

2.

Nguồn gốc của enzyme cellulase:

- Được thu nhận từ các nguồn khác nhau:
+Động vật: dịch tiết dạ dày bò, các nhóm thân mềm…
+ Thực vật: trong hạt ngũ cốc nảy mầm như đại mạch, yến mạch, lúa mì
mạch đen…
+Vi sinh vật: các loại xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm sợi, nấm men…
-Trong thực tế người ta thường thu nhận enzyme cellulase từ vi sinh vật.
Các
chủng vi sinh vật thường sử dụng:
– Nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus candidus…
– Xạ khuẩn: Actinomyces griseus, Streptomyces reticuli…
– Vi khuẩn: Acetobacter xylinum, Bacillus subtilis, Bacillus pumilis…
3.
Những nghiên cứu phát triển sản phẩm như:
Mỹ, năm 1983 PTN của Quân đội Mỹ ở Natik và trường đại học Rutgers, sử
dụng chủng Trichoderma viride QM6 hoang dại để sản xuất cellulase đầu tiên..
Năm 1998, YU đã nuôi cấy T. reesei Rut 30 trong MT chứa 5% bột cellulose và
1% cám mì, thu được hoạt lực CMCase 232,4 IU/g. Năm 2000, Sonia Couri khảo
sát khả năng sinh tổng hợp các enzym như polygalacturonase, cellulase, xylanase
và protease từ A. niger 3T5B8 trên nguồn phụ phế liệu nông nghiệp khác nhau
bằng phương pháp lên men bán rắn và ứng dụng enzym trong việc tách chiết dầu
thực vật. Năm 2002, theo báo cáo gần đây của CORAL, dịch nuôi cấy A. niger
trong MT Czapek-Dox chứa CMC1%, cho chạy điện di trên gel SDS-PAGE (chứa
0,2% CMC) phát hiện có hai vạch có hoạt tính CMCase và trọng lượng phân tử lần
lượt là 83.000 và 50.000 Dalton.
Ở Việt Nam, năm 1989, Lê Hồng Mai nghiên cứu về sinh tổng hợp và một số đặc
tính của cellulase (typ CMCase) ở A. niger VS-1 trên MT lên men bán rắn. Năm

2001, Huỳnh Anh nghiên cứu về nấm sợi T. reesei sinh tổng hợp enzym cellulase
2


trên MT lỏng với nguồn cacbon là CMC. Năm 2002, Kiều Hoa nghiên cứu sinh
tổng hợp enzym cellulase với nguồn cacbon là cellulose tinh khiết, cám trấu, bã
mía, vỏ cà phê. Năm 2003, Hoàng Quốc Khánh nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp
và đặc điểm cellulase của A. niger Rnnl 363. Châu Hoàng Vũ cũng nghiên cứu thu
nhận và tinh sạch enzym cellulase từ nấm mốc T. reesei bằng phương pháp lên
men bán rắn . Năm 2004, Trần Thạnh Phong khảo sát khả năng sinh tổng hợp
enzym cellulase từ T. reesei và A. niger trên MT lên men bán rắn. Năm 2005, Lê
Thị Hồng Nga nghiên cứu sự sinh tổng hợp cảm ứng pectinase và cellulase của
một số chủng nấm mốc.
II.

Tổng quan hệ enzyme cellulase: (1)
Cellulase là phức hệ enzyme có tác dụng quan trọng trong việc thủy phân

cellulose. Đây là enzyme thuộc nhóm enzyme hydrolase thường chi thấy ở vi sinh
vật.
1.

Cellulose: (1)

Cellulose là polysaccarit chủ yếu của thành tế bào thực vật; trong bông chiếm
khoảng 90%, còn trong gỗ chiếm hơn 50%. Hằng năm cellulose do thực vật tổng
hợp khoảng 1011 tấn. Sự tạo cellulase chủ yếu do thực vật còn phân hủy nó thì chủ
yếu do vi sinh vật.
Cellulose có nhiều hơn tất cả hợp chất hữu cơ khác của cơ thể sống vì nó là
nguyên liệu chính của tế bào thực vật, giúp mô thực vật có độ bền cơ học và tính

