Tách chiết enzyme bromelain từ phế liệu vỏ dứa (ananas comosus) bằng phương pháp lọc

i

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM



LÊ NGỌC HÊN

TÁCH CHIẾT ENZYME BROMELAIN TỪ PHẾ
LIỆU VỎ DỨA (ANANAS COMOSUS) BẰNG
PHƯƠNG PHÁP LỌC

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN

Giáo viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Bảo

NHA TRANG, 8/2015


ii

LỜI CẢM ƠN

Qua một thời gian được nghiên cứu và thực tập tại phòng thực nghiệm Trường
Đại Học Nha Trang, em đã hoàn thành đồ án tốt nghiệp. Để hoàn thành đồ án này,
ngoài sự nổ lực của bản thân em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến sự giúp đỡ tận tình
của quý Thầy Cô cùng bạn bè.
Trước hết xin gửi lời cảm ơn Ban lãnh đạo nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Chế

biến, cùng thầy cô trong Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành chương
trình học tập và thực hiện tốt công tác tốt nghiệp.
Qua đây em xin bày tỏ lòng biết ơn đến Thầy giáo hướng dẫn: TS. Nguyễn Bảo
đã định hướng, tận tình chỉ bảo em trong suốt quá trình thực hiện đề tài và em cũng xin
chân thành cảm ơn Thầy Nguyễn Công Minh, tất cả các Cô phòng thí nghiệm Công
nghệ Thực phẩm, phòng Chế biến thủy sản, phòng Công nghệ cao, Công nghệ sinh
học đã tạo điều kiện cho em hoàn thành đề tài này.
Cuối cùng em xin bày tỏ sự biết ơn đến Cha Mẹ luôn tạo điều kiện, động viên lo
lắng và bạn bè đã giúp đỡ em trong thời gian học tập cũng như quá trình thực hiện đồ
án này.

Nha Trang, tháng 8 năm2015
Sinh viên thực hiện
Lê Ngọc Hên


iii

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ii
MỤC LỤC ................................................................................................................ iii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ..................................................................................... v
DANH MỤC BẢNG.................................................................................................. vi
DANH MỤC HÌNH .................................................................................................vii
LỜI MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ...................................................................................... 3
1.1. Tổng quan về dứa .............................................................................................. 3
1.2. Tổng quan về enzyme bromelain ....................................................................... 4
1.2.1. Khái niệm về enzyme ..................................................................................... 4
1.2.2. Đặc điểm, nguồn gốc và ứng dụng của enzyme bromelain .............................. 5

1.2.3. Tính chất của enzyme broemelain ................................................................... 8
1.3. Các phương pháp tách chiết và tinh sạch của enzyme ...................................... 18
1.3.1. Tách chiết enzyme bằng phương pháp kết tủa ............................................... 19
1.3.2. Phương pháp hấp phụ chọn lọc ..................................................................... 19
1.3.3. Phương pháp trao đổi ion .............................................................................. 20
1.3.4. Phương pháp tách hệ 2 pha nước [5] ............................................................. 20
1.3.5. Phương pháp siêu lọc (Ultrafiltration) ........................................................... 20
1.4. Phương pháp xác định khả năng xúc tác của enzyme ....................................... 22
1.4.1. Phương pháp định lượng protein bằng Microbiuret ....................................... 23
1.4.2. Xác định protein bằng phương pháp A280 .................................................... 23
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 25
2.1. Phương tiện nghiên cứu ................................................................................... 25
2.2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu ............................................................ 25


iv

2.2.1. Đối tượng chiết rút enzyme bromelain .......................................................... 25
2.2.2. Xác định hàm lượng protein của enzyme bromelain bằng Phương pháp
microbiuret: ............................................................................................................ 33
2.2.3. Xác định hoạt tính của enzyme bằng phương pháp A280 .............................. 35
2.3. Bố trí thí nghiệm .............................................................................................. 38
2.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát chế độ ly tâm cho quá trình lọc 11 µm. .................... 38
2.3.2 Thí nghiệm 2: Cut-off từng công đoạn khác nhau để khảo sát sự ảnh hưởng của
hoạt tính của enzyme bromelain ............................................................................. 41
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................. 43
3.1. Kết quả khảo sát thông số ly tâm sau công đoạn lọc thô................................... 43
3.2. Hiệu suất thu hồi và định mức sản phẩm .......................................................... 45
3.4 Hàm lượng protein bằng phương pháp microbiuret ........................................... 46
3.5. Hoạt tính riêng của enzyme bromelain ở từng công đoạn bằng phương pháp

A280 ...................................................................................................................... 48
3.6. Kết quả nghiên cứu cut-off tại các công đoạn ảnh hưởng đến hoạt tính
bromelain ............................................................................................................... 49
3.7 Đề xuất quy trình sản xuất hoàn thiện ............................................................... 49
Quy trình ................................................................................................................ 49
Thuyết mình quy trình ............................................................................................ 50
CHƯƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN .............................................. 52
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 53
PHỤ LỤC ................................................................................................................. 55


v

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

BSA: Bovine serum albumin.
TCA: Tricloroacetic Acid.
BAA: Benzyol – L –Arginine Amidez.
BAEE: Benzyol – L –Arginine Ethyl Esther.
BAEM: Benzyol – L –Arginine Methyl Esther.


vi

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Số liệu sản lượng vỏ dứa của các tỉnh thành trên cả nước (2013) .................. 4
Bảng 1.2 Thành phần amino acid và những nhóm khác của bromelain ...................... 11
Bảng 1.3 Hoạt tính phân giải của bromelain............................................................... 14
Bảng 1.4 Hằng số Michaelis (pH 6,5, 50 ºC) với các cơ chất khác nhau..................... 14
Bảng 2.1 Mối quan hệ giữa áp suất và độ thăng hoa của nước đá ............................... 32

