Tiểu luận tìm hiểu về sinh sản vô tính ở động vật

ĐẶT VẤN ĐỀ
Các sinh vật đã ra đời, tồn tại và phát triển qua một thời gian dài, với nhiều sự tiến
hóa, thay đổi để thích nghi với những biến động của môi trường. Một yêu cầu được
đặt ra là làm sao để duy trì được số lượng loài còn sống, như vậy mới có thể duy trì
nòi giống và phát triển. Để làm được điều này buộc sinh vật phải thực hiện một
chức năng sống của mình đó chính là Sinh sản!
Trong tự nhiên, có hai hình thức sinh sản phổ biến là Sinh sản vô tính và Sinh sản
hữu tính. Mỗi hình thức phù hợp với từng bậc tiến hoá của sinh vật. Thông thường,
ở những loài có mức độ tiến hoá thấp, thường sử dụng hình thức sính sản vô tính;
còn ở những loài có mức độ tiến hoá cao hơn thì sử dụng hình thức sinh sản hữu
tính. Vậy một vấn đề đặt ra là tại sao khi trình độ khoa học kỹ thuật ngày càng phát
triển cao hơn, thì các nhà khoa học lại có xu hướng nghiên cứu trên các loài động
vật bậc cao – thậm chí trên cơ thể con người - nhằm tạo ra các thế hệ bằng hình
thức sinh sản vô tính. Vậy chứng tỏ sinh sản vô tính ngày càng thể hiện được tầm
quan trọng trong nghiên cứu khoa học và việc nghiên cứu, mở rộng và áp dụng
sinh sản vô tính để phục vụ cho mục đích của con người là rất cần thiết. Nhưng
việc áp dụng sinh sản vô tính vào việc tạo ra các cá thể mới có phù hợp với quy
luật tự nhiên và đạo lý sinh học hay không là một câu hỏi lớn đã và đang được bàn
luận xôn xao trong giới khoa học và những giới quan tâm.
Bản chất của sinh sản vô tính là quá trình nguyên phân. Ở đây, có sự phát triển của
một cá thể mẹ qua nhiều lần phân bào nguyên nhiễm, tiếp theo là sự tách rời một
phần cá thể ấy, để hình thành nên một cơ thể con. Cad tế bào con nhận được bộ
gen nguyên vẹn từ tế bào mẹ ban đầu, đến lượt mình, chúng lại cho ra các thế hệ
con cái tiếp theo. (Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc, 2006, Công nghệ sinh học
người và động vật).

NỘI DUNG
I. SINH SẢN VÔ TÍNH TỰ NHIÊN
1. Hình Thức Sinh Sản Vô Tính Tự Nhiên ở Động Vật Không Xương
Nảy chồi: các chồi phát triển đủ lớn sẽ tách rời khỏi cơ thể mẹ. Trong vài trường
hợp, cá thể con không rời khỏi cơ thể mẹ, chúng hợp thành một tập đoàn ngày càng

lớn (quần thể san hô, tập đoàn Vonvox…) (Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc,
2006, Công nghệ sinh học người và động vật)


Hình 1.Hydra

Hình 1.1 Sinh sản bằng cách nảy chồi ở Thủy tức

Hình 2.Tập đoàn có hình
cầu với hàng nghìn tế bào
Phân mảnh: Cá thể mẹ phân ra thành 2 hay nhiều phần bằng nhau, mỗi phần pháy
triển thành cá thể mới. Hải quỳ phân chia bằng hình thức này. Ở giun đốt, nơi đầu
mút thân sẽ tạo thành cá thể mới, đầu và cơ quan thụ cảm sẽ hình thành trước khi
cá thể bố mẹ phân mảnh. Dạng biến tấu khác được thấy ở bọt biển: một số tế bào
chuyên biệt trở thành chồi mầm, chồi mầm được giải phóng, phát triển thành cá thể
mới. (Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc, 2006, Công nghệ sinh học người và động
vật)


Hình 3. Hải quỳ
Nhân đôi: Hình thành eo thắt, phân chia đều tế bào chất và nhân ( trùng biến hình,
trùng đế giày…) (Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc, 2006, Công nghệ sinh học
người và động vật)

Hình 4. Một tế bào ban đầu, nhân phân chia, tế bào chất phân chia và hình thành
2 tế bào mới.
Tái sinh: Đó là hiện tượng tái tạo một phần cơ thể khi bị huỷ hoại. Điều này thấy ro
ở sao biển: khi bị đứt mất một cánh, cánh này sẽ được mọc lại. Bản thân sự tái sinh
như vừa mô tả không được xem là sinh sản vì
không tại nên cá thể mới. Nhưng trong một số

trường hợp, cũng con sao biển nói trên, khi bị cắt
thành nhiều phần thì những mảnh nhỏ có dính một
phần trung tâm sẽ tái sinh thành những con sao
biển mới. Hiện tượng này chính là một kiểu sinh
sản vô tính. (Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc,
2006, Công nghệ sinh học người và động vật)
Hình 5. Sao biển Asterias amurensis
Trinh sản: Là sự phát triển cá thể trưởng thành từ trứng không thụ tinh, nghĩa là
không có sự tham gia của tinh trùng, chỉ có nhân nguyên cái tham gia vào sự
phát triển. Hiện tượng trinh sản phổ biến ở động vật bậc thấp.


HÌnh 6. So sánh sự khác nhau giữa trứng bình thường và trứng trinh sản
Tùy thuộc vào trạng thái di truyền của trứng khi sự phát triển của phôi bắt đầu mà
có 2 hình thức trinh sản: đơn bội và lưỡng bội.
Trinh sản đơn bội: Nhân của trứng trải qua các lần phân chia giảm nhiễm bình
thường và tế bào trứng mang bộ nhiễm sắc thể đơn bội (n), không qua thụ tinh
nhưng vẫn phát triển thành phôi rồi thành cơ thể đơn bội. ( Nguyễn Sỹ
Mai,1988, Những kiễn thức cơ bản về di truyền học) Ví dụ như: ong, kiến, tò vò
và một số rệp, nhện…
Thường những cơ thể này có sức sống kém và hoàn toàn vô sinh nhưng đặc biệt
ở ong và một số loài không xương sống, trinh sản đơn bội lại làm xuất hiện
những con đực hữu thụ bình thường, chúng là những giao tử đã được “cơ thể
hóa” có khả năng sản xuất tinh trùng không qua giảm phân. ( Nguyễn Sỹ
Mai,1988, Những kiến thức cơ bản về di truyền học)
Trinh sản lưỡng bội: Ở một số động vật không xương sống như rận nước (
Daphnia ) và rệp cây (Aphis) vốn bình thường vẫn sinh sản hữu tính nhưng khi
gặp điều kiện sống không thuận lợi có thể chuyển sang trinh sản lưỡng bội..
Chúng sinh ra những trứng không qua giảm phân chứa 2n nhiễm sắc thể và
trứng không qua thụ tinh phát triển thành cơ thể trưởng thành. Cơ thể tạo ra

hoàn toàn giống bố mẹ. Ở một số loài phụ thằn lằn núi Armenia cũng cón hiện
tượng này, trong quần thể của chúng hoàn toàn không có giống đực. ( Nguyễn
Sỹ Mai,1988, Những kiễn thức cơ bản về di truyền học)
2. Hình Thức Sinh Sản Vô Tính Tự Nhiên ở Động Vật Có Xương Sống
Sinh sản vô tính là một hình thức tương đối hiếm ở động vật có xương sống.
Nguyên nhân là hiện tượng này chưa được tìm hiểu ro. Lợi ích trước mắt của sinh
sản vô tính là giúp quần thể phát triển nhanh chóng trong điều kiện ổn định. Trong
khi đó, sinh sản hữu tính giúp sinh vật thích nghi nhanh hơn với sự thay đổi của
điều kiện môi trường.
Một số sinh vật dị giao tử (heterogamy), vừa có khả năng sinh sản vô tính, vừa có
khả năng sinh sản hữu tính, tùy thuộc vào điều kiện môi trường.