đàn hồi.
Cellulase là chất được trùng hợp từ các đơn phân tử glucose, mạch thẳng được
tạo bởi bằng liên kết glucoside.
Cellulase là chất rắn, trắng, không mùi vị, không tan trong nước ngay cả khi đem
đun nóng, không tan trong các dung môi hữu cơ thông thường( rượu, ether,
3


benzen). Trong tế bào cây xanh, các vi sợi cellulose sắp xếp dưới dạng các lớp xen
phủ,như thế tạo nên một cấu trúc rất dai và chắc. Đôi khi thành tế bào còn được
củng cố bằng một nguyên liệu gọi là lignin, chất này chèn vào khoảng không giữa
các vi sợi cellulose.
Hình 1. Liên kết glucoside
cellulose không có ý nghĩa về mặt dinh dưỡng của người vì trong cơ thể người

không có enzyme phân hủy được cellulose. Động vật nhai lại có thể tiêu hóa dễ
dàng cellulose vì trong dạ dày chúng có chứa các vi khuẩn có khả năng tiết ra
enzym cellulase có tác dụng thủy phân cellulose.

Hình 2. Thành tế bào thực vật

4


Cellulose là polysaccarit chủ yếu của thành tế bào thực vật. Đơn vị cấu tạo
cellulose gắn với nhau nhờ liên kết glucoside.

Hình 4. Trật tự sắp xếp của Fibrils, Microfibrils and Cellulose in Cell Walls

Mỗi đơn vị cấu trúc nên cellulose là một anhydride d-glucose. Mỗi gốc glucose

chứa ba nhóm –OH ở nguyên tử carbon thứ 2, thứ 3 và thứ 6 (trong nhóm đó –OH
đính trên C6 là nhóm rượu bậc 1, còn lại nhóm rượu bậc 2).
Gốc anhydride d-glucose có 6 cạnh piranose (nhờ 5 nguyên tử C và nguyên tử O)
liên kết 1-4 glucoside.
Phân tử cellulose chứa từ 1.400-10.000 gốc glucose không xoắn mà duỗi thẳng.
Phân tử lượng của cellulase thu được từ các nguồn gốc khác nhau xê dịch trong
giới hạn khá rộng(từ 5.104-106 hoặc cao hơn).

5


Hình 4. Chuỗi phân tử cellulose

Dùng phương pháp phân tích tia rơghen, người ta xác định được phân tử cellulose
có các dạng sợi.

Hình 5.Chuỗi phân tử cellulose

6


Các dạng sợi của cellulose lại gắn vào nhau nhờ liên kết hydro tạo nên cấu trúc
mixen của cellulose.

Hình 7. Liên kết hydro giữa các phân tử cellulose tạo cấu trúc Micele

Hình 8. Các sợi cellulose liên kết liên kết với nhau tạo thành bó sợi, các bó sợi lại
liên kết với nhau tạo thành đại phân tử cellulose.
7

1.1.Cơ chế thủy phân cellulose của enzyme cellulase: (2)

Endocellulase : xúc tác quá trình cắt liên kết trong cellulose, lignin và một cách
ngẫu nhiên sản phẩm của quá trình phân giải là các cellulose phân tử nhỏ,
cellobiose và glucose.
Exocellulase: cắt 2 hoặc 4 đơn vị glucose từ đầu không khử của chuỗi cellulose tạo
thành các cellulose(disaccharide) và một số cellotetrose.
Cellobiase: tham gia phân giải cellobiose(disaccharide) và cellotetrose thành
glucose.

8


2. Cellulase : là hệ phức hydrolase bao gồm C1 đến Cx và , có vai trò là thủy phân
cellulose thành sản phẩm cuối cùng là glucose.

Hình 9. Mô hình phân tử cellulase
2.1.Tổng hợp cellulase:

9


2.2.Cơ chế tác dụng của cellulase :
Ở giai đoạn đầu dưới sự ảnh hưởng của enzyme C1. Những mảnh
polyanhydroglucose có kích thước lớn được tách ra khỏi cellulose không hòa tan
ban đầu, sau đó dưới tác dụng của enzyme Cx mãnh vừa tạo thành sẽ bị tạo thành
oligosaccarit cho đến cellobiose. Như vậy C1 tác dụng trên cellulose nguyên thủy,
cellulase C2 tác dụng trên cellulose đã biến hình nhưng không hòa tan, cellulase Cx
tác dụng trên cellodextrin hòa tan hoặc các dẫn xuất hòa tan, còn cellobiase thì tác

dụng lên các disaccaritcellobiose để tạo ra glucoso.
Sơ đồ minh họa tổng quát cơ chế tác dụng của cellulase:
Cellulose cellulose phản ứngcellobiose glucose.