Bảng 2.2 Dựng đường chuẩn nồng độ BSA bằng phương pháp microbiuret ............... 34
Bảng 2.3 Dựng đường chuẩn nồng độ BSA bằng phương pháp A280 ........................ 36
Bảng 2.4 Đánh giá cảm quan của dịch dứa sau ly tâm ................................................ 40
Bảng 2.5. Miêu tả cảm quan của dịch dứa sau ly tâm ................................................. 40
Bảng 3.1. Kết quả đánh giá cảm quan thông số ly tâm sơ bộ ...................................... 43
Bảng 3.2. Kết quả đánh giá cảm quan cho thời gian công đoạn ly tâm ở thông số 3000
vòng........................................................................................................................... 44


vii

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Quả dứa......................................................................................................... 3
Hình 1.2 Cấu trúc sợi hydro carbon của enzyme bromelain ....................................... 10
Hình 1.3 Cấu trúc bậc 1 của bromelain ...................................................................... 11
Hình 1.4 Trình tự sắp xếp các amino acid của quả dứa............................................... 12
Hình 1.5 So sánh thành phần, chuỗi amino acid của bromelain thân và quả ............... 13
Hình 1.6. Tổng quan về quá trình lọc ......................................................................... 21
Hình 2.1 Vỏ dứa ........................................................................................................ 25
Hình 2.2 Sơ đồ quy trình tách chiết enzyme bromelain .............................................. 26
Hình 2.3 Máy đông khô ............................................................................................. 29
Hình 2.4. Giản đồ pha của nước ................................................................................. 29
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí khảo sát chế độ ly tâm cho quá trình lọc 11 µm ....................... 39
Hình 2.6. Sơ đồ khảo sát hoạt tính enzyme bromelain ở từng công đoạn .................... 41
Hình 3.1 Hiệu suất thu hồi hỗn hợp enzyme bromelain qua từng công đoạn của qui
trình chiết rút ............................................................................................................. 45
Hình 3.2. Khối lượng riêng của dịch chiết ở từng công đoạn trong quá trình chiết rút
hỗn hợp enzyme bromelain. ....................................................................................... 46
Hình 3.3. Đồ thị hàm lượng protein (%) ..................................................................... 47
Hình 4.4. Đồ thị hoạt tính riêng của protein enzyme .................................................. 48

Hình 3.5. Quy trình tách chiết enzyme bromelain từ vỏ dứa ....................................... 49


1

LỜI MỞ ĐẦU
Hầu như mọi phản ứng hóa học trong cơ thể sống đều cần phải có vai trò xúc tác
của enzyme – chất xúc tác sinh học. Chính vì vậy, những nghiên cứu về enzyme đã thu
hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học ở các lĩnh vực liên quan khác nhằm tìm ra
được những công dụng khác nhau của mỗi enzyme. Những nghiên cứu về công nghệ
enzyme đã được tiến hành bởi nhiều tác giả như sử dụng phủ tạng của lò mổ để sản
xuất pancrease, pepsin, tripsin, sử dụng mầm mạ để sản xuất amylase. Đã có những
thử nghiệm công nghệ như sản xuất amino acid từ nhộng tằm bằng protease, bột
protein thịt bằng enzyme bromelain từ vỏ dứa.
Nghiên cứu enzyme còn có ý nghĩa thực tiễn rất quan trọng, đối với một số
bệnh, đặc biệt là bệnh mang tính di truyền, có thể do thiếu hay mất hẳn một hoặc số
enzyme trong các mô, các điều kiện không bình thường cũng có thể xuất hiện do hoạt
tính dư thừa của một số enzyme đặc hiệu. Do đó xác định hoạt tính của một số enzyme
trong huyết tương, hồng cầu hoặc trong các mô là rất hết sức cần thiết trong việc chẩn
đoán bệnh và nó đã trở thành công cụ thực tế không thể thiếu không những trong y học
cả trong công nghệ hóa học, trong chế biến thực phẩm.
Hiện tại trên thế giới enzyme được sản xuất từ nguồn động vật đang đối mặt với
nhiều vấn đề về đạo đức, tôn giáo, truyền thống văn hóa, phong tục truyền thống của
các quốc gia và ngày càng cạn kiệt nguồn nguyên liệu nên việc thực hiện trên nguồn
thực vật đang dần được chú trọng hơn. Đối với nước ta nguồn enzyme từ thực vật có
triển vọng lớn vì nguồn nghiên liệu rất phong phú, dồi dào (dứa, đu đủ…). Trong quá
trình chế biến dứa đóng hộp chỉ sử dụng một phần của quả dứa, phần còn lại là phụ
phẩm. Nếu tận dụng được nguồn phế phẩm thì vừa có thể giảm thiểu chất hữu cơ gây ô
nhiễm môi trường vừa có thể sản xuất sản phẩm enzyme bromelain có từ cây dứa.
Enzyme bromelain có ba hoạt tính khác nhau: Peptidase, amidase, esterase có thể phân

hủy cả cơ chất tự nhiên lẫn cơ chất tổng hợp, chúng có giá trị kinh tế cao.
Từ những lợi ích của enzyme bromelain mang lại, được sự chấp nhận của Khoa
Công Nghệ Thực Phẩm, Trường Đại học Nha Trang và sự hướng dẫn của Thầy
Nguyễn Bảo, em xin tiến hành thực hiện Đồ án tốt nghiệp “Tách chiết enzyme
bromelain từ phế liệu vỏ dứa (Ananas comosus) bằng phương pháp lọc”.