Sinh đôi cùng trứng ở người được xem là hình thức tạo dòng vô tính tự nhiên.
Trường hợp này xảy ra rất ít, nguyên nhân chưa được tìm hiểu ro ràng, mặc dù về
hình thức, hợp tử phân đôi thành hai tế bào phôi, từ đó hình thành nên hai cá thể,
phát triển song song trong tử cung của người mẹ.
Các hiện tượng đa sinh nhiểu hơn hai cá thể rất hiếm gặp trong tự nhiên.
Loài tatu (armadillo) chỉ rụng trứng duy nhất
trong chu kỳ một năm. Sau khi trứng được thụ
tinh, phôi phân chia nguyên nhiễm tạo thành 4
tế bào phôi, mỗi tế bào cho ra một con. Như
vậy, có bốn con (đôi khi nhiều hơn) ra đời từ
một phôi ban đầu, tất cả tatu vừa được sinh ra
một lứa đều có bộ máy di truyền như nhau, và
tất nhiên cùng giới tính.
Hình 7. Tatu Dasytus Bellus
(Bolivia, 2001)
Trinh sản: Ở động vật có xương sống, trinh sản tự nhiên ở bò sát như thằn lằn đá
(Lacerta saxicola) và ở gà tây trong điều kiện tự nhiên có đến 40% trứng không

thụ tinh có khả năng phát triển, nhưng chỉ có tỉ lệ nhỏ phát triển thành gà con.
Trong bệnh học người, trinh sản có thể là nguồn gốc của một số u quái. Và người
ta có thể dùng nhiều tác nhân khác nhau như thay đổi nhiệt độ, pH, độ muối,
tác nhân hóa học hay cơ học để tác động vào trứng để không xảy ra quá trình thụ
tinh nhưng vẫn phát triển thành cơ thể gọi là trinh sản nhân tạo. Ví dụ khi trứng
đã thành thục bằng xử lí lạnh hoặc axit, đặc biệt đối với những trứng đẻ vào nước.
Một vài loài còn có khả năng biến đổi từ giới tính này sang giới tính khác bởi sự
biến động của chu kỳ hormone, khi nồng độ estrogen xuống thấp, cá thể bộc lộ các
tính trạng và hoạt động như con đực. khi estrogen tăng cao chúng lại có biểu hiện
như con cái.
Năm 1954, tại trại thí nghiệm Belvins (Mỹ), M. Olsen phát hiện trong điều kiện
bình thường đã xuất hiện một tỷ lệ nhất định trứng gà chưa hề được thụ tinh (gà tây
trắng Belvins). Nhưng vẫn có khả năng phát triển thành phôi. Ở một số loài khác,
sự trinh sản có những biến tầu và được coi là trinh sản không hoàn toàn, bao gồm
các hiện tượng mẫu sinh (gynogenesis), phụ sinh (androgenesis) và trinh sản giá
(hybriogenesis).
 Mẫu sinh: Gần giống sự trinh sản thướng, cá thể con được sản sinh cùng cơ
chế như trinh sản, nhưng trứng cần phải được kích hoạt bởi một tinh trùng
để phát triển. Tuy nhiên, tinh trùng không đóng góp bất kỳ nguyên liệu di
truyền nào cho thế hệ con non. Ở những quần thể thiếu con đực, sự hoạt hóa
trứng được thực hiện bằng cách con cái sẽ giao phối với những con đực của
loài nào đó có mỗi quan hệ gần gũi nhất.


Hiện tượng mẫu sinh được Hubbs phát hiện vào năm 1932 ở các loài cá
vược đẻ con Mollienesia formosa và sau đó Golovinskaia, Rômashov
(1974) ơhats hiện ở cá diếc bạc (Carassius auratus gibelio). Một kỳ giống
thuộc giống Ambystoma cũng sinh sản theo hình thức mẫu sinh, mặc dù đổi
khi chúng có sự thụ tinh thực sự bởi con đực, nhưng rất hiếm (khoảng một
phần triệu trường hợp giao phối), điều này giúp đổi mới vốn gen loài.

Hình 8.Kỳ giông Ambystoma
(Jim Bogart, 2003)
 Phụ sinh: Đây là quá trình tạo ra một cá thể lưỡng bội chỉ chứa thông tin di
truyền của con đực. do vậy, quần thể loài phụ sinh chỉ bao gồm những con
đực. Tinh trùng của chúng sẽ được thụ tinh với trứng của loài có quan hệ
gần gũi. Chẳng han, loài cá A. nobillis sẽ thụ tinh với trứng của loài
Cyprinnus carpio để tạo hợp tử, hợp tử phát triển tạo thành phôi. Phôi chỉ
chứa nguyên liệu di truyền của con đực A, nobillis. Ro ràng, A. nobillis chỉ
mượn trứng của Cyprinus carpio để phát triển loài.
 Trinh sản giả: Nhiều tác giả gọi là trinh sản lai, bởi hiện tượng này không
hoàn toàn là sinh sản vô tính mà còn có tính chất bán dòng, hay nửa dòng
(hemiclonal), với một nửa bộ gen được truyền cho thế hệ tiếp theo và một
nửa còn lại được thay thế.


Trong những loài trinh sản giả, con cái giao phối với con đực và cả hai đều
đóng góp nguyên liệu di truyền cho con của chúng. Nhưng khi những con
cái trưởng thàn, các trứng do chúng sản xuất không chứa nguyên liệu di
truyền từ cha, mà chứa một bản sao chính xác nguyên liệu di truyền từ mẹ.
Quá trình sinh sản tiếp tục thì cứ mỗi thế hệ sẽ mang một nửa vốn di truyền
từ mẹ và một nửa vốn di truyền từ cha.
Hình thức nói trên thường thấy ở chủng cá Poeciliopsis.

Hình 9.

(Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc, 2006, Công nghệ sinh học người và động vật)
III. SINH SẢN VÔ TÍNH NHÂN TẠO - NHÂN BẢN VÔ TÍNH
1.Khái Niệm
Nhân bản vô tính là kỹ thuật tạo ra một cá thể mới mà không cần sự kết hợp giữa

hai giao tử đực và cái, mà chỉ cần một cá thể đơn lẻ . có nhiều cách để thực hiện
nhưng có hai cách được đánh giá tỷ lệ thành công và phổ biến là tách phôi và
chuyển nhân.
2.Phân Loại
Tách Phôi (Embryo Splitting)
Tách phôi: Một phôi được tách (in vitro) bằng vi thao tác thành hai phần (hay
nhiều hơn) gọi là kỹ thuật tách phôi, được phát triển đầu tiên bởi Willadsen (1979)
với phôi cừu và ngày càng được biến đổi, hoàn thiện để phục vụ chăn nuôi, làm
tăng số lượng phôi.


Tách phôi làm đôi
Phôi có thể được tách bởi lưỡi dao nhỏ (microknife) (Williams và cs, 1982), hoặc
bằng hai mũi pipette thủy tinh (Ozil và vs, 1982; Willadsen và Godke, 1984). Tuy
nhiên, một vài trường hợp, có thể tách phôi thành 3 hay 4 phần tương đối bằng
nhau. Phôi sau khi được tách làm đôi (phôi nửa _ half-embryo ) hoặc được bọc bởi
màng ZP hoặc không, trước khi được chuyển vào mẹ nhận.
Tỷ lệ mang thai trong hai trường hợp này khác nhau đôi chút. Ở một số loài, các
phôi nửa phải được đặt vào trong màng ZP bởi chúng có xu hướng kết hợp và dung
hợp vào nhau khi tiếp xúc, hình thành phôi khảm lớn hơn. Chưa có bằng chứng
nào về những khiếm khuyết sau khi sinh cũng như những bất thường khác biểu
hiện ở thế hệ con cái khi thực hiện quy trình này. Có thể sử dụng nhều phương
pháp để tách phôi ở mỗi giai đoạn khác nhau, chẳng hạn dùng enzyme (phương
pháp hóa học); các yếu tố vật lý (siêu âm, laser…) hay tách bằng tác động cơ học
(sử dụng dao hay các pipette). Tuy nhiên phương pháp cơ học vẫn được coi là tiện
dụng và an toàn hơn cả.
a. Điều kiện của phôi
Chỉ nên chọn các phôi được xác định chắc chắn là phát triển bình thường.
Giai đoạn cuối của phôi dâu (phôi dâu già) hoặc giai đoạn đầu của phôi nang (phôi
nang sớm), khi khối tế bào đủ lớn và chưa biệt hóa sẽ cho kết quả tách đôi cao hơn.