Hình 10.Mô hình cellulase tác dụng lên cơ chất cellulose
Phức hệ cellulase nhiều cấu tử đã được tách ra từ một số loại nấm. Ví dụ: nấm
morythesium verrucaia tạo cellulase sáu cấu tử, Polyporus versicolor tạo cellulase
4 cấu tử, ...
Tính đặc hiệu của cellulase trên các glucoside rất rộng rãi, chúng có thể thủy phân
được xilan ( , glucomanan ( , lichenin , polysaccarit , laminarin , lutean.
2.3.Cấu trúc của enzyme cellulase:
10


Cellulase có bản chất là một protein được cấu tạo từ các đơn vị axit amin, các
axit amin được nối với nhau bởi liên kết peptid-CO-NH-. Ngoài ra, trong cấu trúc
còn có những phần phụ khác, cấu trúc hoàn chỉnh của các loại enzyme nhóm
endoglucanase(EG) và exoglucanase (CBH) giống nhau trong hệ cellulase của nấm
sợi, gồm một trung tâm xúc tác và một đuôi tận cùng, phần đuôi này xuất phát từ
trung tâm xúc tác và được gắn thêm vùng glycosil hóa, cuối đuôi là vùng gắn kết
với cellulose(CBD: cellulose binding domain). Vùng này có vai trò tạo liên kết với
cellulose tinh thể. Trong quá trình phân hủy cellulose có sự tương quan mạnh giữa
khả năng xúc tác phân .
2.4.Phân loại enzyme cellulase:
Dựa trên phương thức thủy phân và đặc điểm cấu trúc:
+Endoglucanase hoặc , phân cắt tạo ra các chuỗi oligosaccharide.
+Endoglucanase, bao gồm (cellodextrinase) và (cellobiohydrolase).
+Exoglucanase phân cắt từ đầu khử hoặc không khử của chuỗi cellulose tạo ra các
sản phẩm chính glucose tinh thể.
+ hoặc . Thủy phân cellodextrin hòa tan và cellobiose thành glucose.

2.5.Tính chất của enzyme cellulase: (3)
Enzyme cellulase thủy phân cellulose tự nhiên và các dẫn xuất như
cacboxymethyl cellulase(CMC) hoặc hydroxyethyl cellulase(HEC).
Cellulase cắt liên kết trong cellulose, lichenin và các
của ngũ cốc.
Nhiệt độ thích hợp hoạt động ở 550C , bền ở 35-450C.
Hoạt tính của cellulase bị pha hủy hoàn toàn ở 800C trong vòng 10-15 phút.
11


Bền PH=5,5 và hoạt tính cao ở PH=6.
Ít ảnh hưởng từ các dung môi hữu cơ (trừ n-butanol).
Các ion kim loại và EDTA nồng độ 4-12Mm ảnh hưởng làm giảm hoạt tính của
enzyme.
2.6.Tổng hợp enzyme bằng phương pháp vi sinh vật:
Các phương pháp thu hồi enzyme cellulase từ vi sinh vật được sử dụng chủ
yếu là phương pháp lên men rắn(SSF), phương pháp lên men lỏng(SMF),...
+phương pháp lên men bán lỏng SMF( lên men ngập nước).
+Lên men rắn SSF
Hình
11.
Công
nghệ
sản xuất
cellulase.
III.

Phương pháp sản xuất enzyme Cellulase: (3)
Theo truyền thống, enzyme thương mại được sản xuất bằng lên men ngâpj

nước(SMF), là phương pháp vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường nước giàu
dinh dưỡng.tuy nhiên sẽ có sự tổn thất đáng kể trong quá trình cô dặc và tách chiết
enzyme từ môi trường chủ yếu là nước. Thay thế cho phương pháp truyền thống là
phương pháp nuôi cấy trong môi trường rắn (SSF).
Khi so sánh với SMF trên lý thuyết, SSF đơn giản và ít tốn kém hơn nhưng lại
không được sử dụng rộng rãi. Trong khi ở các nước châu á, thực phẩm lên men từ
các chất rắn như nước tương, miso được sản xuất cách đây hàng nghìn năm bằng
12