2

Nội dung nghiên cứu
-

Đề xuất qui trình tách chiết enzyme bromelain từ phế liệu vỏ dứa.

-

Khảo sát các thông số kỹ thuật của từng công đoạn.

-

Đánh giá hiệu suất thu hồi bã qua từng công đoạn.

-

Đánh giá hàm lượng protein qua từng công đoạn.

-

Đánh giá hoạt tính của enzyme bromelain qua từng công đoạn.
Mục tiêu đề tài:

Nghiên cứu quy trình tách chiết enzyme bromelain từ phế liệu vỏ dứa (Ananas

comosus) bằng phương pháp lọc, phương pháp mới nhưng vẫn tinh sạch được và cho
sản phẩm enzyme có chất lượng tốt. Từ đó có thể áp dụng sản xuất rộng rãi trong thực
tế.
Ý nghĩa khoa học:
Góp phần cung cấp thông tin về nghiên cứu tách chiết enzyme bromelain từ phế
liệu dứa và enzyme khác (papain từ nhựa đu đủ, ficin từ nhựa sung) bằng phương pháp
lọc. Cung cấp thêm nguồn enzyme từ thực vật cho thị trường thế giới
Ý nghĩa thực tiễn:
- Năng cao thu nhập cho người nông dân trồng dứa.
- Giảm ô nghiễm môi trường, giảm chi phí xử lý rác thải và mang lại nguồn lợi
nhuận từ phế liệu dứa cho các nhà máy chế biến đồ hợp dứa.


3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về dứa

Hình 1.1 Quả dứa

Nguồn gốc – phân bố
Dứa còn gọi là khóm (miền Nam). Loài dứa là loại cây ăn quả nhiệt đới nổi tiếng.
Hoa tập hợp quanh một trục lớn thành bông ngắn, mỗi hoa mọc ở kẽ một lá màu tím,
bầu dưới, quả mọng. Quả dứa là một quả phức, phần ăn được gồm trục hoa và các lá
bắc mọng nước, còn quả thật nằm trong các mắt dứa. Dứa chứa nhiều vitamin và vi
chất rất có lợi cho cơ thể, giúp giảm stress. Ngoài quả dứa dùng để ăn, gần đây dứa đã
trở thành nguyên liệu chiết bromelain dùng trong nhiều ngành công nghiệp và làm
thuốc chữa bệnh. Loại quả này có thể chữa một số bệnh như khó tiêu, viêm ruột, sốt

nóng, cảm nắng...
Thuộc về họ Dứa (Bromeliaceae), được biết đến nhiều nhất là loài Ananas
comosus, là loại dứa cho quả ăn được. Chi này có nguồn gốc từ khu vực Nam Mỹ và
được đưa tới các đảo khu vực Caribe nhờ những thổ dân Anh điêng Carib. Năm 1493,
Christopher Columbus lần đầu tiên đã nhìn thấy các loại cây của chi này tại
Guadeloupe. Nó được đưa sang châu Âu và từ đây nó được người Anh và Tây Ban
Nha phát tán tới các đảo trên Thái Bình Dương. Các cánh đồng trồng dứa thương
phẩm được thành lập tại Hawaii, Philippines, Đông Nam Á, Florida và Cuba. Dứa đã
trở thành một trong những loại cây ăn trái phổ biến nhất trên thế giới. Từ Ananas có
nguồn gốc từ tiếng Guarani để chỉ cây dứa.
Tại Việt Nam, dứa được trồng khá phổ biến, phân bố từ Phú Thọ đến Kiên
Giang. Tiền Giang là tỉnh có sản lượng dứa đứng đầu cả nước. Năm 2013, sản lượng


4

dứa của tỉnh Tiền Giang đạt 233,000 tấn. Tiếp theo là Kiên Giang (114,400 tấn), Ninh
Bình (48,900 tấn), Thanh Hóa (23,600 tấn), Quảng Nam (22,400 tấn), Nghệ An, Hậu
Giang (19,000 tấn). Tổng sản lượng cả nước năm 2013 đạt 585,6 ngàn tấn. Nhiều địa
phương xây dựng thương hiệu đặc sản quả dứa như dứa Đồng Giao (Tam Điệp - Ninh
Bình), hoặc ở Kiên Giang (Khóm Tắc Cậu), Tiền Giang đều có những nhà máy chuyên
sản xuất, chế biến các thực phẩm từ quả dứa. [13]
Hằng năm tổng sản lượng phế phẩm của vỏ dứa từ các tỉnh là rất lớn, gây ô
nhiễm môi trường và hết sức lãng phí. Đây cũng là nguồn nguyên liệu dồi dào cho việc
tách chiết bromelain tăng giá trị kinh tế
.
Bảng 1.1 Số liệu sản lượng vỏ dứa của các tỉnh thành trên cả nước (2013)
Tỉnh

Sản lượng dứa (tấn) Lượng vỏ dứa phế liệu (tấn)

Phú Thọ

2000

515

Ninh Bình

48900

12591,75

Thanh Hóa

23600

6077

Quảng Nam

22400

5768

Nghệ An

19000

49892,5

Tiền Giang

233000

59997,5

Hậu Giang

19000

49892,5

Kiên Giang

114400

29458

Cả nước

585600

150792

Nguồn: Thống kê của bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn (2013)

1.2. Tổng quan về enzyme bromelain
1.2.1. Khái niệm về enzyme
1.2.1.1. Khái niệm

Trong cơ thể sống (các tế bào) luôn luôn xảy ra các quá trình trao đổi chất. Sự
trao đổi chất ngừng thì sự sống không tồn tại. Quá trình trao đổi của một chất là tập
hợp các quy luật phản ứng của rất nhiều các phản ứng hóa học khác nhau. Các phản
ứng hóa học phức tạp này có liên quan chặt chẽ với nhau và điều hòa lẫn nhau.