Hình 10. Hai con bê đầu tiên ra đời từ kỹ thuật cắt phôi tại Việt Nam
Viện chăn nuôi quốc gia – Từ Liên, Hà Nội, 2005
Nếu tách ở giai đoạn phôi dâu, chỉ cần chia hai khối mầm phôi; nếu cắt ở giai
đoạn phôi nang, cần chú ý ngoài phần nhân ra, thì phần lá nuôi (trophoblast)
cũng phải được tách kèm. Khi chia cắt phôi ở các giai đoạn muộn hơn, tế bào
phôi đã biệt hóa hình thành nên các lá phôi, lúc này xác suất cho một cơ thể
trọn vẹn khó được đảm bảo, thông thường thai bị chết trước khi sinh.


Hình 11. Cắt phôi làm đôi
a. cắt phôi giai đoạn phôi dầu già
b.cắt phôi giai đoạn blastocys sớm
b. Thao tác kỹ thuật
Quan điểm thứ nhất: chỉ cắt nhân, sau đó trả nửa phôi đó vào màng ZP trước
khi nuôi cấy.
Quan điểm thứ hai: sau khi tách (thường là phôi già) đem phôi đi cấy ngay,
không cần đưa vào màng ZP.
Có hai cách để cố định phôi, thứ nhất: cho các phôi bám vào đáy đĩa thao tác
(như trình bày ở trên); cách thứ hai: sử dụng hai holding pipette cố định hai
phôi cùng một lúc tại vị trí gần nhau sao cho thuận tiện thao tác. Chú ý cách
nhận biết (tốt nhất là đánh dấu) để tránh nhầm lẫn trong thao tác giữa phôi tốt
(lấy nhân) và phôi còn lại chỉ để lấy vỏ.
Thao tác phôi theo quan điểm thứ nhất (a) (b) Dao cắt Dao cắt Pipette giữ
Màng ZP Khoảng không quanh noãn tương Lá nuôi Khoang phôi Tế bào gốc
phôi
Khi phôi được cố định, dùng lưỡi dao cắt màng trong suốt, mở rộng vết cắt
bằng pipette gạt, dùng micropipette hút nhân phôi (mầm phôi) ra ngoài. Cố
định nhân phôi để cắt làm hai phần. Hút một nửa đưa trở lại màng trong suốt
vừa cắt, còn nửa kia đưa vào màng trong suốt khác của trứng đã loại nhân trước

đó. Các màng trong suốt sẽ tự chúng hàn gắn lại sau đó để bảo vệ phôi (Ozil và
vs, 1982). Theo Elsdel và Seidel (1983) không cần đưa nhân phôi ra ngoài. Sau
khi cố định phôi, cắt mở màng trong suốt và tiến hành chia ngay nhân phôi khi
chúng còn ở trong màng. Hút một nửa nhân ra ngoài cấy vào một màng khác
của trứng đã loại nhân, nửa nhân còn lại đã có sẵn màng của chính nó. Hai nửa
phôi nói trên sẽ phát triển bình thường thành hai phôi mới. Thời gian tiến hành
càng nhanh càng tốt, cố gắng trong khoảng 20 phút cho một phôi (Vlanov và


cs, 1987). Cần chú ý khi chuyển phôi vào vỏ trứng, tránh không để tế bào sót,
rơi rụng.

Hình 12. Cắt phôi theo quan điểm thứ nhất

Thao tác phân tách phôi theo quan điểm thứ hai
- Gắn dao cắt vào hệ thống vi thao tác sao cho mũi dao thẳng góc với đáy đĩa
Petri.
- Đưa phôi vào đĩa có chứa sẵn 200-300 ml dung dịch nuôi cấy, đợi 3-5 phút,
phôi sẽ bám xuống đáy của đĩa.
- Sau khi phôi đã cố định và được quan sát ro (dưới kính hiển vi phóng đại
nhỏ), di chuyển bộ phận dao cắt xuống gần phôi, tăng độ phóng đại lên dần.
- Lưỡi dao cho thấp xuống từ từ và đặt vào đúng giữa khối tế bào (giữa phôi),
nếu là phôi nang phải cân đối để có thể chia 1/2 lá phôi cho mỗi nửa.
- Cho dao thấp xuống nữa hướng tới đáy đĩa; khi dao đã chạm tới đáy: phôi đã
được cắt (điều khiển lưỡi dao chuyển động nhanh, dứt khoát).
- Chuyển phôi sang dung dịch nuôi cấy khác. Hạn chế mọi tác động mạnh,
không cần thiết vì phôi sau khi cắt rất mỏng manh và đã bị tổn thương. Yêu cầu
cả hai phương pháp trên phải đảm bảo mỗi nửa phôi có được ít nhất từ 40 đến
45% khối tế bào phôi còn nguyên vẹn. Điều này cần lưu ý người thao tác về
việc lựa chọn dụng cụ cắt.

Sử dụng các dao cắt có chất lượng không tốt có thể phá vỡ từ 20-30% các tế
bào phôi, với các loại dao tốt, tỷ lệ này có thể chỉ 10-15%. Sau khi cắt, phôi
được nuôi cấy trong môi trường mới từ 2-3 giờ trước khi đem cấy
c. Khả năng sống của phôi nửa (half-embryo)
Nhìn chung, nếu cắt phôi làm đôi và chuyển vào mẹ nhận thì số lượng con non
tạo ra cao hơn so với cấy phôi nguyên (do số lượng được tính chung tăng gấp
đôi), nhưng ro ràng, khả năng sống của mỗi phôi nửa thấp hơn phôi nguyên, lý
do chưa được tìm hiểu kỹ. Có thể vì sinh khối tế bào phôi nửa ít hơn phôi
nguyên nên tín hiệu tạo ra kháng với hoàng thể yếu hơn. Tín hiệu này rất cần
thiết cho sự duy trì, phát triển của thai sau này.

Hình 13. Cắt phôi theo quan điểm thứ 2
Sau khi được tạo ra, các phôi nửa có thể được chuyển vào mẹ nhận của cùng
loài ở dạng tươi hay đưa vào đông lạnh để bảo quản. Lưu ý rằng những tổn
thương của đông lạnh, giải đông càng làm khả năng sống của phôi nửa giảm đi
hơn nữa
(Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc, 2006, Công nghệ sinh học người và động
vật)
3. Tách phôi thành từng tế bào riêng rẽ
a. Giới thiệu
Đây là kỹ thuật sử dụng hệ thống vi thao tác để tách rời các tế bào của phôi
giai đoạn sớm (thường là 2-4 hay 8 tế bào) và mỗi tế bào sẽ phát triển (trong
một vỏ trứng mới- nếu là động vật hữu nhũ) thành một cơ thể hoàn chỉnh với
điều kiện thích hợp bởi chúng có tính toàn thế. Đó chính là cơ sở có tính
nguyên tắc của kỹ thuật này.
Những thí nghiệm tạo dòng động vật bằng tách phôi thành các tế bào riêng rẽ
đầu tiên được bắt đầu từ thế kỷ XIX. Năm 1891, Hans Diresch đã tách rời các

