Tổng hợp Vitamin B12

BÁO CÁO MÔN HÓA HỮU CƠ
Đề tài: TỔNG HỢP VITAMIN B12

TP. HCM - 2015

1


MỤC LỤC
Trang
I .Khái quát…………………………………………………………… …..1
II .Vitamin B12…………………………………………………………….2
1 . Giới thiệu chung………………………………….……………… …….2
2 . Cấu tạo hóa học…………………………………………………… …...3
3 . Tính chất………………………………………………………………..4
4 . Vi sinh vật tham gia tổng hợp vitamin B12…………..……..… ………5
5 . Công nghệ sản xuất…………………………………………………….7
6 . Một số sản phẩm B12 ứng dung trên thị trường…………….… ………9


I.KHÁI QUÁT
- Vitamin là chất hữu cơ không cung cấp năng lượng cho tế bào trong quá trình phát triển.
Tuy nhiên, vai trò của vitamin lại vô cùng quan trọng cho hoạt động sống của tế bào:
vitamin thúc đẩy các quá trình trao đổi chất vì là thành phần không thể thiếu được trong
cấu tạo của nhiều loại enzym. Do đó việc nghiên cứu, sản xuất vitamin trở nên rất cần
thiết

Hình 1. Các loại Vitamin
- Vitamin được sử dụng chủ yếu ở ba lĩnh vực:
+ Y học.

Hình 2: Vitamin ở dạng thuốc

3


+ Thực phẩm cho người.

Hình 3: Vitamin ở dạng thực phẩm
+Thức ăn gia súc.
-Các nhà khoa học đã áp dụng nhiều phương pháp khác nhau trong công nghệ sản xuất
vitamin. Bao gồm các phương pháp sau:
+Chiết rút từ nguồn nguyên liệu thực vật vật động vật.
+Tổng hợp hóa học.
+ Tổng hợp sinh học.
Cả ba phương pháp đều có những ưu và nhược điểm riêng, vì mỗi phương pháp cho ra
những vitamin riêng. Do đó để sản xuất vitamin từ các nguồn nguyên liệu với phương
pháp khác nhau, người ta thường nhắm vào hiệu quả của phương pháp, trong đó giá thành
đóng vai trò quan trọng cho việc quyết định phương pháp sản xuất.Công nghệ sản xuất
vitamin theo phương pháp sinh học chỉ tập trung vào một số vitamin đặc trưng và có hiệu
quả nhất, bao gồm vitamin B12, vitamin B2, hỗn hợp vitamin D2 và các vitamin nhóm B
khác.
II. VITAMIN B12
1. Giới thiệu chung
- Thuật ngữ vitamin B12 rất rộng, dùng để chỉ những hợp chất có chứa cobalamin vì
trong phân tử của nó có chứa kim loại Coban. Tại hội nghị quốc tế về hóa sinh năm 1961,
các nhà bác học đã đề nghị gọi tên nhóm vitamin B12 là corinoit. Hiện nay người ta biết
khoảng 100 loại chất tương tự vitamin B12 trong số đó có các chất quan trọng thường gặp
như cyancobalamin (B12), hydroxycobalamin (B12 ‚b‛), nitritocobalamin (B12 ‚c‛). Hợp
chất corinoit bị loại mất coban được gọi là corin, còn acid corinic là corin có cả các nhánh
4