5

Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein và có tính đặc hiệu cao.
Mỗi enzyme có khả năng xúc tác cho một hoặc một số phản ứng nhất định. Hoạt tính
của enzyme càng mạnh thì lượng cơ chất được chuyển hóa hoặc lượng sản phẩm tạo
thành trên một đơn vị thời gian càng lớn. Vì vậy có thể đánh giá hoạt tính của enzyme
bằng cách xác định tốc độ chuyển hóa cơ chất hoặc tốc độ tích lũy sản phẩm phản ứng.
1.2.1.2. Cơ chế tác dụng của enzyme
Bản chất của các phản ứng enzyme là khi có sự tham gia xúc tác của enzyme,
các cơ chất sẽ được hoạt hóa mạnh, từ đó làm thay đổi tính chất hóa học của cơ chất,
kết quả sau phản ứng sẽ tạo ra những sản phẩm của phản ứng. Dưới tác dụng của
enzyme cơ chất có thể thay đổi không chỉ về cấu trúc hóa học mà còn thay đổi tính
chất hóa học. Quá trình xúc tác của enzyme xảy ra ở ba giai đoạn:
- Giai đoạn thứ nhất: Enzyme sẽ kết hợp với cơ chất bằng những liên kết yếu,
nhờ đó sẽ tạo ra phức hệ enzyme-cơ chất. Phức hệ này thường không bền. Phản ứng
tạo ra phức hệ enzyme-cơ chất thường xảy ra rất nhanh và đòi hỏi một ít năng lượng.
- Giai đoạn thứ hai: Khi cơ chất tạo phức với enzyme sẽ bị thay đổi cả cấu hình
không gian, cả về mức độ bền vững các liên kết. Kết quả là các liên kết bị phá vỡ và
tạo ra sản phẩm.
- Giai đoạn thứ ba: Đây là giai đoạn cuối cùng, sản phẩm quá trình phản ứng
được tạo thành và tách ra khỏi enzyme.
Cơ chế xúc tác tổng quát của enzyme như sau:

Ghi chú: E – enzyme; S – cơ chất (substrate); P – sản phẩm (products)

1.2.2. Đặc điểm, nguồn gốc và ứng dụng của enzyme bromelain
Bromelain có tên gọi khác: Bromelin, Ananase.[7]
Tên thương mại: Bromanase (Kramer – Novis) brormelain 2400 maximum
strength (Vitalize Corp)
Là tên gọi chung cho các enzyme phân giải protein được tìm thấy trong các thành
viên khác nhau của gia đình nhà bromeliaceae. Bromelain từ dứa (Ananas comosus)


6

được nghiên cứu nhiều nhất. Nồng độ enzyme cao nhất được tìm thấy ở phần thân của
cây dứa trưởng thành, cũng hiện diện với số lượng đáng kể trong trái và lá. Trước đây,
cây dứa thường được sử dụng như một loại cây làm thuốc.
Năm 1957, nhà nghiên cứu Heinicke đã nhận thấy trong thân cây dứa có một
lượng lớn bromelain và họ bắt đầu tìm cách tách chiết nó và sản xuất thuốc để chữa
bệnh. Tùy theo nguồn thu nhận mà phân biệt bromelain thân hay bromelain quả.
Bromelain thân là nhóm enzyme có giá trị kinh tế cao. Ở mỗi bộ phận khác nhau trên
thân cây dứa, bromelain có pH tối ưu và cấu tạo khác nhau.
Bromelain có vai trò trong y học nên được nghiên cứu rất nhiều. Bromelain là
enzyme thủy phân protein, nó phân cắt protein trong cơ thể sinh vật. Một trong những
lợi ích của nó được chú ý đến đó là một chất giúp cho tiêu hóa vì nó hoạt động ở môi
trường acid và cả trong môi trường kiềm của ruột non. Nó thay thế được cho cả những
enzyme tiêu hóa khác như pepsin và trypsin. Bromelain có tác dụng kháng viêm, rất có
hiệu quả trong chữa trị bệnh viêm khớp do đó các chuyên gia y tế đề nghị sử dụng
bromelain làm giảm lượng prostaglandin trong cơ thể gay ra đau, viêm và ngăn cản sự
thẩm thấu các chất dinh dưỡng qua mô bằng cách ngăn cản những tiền chất gây viêm.
Bromelain có ảnh hưởng tích cực trên các prostaglandin hữu dụng. Trong một nghiên
cứu trên thỏ đưa ra kết quả khẳng định: Bromelain làm giảm phù nề các vết thương tốt

hơn khi kết hợp với trypsin và rutin.
Bromelain phối hợp với thuốc kháng sinh trong điều trị một số bệnh nhiễm
khuẩn sẽ làm tăng hiệu quả kháng sinh, phối hợp với một số thuốc điều trị hen
(theophhyllin, ephedrin…) làm tăng tác dụng chống hen. Một nghiên cứu trên tạp chí
Anh cho biết, qua thử nghiệm trên chuột, các nhà khoa học đã nhận thấy bromelain
làm giảm hơn 50% dấu hiệu viêm phổi đối với bệnh hen và liều lượng càng cao thì
hiệu quả được cải thiện. Bromelain làm tăng hệ miễn dịch giúp người bị ung thư giảm
được di căn (200 -300 mg bromelain/kg thể trọng kết hợp với xạ trị hoặc hóa trị). Nó
còn có tác dụng chữa đau tim (làm tan máu tụ gây đau tim). Ngoài ra còn rất nhiều ứng
dụng khác trong các ngành công nghiệp như:
- Công nghiệp thực phẩm:
Thủy phân gan bò: Bromelain được ứng dụng để xử lý gan bò nhằm thu dịch thủy
phân gan có hàm lượng acid amine cao. Gan bò được xử lý bằng chế phẩm bromelain


