Đánh giá khả năng sử dụng gene nad1, ITS , psba trnh để phân định loài nhân sâm

MỤC LỤC


Báo cáo đồ án tốt nghiệp

GVHD: Trần Hoàng Dũng

PHẦN 1: ĐẶT VẤN ĐỀ
1. Lý do chọn đề tài
Công nghệ sinh học được coi là một tập hợp của các ngành sinh hóa , vi sinh vật
học, tế bào học, di truyền học với mục tiêu đạt tới sự ứng dụng công nghệ các vi sinh vật,
các mô, các tế bào nuôi và các cấu phần của tế bào.
Ngoài ra, trong những năm gần đây, với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh
học, các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu về công nghệ gene để bảo tồn và di trì
được các loài động, thực vật quý hiếm có nguy cơ bị tuyệt chủng. Trong đó, nhiệm vụ
trung tâm của công nghệ sinh học hiện nay khi nghiên cứu các đối tượng là đọc được
chuỗi mã DNA để phân tích bộ gene nhằm tìm hiểu quan hệ di truyền của các đối tượng
nghiên cứu và mối liên hệ giữa gene nhằm tạo được các chủng loại mới, để tạo sự đa
dạng sinh học và phân loại loài.
Hiện nay nhân sâm (có tên khoa học là panax) được xem như là một loại thuốc có
tác dụng chữa bệnh, có giá trị kinh tế cao. Là loại thực vật có nguồn gốc từ tự nhiên và
được biết đến từ rất lâu. Mặc khác, nhân sâm có rất nhiều loài khác nhau.
Từ trước đến nay nhân sâm được phân loại dựa trên đặc điểm hình thái, điạ lý và
thành phần các chất hóa học, nên kết quả phân loại thường không chính xác. Nhưng giờ
với sự phát triển của sinh học phân tử đã làm cho việc phân loại được chính xác hơn. Nó
dựa trên sự nghiên cứu và so sánh trình tự các gene đóng vai trò quan trọng trong phân
loại và xác định quan hệ di truyền và đặc biệt có ý nghĩa trong ngành phân loại nhân sâm.
Các so sánh dựa trên trình tự Nucleotide được xem là cơ sở chính xác nhất trong phân
loại nhân sâm.
Chính vì thế, mà đề tài :” Đánh giá khả năng sử dụng gene nad1, ITS , psbAtrnH để phân định loài nhân sâm”. Rất đáng được quan tâm.
2. Mục đích

Phân định và chọn ra gene phù hợp nhất cho khả năng phân định các loại nhân sâm..

2


Báo cáo đồ án tốt nghiệp

GVHD: Trần Hoàng Dũng

PHẦN 2 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Khái niệm về phylogeny
-

Phylogeny xuất phát từ sự kết hợp hai từ gốc Hy Lạp: Phylo nghĩa là hệ thống tức trực hệ
(tuyến tính của một dòng họ) và genesis tức là nguồn gốc – tạm dịch phylogeny là sự
phát sinh chủng lòai. Tính từ của nó là phylogenetic

-

Trong ngành Sinh học phân tử ( molecular ) phylogeny, người ta nghiên cứu mối quan hệ
giữa các lòai sinh vật thông qua các bằng chứng phân tử, cụ thể là trình tự DNA và
protein. Như vậy sự khác biệt giữa các trình tự (DNA) chỉ định sự phân kỳ di truyền như
là kết quả của tiến hóa phân tử theo tiến trình thời gian.

-

Trong sinh học , phylogenetics là nghiên cứu về tiến hóa quan hệ giữa các nhóm sinh
vật (ví dụ như các loài , các quần thể ), được phát hiện thông qua các dữ liệu phân tử và
sắp xếp dữ liệu hình thái học ma trận. Phân loại tư duy , phân loại, xác định, và đặt tên
của sinh vật , là đa dạng về thông báo phylogenetics, nhưng vẫn còn khác biệt về phương

pháp và hợp lý. Các lĩnh vực phylogenetics và chồng chéo trong phân loại khoa học về hệ
thống học phát sinh loài - một phương pháp luận,cladism (còn cladistics ) chia sẻ nguồn
gốc ký tự (synapomorphies) được sử dụng để tạo ra tổ tiên, hậu duệ cây ( cladograms ) và
phân định đơn vị phân loại ( clades ). Trong hệ thống học sinh học như một toàn thể,
phân tích phát sinh loài đã trở nên thiết yếu trong nghiên cứu tiến hóa của sự sống.
2.2. Vài nét về cây nhân sâm
Có rất nhiều loại sâm, để phân biệt thường người ta gọi thêm tên địa phương hoặc màu
sắc vào tên gọi:
 Trên Thế giới
Nhân sâm (Panax ginseng họ Araliaceae): được mô tả sớm nhất và được ứng dụng

phổ biến nhất. Theo lịch sử y học cổ truyền của Trung Quốc từ 3000 năm trước Công
nguyên, nhân sâm đã được nói đến như là một thần dược.
-

Đảng sâm (Codonopsis spp. họ Campanulaceae): mọc hoang và được gieo trồng
ở Thượng Đảng.
3


Báo cáo đồ án tốt nghiệp

GVHD: Trần Hoàng Dũng

-

Huyền sâm (Scrophularia họ Scrophulariaceae): có màu đen.