phương SSF thì chúng ta đã không được chú ý ở các nước phương tây do áp dụng
các phương pháp SMF (theo Pandey, 2003).
Kể từ những năm 1990, SSF được quan tâm phát triển nhiều hơn, một phần do sự
thừa nhận rằng nhiều vi sinh vật có thể sản xuất eyme hiệu quả hơn SSF.
1. Phương pháp lên men bán lỏng SMF( lên men ngập nước): (4)
Lên men môi trường lỏng là sự nuôi cấy vi sinh vật trong nước có chứa các
chất dinh dưỡng. Khi vi sinh vật sử dụng các chất dinh dưỡng, chúng ta sẽ tạhs
được các enzyme mong muốn. Nguồn chất nền sử dụng dựa trên các nguyên vật
liệu tái tạo như ngô, đường và đậu nành. Trong suốt quá trình nuôi cấy, chất dinh
dưỡng đã tiệt trùng được thêm vào để làm tăng quá trình lên men. Các thông số
như nhiệt độ, pH, oxi, CO2 được kiểm soát để tối ưu hóa qua trình lên men. Để thu
hoạch các enzyme từ môi trường lên men, người ta phải loại bỏ các sản phẩm
không hòa tan, ví dụ như tế bào vi sinh vật, được thực hiện bằng cách ly tâm.
Ưu điểm:
+Đo các thông số trong quá trình dễ dàng hơn so với quá trình lên men rắn.
+Tế bào vi khuẩn và nấm men được phân bố đều khắp môi trường.
+Có hàm lượng nước cao, là điều kiện lý tưởng cho vi khuẩn.
Nhược điểm:
+Chi phí cao do môi trường dinh dưỡng đắt tiền.
+Lò phản ứng làm chiếm diện tích, khó kiểm soát sự hoạt động của các vi sinh vật.

13


+Nguy cơ ô nhiễm cao do lượng nước thải ra môi trường sau quá trình muôi
trường sau quá trình nuôi cấy.

Hình 1.
Quy trình sản
xuất
enzyme
cellulase

bằng

phương pháp

lên men

bán lỏng SMF
Vi khuẩn
ban đầu

được chuẩn bị và chuyển từ tủ lạnh vào

một bình lắc

tiệt trùng(SFR-101) có chứa

các môi trường

tăng trưởng và

cellulase.

Các chất

được

lên

men trong bình lắc(SFR-101) lần thứ nhất sau đó chuyển sang hệ thống lên men số
1(SF-101) để lên men lần thứ 2. Tiếp tục cung cấp thêm môi trường tăng trưởng và
cellulase(chất nền), pha trộn(MB-101) và tiệt trùng bằng nhiệt(HS-101).
Sau đó, hỗn hợp môi trường được chuyển lên hệ thống lên men số 2(SF-102) để
lên men lần thứ 3, tiếp tục cung cấp môi trường và cellulase, sau đó trộn lẫn(MB102) và tiệt trùng lần thứ 2(HS-102). Sau cùng hỗn hợp môi trường được chuyển
lên hệ thống lên men lỏng chính(LF-101) và lên men lần thứ 4, sử dungk bột giấy
được chứa trong phễu(HP-101).

14


Quyets nito được thực hiện trong tất cả các ống, bình lắc, hệ thống lên men và máy
pha để đảm bảo môi trường yếm khí. Tất cả khí thải từ các bình lắc và hệ thống lên
men thải ra ngoài không khí thông qua máy trộn(MX-101) và bộ lọc không
khí(AF-101). Còn các khí thải ra từ máy pha được thải trực tiếp ra không khí, vì
máy pha chứa vi khuẩn.
Các sản phẩm lên men SMF là các enzyme cellulase cùng với một số dư lượng và
nước. Một máy cô đặc(EV-101) được sử dụng để loại bỏ nước,máy sấy nhiệt
bằng(FDR-101) tiếp tục loại bỏ nước trước khi tạo thành sản phẩm cuối cùng là

cellulase. Máy cô đặc và sấy nhiệt bằng hoạt động trong trình sản xuất cellulase
bằng phương pháp SMF.
2. Lên men rắn SSF:
Lên men rắn là quá trình lên men xảy ra trong môi trường không hoặc gần
như không có nước tự do. Quá trình lên men rắn sử dụng nguyên liệu tự nhiên như
nguồn cung cấp carbon và năng lượng. SSF cũng có thể sử dụng nguồn nguyên
liệu như chất nền rắn, sử dụng nguồn nguyên liệu này thì cần bổ sung dung dịch
dinh dưỡng cần thiết như một nguồn cung cấp carbon. Chất nền rắn thì phải có đủ
độ ẩm. Tùy thuộc vào bản chất của bề mặt chất nền, lượng nước hấp thu có thể gấp
một hoặc nhiều lần so với trọng lượng khô của nó. Duy trì độ ẩm cùng với hoạt độ
nước thích hợp là những yếu tố cần thiết cho quá trình SSF.
Nói chung, chất nền rắn cung cấp môi trường tốt để vi khuẩn, nấm mốc và nấm
men phát triển. Nấm mốc được nghiên cứu nhiều nhất cho phương pháp SSF do
khả năng tăng trưởng, phát triển không chỉ trên bề mặt của chất nền mà còn đâm
sâu vào chất nền. Một số cây trồng nông nghiệp như sắn, lua mạch, phế liệu công
nghiệp như cám, bã, bánh dầu, vỏ cà phê là các chất nền thường được sử dụng cho
phương pháp SSF.
15