7

trong thời gian 10 giờ ở nhiệt độ 55 0C, sau đó xử lý ở 100 0C trong vòng 3-4 phút.
Dịch thủy phân tách được đem lọc và đông khô. Hàm lượng acid amine của chế phẩm
tăng lên gấp 1,5 – 2 lần so với sản phẩm ban đầu (Nguyễn Trọng Cẩn và ctv, 1998).
- Làm đông tụ sữa:
Renin là loại enzyme được sử dụng làm đông sữa truyền thống, enzyme này được thu
từ ngăn thứ 4 của dạ dày bê. Tuy nhiên, lượng renin không đáp ứng được nhu cầu ngày
càng tăng của công nghiệp làm sữa. Vì vậy, ngày nay người ta có xu hướng thay thế
enzyme renin bằng enzyme thực vật, trong đó bromelain được quan tâm sử dụng nhiều
hơn (Nguyễn Trọng Cẩn và ctv, 1998).
- Trong chế biến bia và nước giải khát:
Trong chế bia và nước giải khát; bromelain được dùng để làm trong bia và nước quả
(Nguyễn Trọng Cẩn và ctv, 1998; Quách Đĩnh và ctv, 1996.
- Tăng cường sự ổn định protein của các loại bia và ngăn chặn sự hình thành

sương mù trong công nghiệp sản xuất rựu bia.[8]
- Cải thiện độ đàn hồi và tăng mức co giãn của bột, sản xuất bột không gây kích
ứng trong công nghiệp nướng.
- Thủy phân protein myofibril của thịt, làm tác nhân thủy phân cho thịt gà, sò và
mực trong việc làm mềm thịt
- Thủy phân protein cá để tạo ra protein cá thủy phân.
- Ức chế sự biến nâu của trái cây và oxy hoá phenol
- Bổ sung vô thức ăn chăn nuôi: Trong việc phân hủy protein trong thức ăn ở
động vật nhai lại.
- Giảm thời gian làm mềm trong kén ăn, giảm bỏ tạp chất và qui mô của các sợi
len, tăng cường tính nhuộm của các sợi protein trong công nghiệp dệt may.
- Làm trắng răng: Loại bỏ các vết bẩn, mảng bám, mãnh vụn thức ăn thừa bám
trên răng.
- Mỹ phẩm: Trị mụn trứng cá, nám, giảm sưng và bầm tím sau khi tiêm.


8

1.2.3. Tính chất của enzyme broemelain
1.2.3.1. Thành phần
Bromelain là một hỗn hợp của:
- Thiol Endo-peptidase như Ananain và comosain được coi là thành phần hoạt
động chính [7] . Ngoài ra còn có:
- Phosphatases
- Glucosidases
- Peroxidases
- Cellulases
- Glycoproteins
- Protein ức chế chẳng hạn như cystatin
Hỗn hợp tổng thể này của bromelain có xu hướng hoạt động phản ứng trên liên

kết có analyl, glycyl và leucyl.
Khi tách chiết và tinh sạch phân đoạn có chứa nhóm sulfhydryl của bromelain thì
không chỉ phụ thuộc vào phân đoạn mà còn phụ thuộc nhiều yếu tố khác có trong
bromelain.
Hiện tại người ta ghi nhận được bromelain trong dứa có trọng lượng phân tử
33000 dalton lớn gấp 1.5 lần so với papain.
Trọng lượng phân tử của bromelain thân (EC.3.4.22.32- stem bromelain) ở giá trị
trung bình (22830,93 dalton), đoạn chính (22816,26 dalton). Nó có tám thành phần cơ
bản có hoạt tính thủy phân protein như trên. Hai thành phần chính được gọi là F4
(24397 dalton) và F5 (24472 dalton) [7] . Phân đoạn có hoạt tính mạnh nhất là F9
(23464 dalton) chiếm khoảng 2 % protein trên tổng số. Người ta ước tính rằng khoảng
50 % protein của F4 và F5 là glycosylate, trong khi đó ở F9 không có glycosylate. pH
tối thích của phân đoạn F4 và F5 là 4,0 đến 4,5 và của F9 thì gần với pH trung tính.[9]
So với bromelain thân thì bromelain quả (EC. 3.4.22.33-fruit bromelain) có trọng
lượng phân tử nguyên tử (39029,6 dalton), đoạn propepetide (36417,12 dalton), đoạn
chín (24880,75 dalton).


9

Có sự khác nhau giữa các trọng lượng phân tử của bromelain quả và thân như
trên là do các PTM của các acid amin thay đổi, dẫn đến trọng lượng phân tử của đoạn
code của mã di truyền thay đổi theo.
Dịch chiết được chiết tách từ các thành phần khác nhau trên cây dứa sẽ có hoạt
động sinh lý khác nhau nhưng hoạt tính thủy phân thì giống nhau.
Bromelain có thể thấm qua hoàn toàn dạ dày và ruột của động vật. Nồng độ cao
nhất của bromelain được tìm thấy trong máu sau khi ăn một giờ, tuy nhiên hoạt động
thủy phân protein của nó bị bất hoạt nhanh chóng có thể do tác động của các enzyme
nội sinh và yếu tố α-2-macroglobuline của huyết thanh. [2]
1.2.3.2. Cấu tạo hóa học