-

Đan sâm (Salvia miltiorrhiza họ Lamiaceae): có màu đỏ.

-

Bố chính sâm (Hibicus sagittifolius họ Malvaceae): mọc hoang và được sản xuất ở Bố
Trạch.

-

Sa sâm (Launaea pinnatifida họ Asteraceae/Adenophora spp. họ Campanulaceae): loại
sâm này thường mọc ở vùng đất pha cát.

-

Thổ nhân sâm (Talinum spp. họ Portulacaceae)

-

Nam sâm (Schefflera octophylla họ Araliaceae)

-

Nam sâm (Boerhaavia spp. họ Nyctaginaceae).

-

Bàn long sâm (Spiranthes sinensis họ Orchidaceae).

-

Điền thất nhân sâm (sâm tam thất, Panax pseudoginseng họ Araliaceae)

-

Sâm Nhật Bản (Panax japonicus họ Araliaceae) dùng để thay thế khi không có nhân sâm,
có tác dụng bổ tỳ–vị.

-

Sâm Hoa Kỳ (Panax quinquefolius): còn gọi là sâm Bắc Mỹ có tính mát, tính hàn, gần
như đối nghịch với nhân sâm có tính ấm hay nhiệt. Dùng sâm Hoa Kỳ vào mùa hè nhằm
giải nhiệt, hạ hỏa.

-

Sâm Tây Bá Lợi Á (Eleutherococcus senticosus họ Araliaceae) còn gọi là sâm Siberi.
 Ở Việt Nam


Có nhiều dược thảo có tên sâm được sử dụng từ rất lâu đời ở Việt
Nam, nhưng với nhiều công dụng khác nhau như:

-

Bố chính sâm: (Hibiscus sagittifolius var. quinquelobus họ Malvaceae) thường thấy mọc
ở Quảng Bình, Phú Yên. Hải Thượng Lãn Ông dùng phối hợp với thuốc khác để
trị ho, sốt, gầy yếu. Hiện nay dùng làm thuốc bổ khí, thông tiểu tiện, hạ sốt.

-

Sâm cau: (Curculigo orchiodes họ Hypoxidaceae) mọc nhiều dưới tán rừng xanh Lạng
Sơn, Hòa Bình đến Đồng Nai. Có tác dụng bổ thận, tráng dương, dùng để chữa nam giới
tinh lạnh, liệt dương, phụ nữ bạch đới, người già tiểu són.

-

Sâm đại hành: (Eleutherine subaphylla họ Iridaceae) mọc hoang ở khắp nơi tại Việt Nam,
thường được dùng để trị ho, đinh nhọt, lở ngứa ngoài da, chốc đầu, tổ đĩa.

4


Báo cáo đồ án tốt nghiệp
-

GVHD: Trần Hoàng Dũng

Sâm mây: mọc nhiều ở Bắc Việt Nam, Bình Thuận, Đồng Nai. Người dân thường sử
dụng làm thuốc bổ.

-

Sâm trúc (Panax Vietnamensis Araliaceae) mọc tập trung tập trung ở các huyện miền núi
Ngọc Linh thuộc Kontum và Quảng Nam ở độ cao 1500 đến 2100m, cây mọc dày thành
đám dưới tán rừng dọc theo các suối ẩm trên đất nhiều mùn.

-

Sâm nam (Dipsacus japonicus họ Dipsacaceae).
Các họ nhân sâm

Phân chi Panax
Nhánh Panax

-

Loạt Notoginseng: Panax notoginseng - tam thất, điền thất

-

Loạt Panax: Panax bipinnatifidus - sâm lá lông chim, châu tử sâm
Panax ginseng - sâm Cao Ly, nhân sâm, hồng sâm
Panax japonicus - sâm Nhật Bản, sâm lá to, sâm đốt tre
Panax quinquefolius - sâm Mỹ, sâm Tây Dương
Panax vietnamensis - sâm Ngọc Linh, sâm Việt Nam, sâm Nga
Mi
Panax wangianus - sâm đốt tre lá hẹp, giả nhân sâm lá hẹp
Panax zingiberensis - tam thất gừng
- Nhánh Pseudoginseng: Panax pseudoginseng - tam thất, sâm tam thất, giả

