NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG BƯỞI BẰNG KĨ THUẬT RAPD

1

MỞ ĐẦU
Bưởi (Citrus grandis L.) là cây ăn quả có tác dụng bổ dưỡng và có nhiều
giá trị về mặt y học. Bưởi được trồng rộng rãi ở Việt Nam, tuy nhiên, mỗi vùng
có một số giống bưởi khác nhau do kết quả của quá trình chọn lọc cũng như ảnh
hưởng của điều kiện khí hậu và thổ nhưỡng. Trên đất nước ta từ lâu đã hình
thành những vùng trồng bưởi và những giống bưởi nổi tiếng như bưởi Đoan
Hùng (Phú Thọ), bưởi Đường Hương Sơn (Hương Sơn, Hà Tĩnh), bưởi Phúc
Trạch (Hương Khê, Hà Tĩnh), bưởi Thanh trà (Huế), bưởi Biên Hòa (Đồng Nai),
bưởi Năm roi, bưởi Da xanh (Vĩnh Long)… [1]. Các giống bưởi này về mặt hình
thái khác nhau không đáng kể, từ lá, hoa cho đến hình dạng trái. Sự khác nhau
thể hiện ở màu sắc của cùi quả, cách sắp xếp múi, màu sắc và mùi vị của tép.
Hiện nay, ở nước ta bưởi được trồng phổ biến và đem lại thu nhập cao cho
bà con nông dân. Bưởi có rất nhiều giống do được trồng từ lâu và có nhiều giống
du nhập từ miền Bắc và miền Nam. Để đánh giá mức độ di truyền thì việc dựa
vào những chỉ thị hình thái là chưa đủ mà cần có những đánh giá sâu hơn về cấu
trúc di truyền, cụ thể là hệ gen. Các kỹ thuật sinh học phân tử là công cụ hữu
hiệu, đã được ứng dụng rất rộng rãi để phân tích tính đa dạng di truyền cũng như
xác định mối quan hệ họ hàng giữa các loài với nhau. Trong những năm gần đây,
việc sử dụng các chỉ thị phân tử giúp phát hiện các biến dị trong các giống bưởi
hay các cây có múi đã trở nên phổ biến ở Việt Nam cũng như trên thế giới. Các
chỉ thị phân tử sẽ cho kết quả có độ chính xác cao, tiết kiệm thời gian do các đặc
điểm phân tử thường độc lập với các đặc điểm hình thái.
Kỹ thuật RAPD (Random amplified polymorphic DNA) là kỹ thuật sinh
học phân tử dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những primer ngắn
(khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trước, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên
những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của các primer. Theo nguyên
tắc, khi 2 cá thể hoàn toàn giống nhau, sau khi thực hiện phản ứng PCR-RAPD ở
điều kiện như nhau sẽ tạo ra số lượng các đoạn bằng nhau và chiều dài các đoạn

2

tương ứng bằng nhau. Khi có đột biến làm xuất hiện hay mất đi một vị trí bắt cặp
ngẫu nhiên sẽ tạo ra số lượng và chiều dài các đoạn DNA khác nhau giữa các cá
thể, vì vậy kỹ thuật RAPD có thể phát hiện đột biến. Kỹ thuật RAPD giúp nhận
diện những chỉ thị phân tử trội. Việc ứng dụng kỹ thuật RAPD để nghiên cứu đa
dạng di truyền đã được rất nhiều tác giả quan tâm và thực hiện trên nhiều đối
tượng vi sinh vật, thực vật và động vật [63].
Để có thể phân biệt các giống bưởi dựa trên các đặc điểm di truyền, chúng
tôi chọn đề tài “Nghiên cứu đa đạng di truyền của một số giống bưởi bằng kỹ
thuật RAPD” nhằm khảo sát sự sai khác của các band điện di thu được.
Mục tiêu đề tài
Sử dụng chỉ thị RAPD để nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số
giống bưởi thu thập được ở các vùng khác nhau.
Nội dung nghiên cứu
- Thu thập mẫu lá của các giống bưởi và tách chiết, tinh sạch DNA tổng
số.
- Phân tích đa dạng di truyền của các giống bưởi nghiên cứu bằng kỹ
thuật RAPD.
- Phân tích mối quan hệ di truyền giữa các giống bưởi nghiên cứu dựa
trên giản đồ phả hệ DNA.

Chương 1.


3

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
I. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BƯỞI VÀ GIÁ TRỊ CỦA BƯỞI

1. Giới thiệu chung về bưởi
Những ghi nhận lịch sử và phân tích di truyền có thể kết luận chỉ có 3 loài
thực sự trong chi Citrus (thanh yên, quýt và bưởi) và nhiều dạng sinh học dưới
loài. Cam, chanh, chanh cốm, bưởi chùm mặc dù được thừa nhận rộng rãi nhưng
chúng rất giống nhau về mặt di truyền, được tạo ra do chọn lọc, nhân giống bằng
chiết ghép hay bằng hạt. Sự khác nhau giữa các dạng này có nguồn gốc từ các
đột biến soma. Hơn nữa, nhiều thế hệ cây lai được tạo ra và được con người chọn
lọc từ các dạng ăn được hay theo các tiêu chí công nghiệp tạo nên sự đa dạng
trong chi Citrus như hiện nay [52].
Bưởi thuộc họ cam chanh (Rutaceae), dưới họ Aurantioidae, tộc Citreaea,
dưới tộc Citrinae (Webber, 1967). Họ Rutaceae gồm 2 tộc và 33 chi. Mỗi tộc
Clauseneae và Citreae được tạo thành từ 3 dưới tộc: Clauseneae bao gồm
Micromelinae, Clauseninae và Merillinae; Citrinae gồm có Triphasiinae, Citrinae
và Balsamocitrinae. Citrinae gồm 3 nhóm là Citrus nguyên thủy, gần giống
Citrus và Citrus thật. Citrus thật gồm 6 chi: Clymenia, Eremocitrus, Microcitrus,
Poncitrus, Fortunella và Citrus (Swingle and Reece, 1967). Hai hệ thống phân
loại của chi Citrus được dùng phổ biến nhất là của Swingle và Tanaka. Swingle
(1967) cho rằng chi Citrus có 16 loài, trong khi đó Tanaka (1977) lại cho rằng có
đến 162 loài. Tuy nhiên, Scora (1975) cho rằng chỉ có 3 loài là thanh yên (C.
medica), quýt (C. reticulata), và bưởi (C. grandis hoặc C. maxima) và Papeda là
một nhóm của chi Citrus [62], [39].
Bưởi thuộc cây đại mộc, cao khoảng 10 m. Lá có phiến to, dày, gân phụ 56 cặp, cuống có cánh rộng và có đốt vào phiến. Hoa có chùm ngắn, trục có lông,
cánh hoa trắng, dài 3,5 cm, tiểu nhụy nhiều, dính nhau. Trái to, gần như tròn, to


4

25-30 cm, quả bì dày, nạc quanh hột trong, ngà hay hường. Bộ nhiễm sắc thể
2n=18 [8].
Bưởi là một loài cây ăn quả thân gỗ, sống lâu năm, lá thường xanh quanh

năm, thân cây cao, tán cây có dạng hình tròn tự nhiên, hình dẹt hoặc nón. Cành
thường to hơn cam, quýt, cành lá phát triển mạnh. Các bộ phận lá, cành, quả khi
còn non thường phủ một lớp lông tơ mỏng. Nhìn chung, cây có múi có bộ rễ ăn
cạn, các rễ lông mọc yếu nên khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng thấp [4],
[16].
Bưởi có thể sinh sản hữu tính bằng hạt hay nhân giống bằng giâm, chiết
cành. Thông thường bưởi được nhân giống bằng hạt và thường ít được chú ý
chăm sóc, chọn lọc nên có xu hướng ngày càng đa dạng so với các loài cây kinh
tế khác trong chi Citrus. Bưởi được xem là cây trồng có khả năng thích nghi rộng
với khí hậu mặc dù điều kiện sống tự nhiên của chúng là ở vùng nhiệt đới ẩm
[55].
Bưởi được trồng trên khắp thế giới, ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới,
những nơi mà mùa đông có nhiệt độ ôn hòa, cây có thể sống sót và có đủ nước để
sinh trưởng, phát triển (Gmitter và cs, 1992). Chất lượng quả bưởi tốt nhất là ở
các vùng cận nhiệt đới. Các vùng trồng Citrus phổ biến nhất là châu Mỹ (Brazil,
Mỹ, Argentina và Mexico), lưu vực Địa Trung Hải (Nam Âu, Tây Nam Á, Bắc
Phi), châu Á (Trung Quốc, Ấn Độ và Nhật Bản) và Nam Phi. Theo FAO (2006),
sản lượng bưởi và bưởi chùm trên thế giới là 4 triệu tấn, được trồng ở 74 quốc
gia với diện tích là 264.000 ha. Mỹ là nước có sản lượng bưởi và bưởi chùm lớn
nhất thế giới. Vùng Đông Nam Á, đặc biệt là Đông Ấn Độ, Bắc Burma và Tây
Nam Trung Quốc được xem là trung tâm phát sinh và đa dạng của chi Citrus và
những chi có quan hệ gần gũi với nó. Tổng sản lượng quả của chi Citrus trên
toàn cầu trong thời gian 2004-2005 là 105,4 triệu tấn [36].
2. Giá trị của bưởi