tế bào phôi giai đoạn hai tế bào của nhím biển (sea urchin) bằng cách lắc với
nước biển, những tế bào rời đã phát triển thành những cá thể riêng biệt. Hơn
mười năm sau, một thí nghiệm tương tự với kết quả cũng tương tự được lập lại
bởi Hans Spemann, nhưng trên đối tượng kỳ giông.
Các thí nghiệm thời đó chưa kiểm soát được nhiệt độ cũng như hệ thống thao
tác, hóa chất chưa tốt, nên kìm hãm sự ứng dụng của phương pháp này trên
động vật hữu nhũ. Thành công tách phôi đầu tiên trên gia súc với mục đích
nhân nhanh những loài có giá trị được tiến hành bởi Willasden (1979) và Ozil
và cs (1982). Đến nay, kỹ thuật này đã được ứng dụng thành công ở chuột nhà,
chuột cống, thỏ, cừu, bò, heo và khỉ Rhesus.
b. Quy trình
 Tạo phôi: Chọn phôi ở giai đoạn sớm, các phôi này có thể được
thu nhận bằng cách gội rửa tử cung con vật hay tạo ra trong
phòng thí nghiệm.
 Tách rời các tế bào: Các tế bào giai đoạn này liên kết với nhau
khá yếu nên để tách rời chúng, có thể dùng enzyme trypsin hoặc
lắc nhẹ trong môi trường ổn nhiệt, đồng thời không có các ion
Ca2+ và Mg2+.
 Đóng gói tế bào phôi: Để các tế bào phát triển thành phôi, chúng
được bao bởi lớp ZP. Các ZP có thể được tạo ra bằng cách hút bỏ
noãn bào của tế bào trứng cùng loài hay khác loài, hoặc ZP nhân
tạo
 Nuôi cấy: Nuôi phôi in vitro đến giai đoạn blastocyst và cấy
truyền vào mẹ nhận đã gây động dục đồng pha.
(Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc, 2006, Công nghệ sinh học người và động
vật)
4. Ý nghĩa
 Việc tăng số lượng phôi bò từ một phôi ban đầu giúp cho người chăn
nuôi có nhiều bê hơn, đặc biệt là những bê giống nhau về di truyền.

Điều này rất có lợi cho việc đánh giá chính xác kiểu di truyền hoặc một
yếu tố nào đó của điều kiện ngoại cảnh, ảnh hưởng đến năng suất hay
kiểu hình (phenotype) của vật nuôi nói chung. Một cặp sinh đôi cùng
trứng có giá trị bằng cả nhóm đối chứng 10-25 hoặc nhiều hơn các bê
bình thường khác.
 Tách phôi giúp cho việc xác định giới tính sớm của vật nuôi.


 Giúp cho các vấn đề nghiên cứu cơ bản và ứng dụng khác phát triển.
Tuy nhiên, số lượng phôi tăng lên từ kỹ thuật tách, cắt không nhiều.
Một chiến lược thao tác khác được đưa ra là chuyển nhân tế bào
(nuclear transfer) hay cấy nhân tế bào (nuclear transplantation).

Hình 14. Ảnh chụp thao tác tách phôi chuột giai đoạn hai tế bào bằng
micropipette
(Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc, 2006, Công nghệ sinh học người và động
vật)
5. Chuyển Nhân (Nuclear Transfer)
Chuyển nhân (2n) – Nuclear transfer (khác với chuyển gen - gene transfer ) là một
phương thức điển hình của vi thao tác trong tạo dòng vô tính. Khác với vi tiêm tinh
trùng, nhân tế bào sinh dưỡng của cơ thể trưởng thành (hay của tế bào phôi) được
thu nhận và chuyển vào trứng trưởng thành (đã loại bỏ nhân). Kỹ thuật này giúp
tạo các dòng tế bào mới, và nếu tiếp tục phát triển, một ” phôi ” mới sẽ hình thành
để cho ra một cá thể mới thông qua cấy phôi. Cá thể con ra đời có một ” bản sao ”
DNA chính xác của chính cơ thể mẹ đã cung cấp nguồn tế bào sinh dưỡng ban đầu
nói trên. Ngoài vi tiêm, thao tác chuyển nhân có thể còn được kết hợp hỗ trợ bằng
các kỹ thuật xung điện khác. Chuyển nhân là một trong các kỹ thuật quan trọng của
công nghệ tạo dòng vô tính, nhưng không là phải kỹ thuật duy nhất. Chẳng hạn có
thể tiến hành tách phôi (còn gọi là sự chia phôi), hay trinh sản để tạo dòng vô tính
động vật.

6. Giới thiệu
Chuyển nhân là kỹ thuật then chốt của công nghệ tạo dòng động vật mà trong
đó biểu hiện đỉnh cao là các sản phẩm của nhân bản (cloning) vô tính. Ở một
số động vật, đã có những tế bào phôi sớm chưa biệt hóa và cả các tế bào đã biệt
hóa với mức độ cao của cơ thể trưởng thành được sử dụng chuyển nhân thành
công. Trong những năm gần đầy, công nghệ chuyển nhân của tế bào phôi được
ứng dụng trên chuột khi sử dụng những tế bào gốc phôi thu nhận từ lớp ICM,
phôi giai đoạn blastocyst. Sau đó, nhiều kiểu tế bào đã biệt hóa thu nhận từ


phôi, thai hay tế bào của cơ thể trưởng thành (Wilmut và cs, 1997) được khai
thác và sử dụng để chuyển nhân

Hình 15. Quá trình chuyển nhân tạo cừu Dolly
Sự ra đời của cừu Dolly như là một thuyết về tính toàn năng của tế bào sinh
dưỡng trưởng thành đã mở ra nhiều cơ hội mới và hướng mới trong nghiên
cứu. Từ đó ra đời các thuật ngữ “ Chuyển nhân tế bào sinh dưỡng ” (Somatic
cell nuclear transfer_SCNT) và “ Chuyển nhân tế bào phôi ” (embryonic cell
nuclear transfer_ESNT). Theo trình tự thời gian, sau cừu Dolly, những động
vật khác lần lượt được tạo dòng vô tính bằng chuyển nhân tế bào: chuột nhắt
(Wakayama và cs, 1998), bò thuần (Kato và cs, 1998), dê (Polejaeva và cs,
2000), cừu rừng (Loi và cs, 2001), bò rừng minh–gaur (Hammer và cs, 2001),
thỏ (Chesné và cs, 2002), mèo (Shin và cs, 2002), bò benteng (CBS News
Stories, 2003), la (Woods và cs, 2003), ngựa (Galli và cs, 2003), chuột (Zhou
và cs, 2003)… Ngoài ra, phôi blastocyst cũng đã được tạo dòng vô tính từ tế
bào sinh dưỡng như trâu Bubalus bubalis (Saikhun và cs, 2002), Syncerus
caffer (trâu Châu Phi) (Matshikiza và cs, 2004), linh dương Taurotragus oryx
(Matshikiza và cs, 2004). Thai cũng được tạo dòng vô tính từ tế bào sinh
dưỡng ở các loài linh trưởng (không phải người) (Ng và cs, 2004). Báo cáo về
thành công trong tạo dòng ở chó đầu tiên vào tháng 4 năm 2005 ở Hàn quốc.

Trong kỹ thuật tạo dòng vô tính chó, vai trò của tế bào trứng và chu kỳ kinh
nguyệt có ảnh hưởng rất lớn và tiến trình chín của trứng có đôi chút khác biệt
với các loài khác.
7. Nguyên lý và quy trình cơ bản
Chuẩn bị truớc đĩa vi thao tác có chứa vài vi giọt môi trường được bao phủ bởi
dầu paraffin để ngăn cản sự bay hơi và nhiễm khuẩn. Những vi giọt cho phép
kiểm soát các nhóm tế bào riêng rẽ dễ dàng hơn khi nhiều trứng cùng nằm
trong đĩa đầy môi trường. Ngoài ra, việc sử dụng phương pháp vi giọt có thể
chứa nhiều loại môi trường, hóa chất khác nhau trong cùng một đĩa thao tác
(chẳng hạn môi trường với những thành phần bổ sung: thuốc nhuộm huỳnh
quang, hóa chất ức chế hình thành vi sợi, hóa chất rửa đầu tip… giúp việc vi
thao tác dễ dàng và nhanh hơn


Trứng trưởng thành in vivo cũng được sử dụng để tạo cytoplast trong các quy
trình chuyển nhân, nhưng so với trứng trưởng thành in vitro , chúng quá khan
hiếm. Do vậy nhiều quy trình gần đây đều sử dụng các tế bào trứng chưa
trưởng thành và nuôi cấy chín in vitro. Một số nghiên cứu cho thấy có sự tương
tự giữa hai loại trứng này trong hiệu quả tạo dòng. Tuy nhiên, trên thực tế ở
một vài quy trình khác, việc sử dụng trứng chín in vivo cho kết quả phôi phát
triển đến blastocyst cao hơn khi dùng trứng chín in vitro. Chẳng hạn Ono và cs
(2001) đã coi việc sử dụng trứng chín in vivo làm cytoplast như một gải pháp
để cải thiện sự phát triển của heo và chuột tạo dòng vô tính.

Hình 16. Loại nhân tế bào trứng

Nếu nguyên liệu di truyền (nhân) được chuyển từ một tế bào này sang tế bào
khác, trước hết DNA của tế bào nhận phải được tách ra. Trong trường hợp
trứng còn được bao bọc bởi màng zona pellucida, nên loại bỏ nhân ở kỳ nghỉ
MII, bởi lúc này, NST đang được nén chặt và tập trung ở mặt phẳng xích đạo

của thoi vô sắc. Quy trình chuyển nhân được khái quát gồm năm bước sau:
a. Bước 1 - chuẩn bị cytoplast:
Các tế bào trứng chưa thụ tinh được sử dụng như là tế bào nhận nhân mới, sau
khi loại bỏ nhân của chính chúng. Các trứng này thường được thu nhận bằng
phương pháp chọc hút buồng trứng, sau đó, nuôi trưởng thành in vitro và cuối
cùng loại bỏ nhân. Quá trình bao gồm việc loại bỏ các NST ở kỳ metaphase và
đẩy ra thể cực thứ nhất. DNA ty thể của trứng vẫn phải còn trong nguyên sinh
chất.
b. Bước 2, chuẩn bị tế bào cho nhân:
Các tế bào cho có thể lấy từ nhiều nguồn khác nhau với nhiều mức độ biệt hóa
khác nhau. Ngoài trường hợp sử dụng tế bào tuyến vú tạo cừu Dolly như đã


biết, còn rất nhiều các tế bào khác đã được dùng để lấy nhân cho mục đích tạo
dòng. , ví dụ: tế bào mô cơ (Vignon và cs, 1998), tế bào gốc biểu mô (Kato và
cs, 1999), tế bào thần kinh vỏ não (Yamazaki và cs, 2001), tế bào tử cung (Cho
và cs, 2002), tế bào máu (Panelli và cs, 2004)... Các tế bào cho nhân có thể
nuôi cấy in vitro trong thời gian ngắn hay dài (điều này rất quan trọng) trước
khi chuyển nhân vào trứng đã loại nhân. Sự phù hợp giữa chu kỳ tế bào cho
nhân và trạng thái nguyên sinh chất của trứng luôn có ảnh hưởng lớn đến sự
thành công trong tạo dòng vô tính. Do đó, ở vài trường hợp, tế bào cho nhân
nên bị bỏ đói để đưa chúng về chu kỳ mong muốn. Năm 2002, lần đầu tiên,
Pasqualino Loi và cs đã thực hiện thành công việc sử dụng nhân của tế bào đã
” chết ” để tạo dòng. Các tế bào granulosa bị bất hoạt bằng nhiệt từ 55 0 C- 750
C (cao hơn nhiệt độ sinh lý), nhân của chúng được sử dụng để chuyển tạo ra
bê.
c. Bước 3, chuyển nhân:
Phương pháp thông thường để chuyển nhân của tế bào cho ( karyoplast ) vào tế
bào trứng là dung hợp màng hai tế bào trên. Ba kỹ thuật phổ biến: kích thích
xung điện, xử lý hóa chất (polyethylene glycol_PEG), dùng virus Sendai.

Thành phần của môi trường dung hợp thông thường gồm: 0,3 M mannitol, 0,1
mM MgSO4 và 0,05 mM CaCl2 . Áp suất thẩm thấu có thể được làm thấp bằng
cách điều chỉnh nồng độ mannitol 0,25–0,28 M. Nhiệt độ cũng ảnh hưởng đến
kết quả dung hợp, do vậy phải duy trì ổn định.
Ngoài ra, cần lưu ý tới các thông số lý hóa khác (áp suất, độ keo...). Mg cần
thiết cho quá trình dung hợp để cung cấp nguồn cation hóa trị hai, giúp duy trì
tốt sự tiếp xúc màng giữa hai tế bào. Thêm vào môi trường 0,1 mg/ml các đại
phân tử (như albumin huyết thanh bò, polyvinyl alcohol hay PVP) để ngăn cản
trứng không dính vào dụng cụ. Tuy nhiên, nếu dùng các đại phân tử, chúng
phải đủ lớn để không thể xuyên qua màng ZP gây ảnh hưởng đến sự tiếp xúc
của hai màng cần dung hợp. Hầu hết các nhà nghiên cứu đều 239 không dùng
hệ thống đệm cho môi trường dung hợp, mặc dù nếu sử dụng đệm 0,5 mM
HEPES thì cũng cho kết quả tốt (Wells và cs, 1999). Để tiến hành dung hợp
bằng xung điện , cặp trứng-tế bào được đặt vào môi trường nhược trương nhẹ,
nồng độ ion thấp giữa hai điện cực song song. Phát xung điện một chiều với
điện áp cao sẽ làm vỡ cấu trúc phospholipide trên màng, do đó tạo ra những lỗ
hổng. Trong quá trình hàn gắn, các màng sẽ dung hợp với nhau. Điện áp quá
cao và thời gian dài sẽ làm ly giải tế bào, nhưng điện áp thấp và thời gian ngắn,
khó dung hợp. Do vậy, cần điều chỉnh sao cho thích hợp, các thông số sử dụng
là1,25–1,5 kV/cm trong 50 µgiây. Có nhiều buồng chứa chuyên biệt khác nhau
cho việc dung hợp trứng với tế bào, chúng có thể được điều chỉnh kích thước
và vị trí các cực điện. Thông thường, các buồng dung hợp đều có hướng dẫn
phương pháp tính toán lực điện trường và cách thức vận hành. Cũng có thể vi


tiêm tế bào cho nhân vào bên dưới màng zona pellucida, cạnh với màng của
cytoplast rồi dung hợp chúng bằng xung điện. Bằng cách này, thông tin di
truyền từ tế bào cho sẽ đi vào cytoplast. Thường ngay sau đó, tế bào khởi động
hiện tượng “ tái thiết lập chương trình ” nhờ sự tương tác giữa các nhân tố bên
trong cytoplast với NST của tế bào cho. Ở bò, tỷ lệ thành công với dung hợp

điện thường 36%-89%, tỷ lệ này ở heo là 59% và ở cừu là 63% - 85%
((Wilmut và cs, 1997; Wells và cs, 1998). Dung hợp bằng virus Sendai đã bị
bất hoạt thường cho hiệu quả thấp (43% - 69%) nên ít được sử dụng. Nếu sử
dụng kết hợp giữa dung hợp xung điện và virus Sendai thì kết quả cao hơn.
Chẳng hạn khi sử dùng xung điện để chuyển nhân tế bào fibroblast (thu nhận
từ thai và cơ thể trưởng thành) của ngựa vào trứng, tỷ lệ dung hợp từ 20%67%; nhưng nếu kết hợp với virus Sendai, tỷ lệ dung hợp tăng lên tới 82%. Sau
khi dung hợp, tiến hành hoạt hóa trứng và nuôi phôi. Có nhiều cách để hoạt
hóa trứng và phôi, cũng như nhiều thuyết đưa ra về thời gian tối ưu giữa dung
hợp và hoạt hóa. Sự lựa chọn phương pháp luôn phụ thuộc vào các yếu tố chủ
quan và khách quan.
Chuyển nhân được hỗ trợ xung điện:
Wakayama và cs (1998), là những người đầu tiên sử dụng xung điện để hỗ trợ
chuyển nhân (gọi tắt là kỹ thuật chuyển nhân xung điện). Phương pháp này
được biến đổi từ kỹ thuật ICSI và thử nghiệm đầu tiên trên chuột. Trứng được
loại bỏ nhân bằng một pipette khác có gắn với bộ phận khoan điện (Piezo drill)
(xem phần kỹ thuật vi thụ tinh). Nhiễm sắc thể kì giữa và thể cực thứ nhất
được hút vào pipette để loại bỏ. Sau đó ủ vỏ trứng với môi trường có chứa sẵn
5 µg/ml Cytochalasin B trong 15-30 phút, vỏ trứng sẽ lắng xuống đáy giọt môi
trường. Chuyển nhân tế bào sinh dưỡng vào giọt môi trường đã chứa sẵn vỏ
trứng nói trên (rửa sạch đầu pipette trong giọt môi trường để loại PVP tụ bám
bên ngoài trước khi lấy nhân chuyển vào vỏ trứng). Vỏ trứng được định vị sao
cho pipette chuyển nhân đi vào cùng lỗ đã được tạo trước đó trên màng zona
khi loại nhân của trứng. Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp có thể tạo ra một lỗ
khác. Một biến tấu khác của kỹ thuật này là chuyển tế bào vào trứng trước khi
loại nhân (Munsie và cs, 2000); sau đó, hút nhân nội sinh ra khỏi tế bào. Ngoài
các phương pháp nói trên, có thể sử dụng kỹ thuật vi tiêm để trực tiếp đưa nhân
của tế bào cho (đã được bóc màng) vào cytoplast mà không cần tạo lỗ trước.
Tế bào sinh dưỡng được đặt trong môi trường 10% PVP. Màng của chúng rất
yếu so với màng tế bào trứng, do đó có thể phá vỡ bằng cách dùng pipette hút
vào, đẩy ra liên tiếp nhiều lần (chú ý: pipette này có đường kích trong nhỏ hơn

kích thước tế bào, nhưng lớn hơn một chút so với nhân để tránh làm hư nhân).
Việc làm trên tạo lực cơ học mạnh khi tế bào cọ sát nhiều lần với miệng ống
pipette, khiến màng sinh chất tổn thương, lỏng lẻo và vỡ, giải phóng nhân. Hút
và thu nhận nhân 2n . Tiêm nhân vào trứng có thể được tiến hành bằng phương
pháp cổ điển hay dùng xung điện. Ở ngựa, với phương pháp vi tiêm cổ điển, tỷ


lệ các tế bào tái thiết lập chương trình 240 là13%-30%, nếu kết hợp xung điện,
tỷ lệ này tới 80% (Choi và cs, 2002), thậm chí cao hơn cả với phương pháp
dung hợp bằng điện 20%- 48%. Tương tự, ở chuột, khi tiêm nhân tế bào cho
vào trứng bằng phương pháp có hỗ trợ xung điện, tỷ lệ nhân được cấu trúc lại
trong trứng cao tới 79%-95 (Wakayama và cs, 2001), thậm chí cao hơn cả
phương pháp dung hợp bằng xung điện hay virus Sendai (Ogura và cs, 2000).
Một kỹ thuật mới bỏ qua bước dung hợp hay tách nhân tế bào cho, được đưa ra
bởi Jang-Won Lee (2003): sử dụng tế bào cho nguyên vẹn (không tách riêng
nhân), để tiêm thẳng vào trứng nhận đã loại nhân. Quy trình này được áp dụng
để tạo dòng heo với nhân cho là cumulus và thu được tỷ lệ thành công cao. Các
tế bào cumulus sau khi thu nhận được ly tâm ở tốc độ 800 g trong 5 phút để
rửa sạch môi trường nuôi và làm cô đặc. Huyền phù cặn bằng môi trường thao
tác và đặt các tế bào vào giọt thao tác (đã chứa sẵn các trứng bị loại bỏ nhân).
Có thể hút vài tế bào vào pipette chuyển để tăng nhanh quá trình. Tiến hành
chuyển tế bào (thực hiện dưới kính vi thao tác ở độ phóng đại X 200).
Tế bào được chuyển vào khoảng không quanh hoàng thể của trứng. Trước khi
đâm thủng màng zona pellucida, tế bào cần được định vị gần với đầu pipette để
làm giảm lượng môi trường đưa vào trứng. Nên đưa pipette vào trứng tại vị trí
lỗ có sẵn trước đó (tạo ra trong quá trình loại nhân). Tế bào được chuyển vào
khoang trứng, sử dụng bộ phận vi tiêm để đẩy ra khỏi pipette khi đã đặt chúng
tiếp xúc với màng trứng ở vị trí hoàng thể và sau đó rút nhẹ nhàng pipette ra.
d. Bước 4, hoạt hóa phôi:
Phôi một tế bào hình thành được hoạt hóa bằng các tín hiệu hóa học hay xung

điện để khởi động quá trình phát triển tiếp theo. Các tín hiệu hóa học nói chung,
thường dùng để hoạt hóa trinh sản, ICSI cũng như trong tạo dòng động vật là
ionomycin, ethanol, thimerosal, inositol 1,4,5-triphosphate và calcium
ionophore A23178. Một trong các tín hiệu hóa học khác được sử dụng để hoạt
hóa trứng khá thành công là dịch chiết tinh trùng (nhiều thí nghiệm cho thấy tế
bào trứng có thể được hoạt hóa trinh sản từ dịch chiết của tinh trùng cùng loài.
Trong tạo dòng vô tính ngựa, tỷ lệ hoạt hóa trứng bằng cách nói trên đạt tới
72%. Ngoài ra, các nhà khoa học cũng cho thấy dịch chiết từ tinh trùng của một
loài khác cũng có thể kích hoạt trứng, chẳng hạn dịch chiết tinh trùng từ heo
hoạt hóa trứng bò chuyển nhân có kết quả tốt (Jason G. Knott và cs, 2002).
e. Bước 5, nuôi và cấy phôi:


Phôi sau khi đã hoạt hóa, được nuôi cấy in vitro với môi trường thích hợp (đối
với bò là bảy ngày). Sau thời gian này, phôi sẽ phát triển tới blastocyst (khoảng
120 tế bào), đây là giai đoạn thích hợp cho cấy truyền.
(Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc, 2006, Công nghệ sinh học người và động vật)
8. Một số kỹ thuật chuyển nhân được ứng dụng phổ biến
a. Kỹ thuật tạo dòng vô tính Roslin
Dolly ra đời tại Viện Roslin (Scotland)–nơi mà Wilmut làm việc, nên cách thức
tạo ra cừu Dolly được gọi là kỹ thuật tạo dòng Roslin. Trong thí nghiệm, Wilmut
đã làm đồng bộ chu kì của tế bào cho nhân và trứng. Không có sự đồng bộ của chu
kì tế bào, nhân sẽ không thể đạt được trạng thái phù hợp để được phôi chấp nhận “
sống chung ” . Bằng mọi cách, tế bào phải được đưa về trạng thái Gap Zero (G0)
hoặc trạng thái nghỉ, tương ứng với trứng. Trước hết, nguồn nhân được thu nhận
từ tế bào tuyến vú của cừu Finn Dorset (động vật 1), tiến hành nuôi cấy in vitro để
chúng phân chia. Bước này rất hữu dụng khi cần có sự thay đổi hoạt động trong
bộ gen tế bào cho nhân. Các tế bào cho nhân (và cả tế bào trứng) đều cùng được
bỏ đói (starve), tức nuôi chúng trong môi trường dinh dưỡng tối thiểu, không cho
phát triển. Việc này làm cho các tế bào bắt đầu “ đóng khóa ” tất cả các gen hoạt

động và cùng đi vào trạng thái nghỉ G0. Trứng của cừu Blackface (động vật 2)
được loại bỏ nhân và đặt cạnh tế bào cho nhân. Dùng một xung điện để dung hợp
hai tế bào với nhau và đồng thời hoạt hóa sự phát triển phôi. Kỹ thuật này “ bắt
chước ” sự hoạt hóa của tinh trùng một cách không hoàn toàn. Sau khi kích thích,
thường chỉ một vài tế bào sống sót và phát triển thành phôi. Nếu phôi sống sót,
tiến hành ủ trong tử cung (hay ống dẫn trứng) của cừu 6 ngày, giúp phôi sống và
phát triển mạnh hơn so với ủ trong ống nghiệm. Cuối cùng, phôi được đặt vào tử
cung của mẹ thay thế (động vật 3) đến khi sinh con (bản sao của động vật 1).
Ngày 24-7-1997, tiếp tục với kỹ thuật Roslin, Ian Wilmut và đồng nghiệp báo cáo
tạo dòng hai cừu cái mang gen người như đã nói ở trên. Sau đó, tháng1-1998, Đại
học Massachusetts và Tập đoàn Advanced Cell Technology cùng thông báo thành
công trong việc tạo ra ba con bê cũng bằng phương pháp Roslin.