nhân

sâm, sâm Himalaya
Panax stipuleanatus - bình biên tam thất
-

Nhân sâm có nguồn gốc từ củ của các loài Panax cho thấy tiềm năng cao để chữa trị các
loại bệnh. Mặc dù nhân sâm được sử dụng qua nhiều thế kỷ, nhưng chứng cứ lâm sàng và
so sánh có hệ thống ít được ghi nhận. Một trong những lý do các loại thuốc thảo dược từ
tài nguyên thiên nhiên có khó khăn là kiểm soát chất lượng các thành phần hóa học trong
các cá thể có nguồn gốc từ họ Panax, đặc biệt là các loài đã được coi là giống hoặc phân

loài của Panax japonicus hoặc Panax pseudoginseng. Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy
khả năng sử dụng gene psbA-trnH, nadl, ITS để phân định loài Panax.

5


Báo cáo đồ án tốt nghiệp

GVHD: Trần Hoàng Dũng

2.3. Các phương pháp phân loại loài
-

Các phương pháp phân loại đều dựa trên nguyên tắc sau: những thực vật có
chung nguồn gốc, có những tính chất giống nhau. Thực vật càng gần nhau thì tính
chất giống nhau càng nhiều. Sự giống nhau có thể về đặc điểm hình thái, giải phẫu,
sinh lý sinh hoá, phôi sinh học,... do đó có rất nhiều phương pháp nghiên cứu khác
nhau trong Phân loại học thực vật kể cả việc sử dụng các kỹ thuật đơn giản đến các
phương tiện thiết bị tối tân. Gồm các phương pháp sau:
2.3.1. Phương pháp hình thái so sánh:

-

Dựa vào đặc điểm hình thái, đặc biệt là hình thái cơ quan sinh sản, vì loại cơ
quan này ít biến đổi hơn so với cơ quan sinh dưỡng khi điều kiện môi trường thay
đổi. Những thực vật càng gần nhau càng có những đặc điểm chung về hình thái.
Đây là phương pháp cổ điển nhưng hiện nay vẫn được dùng phổ biến và là chủ yếu.
Hiện nay, ngoài những đặc điểm hình thái bên ngoài người ta còn dùng cả những
đặc điểm hình thái giải phẫu hay vi hình thái (micromorphologie), tức là hình thái
cấu trúc bên trong cơ thể, của mô, của tế bào, kể cả cấu trúc siêu hiển vi, để phân

loại. Xu hướng này ngày càng được chú ý.
2.3.2. Phương pháp cổ thực vật học:

-

Dựa vào các mẫu hoá thạch của thực vật để lại trong các tầng lớp địa chất để
tìm quan hệ thân thuộc và nguồn gốc của các nhóm mà các khâu trung gian hiện nay
không còn nữa. Những nghiên cứu về bào tử và phấn hoa, đặc biệt di tích của phấn
hoa trong các thời đại địa chất đã giúp xác định thành công quan hệ họ hàng của một
số thực vật. Phương pháp này có ý nghĩa quan trọng đối với phân loại học khi góp
phần vào việc xây dựng hệ thống chủng loại phát sinh.
2.3.3. Phương pháp địa lý thực vật học:

-

Mỗi chi, mỗi loài thực vật trên thế giới đề có một khu phân bố nhất định. Khu
phân bố có ảnh hưởng đến tính thích ứng và có khi đến cả lịch sử phát triển của
6


Báo cáo đồ án tốt nghiệp

GVHD: Trần Hoàng Dũng

loài. Nghiên cứu khu phân bố của thực vật người ta có thể xác định được quan hệ họ
hàng.
2.3.4. Phương pháp hóa sinh học:
-

Các nhà thực vật nhận thấy rằng các loài cây có quan hệ gần nhau thường

có các quá trình sinh hoá giống nhau dẫn đến tích tụ một số hợp chất hoá học giống
nhau. Ví dụ: các loài thuộc họ Cà phê thường chứa caffein, các loài thuốc lá chứa
nicotin, cây thuộc họ Hoa môi thường chứa tinh dầu, nhiều cây thuộc họ Thầu dầu
chứa chất cao su…

-

Phương pháp này có ý nghĩa thực tiễn rất lớn, nó cho ta hướng tìm những hợp
chất cần thiết trong các loài gần gũi nhau.
2.3.5. Phương pháp cá thể phát triển:

-

Dựa trên cơ sở của quy luật phát triển cá thể: trong quá trình phát triển cá thể,
cơ thể trải qua những giai đoạn (hình thức) chủ yếu mà tổ tiên nó đã trải qua. Có thể
theo dõi quá trình phát triển lịch sử của cây để xét đoán quan hệ nguồn gốc của nó.
2.3.6. Phương pháp miễn dịch:

-

Miễn dịch là tính không cảm thụ của cơ thể đối với một bệnh nào đó. Tính
chất miễn dịch ở một mức độ nhất định có thể được kế thừa qua các thế hệ và là
một đặc điểm của một họ hay một chi.
Sử dụng các phản ứng của cây chủ đối với sự xâm nhập của nấm hay vi
khuẩn kí sinh. Từ sự giống nhau của các phản ứng của các cây đối với nấm kí sinh
mà các nhà phân loại có được những dẫn liệu có giá trị về mối quan hệ của các loài
đó.
2.3.7. Phương pháp chẩn đoán huyết thanh:

-

Từ các loài thực vật người ta có thể chiết ra được những chất có phản ứng
giống nhau, đối với cơ thể động vật thì người ta có thể nghĩ đến các loài đó có quan
7


Báo cáo đồ án tốt nghiệp

GVHD: Trần Hoàng Dũng

hệ họ hàng với nhau. Dựa trên phản ứng máu của những động vật máu nóng đối với
những chất ngoại lai. Kết quả thu được của những phản ứng giống nhau trên cơ thể
một động vật nào đó cho phép ta xác định mối quan hệ thân thuộc của các loài thực
vật thử nghiệm.
Ví dụ: lấy dịch chiết của hai loài thực vật a và b cho vào máu của cùng một
loài động vật đem thí nghiệm, kết quả đều cho phản ứng máu giống nhau, từ đó có
thể suy ra hai loài a và b nói trên có quan hệ gần gũi với nhau.
2.3.8. Phương pháp giải phẫu:
-

Phương pháp này bắt đầu được dùng từ thế kỷ XIX do sự phát triển và hoàn
thiện của kính hiển vi. Tuy chưa chiếm ưu thế nhưng là phương pháp chính xác và
khách quan. Phương pháp này cho phép xác lập mối quan hệ thân cận không những
cho các bậc phân loại cao như lớp, bộ, họ mà còn cho cả các bậc phân loại cơ bản
như chi và loài. Dùng phương pháp giải phẫu các nhà phân loại học thực vật có thể
nghiên cứu quan hệ chủng loại của nhiều nhóm thực vật. Ví dụ: cây Hai lá mầm
phân biệt với cây Một lá mầm bởi cấu tạo và sự sắp xếp của mô dẫn truyền trong
thân.

-

Phương pháp này bổ sung thêm cho phương pháp hình thái so sánh.
2.3.9. Phương pháp bào tử phấn hoa:

-

Nghiên cứu bào tử, hạt phấn, đặc biệt là hình thái vỏ hạt phấn sẽ cung cấp
nhiều dẫn liệu, nhất là các dẫn liệu cổ thực vật, cho việc xây dựng hệ thống chủng
loại phát sinh.
2.3.10. Phương pháp tế bào học:

-

Nghiên cứu số lượng, hình thái và cấu trúc của nhiễm sắc thể, các đoạn gene có tính chất
bảo tồn.

8


Báo cáo đồ án tốt nghiệp

GVHD: Trần Hoàng Dũng

2.3.11. Phương pháp nuôi cấy
-

Được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu nấm, tảo và vi khuẩn, dựa trên
đặc điểm chỉ có những loài nhất định mới có thể sinh trưởng trên những môi trường
chọn lọc. Phương pháp này tạo điều kiện để các nhà thực vật có thể quan sát một
cách chi tiết quá trình phát triển cá thể và sự biến đổi của các dấu hiệu hình thái.

2.3.12. Phương pháp lai ghép:

-

Để xác định mối quan hệ thân cận của các loài gần, vì chúng ta biết rằng sự
lai tạo chỉ xảy ra ở những loài có quan hệ họ hàng mới lai tạo được và con cái sinh
ra mới có thể phát triển bình thường.
2.3.13. Phương pháp sinh thái:

-

Phương pháp này có ý nghĩa trong nghiên cứu sự biến dị của loài do ảnh
hưởng của điều kiện sống, có những loài sống ven biển, có những loài sống trên núi
cao…
2.3.14. Phương pháp hỗ trợ:

-

Như chúng ta biết, ngày nay khoa học phát triển rất mạnh mẽ, nhiều phương
tiện kỹ thuật hiện đại cho phép các nhà sinh học sử dụng để tăng thêm tính chính
xác và khách quan cho việc nghiên cứu phân loại của mình. Đó là các phương pháp
toán học như xác suất thống kê, phương pháp phân tích tương quan. Các phương
pháp này chỉ mang tính chất bổ trợ cho các phương pháp sinh học.

-

Cùng với sự phát triển của khoa học, ngày càng có nhiều phương pháp nghiên
cứu mới, trong đó phải kể đến các phương pháp di truyền: sử dụng hình thái và số
lượng thể nhiễm sắc của tế bào, hiện tượng đa bội thể, di truyền quần thể... đang được sử
dụng rộng rãi vào Phân loại học và mang lại những dẫn liệu chính xác và đáng tin cậy

hơn.

-

Việc nghiên cứu phân loại không thể chỉ dựa vào một phương pháp nào đó mà phải dùng
kết hợp nhiều phương pháp khác nhau để giải quyết, như vậy những kết luận mới thỏa
9


Báo cáo đồ án tốt nghiệp

GVHD: Trần Hoàng Dũng

đáng và gần với chân lý. Các phương pháp nêu trên đã cung cấp nhiều thông tin, đặc
điểm quan trọng cho các nhà phân loại học khi tiến hành xác định một taxon nhất định
trong thế giới sinh vật
2.4 Những gene sử dụng trong nghiên cứu
2.4.1 Gene nad1
-

Tên đầy đủ là NADH dehydrogenase subunit 1 là một trong các gene mã hóa enzim
NADH dehydrogenase, gene này thuộc hệ gene ty thể . Enzym này tham gia vào phân
giải năng lượng trong quá trình hô hấp của tế bào.
2.4.2 Gene psbA-trnH

- Genes psbA-trnH có mặt trong DNA lục lạp, là vùng không mã hóa cho protein nào ,khu
vực không được phiên dịch psbA 3 ' và RNA cấu trúc thứ cấp. Khu vực này gồm 2 phần
khác nhau để bảo tồn tiến hóa của chúng, 1 là đầu 3' của psbA (khu vực không được
phiên mã) và 2 là psbA-trnH gồm 2 genes và những hoạt động của nó không phiên mã
đệm.

2.4.3 Vùng gene ITS
-

rDNA là nhóm gen mã hóa rRNA của ribosom, đóng vai trò quan trọng trong các nghiên
cứu quan hệ phát sinh loài. rDNA được quan tâm nghiên cứu vì nó là một gen có nhiều
bản sao và đặc biệt không mã hóa cho protein nào. Các bản sao của gen nằm liên tiếp trên
một locus và liên quan mật thiết tới quá trình tiến hóa. Hơn nữa, ribosom hầu như tồn tại
trong mọi sinh vật và có cùng nguồn gốc tiến hóa. Phần lớn phân tử rDNA tương đối bảo
tồn nên được xem là cơ sở để tìm ra sự tương đồng và các khác biệt khi so sánh các sinh
vật khác nhau. Các primer thiết kế dựa trên những oligonucleotide có tính bảo tồn cao
được sử dụng cho tất cả sinh vật nhằm khuếch đại các vùng tương đương dùng trong so
sánh. Ngoài ra, nhiều primer và probe cũng được thiết kế dựa trên các vùng không bảo
tồn dùng trong phát hiện và định danh vi sinh vật (Van de Peer và cộng sự, 1996).
10


Báo cáo đồ án tốt nghiệp
-

GVHD: Trần Hoàng Dũng

Các rDNA 5,8 S, 18 S, và 25 S phiên mã thành các tiền rRNA riêng rẽ, nằm xen kẽ với
các vùng phiên mã bên trong (ITS:for internal transcribed spacer). Vùng ITS là vùng có
rất nhiều sự biến đổi, mặc dù vùng ITS thường được sử dụng trong nghiên cứu tiến hóa
của thực vật tuy nhiên phần lớn các so sánh trên vùng này chỉ thường sử dụng ở mức độ
xác định các biệt hóa trong cùng loài (Guarro, 1999).
2.5 Phương thức tiến hành

-

Là nghiên cứu phát sinh chủng lòai chủ yếu dựa trên một sự giả định về các tiến trình tiến
hóa ở mức phân tử thông qua việc quan sát phân tích trình tự DNA hoặc protein. Bằng
cách sử dụng cộng cụ máy tính, các chuỗi dữ liệu sẽ được mô phỏng tiến trình tiến hóa và
phân tích tiến trình phát sinh chủng lòai. Giả sử là chúng ta có một „cây tiến hóa đúng“,
chúng ta có thể dùng nó để để kiểm tra lại độ chính xác, tính nhất quán khả năng tin cậy
của những mô hình tiến hóa. Tuy nhiên khi sử dụng các dữ liệu sinh học, cái gọi là cây
tiến hóa có thể không bao giờ có. Do vậy người ta chấp nhận một cây tiến hóa được dựng
nên mà người ta tin là nó giống với cây tiến hóa đúng.

-

Các bước nghiên cứu phát sinh chủng lòai bằng DNA mã vạch
1. Xác định mẫu
2. Chọn gene cần đọc trình tự
3. Đọc trình tự
4. Sắp xếp thẳng hàng các trình tự
5. Chọn mô hình tiến hóa
6. Phân tích sự phát sinh chủng loài
7. Đọc cây tiến hóa
8. Kiểm tra cây tiến hóa

11


Báo cáo đồ án tốt nghiệp

GVHD: Trần Hoàng Dũng

12

Báo cáo đồ án tốt nghiệp

GVHD: Trần Hoàng Dũng

PHẦN 3: VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP
3.1 Đối tượng nghiên cứu
-

Sử dụng 8 loài nhân sâm làm vật liệu nghiên cứu, dùng mã vạch DNA có sẵn của từng
loài trên genebank và xử lý số liệu là Panax trifolius, Panax pseudoginseng, Panax
Stipuleanatus,

Panax

notoginseng,

Panax

japonicus,

Panax

quinquefolius,

Panaxginseng, Panax binpinnatifidus
3.2 Các trình tự Genbank Accession Numbers
Species

Genbank Accession Numbers

psbA-tnrH
HQ112893

Nad1
HQ112988

ITS
HQ112445

(GI 306755126)

(GI 306849875)

(GI 306754716)

Panax trifolius

HQ112989
HQ112894

(GI 306849877)

(GI 306755128)
HQ112980
HQ112885
Panax

(GI 306849859)

(GI 306755110)

pseudoginseng

HQ112981
HQ112886

(GI 306849861)

(GI 306755112)
Panax
stipuleanatus

HQ112446
(GI 306754717)

HQ112437
(GI 306754708)

HQ112438
(GI 306754709)

HQ112889

HQ112984

HQ112441

(GI 306755118)

(GI 306849867)

(GI 306754712)

13


Báo cáo đồ án tốt nghiệp

GVHD: Trần Hoàng Dũng
HQ112987

HQ112892

(GI 306849873)

(GI 306755124)
HQ112977
HQ112882
Panax

(GI 306849853)

(GI 306755104)

notoginseng

HQ112979
HQ112884

(GI 306849857)

(GI 306755108)
HQ112968
HQ112873
Panax

(GI 306849835)

(GI 306755086)

japonicus

HQ112976
HQ112881

(GI 306849851)

(GI 306755102)
HQ112982
HQ112887
Panax

(GI 306849863)

(GI 306755114)

quinquefolius

HQ112983
HQ112888

(GI 306849865)

(GI 306755116)
Panax ginseng

HQ112444
(GI 306754715)

HQ112434
(GI 306754705)

HQ112436
(GI 306754707)

HQ112425
(GI 306754696)

HQ112433
(GI 306754704)

HQ112439
(GI 306754710)

HQ112440
(GI 306754711)

HQ112863

HQ112958

HQ112415

(GI 306755066)

(GI 306849815)

(GI 306754686)

14


Báo cáo đồ án tốt nghiệp

GVHD: Trần Hoàng Dũng
HQ112959

HQ112864

(GI 306849817)

(GI 306755068)
HQ112905
HQ112810

(GI 306849709)

(GI 306754960)
HQ112957
HQ112862

(GI 306849813)

(GI 306755064)
HQ112960
HQ112865

(GI 306849819)

(GI 306755070)
HQ112967
HQ112872

(GI 306849833)

(GI 306755084)
Panax
binpinnatifidus

HQ112990
HQ112895

(GI 306849879)

(GI 306755130)
HQ112999
HQ112904

(GI 306849897)

(GI 306755148)

3.3. Phần mền MEGA 5.05
15

HQ112416
(GI 306754687)

HQ112362
(GI 306754733)

HQ112414
(GI 306754685)

HQ112417
(GI 306754688)

HQ112424
(GI 306754695)

HQ112447
(GI 306754718)

HQ112456
(GI 306754727)


Báo cáo đồ án tốt nghiệp
-

GVHD: Trần Hoàng Dũng

MEGA là một công cụ tích hợp để thực hiện sự liên kết trình tự ,tự động và sử dụng, suy
luận cây phát sinh loài, khai thác cơ sở dữ liệu dựa trên web, tỷ lệ ước tính tiến hóa phân
tử,

suy

luận trình

tự tổ

tiên, và

thử

nghiệm các

giả

thuyết tiến

hóa.