5

Bưởi có nhiều giá trị về mặt y học đồng thời là thực phẩm ăn kiêng tốt cho
nhiều loại bệnh. Bưởi có thể được sử dụng trực tiếp hay chế biến thành nhiều món

ăn khác nhau như các loại mứt, bánh kẹo, gỏi và nước uống [22].
Theo Bộ nông nghiệp Hoa Kỳ, các thành phần dinh dưỡng của bưởi được
xác định ở bảng 1.1.
Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng của bưởi
Thành phần
Hàm lượng (100 g phần ăn được)
Nước
89,10 g
Năng lượng
38 kcal
Protein
0,76 g
Lipid tổng số
0,04 g
Tro
0,48 g
Carbohydrate
9,62 g
Chất xơ
1,0 g
Chất khoáng
Calcium
4 mg
Sắt
0,11 mg
Magnesium
6 mg
Phosphorus
17 mg
Potassium

216 mg
Sodium
1 mg
Kẽm
0,08 mg
Đồng
0,048 mg
Mangan
0,017 mg
Vitamin
Vitamin C
61,0 mg
Thiamin
0,034 mg
Riboflavin
0,027 mg
Niacin
0,220 mg
Vitamin B-6
0,036 mg
Vitamin A, IU
8 IU
Cholesterol
0 mg
Thành phần khác
β-Carotene
0 µg
α-Carotene
0 µg
β-Cryptoxanthin

10 µg
Nguồn: United States Department of Agriculture (USDA), 2004

Trong dung dịch nước ép múi bưởi có khoảng 9% citric acid, 14% đường.
Ngoài ra còn có lycopin, các enzyme amylase, peroxidase, vitamin C (50 mg trong
100 g dịch ép), vitamin A và B [11].
Phần vỏ quả bưởi có thể được sử dụng để làm mứt hoặc dùng làm nguyên
liệu của các hộp và thùng chứa. Hoa, quả và hạt bưởi có thể được ứng dụng trong


6

các mục đích y tế. Hoa bưởi còn có thể được sử dụng để tách chiết các chất trong
quá trình chế tạo nước hoa và pectin có thể được tách từ vỏ quả [55].
Bưởi được xem là nguồn vitamin C và các hợp chất giúp tăng cường sức
khỏe như carotenoids, flavonoids, linonoids và chất xơ (Yu và cs, 2005). Các chất
này có khả năng chống chất sinh ung thư và kháng đột biến, giúp con người chống
lại bệnh tật. Ngoài ra, hoạt tính chống oxy hóa của bưởi còn liên quan đến sự hiện
diện của nhiều loại polyphenols và acid ascorbic [56].
Bưởi chứa nhiều loại flavonoid có cấu trúc khác nhau, bao gồm flavanone và
flavone O- và C-glycosides, ngoài ra còn có methoxylated flavone. Mỗi nhóm
hợp chất này đều biểu hiện hoạt tính cao trong chống viêm và trị ung thư. Có
bằng chứng cho rằng các tác dụng sinh học của các flavonoid ở bưởi là có liên
quan đến những tương tác của chúng với các enzyme điều hòa chủ chốt tác động
đến kích hoạt tế bào và gắn kết thụ thể. Các flavonoid bưởi biểu hiện hoạt tính
thấp trên các tế bào khỏe mạnh, bình thường, và vì thế biểu hiện đặc tính gây độc
thấp rõ rệt ở các loài động vật. Những chất này mở rộng ảnh hưởng của chúng
trong cơ thể thông qua sự cảm ứng của các enzyme gan I và II, và thông qua hoạt
động sinh học của các chất chuyển hóa của chúng. Như vậy, có bằng chứng rõ
ràng về những đặc tính tiềm năng của các hợp chất này trong việc tăng cường sức

khỏe ở con người [50].
Carotenoid được xem như là tiền chất của vitamin A – chất rất quan trọng
trong chế độ ăn của con người và động vật; ngoài ra nó còn đóng vai trò là chất
chống oxy hóa, giúp giảm nguy cơ mắc bệnh ung thư (Olson, 1989). Bưởi là
nguồn phức hệ carotenoid với số lượng carotenoid lớn nhất được tìm thấy trong
bất kỳ loại trái cây nào. Nồng độ và thành phần carotenoid thay đổi rất lớn giữa
các loài bưởi và phụ thuộc vào điều kiện phát triển (Gross, 1987) [46].
Ngày nay, khoa học còn khám phá thêm những đặc tính trị liệu mới của
bưởi. Trong bưởi chứa nhiều pectin, là chất sợi hòa tan chứa polysaccharide giúp
hấp thu cholesterol của thức ăn và muối mật nên làm giảm cholesterol trong máu
[11].


7

II. ỨNG DỤNG CỦA CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ
TRONG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN Ở CHI CITRUS
Trong xu hướng hiện nay, để chọn giống cây trồng hay xác định nguồn
gốc của các loài cây trồng người ta thường sử dụng các chỉ thị phân tử (marker).
Việc sử dụng các chỉ thị phân tử sẽ cho kết quả có độ chính xác cao, tiết kiệm
thời gian do các đặc điểm phân tử thường độc lập với các đặc điểm hình thái,
không chịu tác động của môi trường và chủ động trong nghiên cứu. Việc sử dụng
các kỹ thuật sinh học phân tử là một công cụ đắc lực để phân tích tính đa dạng di
truyền của rất nhiều loài.
Gần đây, các phân tích phân tử như phân tích trình tự các đoạn nucleotide
lặp lại đơn giản (SSR-Simple sequence repeat), hay microsatellite các đoạn giữa
hai SSR (ISSR-Inter-simple sequence repeat), đa hình chiều dài các đoạn cắt hạn
chế (RFLP-Restriction fragment length polymorphism), đa hình các đoạn khuếch
đại ngẫu nhiên (RAPD-Random amplified polymorphic DNA), đa hình các đoạn
khuếch đại với các primer đặc hiệu (SCAR-Sequence characterized amplified

region), phản ứng RAPD cho gen ctv (CAPS)… đã được sử dụng để kiểm tra
mối quan hệ họ hàng trong số các nhóm phân loại chi Citrus [52]. So sánh với
phương pháp truyền thống thì phân loại và nghiên cứu đa hình bằng các chỉ thị
phân tử cho kết quả có độ tin cậy cao [3].
Trong số các chỉ thị trên thì RAPD được sử dụng phổ biến nhất để phân
biệt giữa các loài khác nhau hay để xác định bản đồ gen ở các loài thực vật. Kỹ
thuật này đã được sử dụng thành công trong việc xác định sự đa hình ở cà chua,
cây mâm xôi, táo và cây mơ (Bogani và cs, 1994; Davis và cs, 1995; Dubouzet
và cs, 1997; Mariniello và cs, 2002; Tartarini, 1996; Warburton và cs, 1996)
[51].