Một số yếu tố quan trọng khác ảnh hưởng đến sự phát triển dựa trên phương pháp
SSF: Ph môi trường nhiệt độ và thời gian nuôi cấy, kích thước, độ tuổi của vi
khuẩn cấy, bản chất chất nền, loại vi sinh vật sử dụng,..
Ưu điểm:
+Hiệu quả không gian lớn: cùng một thể tích lên men rắn, sử dụng được một khối
lượng cơ chất 4-5 lần lên men lỏng.
+Môi trường rắn dễ bảo quản.
+Lượng nước ít nên tiêu hao cho việc khử trùng và xử lý sản phẩm ít.
+Hoạt tính nước thấp, ít bị nhiễm.
+Đòi hỏi thiết bị và kỹ thuật đơn giản.

+Tuy mức độ sử dụng cơ chất thành sản phẩm thấp nhưng tính theo mật độ cơ chất
thì năng suất vẫn cao.
Nhược điểm:
+Khí, sự truyền nhiệt bị hạn chế làm ảnh hưởng đến sự khuếch tán qua bề mặt.
Nếu không được kiểm soát, sự tích tụ nhiệt và giảm năng lượng oxy có sẵn có thể
dẫn đến chấm dứt hoạt động của vi sinh vật hiếu khí mesophilic và hậu quả là
ngừng sản xuất enzyme
+Tính đồng nhất khi cây, vi sinh vật phát triển không đồng đều, cách khắc phục
khó do khối lượng lên men lớn.

16


Hình 2. Quy trình sản xuất enzyme cellulase bằng phương pháp lên men bán rắn
SSF
Phần lớn phương pháp này tượng tự như SMF nhưng có 2 sự khác biệt do
tính chất của chất nền rắn:
(1)Bột giấy và môi trường tăng trưởng được khử trùng trong một cái trống khử
trùng(SD-101), khuấy mạch và trộn rồi chuyển đến hệ thống lên men số 2(SF-102)
và chuyển vào hệ thống lên men rắn chính(SMF-101) bằng cách sử dụng một băng
17


tải vô trùng(SC-101). Phương pháp này cần phải sử dụng một cái trống khử trùng
do việc khuấy trộn gặp nhiều khó khăn trong hệ thống lên men rắn.
(2)Các sản phẩm cuối cùng được sử dụng ngay, không cần cô đặc và sấy đông khô
như phương pháp SMF. Bản chất của bề mặt là một trong những yếu tố quan trọng
nhất ảnh hưởng đến quá trình sản xuất và cách lựa chọn phù thuộc vào yếu tố liên
quan tới chi phí và tính sẵn có. Vì vậy nhiều nghiên cứu đã được thục hiện quan
điểm sàng lọc các chất thải nông nghiệp như rơm,...

Các nhà nghiên cứu đã thực hiện nhiều phân tích và đưa ra kết luận có độ chắc
chắn 99,6%: phương pháp SSF hiệu quả kinh tế hơn so với phương pháp truyền
thống SMF.
3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất enzyme cellulase:
+Ảnh hưởng của PH.
+Ảnh hưởng của nhiệt độ.
+Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy.
+Ảnh hưởng của nguồn carbon.
+Ảnh nhưởng của nguồn nitro.
+Ảnh hưởng của nguyên liệu làm chất nền.
4. Chiết và tinh sạch:
Quy trình tinh sạch enzyme cơ bản gồm các bước sau:
B1: Thu hồi ezyme: phá vỡ tế bào(bằng phương pháp enzyme, hóa học, vật
lý)=>phân lập enzyme hòa tan lọc màng, ly tâm).
B2: Tinh sạch sơ bộ: loại bỏ các mảnh vỡ tế bào=>ly tâm mẻ=>ly tâm dòng chảy
liên tục(dành cho quy mô lớn)
18


B3: Kết tủa dịch chiết.
B4: Tinh sạch, thu cặn.