Hình 17. Kỹ thuật tạo dòng Roslin

b. Kỹ thuật tạo dòng Honolulu
Kỹ thuật này được đưa ra bởi Teruhiko Wakayama và Ryuzo Yanagimachi của
Đại học Hawaii. Khi đó (tháng 7 năm 1998), Teruhiko Wakayama là người đứng
đầu nhóm nghiên cứu Honolulu, do vậy, tên gọi kỹ thuật tạo dòng Honolulu ra đời
với sự thành công rực rỡ: hơn 50 con chuột giống nhau về di truyền được tạo dòng
hoàn hảo. Có ba khác biệt chính trong kỹ thuật Honolulu so với Roslin:
Thứ nhất: các nhà nghiên cứu sử dụng cumulus (các tế bào bao xung quanh trứng)
làm tế bào cho nhân. Các tế bào hạt này đang ở pha nghỉ, không phát triển do đó
dễ dàng tái thiết lập chương trình trong trứng (đã loại bỏ nhân) mà không cần phải
bỏ đói trong dung dịch đặc biệt như trong trường hợp các tế bào tuyến vú.
Thứ hai: thay vì dùng dòng điện để dung nạp, ở đây nhân đã được vi tiêm vào
trong vỏ trứng. Kỹ thuật này ít làm hư hại trứng hơn là việc dùng xung điện, do
vậy tạo nhiều thuận lợi để phôi phát triển khỏe mạnh.
Không giống như ở Roslin đã có tiến trình đồng bộ hóa (bỏ đói) hai tế bào trước

đó, kỹ thuật Honolulu đòi hỏi việc nuôi cấy trung gian được tiến hành tối thiểu
một giờ sau khi tiêm nhân. Việc này giúp cho các tế bào trứng tự lựa chọn nhân
phù hợp và chấp nhận nhân mới. Sau năm giờ tiếp theo, trứng mới được chuyển


vào trong môi trường nuôi có chất kích hoạt sự phát triển giống như trong thụ tinh
tự nhiên. Wilmut sử dụng các tế bào tuyến vú nên cần phải đưa chúng về trạng
thái G0. Wakayama đã sử dụng các loại tế bào Sertoli, não và cumulus... Tế bào
Sertoli và tế bào não luôn ở giai đoạn G0, tế bào cumulus hầu như ở giai đoạn G0
và G1 (tế bào cumulus cho nhân có hiệu quả cao hơn các tế bào còn lại, do vậy
chúng rất được ưa dùng). Trong nuôi cấy (kể cả Roslin và Honolulu), một hóa
chất được thêm vào đó là Cytochalasin B, có chức năng làm ngưng sự hình thành
thể cực thứ hai (trong tự nhiên, sự hình thành thể cực thứ hai của trứng sẽ chia
DNA của tế bào chỉ còn một nửa để sẵn sàng nhận nửa còn lại từ tế bào tinh
trùng). Do thể cực thứ hai không được hình thành, nên trứng sẽ không chia đôi bộ
nhân mới 2n vừa được chuyển vào. Điều đó có nghĩa trứng coi bộ nhân mới 2n
như là hợp tử, xúc tiến quá trình phát triển thành phôi khi được kích thích hoạt
hóa.

Hình 18. Kỹ thuật tạo dòng Honolulu

(Cần lưu ý rằng trong thụ ICSI hay trinh sản, cytochalasin B cũng thường được sử
dụng với nhiều tác động khác nhau trong một số trường hợp, tuy nhiên không sử


dụng chất này cho chuột và người). Ngoài chuột, nhiều động vật tạo dòng khác ra
đời từ tế bào cumulus: heo (Onishi và cs, 2000), hay 8 con bê (Yoko Kato, 2003).
c. Kỹ thuật tạo dòng Handmade (Handmade cloning_HMC)
Gần đây, các nhà nghiên cứu Đan Mạch (do Gabor Vajta, Viện Khoa học Nông
nghiệp Đan Mạch lãnh đạo) và Australia phát triển một phương pháp tạo dòng

mới, kinh tế và dễ thực hiện hơn so với các phương pháp truyền thống. Đây là một
biến tấu của cả hai kỹ thuật chuyển nhân tế bào phôi và chuyển nhân tế bào sinh
dưỡng (Vajta và cs, 2003). Điểm mới ở đây là màng pellucida được tách ra sau khi
tế bào trưởng thành và trước khi loại nhân. Đầu tiên, những tế bào trứng được xẻ
làm đôi, các phần chứa nhân bị loại bỏ. Hai nửa không chứa nhân sẽ được gắn lại
với nhau, cộng thêm vật liệu di truyền của loài vật cần tạo dòng, một “ quả trứng ”
mới, hoàn chỉnh được hình thành. Như vậy, tối thiểu phải cần có hai tế bào trứng
một lúc.
Thuận lợi: không cần sử dụng hệ thống vi thao tác để loại bỏ nhân và dung hợp tế
bào. Đó là lý do các tác giả gọi kỹ thuật này là “ làm bằng tay ” (handmade) . Nhờ
vậy, chi phí ở handmade giảm, không đòi hỏi kỹ năng cao để sử dụng hệ thống vi
thao tác. Việc nuôi cấy in vitro, khi đã loại bỏ màng zona pellucida có thể sẽ nguy
hiểm cho phôi, nhưng với những cải tiến trong hệ thống nuôi thì tỷ lệ phôi phát
triển sẽ được cải thiện. Nhiều quy trình có thể được chuẩn hóa, hơn nữa dễ dàng
tự động hóa (Vajta, 2004).

Hình 19.


Trong thí nghiệm của Vajta, một nửa số phôi bò được tạo ra đã sống sót tới giai
đoạn túi phôi, sẵn sàng để cấy vào tử cung. Tỷ lệ thành công này cao không kém
so với phương pháp truyền thống. Ở Australia, New Zealand và Nam Phi, với kỹ
thuật HMC và loại bỏ màng zona, các nhóm nghiên cứu đã cho ra đời 20-25 bê
khỏe mạnh. Tuy nhiên, có lẽ còn quá sớm để kết luận HMC có thể thay thế được
phương pháp cổ điển.
(Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc, 2006, Công nghệ sinh học người và động vật)
9. Sự phát triển của phôi sau khi chuyển nhân
Có năm sự kiện trong quá trình phát triển và biệt hóa, tương ứng với các bước tái
thiết lập chương trình và phát triển của phôi sau khi đã được chuyển nhân.
a. Sự hoạt hóa phôi và phân cắt đầu tiên