Bromelain thân là một protease nhưng nó khác với các protease thực vật khác
như papain (từ đu đủ), ficin (nhựa sung) ở chỗ nó là glycoprotein, mỗi phân tử có
glycan gồm 3 manose, 2 glucosamine, 1 xylose và 1 fuctose. Sợi hydrate carbon này
liên kết hoán vị với sợi polypeptide. Trong sợi hydrate này dường như một nữa sợi
không kiên kết đến cơ chế xúc tác phân tử.
Người ta đề nghị cấu trúc sợi hydrate carbon của phân tử bromelain như sau:


10

OH

OH
OH
fructose

OH

OH

Maltose

CH2O2
OH
CH2

OH

OH

Maltose
OH

Glucofamine
Maltose

CH2O2

CH2O2
OH

C
NHCONH2
NH-CO-CH2-CH

OH

OH

N

OH
NHCONH2
Xylose

Hình 1.2 Cấu trúc sợi hydro carbon của enzyme bromelain

Khi phân tích thành phần amino acid ở bromelain thân và quả thì tùy vào phương
pháp thu nhận và phân tích mà có thành phần amino acid thay đổi khác nhau. Thay đổi
trong khoảng 144-321 amino acid và bromelain quả là 161-283 amino acid.

Bromelain thân là một sợi polypeptide có amino acid ở đầu amine là valine và ở
đầu carbonhydrate là glycine, còn bromelain quả có amino acid ở đầu amine là
alanine.


11

Bảng 1.2 Thành phần amino acid và những nhóm khác của bromelain
Amino acid

Thân

Quả xanh

Quả chín

Aspartic acid

29 - 29,4

29,8

29,8

Glutamicacid

23

23,2

23,4

Glycine

24,6 – 35

32,6

32,2

Alanine

35 - 35,4

23,8

24,4

Valine

21,6 – 22

19,8

20,1

Leucine

10

10

10

Threonine

21 – 21,2

16,4

16,2

Cystine

28 – 28,2

32,2

32

Methionine

13,6 – 14

13,5

13,8

Proline

14 – 14,2

11,6

12,1

Phenylalanie

8,8 – 9

7,6

8

Tyrosine

20,8 – 21

22,4

22,2

Tryptophan

8 – 8,1

5,6

-s

Histidine

1,9 – 2

1,4

1,3

Lysine

22,9 – 23

7,8

8,3

Arginine

11,5 – 12

8,6

9,1

Amid

41,6 – 42

43

43,4

Glucosamine

5,8 – 6

0,2

0,2

Carbohydrae

1,46

3,2

3,2

Nguồn: [2]

1.2.3.3. Cấu trúc không gian của bromelain

Theo Murachi và Busan[10] , cấu trúc bậc 1 của bromelain được sắp xếp amino
acid trong phân tử bromelain như sau:

Hình 1.3 Cấu trúc bậc 1 của bromelain


12

Bromelain là protein là một trung tâm hoạt động có chứa cysteine và hai sợi
polypeptide liên kết với nhau bằng cầu nối –S-S-. Phân tử có dạng hình cầu dó đó có
cách sắp xếp phức tạp, bao gồm 351 amino acid:

Hình 1.4 Trình tự sắp xếp các amino acid của quả dứa
Nhưng trong đó enzyme bromelain chỉ từ amino acid 122 đến 351. Còn lại amino
acid 1 đến 24 là các hoạt chất sinh học bắt tính hiệu kết hợp với các propeptide 25 đến
121 ngắt tách protein enzyme bromelain ra ngay tại vị trí đó.
Trong phân tử bromelain thân có chứa nhóm sulfulhydryl có vai trò chủ yếu
trong hoạt tính xúc tác và trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối disulfite. Ngoài ra,
trong phân tử còn có các ion Zn2+ có vai trò trong duy trì cấu trúc không gian của
enzyme. Ngoài ra nó cũng không có khác biệt lớn về trình tự sắp xếp và thành phần
amino acid của bromelain quả. Bảng so sánh các thành phần, chuỗi amino acid của
bromelain thân và quả:[10]


13

Hình 1.5 So sánh thành phần, chuỗi amino acid của bromelain thân và quả
1.2.3.4. Tính riêng biệt
Hai hình thức (A và B) của Bromelain với độ đặc hiệu tương tự đã được phân lập
từ thân dứa [10]
1.2.3.5. Hoạt tính của bromelain
Hoạt tính phân giải
Bromelain có ba hoạt tính khác nhau: Peptidase, amidase và esterase. Bromelain thân
có thể thủy phân cả cơ chất tự nhiên lẫn cơ chất tổng hợp như hemoglobin, casein,
gelatin, BAA (Benzyol – L –Arginine amidez), BAEE (Benzyol – L –Arginine Ethyl
Ester), BAEM (Benzoyl – L – Arginine Methyl Ester). [2]

14

Khả năng thủy phân cơ chất tự nhiên của bromelain
Bảng 1.3 Hoạt tính phân giải của bromelain
Cơ chất

Hoạt tính phân giải (UI/mg)
Bromelain thân

Bromelain trái xanh

Bromelain trái chín

Casein

7,4

4,0

3,0

BAA

3,7

9,1

7,2

Nguồn: [2]

Đối với cơ chất là casein, hoạt tính phân giải của bromelain thân cao hơn
bormelain trái xanh và bromelain trái chín.
Khả năng phân giải cơ chất nhân tạo của bromelain
Bromelain trái xanh có hoạt tính phân giải BAA cao hơn bromelain thân và bromelain
trái chín.