1. Ứng dụng của kỹ thuật RAPD trong phân tích đa dạng di truyền


8

Kỹ thuật RAPD dựa trên nguyên tắc của PCR, sử dụng các primer ngắn
không đặc hiệu để nhân bản các đoạn DNA trong genome một cách ngẫu nhiên
[9]. Sự đa hình RAPD tạo thành từ sự thay đổi của 1 nucleotide, ví dụ như chèn
đoạn hay mất đoạn dẫn đến thay đổi vị trí kết hợp primer (Williams và cs, 1993).
Những sản phẩm của sự khuếch đại có thể là đa hình và được sử dụng như là các
chỉ thị di truyền (Tingey and del Tufo, 1993) [65]. RAPD là một kỹ thuật dễ thực
hiện và có giá thành rẻ, với những ưu điểm nổi bật là chỉ cần một lượng nhỏ
DNA khuôn mẫu, không tạo thành phóng xạ và cho kết quả phân tích nhanh mà
không đòi hỏi các thông tin về tình tự DNA của một loài (Williams et al., 1990;
Martin et al., 1997). Mặc dù trong một số trường hợp, kỹ thuật RAPD có khả
năng lặp lại thấp nhưng vấn đề này có thể được khắc phục bằng cách tối ưu hóa
các điều kiện phản ứng (Weising et al., 1995). Nhìn chung, RAPD có thể cung
cấp các dữ liệu có giá trị về sự đa dạng di truyền bên trong hoặc giữa các quần
thể của một loài (Lynch and Milligan, 1994; Collignon et al., 2002) [47].

Trong kỹ thuật RAPD thì các primer ngẫu nhiên chứa 10 nucleotide là cho
kết quả khuếch đại tốt nhất (Coletta Filho và cs, 1998; Elisiario và cs, 1999).
Trong chi Citrus, RAPD đã được sử dụng để xác định các đột biến ở loài chanh
(Deng và cs, 1995), xây dựng bản đồ gen (Cai và cs, 1994), xác định các chỉ thị
liên quan với các đặc điểm nông học (Cheng và Roose, 1995; Gmitter và cs,
1996) và cho các nghiên cứu về phân loại học (Luro và cs, 1992) [33].
Tính đa dạng sinh học của các loài cây có múi ở Gò Quao (Kiên Giang) đã
được Nguyễn Hữu Hiệp và cs (2004) nghiên cứu dựa vào các đặc điểm hình thái
và phân tử. Các đặc điểm về hình thái học cho thấy cây có múi tại Gò Quao,
Kiên Giang chia làm 5 nhóm bao gồm: bưởi, cam, quýt, chanh và hạnh. Sử dụng
4 primer là OPA02, OPA04, OPA11 và OPA13 (Operon Technologies, CA)
trong phân tích đa dạng di truyền bằng kỹ thuật RAPD cho kết quả 49 chỉ thị
phân tử được ghi nhận. Giản đồ phả hệ cho thấy cây có múi của Gò Quao, Kiên
Giang chia thành 4 nhóm: bưởi, cam-quýt, chanh và hạnh. Kết quả phân tích cho
thấy khoảng cách di truyền giữa các nhóm biến động từ 0-43%. Trong 49 chỉ thị


9

có 11 chỉ thị xuất hiện ở 100% số cá thể, 26 chỉ thị trên 90%, 4 chỉ thị trên 80%,
2 chỉ thị trên 70%, 6 chỉ thị dưới 70% và có 1 chỉ thị là 45% [7].
Kỹ thuật RAPD đã được sử dụng để phân biệt các cây con có nguồn gốc
từ phôi tâm và hợp tử tạo thành từ phép lai giữa các giống quýt Montenegrina
(Citrus deliciosa Tenore) và King (C. nobilis Loureiro). Phôi được tách ra từ
những hạt giống, nhân giống in vitro và thích nghi trong điều kiện nhà kính. Bốn
primer ngẫu nhiên đã được sử dụng để nhận biết 54 cây có cùng nguồn gốc hữu
tính từ tổng số 202 cá thể. Mức độ đa hình của mỗi primer được phản ánh qua số
lượng của các cây có nguồn gốc hợp tử thu được trên mỗi primer. Thuật toán
phân tích nhóm của cây bố mẹ và con cái đã sắp xếp các cá thể vào các nhóm
riêng biệt với khoảng cách di truyền lớn nhất là 20% [23].

Abkenar và cs (2003) đã sử dụng kỹ thuật RAPD khi nghiên cứu các đặc
điểm phân tử và khoảng cách di truyền giữa các loài Citrus ở Nhật. Đối tượng
nghiên cứu gồm 31 loài Citrus khác nhau, trong đó có 6 loài cam chua, 4 loài
‘Yuzu’ và 21 loài họ hàng. Trong số 60 primer sử dụng có 27 primer được lựa
chọn với 108 chỉ thị tạo thành, 76 chỉ thị trong số đó là đa hình, trung bình là 2,8
chỉ thị trên mỗi primer. Số lượng của các chỉ thị đa hình trên mỗi primer nằm
trong khoảng từ 1 đến 8 và kích thước của các chỉ thị là từ 400 bp (OPA18) đến
3.200 bp (OPA01). Trong nghiên cứu này, một số chỉ thị RAPD có thể giúp phân
biệt giữa các loài cây trồng rất gần gũi: OPA17 (1.100) và OPE20 (675) chỉ có ở
‘Kabosu’ mà không có ở ‘Aka kabosu’; tương tự OPA20 (1.400), OPB05 (990)
và OPE16 (1.000) chỉ có ở ‘Aka kabosu’ mà không có ở ‘Kabosu’. Cây phát sinh
loài được tạo thành dựa trên khoảng cách di truyền cho thấy các loài cam chua
rất khác với các loài ‘Yuzu’ và họ hàng của chúng. Các loài ‘Yuzu’ có mối quan
hệ gần gũi với nhau, tuy nhiên sự đa hình di truyền của các loài nghiên cứu khác
có thể được xác định dễ dàng bằng kỹ thuật RAPD và sự đa dạng di truyền giữa
các loài là khá cao, biểu lộ các nguồn gốc khác nhau của chúng [18].
Trong nghiên cứu nhằm xác định 10 giống chanh ở vùng Campania, miền
Nam nước Ý, Mariniello và cs (2004) đã sử dụng kỹ thuật RAPD với 44 primer


10

ngẫu nhiên có độ dài 10 nucleotide. Tất cả các primer đều được sử dụng trong
phản ứng RAPD với DNA khuôn mẫu của các giống chanh nghiên cứu nhằm xác
định sự đa hình. Mọi primer đều tạo ra các sản phẩm khuếch đại trong đó có 5
primer tạo ra các band có thể dùng để xác định các giống cây trồng. Sản phẩm
khuếch đại của giống Sorrento khi thực hiện phản ứng với primer OPL02 cho
thấy sự hiện diện 2 band (1.000-1.200bp) mà không có ở các giống khác. Giống
chanh này còn tạo ra chỉ một sản phẩm khuếch đại duy nhất khi được khuếch đại
với primer OPL16. Ngoài ra, primer OPL14 còn rất hữu ích trong xác định giống

Amalfi với hình ảnh điện di biểu thị sự vắng mặt của các band có khối lượng
phân tử cao và thấp. Giống Procida được nhận dạng bởi primer OPL19 với các
band khuếch đại đặc biệt có khối lượng phân tử thấp. Cuối cùng, với việc sử
dụng primer OPL31, giống Gloria d’Amalfi cho kết quả điện di không có các
band khối lượng phân tử cao. Kết quả còn cho thấy mức độ tương đồng giữa các
giống chanh nghiên cứu là khá cao, lớn hơn 80%, và có thể xếp chúng vào 4
nhóm. Nhóm thứ nhất bao gồm giống Napoli và S. Agnello; nhóm thứ hai gồm
Gloria d’Amalfi, Sorrento, Procida, Sfusato d’Amalfi, Variegato, and Cannellino;
nhóm thứ ba và nhóm thứ tư chỉ chứa 1 giống là Massa Lubrense và Amalfi [51].
Bastianel và cs (2001) đã sử dụng các chỉ thị RAPD để phân tích sự tương
đồng về mặt di truyền của 15 giống thuộc chi Citrus (Citrus spp.) ở Brazil, bao
gồm 4 giống cam ngọt (C. sinensis Osbeck), 4 giống quýt (C. reticulata Blanco,
C. nobilis Loureiro, C. sunki Loureiro và C. deliciosa Tenore), cam chua (C.
aurantium L.), bưởi chùm (C. paradisi Marcf.), bưởi (C. grandis Osbeck), thanh
yên (C. medica L.), chanh cốm (C. latifolia) và 2 dạng lai [C. clementina T. × (C.
tangerina T. × C. paradisi Macf.)]. Sự tương đồng di truyền của 15 giống này
được quan sát từ 12 primer ngẫu nhiên, độ tương đồng di truyền giữa các giống
quýt thấp nhất là 81%. Độ tương đồng thấp hơn thấy ở các loài ít quan hệ là C.
medica, C. grandis và C. latifolia. Bốn giống cam ngọt (C. sinensis Osbeck)
không có sự khác nhau dựa vào chỉ thị RAPD, chúng có độ tương đồng cao nhất
[22].