Sự phát triển đầu tiên của phôi là hình thành bộ gen chức năng duy nhất của
chính nó. Các cấu trúc chromatin đơn mới được hình thành và ổn định nhanh
chóng để có thể điều hòa sự sao chép, do đó gen sẽ được thể hiện đúng các thời
điểm cần thiết và đúng với các tiến trình khác của tế bào. Ngày càng nhiều các
nghiên cứu sử dụng kỹ thuật chuyển nhân như là một phương tiện trực tiếp để
giải đáp câu hỏi: làm thế nào cytoplasm của một trứng đang im lặng phiên mã,
lại có khả năng tái tổ chức một chromatin ngoại lai thành một nhân chức năng
của chính mình. Những biến đổi epigenetic, giống như sự khử methyl hóa của
các gen không được in dấu, xảy ra trong suốt thời kỳ này (Santos F. và cs,
2002). Do đó, một trong những thử thách trong phôi chuyển nhân là phải ức chế
sự biểu hiện các gen sinh dưỡng và hoạt hóa các gen cần thiết cho sự phát triển
thành phôi.
b. Sự hình thành blastocyst
Biểu hiện (nhìn thấy được) đầu tiên của việc tái thiết lập chương trình trong
nhân tế bào là sự hình thành blastocyst. Các tế bào biệt hóa thành hai quần thể:
tế bào lớp ICM và TE. Ở nhân của các tế bào thuộc giai đoạn blastocyst, sự
methyl hóa không đối xứng bắt đầu xuất hiện để tạo thành dòng tế bào bên
ngoài (TE). Có thể các dòng tế bào nội bì có sự methyl hóa cao so với các tế


bào biểu mô, điều này cũng đưa đến nguy cơ làm rối loạn một số quá trình của
phôi.
c. Sự phôi vị hóa
Trong quá trình phôi vị hóa của phôi heo, tỷ lệ chết khá cao so với các thời kỳ
khác, mặc dù chỉ một vài gen có vai trò điều hòa quan trọng bị ảnh hưởng,
chúng tạo ra những kiểu hình riêng biệt. Nếu tất cả đều bình thường, khả năng
biệt hóa của các tế bào phôi không sẽ không hề bị ảnh hưởng nhờ tính đa năng
của các tế bào gốc trong đó.
d. Sự hình thành nhau thai
Khiếm khuyết trong quá trình phát triển nhau thai của các phôi được tạo ra

bằng chuyển nhân, là một trong các nguyên nhân gây chết đã được biết ở cừu
(De sousa và cs, 2001), ở bò (Chavatte-Palmer và cs, 2002) và ở chuột (Tanaka
và cs, 2001). Điều này, không chỉ vì nhau thai là một cơ quan đầu tiên được
hình thành trong suốt quá trình phát sinh phôi, mà còn vì nó xác định sự phát
triển cho một số chức năng quan trọng khác, chẳng hạn sự tạo mạch (Rossant
và Cross, 2001). Các biểu hiện bất thường của một vài gen được in dấu và
không in dấu cũng được phát hiện trong nhau thai của chuột mới sinh (Suemizu
và cs, 2003).
e. Sự phát triển sau khi sinh
Một vài hội chứng khác nhau được báo cáo là có ảnh hưởng ở chuột trưởng
thành: hư hỏng gan hay nhiễm khuẩn dẫn đến chết sớm (Tamashiro và cs,
2002), chứng béo phì (Ogonuki và cs, 2002)… Động vật tạo dòng chết trước
khi sinh chiếm tỷ lệ cao ro ràng có nguyên nhân gắn liền với những khiếm
khuyết thuộc nhiều cơ quan khác nhau: phổi, tim, thận... cũng như kích thước
tương đối của chúng thường cao hơn so với động vật làm đối chứng. Các
nghiên cứu về epigenetic ngày càng làm ro bản chất những khiếm khuyết này.
10. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự thành công của kỹ thuật chuyển nhân
Có quá nhiều yếu tố ảnh hưởng trực tiếp lên hiệu quả của quá trình chuyển nhân:
sự trưởng thành của trứng nhận, quá trình loại nhân tạo cytoplast, chuyển tế bào
cho nhân, dung hợp hay tiêm tế bào cho nhân vào cytoplast nhận, hoạt hóa phôi
một tế bào (phương pháp hoạt hóa, chất hoạt hóa và thời gian hoạt hóa), kỹ thuật
nuôi và chuyển phôi… Lựa chọn tế bào cho nhân là bước quan trọng trong quá
trình tạo dòng. Hiện tại, còn rất ít hiểu biết về các sự kiện tế bào và phân tử liên
quan đến quá trình tái thiết lập chương trình của tế bào sinh dưỡng trưởng thành
để trực tiếp phát triển thành phôi và thai.


Những yếu tố khác ảnh hưởng lên khả năng phát triển của mỗi tế bào cho nhân là
nguồn gốc mô, trạng thái biệt hóa, thời gian và điều kiện nuôi cấy, kiểu gen, kể cả
những ảnh hưởng biến đổi do chuyển gen, trạng thái epigenetic và giới tính... Hiệu

quả tạo dòng từ các nguồn tế bào khác nhau đã được tóm lược bởi Back và Wells
(2002), song thông thường chỉ đạt 0,1- 6% ở hầu hết các phòng thí nghiệm, ngoại
trừ, một số báo cáo khác có kết quả cao hơn (Kato và cs, 2000).
So sánh hiệu quả tạo dòng từ mỗi kiểu tế bào cho nhân là rất khó vì khác nhau
trong quá trình chuyển nhân, phòng thí nghiệm và kỹ thuật viên, trứng nhận
(nguồn trứng và chất lượng trứng), tuổi và kiểu gen của động vật cho, hệ thống
nuôi phôi và những ảnh hưởng của mẹ nhận như tuổi, giống, dinh dưỡng và mùa.
Rideout và cs (2001), đã thử tóm lược một loạt các thí nghiệm về sự phát triển của
phôi tạo dòng từ tế bào gốc phôi, cumulus và fibroblast ở chuột. Các tác giả quan
sát thấy những dòng được tạo từ tế bào gốc gần như ít phát triển đến giai đoạn
blastocyst hơn các dòng được tạo từ tế bào cumulus và fibroblast (theo thứ tự 1020% và 58% blastocyst được tạo ra - so với số phôi được tạo ra). Tuy nhiên,
những phôi được tạo dòng từ tế bào gốc phôi có tỷ lệ sống sót cao hơn các phôi
được tạo dòng từ tế bào cumulus và tế bào fibroblast (theo thứ tự, 15%, 2% và
0,5% con được tạo ra trên tổng số phôi được chuyển) khi đạt đến giai đoạn
blastocyst. Ở bò, Heyman và cs (2002) đã tiến hành tạo dòng từ các tế bào phôi,
thai và sinh dưỡng trưởng thành và cho biết tỷ lệ thai bị thất bại trong các dòng
được tạo từ tế bào sinh dưỡng trưởng thành cao gấp 10 lần so với các dòng được
tạo từ tế bào phôi (43,7% so với 4,3%). Từ việc kết hợp một số các nghiên cứu so
sánh với nhau, có thể kết luận tạo dòng chuyển nhân từ các tế bào cho nhân là thai
và phôi thì tỷ lệ thành công cao hơn là sử dụng nhân của các kiểu tế bào đã biệt
hóa.
11. Hiệu quả của kỹ thuật chuyển nhân
Nhìn chung, hiệu quả của kỹ thuật chuyển nhân tế bào sinh dưỡng đến nay còn
thấp. Tại AgResearch, phôi bò giai đoạn một tế bào phát triển đến blastocyst sau 7
ngày nuôi cấy chỉ chiếm 40% so với phôi phát triển in vitro từ công nghệ sản xuất
phôi IVF. Hơn nữa, sự phát triển của phôi chỉ bằng 1/3 so với IVF. Chẳng hạn, 988
phôi được tạo ra từ kỹ thuật chuyển nhân tế bào sinh dưỡng tại AgResearch chỉ có
13% phát triển thành bê, trong khi đó tỉ lệ này đạt 30–45% trong IVF. Mặc dù tỷ lệ
mang thai đến ngày thứ 50 sau khi chuyển phôi được tạo ra bằng chuyển nhân cao
(65%) bằng với phôi IVF hay dẫn tinh nhân tạo, nhưng sau đó tỷ lệ này giảm

xuống do sẩy thai. Sau khi sinh ra, có chừng 64% bê sống sót đến ba tháng tuổi.
Gần đây, nhiều báo cáo cho thấy bê có thể sống khỏe mạnh, cho sữa và sinh con
trong một thời gian dài. Campell (1996) báo cáo 244 phôi cừu được tạo ra bằng kỹ
thuật chuyển nhân tế bào sinh dưỡng với các tế bào cho nhân giống tế bào biểu mô
phát triển từ những tế bào gốc phôi nuôi cấy. Trong 244 phôi chỉ có 34 phôi (14%)