Bảng 1.4 Hằng số Michaelis (pH 6,5, 50 ºC) với các cơ chất khác nhau
Enzyme cơ chất

BAA

BAEE

BAEM

Bromelain thân

1,2*10-3

17*10-1

3,2*10-2

Papain

3,9*10-2

1,89*10-3

Ficin

4,8*10-3

2,5*10-2

Nguồn: [2]

- BAA: Benzyol – L –Arginine amidez.
- BAEE: Benzyol – L –Arginine Ethyl Esther.
- BAEM: Benzyol – L –Arginine Methyl esther.
Theo Murachi et al., (1964) với cơ chất là hemoglobin thì bromelain mạnh gấp 4
lần papain, với casein thì tương đương với cơ chất BAA, BAEE thì kém hơn.
Như vậy hằng số xúc tác của bromelain đối với BAEE gấp 140 lần so với BAA, khác
hẳn trường hợp papain và ficin.


15

Ý nghĩa của hằng số Michaelis-Menten: Chính là giá trị nồng độ cơ chất khi tốc
độ phản ứng bằng ½ tốc độ cực đại. Km có đơn vị là Molar, đơn vị nồng độ. Hằng số
Michaelis là hằng số rất quan trọng. Nó xác định ái lực của enzyme với cơ chất. Km
càng nhỏ thì ái lực càng lớn, tốc độ phản ứng càng cao vì thế tốc độ cực đại Vmax đạt
ở giá trị nồng độ cơ chất thấp.
Cơ chế tác dụng
Bromelain thủy phân protein, peptide, amit và các este của các axit amin và
peptide; vị trí phân cắt ưu tiên là cacbonyl cuối của lysine, alanine, tyrosine và glycine
Tài liệu nước ngoài
Đối với hoạt động trên một số chất amino acid Barman thấy [14] [3] [3] . Các
hoạt động phía sau có thể được phát hiện trong các chế phẩm Bromelain: Amylase,
phosphatase, peroxidase, rất không ổn định khi lưu trữ sau này.

Theo Doi E et al., (1974) bromelain thô có tác dụng như một carboxyl-peptitase
(từ dịch tụy) thủy phân các liên kết peptide tận cùng cạnh nhóm carboxyl tự do của cơ
chất, nhất là khi acid amine tận cùng có nhân thơm.
Hầu hết các tác giả đều thừa nhận vai trò của nhóm –SH của cystein, nhóm
imidazole của histidin và nhóm đi sulfur trong hoạt động thủy phân của bromelain.
Nhóm –SH tham gia tạo thành acyl-thioester trung gian với nhóm carboxyl của cơ chất
(nơi cá liên kết peptide bị cắt). Nhóm imidazole làm chất trung gian nhận gốc acid và
chuyển cho nhóm anino của chất nhận khác. Cầu nối S-S có vai trò duy trì cấu trúc
không gian của bromelain. Casein và hemoglobin là hai cơ chất tự nhiên được dùng
nhiều nhất. Đầu tiên, bromelain kết hợp với protein và thủy phân sơ bộ cho ra
polypeptide và acid amine. Protein kết hợp với nhóm –SH của enzyme khiến nó bị
ester hóa rồi nhóm imidazole sẽ khử ester để giải phóng enzyme, acid amine và
peptide.
Ở giai đoạn đầu Zn2+ rất quan trọng, chúng kết hợp với nhóm –SH của tâm hoạt
động hình thành mercaptid phân ly yếu (nhưng vẫn còn khả năng kết phối trí bổ sung
với các nhóm chức năng của phân tử protein như amine, carboxyl…)
Enzyme – SH + Zn 2+ => enzyme – S – Zn + H+


16

Do vậy nhóm –SH trong trung tâm hoạt động đã bị ester hoá bởi cơ chất, cấu trúc
không gian được bảo vệ ổn định.
1.2.3.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của bromelain
Ảnh hưởng của một số hóa chất và biến đổi cấu trúc của bromelain
Bromelain là một proteinase thiol, nó có chứa trong các trung tâm hoạt động một
cysteine phản ứng cao cần thiết cho xúc tác. Do đó, các enzyme có thể được kích hoạt
bằng cách giảm các hợp chất, ví dụ như cysteine, 2-mercaptoethanol, dithiothreitol,
KCN. Mặt khác, bromelain không được phục hồi ức chế bởi các tác nhân alkyl hóa
như N-ethylmaleimide (NEM), acid iodoacetic và 1,3-dibromoacetone. Ức chế được

hồi phục bởi chất vô cơ ion Hg, các hợp chất hữu cơ và Hg tetrathionate.[4]
Giới hạn pH và nhiệt độ hoạt động của bromelain
- PH tối ưu cho hoạt động xúc tác phụ thuộc vào bản chất của chất nền, loại và
nồng độ đệm và sự hiện diện hay vắng mặt của một chất khử.
- Khoảng pH tối ưu là khoảng 4,5-7,5.
- Nhiệt độ tối ưu là 35-45 °C [5]nhiệt độ hoạt động tối đa cho các ứng dụng công
nghiệp (thời gian phản ứng ≤4h) là 50 °C. [12]
Sự ổn định của bromelain
- Bromelain ổn định ở khoảng pH 3-6 và ở nhiệt độ lên đến 60 °C. [5] Bột
bromelain thô sau khi đóng gói có thể được lưu trữ đến hai năm tại nhiệt độ dưới 8 °C
mà không mất hoạt tính.
- Khi lấy ra các hoạt động của enzyme giảm dần, trừ khi các enzyme ngay lập tức
enzyme được pha trộn với chất pha loãng (lactose), sẽ giúp ngăn chặn các protein tự
ngừng hoạt động.
- Thiệt hại gây ra bởi hoạt động lưu trữ hoặc chuẩn bị các điều kiện không thích
hợp có thể được bãi bỏ đến một mức độ đáng kể bởi việc bổ sung cysteine.
Ảnh hưởng của ion kim loại
- Các ion kim loại có ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme do chúng thường gắn
vào các trung tâm hoạt động của enzyme. Vì bromelain thuộc nhóm protease cystein,
trung tâm hoạt động có nhóm –SH. Bromelain bị ức chế bởi các ion hoặc hợp chất có


17

ái lực mạnh hơn nhóm –SH, các tác nhân oxy hóa, halogen hóa, alkyl hóa như:
Iodoacetate, cloacetophenol, H2O2. Các ion kim loại như Fe, Cu, Ag, Zn có xúc tác
làm ổn định cấu trúc phân tử bromelain. [2]
1.2.3.7. Độ hòa tan, điểm đẳng điện, dữ liệu quang phổ
Độ hòa tan: Bromelain hòa tan một phần trong nước nhưng không tan hầu hết
trong các dung môi hữu cơ.