MEGA là một đa luồng ứng dụng Windows. Nó chạy trên tất cả cácphiên bản của hệ điều
hành Microsoft Windows.
Giao diện phần mềm MEGE 5.05

3.4. Các phương pháp dùng trong phân tích DNA mã vạch trong MEGA 5.05
3.4.1 Phương pháp Maximum Likehood Tree

-

Phương pháp Maximum Likelihood là phương pháp tiêu tốn rất nhiều thời gian nhưng lại
cho kết quả đáng tin cậy nhất. Mô hình tiến hóa dùng trong phương pháp này cũng là một
hàm hiện. Ứng với mỗi mô hình tiến hóa được chọn, phương pháp này sẽ tính tóan khả
năng xác suất (dưới dạng – ln L)mà một cây tiến hóa có thể có từ chuỗi trình tự phân tích.
3.4.2

-

Phương pháp Neighbor –Joining Tree

Phương pháp Neighbor-Joining phương pháp nhanh nhất để dò tìm cây tiến hóa nêng nó
thường được sử dụng để phân tích khối dữ liệu lớn với nhiều taxa.

-

Phương pháp Neighbor-Joining là một phiên bản đơn giản của sự tiến hóa tối thiểu, trong
đó sử dụng các biện pháp khoảng cách chính xác cho số truy cập nhiều tại các trang web
16


Báo cáo đồ án tốt nghiệp

GVHD: Trần Hoàng Dũng

tương tự, và chọn một cấu trúc liên kết hiển thị các giá trị nhỏ nhất của tổng của tất cả các
ngành như là một ước tính chính xác cây.
3.4.3 Phương pháp Minimum-Evolution Tree
-

Phương pháp này xây dựng một cây phát sinh loài theo tiêu chí phát triển tối
thiểu .Tiêu chuẩn này không yêu cầu các giả định về tỷ lệ tiến hóa kiên trì khi
cần thiết trong phân tích UPGMA. Do đó cây phát sinh loài suy ra là một cây
unrooted, mặc dù, để dễ kiểm tra, nó thường được hiển thị một cách tương tự
như cây bắt rễ.
3.4.4 Phương pháp UPGMA Tree

-

Phương pháp này làm cây giả định rằng tốc độ tiến hóa vẫn không đổi trong suốt
lịch sử tiến hóa của loài bao gồm. Vì vậy, nó tạo ra một cây bắt rễ.
Nếu dữ liệu đầu vào của bạn là một ma trận khoảng cách, sau đó sử dụng lệnh
này làm cho MEGA tiến hành trực tiếp để xây dựng và hiển thị các cây UPGMA.

-

Trong tất cả các trường hợp khác, bạn sẽ được hỏi trong hộp thoại Preferences
phân tích để xác định phương pháp ước lượng khoảng cách, tập hợp con của các
trang web để bao gồm, và liệu có nên tiến hành một thử nghiệm của cây suy ra.
3.4.5

-

Phương pháp Maximum Parsimony Tree

Phương pháp MP - Maximum parsimony mô hình tiến hóa là một hàm ẩn, thay vào đó
một sự giả định cho rằng cây tiến hóa tốt nhất mổ tả tiến trình tiến hóa tốt nhất chính là
cây mô tả được các lòai ít thay đổi nhất tức là có ít đột biến nhất, cây vì thế có điểm thấp
nhất (hà tiện) theo một tiêu chuẩn định sẵn.

3.5. Trình tự phân tích dữ liệu trên MEGA 5.05

-

Trong cửa sổ làm việc của MEGA5.05, trên thanh công cụ (toolbar) chọn Align, trong
nhóm lệnh Align, click nút lệnh Query Databanks

17


Báo cáo đồ án tốt nghiệp

GVHD: Trần Hoàng Dũng

-

Xuất hiện cửa sổ M5: Web Browser (Nucleotide home).

-

Trong ô tìm kiếm ta nhập accession number của gene bank tương ứng với mỗi đối tương
nghiên cứu rồi click vào search. Dữ liệu sẽ được tìm kiếm trong gene bank, khi kết quả
tìm kiếm đã xuất hiện trong cửa sổ thì click vào nút lệnh Add to Alignment.

18


Báo cáo đồ án tốt nghiệp

-

GVHD: Trần Hoàng Dũng

Xuất hiện cửa sổ M5: Input Sequence Lable gồm các thành phần:
•
•
•
•

First word: chọn tên panax
Second word: chọn tên chủng cho loài
Three word: chọn tên gene
Fourth word: chọn Accession Numbers

19


Báo cáo đồ án tốt nghiệp
-

GVHD: Trần Hoàng Dũng

Click nút Ok, khi đó kết quả sẽ sắp xếp vào cửa sổ M5: Alignment Explorer. Sau khi đã
nhập đủ số của ngân hàng gene cần sắp xếp, chúng ta sẽ lưu dữ liệu trong cửa sổ M5:
Alignment Explorer.

-

Lặp lại trình tự như vậy thì ta sẽ được bảng dữ liệu như sau:

Sau đó lưu dữ liệu trong bảng lại.
3.5.1 Chọn lựa mô hình tiến hóa
-

Trong cửa sổ làm việc của MEGA5.05, trên thanh công cụ (toolbar) chọn Models, trong
nhóm lệnh Models, click nút lệnh Find Best DNA/Protein Model (ML).
20


Báo cáo đồ án tốt nghiệp

-

GVHD: Trần Hoàng Dũng

Khi đó xuất hiện bảng thông báo hỏi “would you like to use the currently active
data?”(bạn có muốn sử dụng dữ liệu đang hoạt động?).

Xuất hiện cửa sổ M5: Analysis Preferences gồm các thành phần:
-

-

Analysis (phân tích): model selection (chọn mô hình)
+

Tree to use: Automatic (Neighbor-joining tree)

+

Statistical Method(phương pháp thống kê): Maximum Likelihood

Substitution model (chọn mô hình thay thế)
+

-

Substitution type(chọn loại thay thế): Nucleotide hoặc Aminoacid

Data subset to Use: tập hợp tất cả dữ liệu để sử dụng
21


Báo cáo đồ án tốt nghiệp

GVHD: Trần Hoàng Dũng

+

Gaps/Missing Date treatment: complete deletion

+

Select codon postions: nếu gene mã hóa cho codon thì check chọn 1st, 2nd, 3rd.
nếu gene không mã hóa cho codon thì check chọn Noncoding Sites.

-

Sau khi chọn đầy đủ các dữ liệu, click nút compute. Xuất hiện cửa sổ M5: Find Best-Fit
Subtitution Model (ML).

-

Dựa vào kết quả trong cửa sổ, chọn giá trị nhỏ nhất trong cột lnL, với giá trị nhỏ nhất đó
sẽ có một model tương ứng và ghi nhớ model tương úng đó để sử dụng trong quá trình
phân tích phát sinh chủng loài và tiêu chuẩn hóa.
3.5.2. Phân tích sự phát sinh chủng loài bằng Phylogeny
22


Báo cáo đồ án tốt nghiệp

GVHD: Trần Hoàng Dũng

3.5.2.1 Phương pháp Test Maximum Likehood Tree
Mở cửa sổ MEGA5.05, trên thanh công cụ (toolbar) chọn Construct/Test Maximum
Likelihood Tree.

Xuất hiện bảng thông báo hỏi “Would you like to use the currently active data?” (bạn có
muốn sử dụng dữ liệu đang hoạt động?).

Xuất hiện cửa sổ M5: Analysis Preferences gồm các thành phần:
-

Analysis (phân tích):Phylogeny Reconstruction (thiết lập cây phát sinh chủng loài)

+ Statistical Method (phương pháp thống kê): Maximum Likelihood
-

Phylogeny Test (kiểm tra cây phát sinh chủng loài)

+ Test of Phylogeny: Bootstrap method (dùng phương pháp Bootstrap)
+ No of Bootstrap Replications ( Số lần lặp lại của Bootstrap): 100
-

Substitution Model: (Mô hình thay thế)

+ Substitution type(chọn loại thay thế): Nucleotide
+ Model/Method: Jukes-Cantor model
23


Báo cáo đồ án tốt nghiệp
-

GVHD: Trần Hoàng Dũng

Rates and Patterns:

+ Rates among sites: Uniform rates
Data subset to Use: tập hợp tất cả dữ liệu để sử dụng
+Gaps/Missing Date treatment: complete deletion
+ Select codon postions: nếu gene mã hóa cho codon thì check chọn 1st, 2nd, 3rd. nếu
gene không mã hóa cho codon thì check chọn Noncoding Sites.
Chọn xong dữ liệu, click Compute

-

Sau đó dữ liệu sẽ được phân tích và thực hiện kết nhóm tạo ra cây phát sinh chủng loài
như sau.

24


Báo cáo đồ án tốt nghiệp

GVHD: Trần Hoàng Dũng

3.5.2.2. Phương pháp Construct/ Test Neighbor-Joining Tree
-

Mở cửa sổ MEGA5.05, trên thanh công cụ (toolbar) chọn Construct/ Test NeighborJoining Tree

-

Các bước tiếp theo thực hiện như phương pháp Test Maximum Likehood Tree. Để ra cây
phát sinh chủng loài.

25