bên. Dạng tự nhiên của những hợp chất cobalamin là adenosylcobalamin,
methylcobalamin và hydroxocobalamin._Cyanocobalamin, được định nghĩa là vitamin
B12, là một hợp chất cobalamin bền vững, được sản xuất ở quy mô công nghiệp nhưng
không tìm thấy trong tự nhiên.
- Vitamin B12 là một vitamin quan trọng để chữa bệnh thiếu máu nguy hiểm vì bệnh viêm
dây thần kinh ngoại biên, đồng thời nó cũng là một vitamin quan trọng cần bổ sung trong
khẩu phần ăn động vật và cả con người. Nó rất quan trọng trong quá trình trao đổi chất:
nếu thiếu hoặc không đủ vitamin B12 trong cơ thể con ngƣời và động vật sẽ gây ra hiện
tượng rối loạn trao đổi chất hydratcacbon và axit béo. Cụ thể: Vitamin B12 tham gia vào
việc sinh tổng hợp enzym metyl malomye – CoA - mutase và rất nhiều enzym quan trọng
khác. Các enzym này tham gia vào các phản ứng chuyển metyl và quá trình tổng hợp
methionin, cholin, thimin.
- Bởi vì tổng hợp vitamin B12 bằng phương pháp hóa học khó khăn và tốn kém nên người
ta thƣờng sản xuất vitamin B12 đại trà bằng phương pháp lên men vi sinh vật gián đoạn
hoặc kết hợp gián đoạn và liên tục.
2. Cấu tạo hóa học
- Tên quốc tế: cyanocobalamin và hydroxo –cobanamin
- Công thức hóa học là C63H90N14O14PCo
- Cấu trúc hóa học của vitamin B12 gồm 2 phần:
+ Phần cobamid gồm 4 nhân pyrol đã hydrogen hóa, giữa nhân là nguyên tửcoban hóa trị
3; các nhân này đã bị thế bởi nhóm methyl, acetamid và propionamid.
+ Phần nucleotid gồm 5,6 dimethylbenzimidazol đã este hóa bởi acid phosphoric
- Cobamid và nucleotid được nối với nhau qua cầu isopropanol.Nguyên tử coban
liênkếtcộng hóa trị với 1 nitơ của một nhân pyrol, liên kết phối trí với 3 nitơ của 3
nhân pyrol còn lại và nitơ trong nhân benzimidazol; liên kết ion với acid phosphoric. Hóa
trị cuối cùng của coban liên kết với các nhóm chức khác nhau tạo ra các vitamin B12
khácnhau. Hai chế phẩm vững bền khi bảo quản và là chế phẩm dược dụng là
cyanocobalamin có công thức cấu tạo như trên vàhydroxocobalamin khi thay CN bằng

nhóm OH.

5


Hình 4: Cấu tạo của vitamin B12
3. Tính chất
- Vitamin B12 thường ở dạng kết tinh ,có kích thước rất nhỏ ,màu sẫm đỏ,không có mùivà
vị.
- Vitamin B12 hòa tan trong nước,trong các dung dịch trung tính,trong cồn.
- Vitamin B12 không hòa tan trong eter, axeton,benzene,clorofoc.
-Vitamin B12 bền nhiệt khi chúng ở dạng xiamit, nhưng khi tiếp xúc với kim loại nặng thì
rất dễ mất hoạt tính, vitamin B12 không bền trong môi trường pH kiềm.
-Vitamin B12 có trong gan và các bộ phận khác của động vật, nhưng lại không thấy có
mặt ở các tổ chức thực vật bậc cao.
6


4.Vi sinh vật tham gia tổng hợp vitamin B12
-Quá trình sinh tổng hợp vitamin B12 là một quá trình rất phức tạp, trải qua nhiều giai
đoạn khác nhau nhờ sự tham gia củanhiều loại enzyme khác nhau.
-Quá trình sinh tổng hợp vitamin B12 bắt đầu bằng sự tạo thành các porphinin, sau đógắn
các nucleotat và các thành phần khác vào.Porphinin của vitamin B12 khác với porphinin
của xytocrom, clorofin ở chỗ nó chứa rất nhiều nhómCH2CH2COOH và CH3
-Co trong cấu tạo vitamin B12 được gắn vào bằng ba hóa trị thong thường và ba hóa trị
phụ.Co tạo màu đỏ cho vitamin B12
-Tham gia quá trình tổng hợp vitamin B12 có rất nhiều vi sinh vật khác nhau.
4.1.Vi khuẩn Propionibacterium.
-Trong các giống vi khuần tham gia tổng hợp vitamin B12 có giống Propionibacterium
shermanii là giống có nhiều ưu điểm nhấtvà có thể đưa vào sản xuất công nghiệp.

-Vi khuẩn này có một số đặc điểm sau:
•Là trực khuẩn,có kích thước nhỏ.
•Trong thiên nhiên chúng thường xếp
thành từng đôi hoặc từng chuỗi ngắn
•Chúng thuộc loại hiếu khí tùy ý.
•Chúng có khả năng lên men acid lactic
, glycerol, glucose, fructo, manit, lactose.
Hình 5: Vi khuẩn Propionibacterium shermanii
•Khoảng pH hoạt động 4,5-7,5, pH tối ưu cho việc sinh tổng hợp B12 là 5,8-7,5
•Nhiệt độ thích hợp cho sinh tổng hợp vitamin B12 là 28-30C
•Các chất dinh dưỡng cho sự phát triển bao gồm:muối amon,amoniac, CoCl2
hoặc Co(NO3)2;các kim loại :Cu ,Fe,Zn,Mn thườnglàm giảm quá trình tổng hợp B12.
•Các vitamin làm tăng hiệu suất tổng hợp vitamin B12 bao gồm: tiamin, biotin,acid
nicotinic ,acid tolic.

4.2. Xạ khuẩn Actinomyces
- Trong các giống thuộc Actinomyces có giống Actinomyces olivacens có khả năng tổng
hợp vitamin B12 cao hơn cả và chúng được sử dụng để sản xuất vitamin B12 theo quy mô
công nghiệp.
7


Một số đặc điển quan trọng của giống xạ khuẩn này là
•Xạ khuẩn Act. Olivacens thuộc loại kị khí tùy tiện.
•Chúng phát triển mạnh và sinh nhiều vitamin B12 trong môi trường chứa glucose, tinh
bột, mật rỉ, bã rượu. Trong thành phầnmôi trường này cần cho thêm các muối amon, muối
coban, CaCO3
•Sinh tổng hợp B12 chỉ xảy ra mạnh sau 24 giờ nuôi cấy.
•Trong quá trình lên men, xạ khuẩn tạo ra hai pha rõ rệt:
+ Pha tạo thành sinh khối

+ Pha tạo thành vitamin B12
•Thường pha tạo thành vitamin B12 chỉ
xảy ra mạnh khi kết thúc quá trình tăng sinh khối.
•pH ban đầu môi trường nên điều chỉnh ở khoảng 7.
Ở pha thứ nhất pH sẽ giảm xuống khoảng 6,5 và
bước sang pha thứ hai pHsẽ tăng lên 8,2-8,7 .
•Thổi khí có ảnh hưởng rất lớn đến sự tổng hợp
vitamin B12,do đó trong quá trình lên men
bắt buộc phải thổi khí mạnh.

Hình6: Xạ khuẩn Actinomyces

•Nhiệt độ cho sự phát triển và sinh tổng hợp B12 là 28-300C. •Thời gian lên men là 60120 giờ.
4.3.Vi khuẩn sinh metan :
- Trong thiên nhiên có rất nhiều vi sinh vật tham gia lần lượt nhiều phản ứng tạo ra khí
metan.Khí metan là loại khí có thể đốtđược,đồng thời nó là loại khí tạo ra hiện tượng hiệu
ứng nhà kính lớn nhất. Cùng với sự tạo thành khí metan, vi sinh vật còn tổnghợp được số
lượng vitamin B12 rất lớn
Đặc điểm chung của vi khuẩn sinh khí metan:
•Chúng thuộc vi khuẩn gram(-)
•Chúng không chuyển động.
•Không sinh bào tử.
•Thuộc loại kị khí bắt buộc.
8


Hình 7: Vi khuẩn sinh metan

5 .Công nghệ sản xuất:
5.1.Giữ giống:

- Để sản xuất vitamin B12 theo qui mô côngnghiệp người ta thường sử dụng chủng
Prop.shermanii .Chủng này được giữ giốngtrong môi trường thạch nghiêng với
glucose,KH2PO4, (NH4)2SO4
- Trong môi trường người ta cho thêm cao ngô hoặc nước chiếttrái cây, nuôi vi khuẩn
ở điều kiện nhiệt độ 28-32C trong thời gian 7-8 ngày, sau đó bảo quan lạnh,cấy truyền
định kỳ mỗi thángmột lần.
5.2.Nhân giống cho sản xuất:
-Nhân giống cho sản xuất thường được tiến hành trong điều kiện kị khí bắt buộc.Môi
trường cho nhân giống có lượng đường ít hơn môi trường lên men,còn các thành phần
khác của môi trường giống như môitrường len men.
- Trong môi trường ngoài thành phần đường ra người ta còn cho them các muối amon,
amoniac, CoCl2 hoặc Co(NO3)2 .Nhân giống là quá trình tăng dung tích, dịch chứa sinh
khối qua nhiều cấp. Mỗi cấp nhân giống thường tăng dung khối từ 10-15lần. Cứ làm như
vậy cho đến khi toàn bộ dung tích đủ để tiến hành quá trình lên men.
-Lưu ý là trong trường hợp không dung chủng vi khuẩn Prop.shermanii để sản xuất
vitamin B12 ta dùng xạ khuẩn hoặc các vi khuẩn sinh khí metan thì phải thay đổi thành
phần môi trường và điều kiện nuôi cấy
5.3.Quá trình lên men:
5.3.1.Lên men trực tiếp
- Trong quá trình này, olivaceus Streptomyces được cấy trong môi trường có chứa chất
dinh dưỡng glucose là nguồn carbon.chloride Cobalt, CoCl2 (ít hơn 10ppm) được thêm
vào như là chất tiền thân bổ trợ ở giai đoạn đầu hoặc không liên tục trong thờigian sản
xuất. Nồng độ cao hơn của CoCl2 thường gây độc hại. Lên men được thực hiện ở 27˚C bổ
sung thêm khí CO2 trongkhoảng 5 ngày. Vào cuối thời kì lên men, Vitamin được thu hồi
trước khi tế bào phá hủy các vitamin. vitamin này được thu hồi từnước bằng cách lọc ly
tâm tốc độ cao. Một phần tế bào có chứa vitamin B12 được sấy khô và dùng làm thức ăn
gia súc, gia cầm.Phần nước lọcra và tế bào còn lại được axit hóa hoặc xử lý với rượu để
9

phục hồi thêm các vitamin. Đôi khi cần xử lý nhiệt đểkhai thác triệt để các vitamin từ tế
bào; vitamin không bền với nhiệt nên nhiệt được áp dụng một cách thận trọng và
được tínhtoán trước.
- Trong quá trình axit hóa, natri sunfit được thêm vào để ổn định vitamin. Acidified broth
được dùng để loại bỏ sự pháttriển tế bào và phần nước lọc được bốc hơi để khô trong chân
không. Vitamin B12 có thể được tiếp tục tinh chế bằng cách xử lý với các loại phenol và
acetone. Cuối cùng được kết tinh bởi dung dịch nước-aceton
-Lên men trực tiếp sử dụng Bacillus megaterium, Propionibacterium freudenreichii,
Propionibacterium shermanii vàPseudomonas cũng đã được sử dụng cho sản xuất thương
mại vitamin B12. Những phương pháp này tương tự như trên, nhưngkhác nhau về năng
suất và phục hồi, điều kiện tăng trưởng và số lượng lên men trung bình.
-P. shermanii được trồng trong điều kiện kỵ khí trong 3 ngày ở 30°C và trong điều kiện
hiếu khí trong 4 ngày, các môi trường lên men (tăng trưởng trung bình) chứa glucose,
cobalt chloride, cao ngô (một sản phẩm chất thải của sản xuất tinh bột),ammonia và.
Amoniac được sử dụng trong các hình thức hydroxit amoniac để duy trì độ pH của môi
trường tại 7. Năng suất bình thường là 23 mg/lít khi Propionibacterium được sử dụng
-Denitrificans Pseudomonas được trồng trong 2 ngày trong môi trường nuôi cấy hiếu khí
có chứa nhiều đường sucrose, betain,axit glutamic, clorua coban, 5,
6 dimethylbenzimidazol, và muối.
5.3.2.Sản xuất gián tiếp
- Vitamin B12 còn là sản phẩm phụ của quá trình lên men kháng sinh khác nhau như
Grisein, Streptomycin và sản xuấtAureomycin. Nó cũng được hình thành trong quá trình
lên men acetone- butanol. Vitamin B12 có mặt ở nồng độ cao trong bùnthải.
5.3.3.Kỹ thuật di truyền
-Các chủng Streptomyces griseus đã được phát triển thông qua cải tiến giống đột biến có
liên quan đến chương trình nghiêm ngặt và kỹ thuật tái tổ hợp để sản xuất lượng vitamin
B12 nhiều hơn so với sản xuất thuốc kháng sinh. Phương pháp tiếpcận di truyềnnhư xáo
trộn hệ gen cũng đã được áp dụng trong khuẩn shermanii Propionibacterium để cải thiện
năng suất thu hồi vitamin B12.
-Đối với vi khuẩn Prop. Shermanii quá trình lên men được thực hiện ở pH ban đầu của

môi trường là 6,8-7 . Trong quá trình lên men phải điều chỉnh pH bằng NH4OH
-Đối với xạ khuẩn pH ban đầu là 7 .Trong quá trình lên men ít khi người ta điều chỉnh pH.
Lượng vitamin B12 bắt đầu tổng hợpmạnh ở pha thứ hai.Khi đó pH sẽ tăng dần đến vùng
kiềm yếu. Đối với các vi khuẩn sinh metan thường sử dụng môi trường làcác loại phế liệu
trong sản xuất cồn, bia,thậm chí cả bùn thối,việc điều chỉnh pH không cần đặt ra nhiều.
10


- Nhiệt độ lên men cho các vi khuẩn tổng hợp B12 thường nằm trong khoảng 28-32C
-Thời gian lên men thường là 5-7 ngày. Đối với xạ khuẩn thời gian thường ngắn hơn các
vi khuẩn. Dịch sau khi nuôi sẽ được lytâm ở máy ly tâm cao tốc với tốc độ 10.000
vòng /phút.Sinh khối thu được đem sấy khô làm chế phẩm thô cho gia súc hoặc đemsing
khối chiết rút và tinh chế thu nhận vitamin B12.
6.Một số sản phẩm B12 ứng dụng trên thị trường
-Hiện nay trên thị trường có bán nhiều chế phẩm vitamin B12 cùng kháng
sinh tetracycline,clotetracycline được mang tênthương mại là BIOVIT, chế phẩm vitamin
B12 với tetramicin được gọitên thương mại là TERAVIT hay OTC.Các chế phẩmB12 này
sử dụng rộng rãi trong chăn nuôi.Ngoài ra còn một số công dụng đối với các bệnh về máu:
thiếu máu ác tính tự pháthoặc sau khi
cắt dạ dày, các bệnh khác thiếu
vitaminB12 do hấp thụ kém. Hấp
thụ kém sau khi cắt một phần dạ dày và
hội chứngquai ruột chột cũng như một
số hiếm trường hợp thiếu máu do thai
nghén. Dùng hỗ trợ khi điều trị với
amoni Salicylat vì làmgiảm hấp thu
vitaminB12. Để xác định sự thiếu
vitaminB12 dùng nghiệm pháp thilly.
VitaminB12 dùng điều trị một số bệnh
thầnkinh như đau thần kinh toạ, đau

dây thần kinh cổ, cánh tay, đau do các
bệnh thần kinh, hoặc dùng làm thuốc bổ
Hình 8: Vitamin B12 trên thị trường
cho người bệnhkêu mệt mỏi hoặc trạng thái dễ bị mệt nhưng chưa có căn cứ về tính hiệu
quả điều trị bệnh này.
-Vitamin B12 có tác dụng tốt với nhiều người bệnh vì nó giúp cho sự phân chia và tái tạo
tổ chức tế bào, tổng hợp mạnh protein và chuyển hóa lipid. Nó tham gia tổng hợp
thymidylate- một thành phần trong ADN, cung cấp nguyên liệu để tổng hợp ADN,góp
phần vào quá trình phân chia tế bào trong cơ thể. Nhưng với người bệnh ung thư thì điều
này lại không có lợi. Khối u ác tínhcó những biểu hiện sinh hóa của một tổ chức đang phát
triển mạnh, tăng protein có trọng lượng phân tử nhỏ, tăng ADN, ARN và quá trình phân
bào. Trong khi đó, vitamin B12 lại thúc đẩy quá trình này.Vì vậy không nên cho bệnh
nhân ung thư sử dụngvitamin B12.

11


12