Hình 3. Qúa trình tinh sạch enzyme.
5. Một số quá trình thu nhận và tinh sạch:
-Tinh sạch sơ bộ
Cách thực hiện: lấy 40ml dịch enzyme sau khi ly tâm 10 phút ở 1200 vòng/phút
được tủa với ammonium sulfate ở nồng độ 65% và để ở 400C qua đêm. Sau khi ly
tâm ở 1200 vòng/phút, tủa được hòa vào đệm 100mM acetat PH 5,5 và thẩm tích
loại muối. Để thẩm tích loại muối, 15ml mẫu được hút vào trong túi thẩm tích đã
hoạt hóa và kẹp chặt hai đầu. Cho túi vào cốc chứa 200ml nước cất có khuấy từ

liên tục và đặt cốc vào trong đá, sau 3 giờ mẫu được thay nước một lần để loại
19


muối. Dịch tủa sau khi loại muối đưa qua cột sắc ký lọc gel Sephadex 2000,
G50(30cm/h). Cột có kích thước 2,6 x 60cm. Cột được cân bằng với đệm
phosphate 50 mM, pH 7,5. Tốc độ chảy là 25ml/h. Thể tích mỗi phân đoạn được
thu 2ml(thu 20 phân đoạn). Hàm lượng protein và số đơn vị hoạt tính enyme được
xác định trong mỗi phân đoạn.
-Phương pháp thu nhận enzyme cellulase từ vi khuẩn Bacillus subtilis:
Phương pháp hoạt hóa chủng Bacillus subtilis
Chủng Bacillus subtlis được hoạt hóa trên môi trường với thành phần: NaCl 0,5%,
pepton 1%, cao nâm 1%, cao thịt 0,3%, Agar 0,7%, pH=7. Phương pháp định tính
khả năng enzyme cellulase. Chúng tôi sử dụng phương pháp cấy điểm trên môi
trường hoạt hóa có bổ sung CMC 1%, ủ ở nhiệt độ 3000C trong 24h. Sau đó nhuộm
màu bằng thuốc thử Lugol và đo đường kính còng thủy ngân.
Phương pháp thu nhận dịch chiết enzyme thô
Nuôi cấy chủng Bacillus subtilis trong môi trường với thành phần CMC 1%,
Glucose 0,1%, Pepton 5%, Cao nâm 2,5% ở các thời điểm, nhiệt độ và Ph khác
nhau. Sau đó ly tâm ở tốc độ 800 vòng/phút, thu dịch nồi enzyme.
-Phương pháp chiết tách enzyme:
Sử dụng hai dung môi hữu cơ: Aceton và etanol 900. Tiến hành kết tủa dịch chiết
enzyme thô theo tỷ lệ 1:4( V dịch chiết: V dung môi), ủ hỗn hợp ở -2000C trong 60
phút, ly tâm 1300 vòng/phút, thu cặn.

6. Xác định hoạt độ, hoạt tính của cellulase:
Xác định hoạt độ:

20

Để xác định hoạt độ cellulase có thể dùng nhiều phương pháp khác nhau. Các
phương pháp dựa vào một trong các nguyên tắc sau đây:
+Xác định sự giảm trọng lượng của cơ chất cellulose không hòa tan.
+Xác định sự giảm tính chất cơ học của các sợi hoặc các màng mỏng.
+Xác định sự thay đổi độ đục của dung dịch cơ chất.
+Xác định sự giảm độ nhớt của dung dịch cơ chất.
+Xác định sự tăng trưởng các nhóm khử tận cùng.
+Dùng phương pháp so màu để xác định sản phẩm hòa tan của cellulose.
+Dùng phương pháp so màu để xác định sản phẩm hòa tan của cellulose.
+Xác định bán kính vòng thủy phân trên môi trường thạch-cellulose.
Nồng độ enzyme trong dung dịch môi trường thường được biểu diễn bằng đơn vị
ml hay đơn vị g v.v...
Xác định hoạt tính:
+Xác định hoạt tính enzyme bằng khuyếch tán trên thạch
+Xác định hoạt tính cellulase trên gel polyacrylamide:
IV.

Các công trình nghiên cứu:
Các công trình khoa học nghiên cứu về khả năng sinh enzyme cellulase từ

chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn cần giờ.(5)
Tác giả Khưu Phương Yến Anh, Trường Đại Học Sư Phạm TPHCM nghiên cứu về
RNM Cần Giờ là nơi lưu trữ các nguồn gen sinh vật quí hiếm và bền
vững, có khả năng chịu đựng điều kiện sống rất đặc biệt khắc nghiệt. Là nơi
có hệ VSV vô cùng phong phú và đa dạng như nấm sợi, vi khuẩn, xạ
khuẩn…., trong đó nấm sợi chiếm số lượng rất lớn. Nấm sợi đóng vai trò rất
21

quan trọng trong vòng tuần hoàn vật chất và năng lượng của hệ sinh thái
RNM, nhờ có khả năng sinh các loại enzym ngoại bào như cellulase,
protease, kitinase, amylase, enzym phân giải dầu…..Đặc biệt, enzym cellulase do
nấm sợi sống trong RNM sinh ra là rất lớn. Do thảm thực vật dày đặc ở RNM Cần
Giờ là nơi sinh sống tốt nhất, nguồn thức ăn dồi dào nhất cho các chủng nấm
sợi có khả năng sinh enzym này.
Enzym cellulase là hệ enzym bao gồm các loại enzym: C1, Cx, βglucosidase, có khả năng hoạt động phối hợp để phân giải cellulose thành
glucose. Enzym cellulase được ứng dụng trong nông nghiệp để chế biến t
hức ăn chăn nuôi, trong công nghiệp thực phẩm để chế biến thực phẩm, trong quá
trình li trích các chất từ thực vật, trong việc phân hủy các phế liệu giàu
cellulose….Theo Bhat (2000), xấp xỉ 20% trong số 1 tỷ USD thu được từ
lượng enzym công nghiệp được bán ra trên thế giới gồm các enzym cellulase,
hemicellulase và pectinase. Đến năm 2005, thị trường enzym công nghiệp
trên thế giới tăng từ 1,7- 2,0 tỷ USD.
Hàng năm, nước ta phải nhập ngoại một lượng lớn những nguồn
enzym cellulase để giải quyết vấn đề sản xuất và xử lý ô nhiễm MT. Việt
Nam là nước nhiệt đới có nền nông nghiệp rất phong phú, đa dạng và đang
trên đà phát triển. Vì vậy, lượng phế thải nông nghiệp rất dồi dào, cùng với sự
công nghiệp hóa, hiện đại hóa đất nước, ô nhiễm MT đang trở thành nguy cơ
thật sự. Thành phần chính trong phế thải rắn trong sinh hoạt công, nông, lâm
nghiệp là cellulose. Trong khi đó, RNM Cần Giờ là kho dự trữ các chủng VSV có
hoạt tính enzym cao chưa được khai thác. Các công trình khoa học nghiên cứu về
khả năng sinh enzym cellulase của các chủng nấm sợi ở RNM Cần Giờ cho
đến nay vẫn còn bỏ ngõ.

22


Nghiên cứu enzyme cellulase và pectinase từ chủng Trichoderma viride và
Aspergillus niger nhằm xữ lý nhanh vỏ cà phê (6):

Tác giả Trần Thị Thanh Thuần, Nguyễn Đức Lượng Trường đại học Bchs Khoa,
DDHQG-HCM nghiên cứuVỏ cà phê là một phế phẩm không thể tránh khỏi trong
quá trình sản xuất cà phê. Trong thành phần của nó chứa nhiều hợp chất khó phân
hủy tự nhiên. Bằng việc sử dụng 2 chủng nấm mốc Trichoderma viride và
Aspergillus niger để sinh tổng hợp cellulase và pectinase làm cho quá trình phân
hủy diễn ra nhanh hơn. Chúng tôi đã nghiên cứu và xác định các điều kiên ảnh
hưởng đến quá trình sản xuất hai enzyme này. Điều kiện tối ưu sản xuất enzyme
pectinase của Aspergillus niger là: 2 ngày, độ ẩm 62%, giống 8%. Điều kiện tối ưu
sản xuất enzyme cellulase của Trichoderma viride là: 4 ngày, độ ẩm 58%, giống
8%. Qua thử nghiệm thực tế chúng tôi nhận thấy, vỏ cà phê phân hủy trong 14
ngày, 60% độ ẩm, 8% giống.
Trong bài nghiên cứu này, tác giả Trần Thị Thanh Thuần, Nguyễn Đức Lượng
dùng các phương pháp lên men vỏ cà phê bằng Trichoderma viride và Aspergillus
niger. Quá trình lên men Trichoderma viride và Aspergillus niger nhằm tận dụng
nguồn phụ phế phẩm trong nông nghiệp, làm giảm khả năng ô nhiễm môi trường
do các chất thải gây ra như vỏ cà phê, hèm bia sau khi lên men bia, mật rỉ đường,
các loại trấu của nhà máy xay xát… Ứng dụng chủ yếu của đề tài này nhằm nghiên
cứu khả năng phân hủy pectin và cellulose bằng enzyme pectinase và cellulase.
Lên men giúp loại bỏ những chất độc hại và sau cùng là tận dụng làm phân bón.
Đây là một giải pháp hữu hiệu vì khai thác triệt để việc tận dụng phế phụ liệu nông
nghiệp hiện nay. Để đẩy mạnh vòng chu chuyển vật chất các phế thải nông nghiệp
trong đó có vỏ cà phê là tạo phân bón.
Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme cellulase kỹ thuật từ xạ khuẩn và ứng
dụng sản xuất thử nghiệm bột trong thực phẩm: (7)
23


Nguyễn Phước Bảo Hoàng, Trường Đại Học Đại Học Nha nghiên cứu về rong
biển là nguồn thực phẩm tự nhiên quý giá giàu chất dinh dưỡng, có tác dụng đến
sức khỏe và sự ổn định của cơ thể con người.

Hiện nay, nhu cầu sử dụng rong biển làm thực phẩm trên thế giới ngày càng tăng
và phổ biến. Tuy nhiên vấn đề khai thác và chế biến rong biển ở Việt Nam còn
nhiều mới mẻ và hạn chế, không sử dụng hết sản lượng cũng như hiệu quả lợi ích
mà rong đem lại. Hơn nữa, các sản phẩm từ rong biển ở nước ta chưa nhiều, chưa
thực sự được chú ý và phổ biến, rất ít người dân biết đến loại thực phẩm đặc biệt
này, đây đang là một vấn đề còn đang bỏ ngỏ .
Ngoài các thành phần dinh dưỡng cơ bản và hàm lượng acid amin quan
trọng vốn có, rong biển còn chứa lượng cel lớn mà cơ thể con người không có
khả năng tiêu hóa. Cel là một thành phần quan trọng cấu tạo nên lớp thành tế
bào thực vật, là một loại polysaccharide có cấu trúc phức tạp. Việc phân hủy
cel bằng các tác nhân lý hóa (acid, bazơ mạnh) gặp nhiều khó khăn, làm ảnh
hưởng đến tốc độ của nhiều quá trình sản xuất công nghiệp và không được khuyến
khích trong chế biến thực phẩm ngày nay. Chính vì vậy mà yêu cầu đặt ra là phải
thay thế bằng các phương pháp an toàn hơn.
Để giải quyết vấn đề này, chúng tôi nhận thấy có thể ứng dụng các chế
phẩm vi sinh vật có hoạt tính cellulase tác động một cách đặc hiệu lên cơ chất
cel, đây là loại enzyme hiện nay đang được rất nhiều nhà khoa học quan tâm.
Cellulase là một phức hợp enzyme bao gồm 3 loại enzyme thủy phân cel. Các
enzyme này kết hợp với nhau và tham gia phân cắt ngẫu nhiên các liên kết β-1,4
glucoside từ bên trong phân tử cel và một số loại polysaccharide tương tự khác
tạo thành glucose và một số đường chức năng như Oligossacharide. Các nghiên
cứu về Oligossacharide trong thực phẩm và dinh dưỡng đang là vấn đề quan tâm
của các nhà khoa học trên thế giới. Đây là nhóm thực phẩm có giá trị dinh dưỡng
24


và mức năng lượng thấp, nhưng lại chứa các hoạt chất cải thiện chất lượng sản
phẩm và tăng cường sức khỏe con người.
V.

Các chế phẩm cellulase thường được dùng để:
- tăng chất lượng các sản phẩm thực phẩm và thức ăn gia súc:

Chúng ta đều biết, celluloza là hợp phần vô cùng quan trọng của vỏ tế bào thực
vật. Các nguyên liệu thực phẩm có nguồn gốc từ thực vậtđều được gia công bằng
chế phẩm celluloza sẽ được mềm ra, sẽ tăng hệ số đồng hóa và nói chung chất
lượng được tăng lên. Trong đó rất bổ ích khi chuẩn bị các thức ăn đặc hiệu cho trẻ
em, cho người ăn kiêng cũng như khi chế biến thức ăn gia xúc.

Hình 12. Thức ăn cho gia súc, gia cầm
-Tăng hiệu suất trích ly các chất khác nhau từ nguyên liệu thực vật:
Protein, acid amin, vitamin từ đậu tương, thạch từ rong, tinh bột từ bã,chất thơm và
chất hòa tan khi sản xuất chè xanh và cà phê hòa tan.
Chẳng hạn trong sản xuất bia dưới sự ảnh hưởng của các phức enzyme xitaza(chủ
yếu gồm 4 enzyme cellulaza, hemicellulaza, enzyme thủy phân chất gôm và
25