11

Năm dòng khác nhau của loài cam chua (Citrus aurantium L.) biểu hiện
những khác biệt có ý nghĩa về hình thái học đã được xác định bằng các chỉ thị
phân tử phát triển từ kỹ thuật PCR là ISSR và RAPD. De Pasquale và cs (2006)
đã phân tích các mẫu nghiên cứu với 11 primer ISSR và 6 primer RAPD
(OPH04, OPAT14, OPH15, OPM04, OPO14 và OPN14). Dòng AACNR32 biểu

hiện một kiểu band đặc trưng với tất cả các primer sử dụng, trong mỗi trường
hợp đều có từ 1 đến 3 band đa hình mà có thể phân biệt được nó với các dòng
khác. Các dòng còn lại có các kiểu band khuếch đại rất giống nhau, ngoại trừ các
sản phẩm khuếch đại thu được bởi primer ISSR (CA) 8RG, (AC)8YG và primer
RAPD OPH04. Với primer ISSR (CA) 8RG, dòng AACNR32 được phân biệt với
các dòng khác bởi một đoạn khuếch đại đơn hình 1.800 bp và không có đoạn
khuếch đại 800 bp mà hiện diện ở tất cả các dòng còn lại. Dòng AACNR9A được
xác định bởi sự vắng mặt của đoạn khuếch đại 500 bp. Ngoài ra, dòng
AACNR26A không thể phân biệt được với các dòng còn lại khi sử dụng các
primer trên [33].
Machado và cs (1996) đã sử dụng kỹ thuật RAPD để đánh giá sự đa hình
và sự tương đồng di truyền giữa 39 loài quýt Địa Trung Hải. Kết quả đã xác định
được 111 sản phẩm khuếch đại từ 21 primer ngẫu nhiên. Trung bình mỗi primer
có 2,2 chỉ thị RAPD, tương ứng với 42% của các sản phẩm khuếch đại. Các chỉ
thị RAPD đặc hiệu kiểu gen đã được xác định, phần lớn là của các cây lai. Thuật
toán phân tích nhóm UPGMA thể hiện sự khác biệt di truyền thấp giữa các loài
quýt Địa Trung Hải, trong khi các dạng lai của chúng với những loài Citrus khác
thể hiện sự khác biệt di truyền lớn hơn. Sự đa hình về mặt di truyền xác định
bằng kỹ thuật RAPD cho thấy sự khác nhau giữa các mẫu là khá thấp, như vậy có
thể chúng là một dòng đơn. Với số lượng dạng lai lớn cùng với sự đa hình giữa
các mẫu thấp có thể khẳng định giả thuyết rằng tất cả quýt Địa Trung Hải là dạng
lai của loài quýt phổ biến Citrus reticulata Blanco [49].
Năm mươi mốt cây đại diện cho 8 loài Citrus được thu thập từ Viện
nghiên cứu Nông nghiệp, Lefcosia, Cyprus (ARI) đã được phân tích bởi 10


12

microsatellite và 6 primer RAPD. Cả 2 phép phân tích microsatellite và RAPD
đều cho phép phân biệt các cây nghiên cứu ở mức độ loài. Mức độ đa hình thấp

hơn đã thu được giữa các cây trong cùng loài. Trong nhóm cam (gồm 6 giống và
các dòng của chúng) chỉ có 1 trong 10 primer SSR là có thể phân biệt giữa 2
nhóm cây trồng: một là giữa giống thương mại Shamouti và 2 giống địa phương,
Jaffa và Aematousiki; hai là giữa giống cam Valencia và giống cam địa phương
Shekeriko. Trong nhóm chanh (gồm 3 giống và các dòng của chúng), sự đa dạng
của tất cả các giống nghiên cứu (giống địa phương Polyphori, Lapithou và giống
thương mại Lisbon) đã được phân biệt bởi 1 primer SSR và 2 primer RAPD.
Giống quýt địa phương Arakapas và Willowleaf thể hiện sự tương đồng di truyền
hoàn toàn khi sử dụng cả chỉ thị microsatellite và RAPD. Kết quả này cho thấy
rằng giống địa phương Arakapas có thể là một dòng của Willowleaf, có nguồn
gốc từ một đột biến soma mà không được xác định bởi các chỉ thị phân tử được
sử dụng. Các marker SSR không cho thấy sự đa hình giữa các dòng của các
giống nghiên cứu. Các marker RAPD đặc hiệu dòng đã được xác định cho 1
dòng của Frappa và 1 dòng của Bergamot. Chỉ thị PB4-1000 tương ứng với sản
phẩm khuếch đại 1 kbp được tạo ra bởi primer OPB04 chỉ có ở cây Frappa dòng
4 mà không có ở các dòng Frappa khác. So sánh kết quả phản ứng RAPD của 5
dòng Bergamot được khuếch đại bởi primer OPB04 cho thấy sự hiện diện của
band 580 bp ở dòng 2 mà không thu được ở các dòng còn lại [40].
Năm quần thể loài chanh khác nhau thu được từ các noãn chưa phát triển
thông qua các quá trình nuôi cấy mô khác nhau đã được kiểm tra cho sự biến dị
di truyền dòng soma và biến dị do cảm ứng ánh sáng. Mẫu DNA từ 360 cây (72
cây của mỗi nhóm) đã được kiểm tra sự đa hình bằng kỹ thuật RAPD với 10
primer. Số lượng các sản phẩm khuếch đại được tạo ra bởi mỗi primer thay đổi từ
8 đến 15 với kích thước các band từ 100-3.000 bp. Trong số các cây thí nghiệm,
sự biến dị di truyền chỉ được xác định bên trong nhóm cây tái sinh từ các callus
phát sinh phôi được chiếu sáng. Trong số 72 cây của nhóm này, ba cây có chỉ thị
RAPD khác biệt so với những cây còn lại trong quần thể. Sự đa hình của các cây


13

13, 35 và 36 thu được theo thứ tự bởi các primer: OPA07, OPW15 và OPN09.
Trong cả 3 trường hợp này, sự khác biệt được thể hiện bởi sự vắng mặt của một
sản phẩm khuếch đại cụ thể là đoạn 500 bp ở cây 13, đoạn 3.000 bp ở cây 35 và
đoạn 300 bp ở cây 36 [54].
Sự đa dạng di truyền của các cây cam ngọt (Citrus sinensis Navel) được
trồng ở tỉnh Mazandaran, Iran đã được Dehesdtani và cs (2007) đánh giá bằng
chỉ thị RAPD. Năm mươi hai mẫu lá của các cây có ba hình thái quả khác biệt
(vỏ nhẵn, vỏ nhám và vỏ nửa nhám) đã được thu thập để tiến hành thí nghiệm.
Hai mươi mốt primer ngẫu nhiên đã được sử dụng trong phản ứng RAPD. Bốn
trong số 21 primer sử dụng đã tạo các band đa hình có tính lặp lại. Trong số các
band có kích thước từ 150 đến 2.100 bp tạo thành bởi 4 primer, có 70,13% là
band đa hình. Ma trận tương đồng sử dụng hệ số Nei đã được tạo ra và các kiểu
gen đã được sắp nhóm bằng phương pháp UPGMA. Sự đa hình di truyền cao
nhất đã thu được trong các nhóm vỏ nhẵn và vỏ nhám [34].
Ngoài chi Citrus, kỹ thuật RAPD cũng đã được nhiều tác giả sử dụng
trong nghiên cứu đa dạng di truyền ở một số đối tượng thực vật khác như đu đủ
(Nguyễn Trịnh Nhất Hằng, 2005) [5], đậu xanh (Điêu Thị Mai Hoa và cs, 2005)
[9], tảo (Hồ Sỹ Hạnh và cs, 2006) [6], dưa leo (Nguyễn Thị Lang, 2007) [10], lúa
cạn (Nguyễn Thị Tâm và cs, 2005) [15], vải thiều (Lê Trần Bình và cs, 2004)
[2]... nhằm đánh giá tính đa dạng di truyền và chọn lọc các loại cây trồng có chất
lượng tốt.
Chu Hoàng Mậu và cs (2007) đã sử dụng kỹ thuật RAPD khi nghiên cứu
sự đa dạng di truyền và mức độ sai khác trong cấu trúc DNA hệ gen của năm
giống lạc (Aachis hypogaea L.) có khả năng chịu hạn là L14, L18, LVT, MD7,
ĐBG. Các tác giả đã sàng lọc 20 primer ngẫu nhiên (10 nucleotide) và xác định
được 5 primer RA31, RA40, RA45, RA46 và RA159 thể hiện sự đa hình. Kết
quả điện di PCR-RAPD cho thấy số đoạn DNA nhận được ở mỗi phản ứng rất
khác nhau, dao động từ 3 đến 11 đoạn. Primer xuất hiện nhiều band điện di nhất
là RA40 (52 band), primer có ít band nhất là RA45 (17 band). Như vậy, với 5

14

primer ngẫu nhiên các tác giả đã thu được tổng số 168 band DNA từ các giống
lạc nghiên cứu. Kết quả phân tích cho thấy hệ số tương đồng di truyền dao động
từ 0,659 đến 0,954. Hai giống lạc ĐBG và LVT có hệ số tương đồng cao nhất là
0,954, còn hai giống lạc L18 và MD7 có hệ số tương đồng di truyền thấp nhất là
0,659. Trên sơ đồ cây thu được, 5 giống lạc được phân bố ở 2 nhóm tương ứng
với 2 mức độ chịu hạn khác nhau: nhóm 1 gồm 4 giống là ĐBG, L14, LVT và
MD7, có hệ số giống nhau từ hơn 0,90 đến 0,98; nhóm 2 chỉ gồm giống L18 có
khả năng chịu hạn kém nhất với khoảng cách di truyền với các giống còn lại là
lớn nhất (0,31) [12].
Nguyễn Thị Tâm và cs (2003) đã ứng dụng kỹ thuật PCR-RAPD vào việc
đánh giá sự thay đổi ở mức độ phân tử của các dòng lúa chọn lọc HR31,
HR3128, HR3494, HR3499 tái sinh từ mô sẹo chịu nhiệt độ cao ở thế hệ 3 của
các giống lúa CR203, CS4 và ML107. Mười primer ngẫu nhiên đã được sử dụng
trong nghiên cứu này, trong đó 5 primer RA31, RA 36, RA46, RA142, RA159 có
thể hiện sự đa hình đối với dòng chọn lọc HR31 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu
nhiệt độ cao của giống CR203 và dòng chọn lọc HR3218 có nguồn gốc từ mô
sẹo chịu nhiệt độ cao của giống CS4. Các primer RA31, RA32, RA36, RA142,
RA159 tạo ra các band đa hình đối với các dòng chọn lọc HR3493 và HR3499 có
nguồn gốc từ mô sẹo chịu nhiệt độ cao của ML107. Kết quả xác định hệ số đồng
dạng di truyền của các dòng chọn lọc so với giống gốc cho thấy, dòng HR31 có
hệ số di truyền sai khác so với giống gốc là 31%, dòng HR3128 là 54%, dòng
HR3494 là 10%, dòng HR3499 là 41%. Những kết quả này chứng tỏ các dòng
chọn lọc tạo ra từ các giống đã có những thay đổi đáng kể ở mức phân tử trong
bộ gen [14].
Tình trạng di truyền của các phôi soma có nguồn gốc từ các cây con của
Cymbopogon flexuosus đã được Bhattacharya và cs (2008) đánh giá bằng kỹ

thuật RAPD. Mẫu DNA từ cây mẹ và 18 cây con tái sinh từ callus đơn chọn ngẫu
nhiên đã được thu thập để tiến hành phản ứng RAPD với 6 primer để chọn các
dòng thuần. Tổng cộng 64 band đã được tạo thành với 19 band trong số đó là đa


15

hình. Hệ số đồng dạng di truyền dựa trên kết quả phản ứng RAPD cho thấy phần
lớn các dòng nghiên cứu là đồng nhất hay giống đến hơn 92% so với cây mẹ,
ngoại trừ CL2 và CL9 (66%) đã thể hiện mức độ thay đổi di truyền lớn nhất với
sự có mặt của 2 band RAPD mà không có ở cây mẹ [25].
Năm 2005, Chadha và Gopalakrishna đã nghiên cứu tính đa dạng di
truyền của nấm đạo ôn gây bệnh trên lúa ở Ấn Độ bằng phương pháp RADP.
Nghiên cứu nhằm xác định mối quan hệ di truyền và khả năng biến đổi di truyền
trong những chủng nấm đạo ôn. Tổng cộng có171 band đa hình được tạo ra khi
khuếch đại với 33 primer chọn lọc ngẫu nhiên trên 20 chủng nấm đạo ôn (chiếm
khoảng 64%). Kích thước của sản phẩm khuếch đại thay đổi từ 0,2-3,0 kb. Số
lượng sản phẩm khuếch đại thu được là đặc trưng cho từng primer và thay đổi từ
3 (OPF03) đến 14 (OPG10 và OPG17), trung bình 8,2. Hệ số tương đồng trong
các chủng từ 0,76-0,92. Sự đa hình cao có thể được giải thích do kết quả của sự
tiến hóa từ tự nhiên, sự hoán vị gen do stress gây ra và sự chuyển gen ngang giữa
nấm đạo ôn và vật chủ của nó. Sự hiểu biết về nguyên nhân của đa dạng nguồn
bệnh sẽ giúp cải thiện những phương pháp quản lý lúa bị bệnh [29].
Trà là loại thức uống không cồn tốt cho sức khỏe phổ biến nhất trên thế
giới. Cây trà (Camellia sinensis (L.) O. Kuntze) thuộc nhóm (section) Thea, chi
Camellia, họ Theaceace, có nguồn gốc từ Tây Nam Trung Quốc. Sự đa dạng di
truyền, mối quan hệ và đặc điểm phân tử của 15 nguồn vật liệu di truyền phổ
biến ở tỉnh Zhejiang, Trung Quốc đã được Chen và cs (2005) xác định bằng kỹ
thuật RAPD. Các tác giả đã sử dụng 100 primer khác nhau, trong đó 20 primer
tạo ra các sản phẩm đa hình và có tính lặp lại đã được chọn lọc. Có tổng cộng

1.050 band được tạo thành, trung bình là 52,5 band trên mỗi primer hay 70 band
đối với mỗi nguồn vật liệu di truyền được nghiên cứu. Kích thước của các sản
phẩm khuếch đại thay đổi từ 0,4 đến 3,0 kb. Trong số 137 sản phẩm khuếch đại
có 129 band là đa hình, tương ứng với 92,4%. Khoảng cách di truyền giữa các
giống nghiên cứu thay đổi từ 0,16 đến 0,62; giá trị trung bình là 0,37. Mười lăm
mẫu nghiên cứu đã được xếp vào 3 nhóm theo thuật toán UPGMA dựa trên các


16

dữ liệu RAPD. Ngoài ra, tất cả 15 mẫu có thể được phân biệt dễ dàng bởi sự có
mặt của 20 chỉ thị RAPD và sự vắng mặt của 11 chỉ thị [30].
Chuối được xem là một loài cây ăn quả có giá trị kinh tế và là một loại
thực phẩm ăn kiêng rất tốt. Jain và cs (2007) đã phân tích mối quan hệ di truyền
của 4 giống chuối khác nhau được trồng ở miền Nam Ấn Độ (Grand Naine, Red
Banana, Nendran và Rasthali) bằng kỹ thuật RAPD với 3 primer (OPA19,
OPB18, OPD16). Kết quả có 43,47% sản phẩm khuếch đại là band đơn hình,
chung cho tất cả các kiểu gen, trong khi đó có 30,43% là band duy nhất, nhưng
chỉ có 26,08% thể hiện mối quan hệ di truyền giữa các kiểu gene này. Trong số
các primer đã chọn, primer OPB18 tạo ra số lượng band đa hình cao nhất (4
band), tiếp theo là primer OPA19 và primer OPD16 (1 band). Các ma trận khác
nhau đã được tính toán bằng cách sử dụng chỉ số SED (squard euclidean
distance) để ước đoán sự khác nhau của tất cả các cặp trong sản phẩm khuếch
đại, chương trình được xây dựng bởi phương pháp của Ward sử dụng thuật toán
phương sai nhỏ nhất. Sự phân tích cụm thể hiện 4 kiểu gen được xác định bằng
chương trình của Grandnaine và Rasthali. Giá trị sai khác về mặt di truyền từ
2,82%-3,6%, sự sai khác lớn nhất là 3,6% được phát hiện giữa hai giống Red
banana và Rasthali, và thấp nhất là ở hai giống Nendran và Rashali (2,23%) [43].
Santos và cs (2010) đã sử dụng kỹ thuật RAPD nhằm xác định đặc điểm
phân tử của 7 mẫu chuối (Borneo, Grand Naine, 1304-06, 4249-05, 0337-02,

0323-03 và 4279-06) với khả năng kháng giun tròn Radopholus similis. Có tổng
cộng 521 chỉ thị RAPD tạo thành từ 36 primer, tương ứng với 14,5 chỉ thị trên
mỗi primer, trong đó 420 (81%) là đa hình, bao gồm cả 140 (27%) chỉ thị có tiềm
năng cho ứng dụng trong các nghiên cứu lập bản đồ di truyền về khả năng đề
kháng R. similis. Trong số các primer sử dụng, chỉ có 2 primer (OPH-04 và OPF20) không tạo ra các band có ở các mẫu đề kháng và vắng mặt ở tất cả các mẫu
mẫn cảm. Do đó, có đến 96% primer có khả năng tạo thành ít nhất 1 band triển
vọng cho việc lập bản đồ di truyền. OPE-15, OPH-17 và OPG- 09 là những
primer tạo ra số band tiềm năng lớn nhất (theo thứ tự là 12, 8 và 8). Khoảng cách


17

di truyền giữa những mẫu nghiên cứu thay đổi từ 0,106 đến 0,455 với khoảng
cách lớn nhất là giữa mẫu Borneo và kiểu gen 4279-06, được đánh giá tương ứng
với mẫu nhạy cảm nhất và mẫu đề kháng cao nhất đối với giun tròn tùy thuộc yếu
tố sinh sản. Thuật toán sắp nhóm dựa trên khoảng cách di truyền đã xếp 7 mẫu
nghiên cứu vào ít nhất 3 nhóm, trong đó các kiểu gen có khả năng đề kháng cao
nhất được xếp vào cùng một nhóm [59].
Đối với quả lê Nhật (Pyrus pyrifolia Nakai), màu sắc của vỏ quả là một
đặc điểm rất quan trọng đối với cây trồng bởi vì vỏ màu nâu đỏ giúp bảo vệ quả
chống lại những tác động từ bên ngoài như dịch bệnh, côn trùng, ảnh hưởng của
thời tiết... Inoue và cs (2006) đã sử dụng kỹ thuật RAPD nhằm xác định chỉ thị
có liên quan đến các gen có vai trò quyết định màu sắc của vỏ quả. Các dạng cây
con F1 của hai phép lai của ‘Kousui’ - ‘Kinchaku’ (KK) và ‘Niitaka’ - ‘Chikusui’
(NC) được phân biệt bởi màu sắc vỏ quả đã được sử dụng cho phép phân tích.
Bốn dạng khác nhau của DNA tổng số, KK với vỏ quả màu nâu đỏ (KK-R) và
KK với vỏ quả màu xanh (KK-G), tương tự là NC-R và NC-G, đã được sử dụng
cho phân tích RAPD với 200 primer ngẫu nhiên. Sau hai phép phân tích độc lập,
có tổng cộng 893 band đã được xác định, số lượng band trung bình trên mỗi
primer là 4,5. Kết quả thu được cho thấy, các band đặc hiệu có liên quan đến đặc

tính vỏ màu nâu đỏ đã không thu được trong thí nghiệm này, chỉ có duy nhất
band OPH19425 có liên quan với tính trạng vỏ quả màu xanh (KK-G và NC-G).
Mặc dù chỉ có 86,4% DNA các cây có vỏ quả màu xanh tạo ra band này khi thực
hiện phản ứng RAPD nhưng có đến 94,3% các cây có vỏ quả màu nâu đỏ không
tạo ra sản phẩm khuếch đại này. Chỉ thị RAPD OPH19 425 có thể phân biệt được
các cây có vỏ quả màu xanh với tỉ lệ lên đến 92% [41].

2. Các kỹ thuật khác
Bên cạnh kỹ thuật RAPD, có rất nhiều loại chỉ thị phân tử khác được sử
dụng để xác định sự khác nhau giữa các dạng thuộc chi Citrus, bắt đầu từ những
nghiên cứu isozyme vào cuối những năm 1970 (Torres và cs, 1978), đa hình


18

chiều dài các đoạn cắt hạn chế (RFLP) vào những năm 1980 và đầu những năm
1990, và gần đây nhất là các marker AFLP, SSR, ISSR (Fang và Roose,1997;
Bretó và cs, 2001; Sankar và Moore, 2001). Bức tranh tổng thể được dựng lên từ
những nghiên cứu này là sự đa dạng rất lớn từ các nhóm loài tổ tiên thuộc chi
Citrus, đặc biệt là quýt và bưởi [58].
RFLP (Restriction fragment length polymorphism-đa hình chiều dài các
đoạn cắt giới hạn) thể hiện sự khác nhau về kích thước các phân đoạn được tạo ra
khi cắt DNA bằng các enzyme cắt giới hạn khi có sự thay đổi trình tự trên DNA
bộ nhân hoặc trong các bào quan khác. RFLP có ưu điểm là marker đồng trội cho
phép phân biệt được cá thể đồng hợp và dị hợp, do kích thước DNA khảo sát
trong RFLP lớn vì vậy số lượng marker tạo ra nhiều đủ đáp ứng nhu cầu nghiên
cứu. Phân tích RFLP đã được sử dụng thành công khi nghiên cứu đa dạng di
truyền ở rất nhiều loài cây ăn quả như Prunus (Badenes và Parfitt, 1995),
Diospyros (Yonemori và cs, 1998) và Mangifera (Eiadthong và cs, 1999) [19].
SSR (simple sequence repeat) là kỹ thuật dựa trên phản ứng chuỗi PCR

với mục tiêu đầu tiên là nhận dạng các trình tự lặp lại đơn giản. Sau khi các trình
tự lặp lại đơn giản này được nhận dạng, bước tiếp theo là xác định trình tự của
DNA và thiết kế primer. Các trình tự gần kề và các trình tự lặp lại sẽ tạo nên
SSR. SSR primer sau đó được sử dụng tương tự như các RAPD primer. SSR là
một marker đồng trội, có tính đa hình cao và đáng tin cậy vì vậy đã được sử dụng
để nghiên cứu đa dạng di truyền trên nhiều đối tượng cây trồng như cam chanh
(Nunes và cs, 2002; Golein và cs, 2005), táo (Guilford và cs, 1997) và nho
(Tomas và Scott, 1993) [37], [38].
Mười lăm cặp primer SSR đã được sử dụng để đánh giá mức độ đa hình
trong 23 kiểu gen Citrus và 4 dạng lai tự nhiên hay đột biến chồi mà đã được
chọn lọc từ Kotra Germplasm Bank (Iran). Tất cả 15 locus thí nghiệm ở thực vật
có múi đều có mức độ đa hình cao, với số lượng allele trên mỗi locus thay đổi từ
4 ở TAA41 đến 12 ở CAT01, ATC09, AG14 (trung bình 8,27 allele trên mỗi
locus). Thuật toán phân tích nhóm với chỉ thị SSR đã xếp các mẫu nghiên cứu


19

vào trong 2 nhóm: nhóm A gồm Yuzo và Poncirus; nhóm B bao gồm 3 phân
nhóm riêng biệt: (i) giống Fortunella sp; (ii) phân nhóm quýt: Citrus reticulate
(C. clemantin), C. sinensis (Pineapple, Washington Navel), các dạng tự nhiên
(Siahvaraz, Shalmahaleh, Moallemkoh và 4 dạng lai Kotra), và (iii) C. limon
(Amol lemon - pear, Eureka, Rough Lemon), C. aurantifolia, C. aurantium, C.
medica và C. grandis [44].
Sự đa dạng di truyền của 122 mẫu bưởi (Citrus grandis Osbeck) và các
giống họ hàng của chúng đã được xác định bằng chỉ thị SSR. Yong và cs (2006)
đã sử dụng 31 cặp primer SSR, kết quả tạo thành tổng cộng 34 locus và 335 band
(90-335 bp), trong đó 332 band là đa hình, trung bình 10,81 band trên mỗi primer
và 9,85 allele trên mỗi locus. Tỷ lệ của các locus đa hình là 99,1%. Trong tất cả
các locus xác định, giá trị thông tin đa hình allele (PIC) thay đổi từ 0,1939 đến

0,9073; trung bình 0,7085 trên mỗi primer. Phân tích cây phả hệ UPGMA cho
thấy các mẫu nghiên cứu có thể được xếp vào 7 nhóm trong đó nhóm 1 bao gồm
các mẫu bưởi chùm (110 mẫu); nhóm 2 là C. hongheensis (3 mẫu); nhóm 3 là C.
macroptera (1 mẫu); nhóm 4 tạo thành từ C. yichangensis (2 mẫu); nhóm 5 bao
gồm C. reticulate, C. daoxianensis 1, C. daoxianensis 2 and C. tachibana; nhóm
6 là C. indica và nhóm 7 có C. mangshanensis. Trong số đó, các mẫu bưởi chùm
có thể được chia vào 7 phân nhóm với hệ số tương đồng là 0,712 [48].
ISSR (inter-simple sequence repeats) là kỹ thuật đã được sử dụng trong
nhiều nghiên cứu đa dạng di truyền (Kantety và cs, 1995; Charters và cs, 1996),
và đã được dùng để phân biệt giữa các giống cây Citrus khó thực hiện bởi các
marker phân tử khác (Fang và Rose, 1997). Mối quan hệ di truyền giữa các giống
chanh thương mại (C. limon) đã được Capparelli và cs (2004) phân tích bằng kỹ
thuật ISSR và phân tích dòng chuỗi (flow cytometry). Hai giống với các đặc
điểm khá giống nhau đã được phân biệt bằng cách sàng lọc với 10 SSR primers
và xác định hàm lượng DNA trong nhân trước khi nhuộm [27].
Shahsavar và cs (2007) đã sử dụng chỉ thị ISSR để nghiên
cứu mối quan hệ phát sinh loài giữa 33 cây thuộc chi Citrus ở


20

tỉnh Fars, Iran. Cây phát sinh loài đã được xây dựng dựa trên 234
đoạn ISSR (209 đoạn đa hình) bằng thuật toán phân tích nhóm
UPGMA. Ba mươi ba cây trên đã được phân vào sáu nhóm chính
với giá trị tương đồng trong nhóm ≥ 0,65. Nhóm 1 gồm C.
sinensis và C. reticulata; nhóm 2 gồm các loài cam chua bình
thường

và

cam

chua

‘Peach’;

nhóm

3

gồm

‘Bakraee’,

Volkameriana và 3 dạng chọn lọc của chanh lá cam. ‘Bakraee’ là
một dạng chưa xác định với đặc điểm hình thái học tương tự với
cả chanh lá cam ngọt và quýt. Đây có thể là dạng lai giữa hai
loài này. Nhóm 4 bao gồm chanh Lisbon (C. limon) và hai dạng
chọn lọc chưa xác định ‘Rock lemon’ và ‘Pear-shaped lemon’.
Nhóm 5 bao một kiểu gen duy nhất (D3) với sự tương đồng phân
tử thấp nhất so với những kiểu gen khác. Nhóm 6 có thể được
chia thành 2 nhóm phụ, nhóm phụ 1 bao gồm thanh yên (C.
medica) và 3 dạng ‘Otroj’, ‘Bidkhoni’ từ Darab và ‘Bidkhoni’ từ
Fassa. Dựa trên đặc điểm hình thái và phân tử tương tự với
thanh yên thì 3 dạng này có thể được xem là các biến thể của
thanh yên. Nhóm phụ còn lại bao gồm C. aurantifolia, C. latifolia
và 11 kiểu gen chưa xác định với đặc điểm hình thái và phân tử
giống với chanh lá cam [61].
AFLP (Amplified fragment length polymorphism-sự đa hình các đoạn cắt
khuếch đại) là kỹ thuật kết hợp giữa RFLP và PCR. AFLP sử dụng enzyme cắt

giới hạn cắt DNA bộ gen, sử dụng những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản
ứng khuếch đại PCR. AFLP có thể dùng để phân biệt các cá thể rất gần nhau,
thậm chí ngay cả những dòng đẳng gen. AFLP nhanh, đơn giản không phức tạp
như RFLP nhưng vẫn khảo sát được toàn bộ gen. Kỹ thuật này đòi hỏi ít lượng
DNA ban đầu, không cần biết trước trình tự đích và độ lặp lại phản ứng cao, các
primer sử dụng không cần đặc hiệu loài và các primer thương mại có thể dùng
cho hầu hết các loài. Có nhiều tác giả đã sử dụng kỹ thuật này để phân tích đa


21

dạng di truyền trên nhiều đối tượng như bưởi chùm (Cervera và cs, 1998), dừa
(Pepera và cs, 1998), đu đủ (Kim và cs, 2002), Carya illinoinensis (Beedanagari
và cs, 2005) [24].
Quả không hạt là một tính trạng mong muốn ở những cây thuộc chi Citrus
và là mục tiêu quan trọng trong nhân giống. JinPing và cs (2009) đã sử dụng kỹ
thuật đa hình chiều dài các đoạn khuếch đại AFLP để tìm ra các chỉ thị phân tử
cho quýt không hạt Ponkan (C. reticulata Blanco). Tác giả đã chọn ra được 5 cặp
primer có liên quan trực tiếp đến tính trạng mong muốn sau khi sàng lọc 72 cặp
primer, sự bắt cặp này đã được kiểm tra bằng phân tích AFLP từ các nhóm cá
thể. Năm đoạn khuếch đại đã được tạo dòng, phân tích trình tự và so sánh tương
đồng, kết quả cho thấy 4 chỉ thị có sự tương đồng cao với các gen chức năng,
điều này có thể giúp hiểu được cơ chế phân tử của tính trạng không hạt ở chi
Citrus. Dựa trên các thông tin về trình tự, 8 primer đặc hiệu đã được thiết kế và 2
đoạn AFLP-2 và AFLP-5 đã được chuyển đổi thành công sang dạng chỉ thị
SCAR (sequence characterized amplified region). Vì vậy, có thể đẩy nhanh các
chương trình chọn giống bằng cách sàng lọc các đột biến không hạt dựa trên các
chỉ thị đã được chọn lọc [45].

22

Chương 2.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
I. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Bưởi: Citrus grandis (L.) Osbeck
Thuộc chi: Citrus
Họ cam quýt: Rutaceae
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên 18 giống bưởi thu thập được ở nhiều
vùng khác nhau, mỗi giống tiến hành thu 3 mẫu ở 3 cây. Các giống bưởi này về
mặt hình thái khác nhau không đáng kể, từ lá, hoa cho đến hình dạng trái. Sau
khi tách chiết, điện di kiểm tra DNA tổng số và chạy PCR-RAPD thử nghiệm với
một số primer, chúng tôi đã lựa chọn mỗi giống một mẫu DNA tổng số có khả
năng khuếch đại tốt để làm khuôn mẫu cho các phản ứng PCR-RAPD tiếp theo.
Địa điểm thu mẫu của 18 giống bưởi nghiên cứu được trình bày trong bảng 2.1.

Bảng 2.1. Địa điểm thu mẫu của 18 giống bưởi
STT

Giống bưởi

Địa điểm thu mẫu

1

Bưởi Thanh Trà

Thủy Biều, Huế

2

Bưởi Năm roi

Ấp An Thiên, huyện Mỏ Cày Nam, Bến Tre

3

Bưởi Da xanh

Bến Tre

4

Bưởi Phúc Trạch

Quảng Bình

5

Bưởi Bành

Thủy Biều, Huế

6

Bưởi Láng

Thủy Biều, Huế

7

Bưởi Tàu

Thủy Biều, Huế

8

Bưởi Trẹm

Thủy Biều, Huế

9

Bưởi Thanh du

Thủy Biều, Huế

10

Bưởi Đỏ

Thủy Biều, Huế

11

Bưởi Hồng da xanh

Trung tâm nghiên cứu và phát triển Nông nghiệp Huế

12

Bưởi Cốm

Trung tâm nghiên cứu và phát triển Nông nghiệp Huế


23

13

Bưởi Trắng

Lại Bằng, Huế

14

Bưởi Thái Lan

Lại Bằng, Huế

15

Bưởi Trụ lông

Quảng Nam

16

Thanh trà Tiên Phước

Quảng Nam

17

Bưởi Đường lá goắn

Bến Tre

18

Bưởi Hải Phòng

Quảng Bình

II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đồ án của chúng tôi được tiến hành từ tháng 01/2011 đến tháng 05/2011
tại Phòng thí nghiệm Công nghệ gene, Viện Tài nguyên, Môi trường và Công
nghệ sinh học, Đại học Huế.

1. Tách chiết genomic DNA
DNA được tách chiết từ lá của các giống bưởi theo phương pháp của
Ahmed và cs (2009) [20] có cải tiến: cắt lá bưởi (200 mg) thành từng mảnh nhỏ,
đồng hóa mẫu với 500 µL đệm chiết DNA (100 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA,
250mM NaCl). Sau đó thêm 40 µL SDS 20%, vortex 30 giây rồi ủ ở 65 oC trong
30 phút. Mẫu được chiết 2 lần với cùng thể tích của hỗn hợp phenol: chloroform:
isoamylalcohol (25 : 24 : 1) để loại bỏ protein và lấy dịch trong chứa DNA hòa
tan ở pha trên. Loại polysaccharide bằng ether hydrat hóa. Kết tủa DNA bằng
ethanol 100% lạnh trong 30 phút ở -20oC. Thu kết tủa DNA bằng ly tâm 11.000
vòng/phút, ở 25oC trong 12 phút. Rửa tiểu thể DNA bằng ethanol 70%. Hòa tan

tiểu thể bằng nước cất vô trùng, thêm 1 µL RNase, bảo quản ở -20 oC dùng làm
nguyên liệu cho phản ứng PCR-RAPD. Nồng độ và độ tinh sạch của DNA tổng
số được xác định bằng phương pháp quang phổ trên máy NanoDrop ND-1000
(Thermo, Mỹ).

2. Phân tích RAPD
DNA tổng số của lá bưởi được dùng làm khuôn mẫu để khuếch đại PCR-


24

RAPD. Hỗn hợp phản ứng PCR-RAPD bao gồm 10 pmol primer ngẫu nhiên, 4
mM MgCl2, 0,4 mM dNTP mỗi loại, 0,625 unit/µl Taq DNA polymerase (PCR
Master Mix 2×, Fermentas, Đức); 25 ng DNA khuôn mẫu với tổng thể tích phản
ứng là 25 µl. Phản ứng PCR-RAPD được thực hiện theo phương pháp của
Coletta Filho và cs (1998) [31] với 25 primer ngẫu nhiên (Operon Technologies,
CA) (Bảng 2.2). Quy trình phản ứng khuếch đại PCR: biến tính 92 oC/2 phút; 42
chu kỳ: 92oC/1 phút, 36oC/1 phút, 72oC/2 phút; và cuối cùng là 72oC/10 phút. Sản
phẩm PCR-RAPD được điện di trên agarose gel 1,4% và nhuộm bằng ethidium
bromide 0,006%. Hình ảnh điện di được thu nhận bằng hệ thống Gel
Documentation và phân tích bằng chương trình Quantity One (Bio-Rad, Mỹ).
Bảng 2.2. Trình tự của các primer sử dụng
STT

Primer

Trình tự 5’-3’

Tài liệu tham khảo

1

A02

TGCCGAGCTG

Vũ Thị Nhuận và cs, 2005 [13]

2

A04

AATCGGGCTG

Vũ Thị Nhuận và cs, 2005 [13]

3

A18

AGGTGACCGT

Shaaban và cs, 2006 [60]

4

A15

TTCCGAACCC

Shaaban và cs, 2006 [60]

5

C09

CTCACCGTCC

Shaaban và cs, 2006 [60]

6

B05

TGCGCCCTT C

Andrade-Rodriguez và cs, 2004 [21]

7

B17

AGGGAACGAG

Andrade-Rodriguez và cs, 2004 [21]

8

B10

CTGCTGGGAC

Cevik và cs, 2007 [28]

9

C02

GTGAGGCGTC

Cevik và cs, 2007 [28]

10

C04

CCGCATCTAC

Cevik và cs, 2007 [28]

11

B04

GGACTGGAGT

Cevik và cs, 2007 [28]

12

C05

GATGACCGCC

Cevik và cs, 2007 [28]

13

C08

TGGACCGGTG

Cevik và cs, 2007 [28]

14

AA10

TGGTCGGGTG

Rao và cs, 2008 [57]

15

AD10

AAGAGGCCAG

Rao và cs, 2008 [57]

16

A11

CAATCGCCGT

Cai và cs, 1994 [26]

17

A09

GGGTAACGCC

Cai và cs, 1994 [26]

18

A01

CAGGCCCTTC

Coletta Filho và cs, 1998 [31]

19

AT14

GTGCCGCACT

Coletta Filho và cs, 1998 [31]


25

20

N09

TGCCGGCTTG

Orbović và cs, 2008 [54]

21

L17

CTGCAATGGG

Mariniello và cs, 2004 [51]

22

M20

GGTGCACGTT

Elisiario và cs, 1999 [35]

23

K16

GAGCGTCGAA

Elisiario và cs, 1999 [35]

24

N06

GAGACGCACA

Yi và cs, 2006 [64]

25

N02

ACCAGGGGCA

Yi và cs, 2006 [64]

3. Xây dựng giản đồ phả hệ
Xây dựng giản đồ phả hệ và phân tích cụm theo thuật toán UPGMA dựa
trên hệ số Jaccard (1908) [42] bằng phần mềm NTSYS 2.1 (Exeter Software,
Mỹ) trên cơ sở xuất hiện hay không xuất hiện của các band trên phổ điện di sản
phẩm PCR-RAPD của các mẫu với các primer theo nguyên tắc đánh số "1" nếu
có xuất hiện band và số "0" nếu không xuất hiện band.
Các band được ký hiệu bằng tên primer khuếch đại và kích thước của

band đó.
Chương 3.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
I. CHẤT LƯỢNG DNA TỔNG SỐ
Chúng tôi tiến hành tách chiết DNA tổng số từ lá của 18 giống bưởi
nghiên cứu theo phương pháp của Ahmed và cs (2009) [20] có cải tiến. Sản
phẩm tách chiết DNA tổng số được điện di trên agarose gel 0,8% và đo độ hấp
thụ quang (OD260/280) để xác định nồng độ và kiểm tra chất lượng. Kết quả kiểm
tra cho thấy DNA tổng số của 18 mẫu nghiên cứu khá sạch (tỷ lệ hấp thu ở bước
sóng 260/280 nm từ 1,73-1,81), ít bị đứt gãy và nồng độ các mẫu tương đối đồng
đều. Chất lượng và nồng độ DNA của các mẫu đáp ứng yêu cầu cho các phản ứng
PCR-RAPD. Kết quả được trình bày ở hình 3.1 và bảng 3.1.