Điểm đẳng điện: 9,55
Dữ liệu quang phổ: E280 (1%, 1cm) = 20,1
1.2.3.8. Nghiên cứu trong và ngoài nước
Tình hình nghiên cứu enzyme bromelain trong nước
Ở nước ta có nhiều công trình công bố về nghiên cứu sử dụng enzyme bromelain,
các công trình công bố tập trung trong các lĩnh vực tách chiết, tinh sạch và khả năng
ứng dụng của enzyme này như:
Lê Thị Thanh Mai (1997) nghiên cứu các phương pháp tinh sạch và ứng dụng
bromelain cho thấy có thể thu nhận bromelain theo phương pháp kết tủa bằng aceton
hay cô đặc theo phương pháp siêu lọc rồi kết tủa bằng aceton, cũng như có thể tính
sạch bromelain theo phương pháp lọc gel sephadex G75 với hiệu suất cao. Nghiên cứu
còn cho thấy có thể sử dụng enzyme này để rút ngắn thời gian chế biến nước mắm.[1]
Dương Thị Hương Giang và Lê Thanh Hùng (2002) nghiên cứu điều kiện nhằm
ổn định phương pháp tinh sạch bromelain bằng nước khóm khô cho thấy có thể thu
nhận và tinh sạch enzyme bromelain bằng phương pháp sắc ký và trao đổi ion trên cột
SP-Streamline XL với hiệu suất cao.
Tạp trí khoa học đại học Cần Thơ “trích ly enzyme bromelain từ phế phẩm khóm
Cầu – Đúc Hậu Giang”, theo Nguyễn Văn Thành và cộng tác viên (30/10/2013) đã
khảo sát các tác nhân ảnh hưởng đến trích ly và bảo quản enzyme bromelain. Kết quả
nghiên cứu cho thấy trong số những phế phẩm (lá, thân, trái) thân khóm là nguồn cơ
chất thích hợp để sản xuất brmelain. Chế phẩm enzyme bromelain được kết tủa với
amonium sulfate 70%, ở nhiệt độ 28 ºC, cho sản lượng 69,52% protein. Bột enzyme
thu được bởi sấy chân không 24 giờ, độ ẩm đạt 1,87% và hoạt lực 12,29 (TU/mg). Bột


18

enzyme thu được nên bảo quản ở nhiệt độ lạnh (4 ºC ) trong chai thủy tịnh có hoạt lực
ổn định trong 12 tuần.
Tình hình nghiên cứu enzyme bromelain ngoài nước.

Theo Salem và ctv (1995) đã sử dụng tỉ lệ là 0,3% enzyme so với cá gồm papain,
tripsin , ficin và bromelain thêm vào cùng với 25% muối ngay từ lúc đầu của quá trình
sản xuất nước mắm trên năm loại cá (Sardine, Macaroni, Bolti, Bourri và Shark ). Kết
quả cho thấy với 0,3% bromelain cho hàm lượng đạm tổng số cao nhất so với các
enzyme còn lại trên mẫu cá mòi (Sardine) sau 180 ngày lên men và cao hơn so với
mẫu đối chứng lên men cổ truyền là 30%.
Liang và ctv (1999) nghiên cứu hoạt tính của bromelain sau khi bổ sung
polyphenol trích ly từ trà xanh của Trung Quốc cho thấy tính bền nhiệt của bromelain
được tăng lên.

1.3. Các phương pháp tách chiết và tinh sạch của enzyme
Enzyme có mặt trong tất cả các tế bào, chúng tồn tại ở dạng nội bào hay ngoại
bào.Vì vậy vấn đề tách và thuần khiết enzyme là công việc rất khó khăn, đặc biệt đối
với các enzyme nội bào. Muốn tách enzyme nội bào ra khỏi tế bào thì cần phải phá vỡ
cấu trúc tế bào bằng các biện pháp cơ học như: nghiền với cát hoặc tác dụng của máy
siêu âm... Sau đó dùng nước cất, dung dịch đệm hoặc dung dịch muối trung tính để
chiết enzyme ra.
Có nhiều những khó khăn trong tách chiết enzyme ra khỏi tế bào như:
Enzyme có trong tế bào sinh vật với lượng không lớn so với các thành phần khác.
Do đó, việc tách để thu nhận thành phần này là rất khó. Nó là chất hữu cơ không bền,
chúng có rất dễ bị biến tính khi bị tác động của các yếu tố bên ngoài. Là protein, luôn
đi cùng những loại protein không phải là enzyme nhưng lại có tính chất lý hóa rất
giống protein enzyme. Do đó, việc tách chiết protein-enzyme ra khỏi các loại protein
không phải lúc nào cũng đạt kết quả tốt và gặp rất nhiều khó khăn.
Vì thế để thuần khiết enzyme cần phải tiến hành phối hợp nhiều biện pháp khác
nhau như đem dung dịch lọc ly tâm theo tốc độ tăng dần ta sẽ thu được những phần có
trọng lượng khác nhau hoặc có thể dùng phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng