đánh giá đa dạng di truyền nguồn vật liệu ngô phục vụ công tác chọn tạo giống ngô lai chín sớm, chịu hạn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LÊ CÔNG TÙNG

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN VẬT LIỆU NGÔ PHỤC
VỤ CÔNG TÁC CHỌN TẠO GIỐNG NGÔ LAI CHÍN SỚM, CHỊU HẠN

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI, NĂM 2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LÊ CÔNG TÙNG

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN VẬT LIỆU NGÔ PHỤC VỤ
CÔNG TÁC CHỌN TẠO GIỐNG NGÔ LAI CHÍN SỚM, CHỊU HẠN

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Mã số: 60.42.02.01
Người hướng dẫn khoa học:
TS. NGUYỄN XUÂN THẮNG

PGS.TS. NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO

HÀ NỘI, NĂM 2014


Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung
thực và chưa từng được sử dụng để bảo vệ một học vị nào.

Tác giả luận văn

Lê Công Tùng

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page i


Lời cảm ơn!
Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tôi xin chân thành bày tỏ lòng
kính trọng và biết ơn sâu sắc tới:
- TS. Nguyễn Xuân Thắng, PGS.TS. Nguyễn Thị Phương Thảo đã
tạo điều kiện, hướng dẫn tận tình cho tôi trong suốt quá trình thực tập làm
luận văn.
- Toàn thể cán bộ,Bộ môn Công nghệ sinh học-Viện Nghiên cứu Ngô;
các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học thực vât-Khoa Công nghệ sinh
học-Học viện nông nghiệp Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn
thành luận văn.
- Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã giúp đỡ, động viên tôi
trong suốt quá trình học tập cũng như trong thời gian tôi thực tập làm luận

văn này.

Hà Nội, ngày 29 tháng 10 năm 2014
Tác giả luận văn

Lê Công Tùng

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page ii


MỤC LỤC
Lời cam đoan .................................................................................................... i
Lời cảm ơn ....................................................................................................... ii
Mục lục ........................................................................................................... iii
Chữ viết tắt...................................................................................................... vi
Danh mục bảng, hình .................................................................................... viii
MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1
1.

Tính cấp thiết của đề tài ......................................................................... 1

2.

Mục đích, yêu cầu của đề tài .................................................................. 2

2.1.

Mục đích ................................................................................................ 2

2.2.

Yêu cầu ................................................................................................. 2

3.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ................................................ 2

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3
1.1.

Tổng quan về cây ngô ............................................................................ 3

1.1.1. Giới thiệu chung về cây ngô ................................................................... 4
1.1.2. Giá trị của cây ngô ................................................................................. 4
1.2.

Ảnh hưởng của hạn đến sản xuất ngô ..................................................... 4

1.3.

Nghiên cứu đa dạng di truyền ................................................................ 6

1.3.1. Đa dạng di truyền .................................................................................. 6
1.3.2. Nghiên cứu đa dạng di truyền sử dụng dữ liệu hình thái ......................... 6
1.3.3. Nghiên cứu đa dạng di truyền sử dụng chỉ thị hóa sinh .......................... 7
1.3.4. Nghiên cứu đa dạng di truyền sử dụng chỉ thị phân tử ............................ 7
a)

Chỉ thị phân tử RFLP ............................................................................. 8

b)

Chỉ thị RAPD ......................................................................................... 9

c)

Chỉ thị AFLP ........................................................................................ 10

d)

Chỉ thị SSR ........................................................................................... 11

1.4.

Nghiên cứu đa dạng di truyền trên đối tượng cây ngô .......................... 11

1.4.1. Nghiên cứu đa dạng di truyền cây ngô sử dụng chỉ thị hình thái ........... 12
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page iii


1.4.2. Nghiên cứu đa dạng di truyền cây ngô sử dụng chỉ thị phân tử ............. 13
1.5.

Dòng thuần và cơ sở khoa học của ưu thế lai........................................ 16

1.5.1. Dòng thuần........................................................................................... 16

1.5.2. Cơ sở khoa học của ưu thế lai............................................................... 16
1.6.

Khoảng cách di truyền và ưu thế lai ở ngô............................................ 17

Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 19
2.1.

Vật liệu nghiên cứu .............................................................................. 19

2.2.

Nội dung nghiên cứu ............................................................................ 23

2.3.

Phương pháp nghiên cứu ..................................................................... 24

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 32
3.1.

Kết quả đánh giá đặc điểm nông sinh học các dòng ngô dùng phục vụ

công tác chọn tạo giống ngô lai chín sớm, chịu hạn........................................ 32
3.1.1. So sánh khả năng chịu hạn của các dòng ngô dùng trong nghiên cứu ở
giai đoạn cây con............................................................................................ 32
3.1.2. Đánh giá đặc điểm nông sinh học các dòng ngô ................................... 34
a)

Thời gian sinh trưởng của các dòng ngô .............................................. 35

b)

Đặc điểm hình thái của các dòng ngô .................................................. 38

c)

Hình thái bắp, các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất ................ 40

d)

Giá trị CV% của mỗi tính trạng ........................................................... 42

e)

Xác định các dòng ngô có đặc điểm nông sinh học tốt cho bước nghiên

cứu tiếp theo ................................................................................................... 42
3.2.

Kết quả đánh giá đa dạng di truyền các dòng ngô................................. 42

3.2.1. Kết quả đánh giá đa dạng di truyền các dòng ngô sử dụng đặc điểm
nông sinh học ................................................................................................. 43
3.2.2. Kết quả đánh giá đa dạng di truyền các dòng ngô sử dụng chỉ thị phân
tử SSR ............................................................................................................ 45
a)

Kết quả tách chiết DNA tổng số ........................................................... 46

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page iv


b)

Kết quả phân tích băng DNA đa hình và mức độ đa hình của từng locus

SSR…… ......................................................................................................... 47
c)

Kết quả đánh giá độ thuần di truyền của các dòng ngô và tỷ lệ khuyết

số liệu ............................................................................................................. 52
d)

Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền giữa 22 dòng ngô sử dụng chỉ

thị phân tử SSR............................................................................................... 54
e)

So sánh kết quả đánh giá đa dạng di truyền các dòng ngô sử dụng đặc

điểm nông sinh học và chỉ thị phân tử SSR ..................................................... 56
3.2.3. Định hướng lai tạo THL cho các bước nghiên cứu tiếp theo ................. 57
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 60
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................ 61
PHỤ LỤC...................................................................................................... 67

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page v


CHỮ VIẾT TẮT
Cs

: Cộng sự

THL

: Tổ hợp lai

Gbp

: Giga base pairs

ABIONET-CIMMYT

: International Maize and Wheat Improvement
Center

TGST

: Thời gian sinh trưởng

DNA

: Deoxyribonucleic acid

RNA

: Axit ribonucleic

MAS

: Marker assisted selection

RFLP

: Restriction fragment length polymorphisms

RAPD

: Random amplified polymorphic DNA

AFLP

: Amplified fragment length polymorphisms

SSR

: Simple sequence repeats

PCR

: Polymerase Chain Reaction

SSLPs

: Single sequennce length polymorphisms

STRs

: Simple Tandem Repeats

PIC

: Polymorphic information content

NST

: Nhiễm sắc thể

UPMGA

: Unweighted Pair Group Method with Arithmetic
Mean

CTAB

: Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

dNTP

: Deoxyribonucleotide Triphotphate

Rnase

: Ribonuclease

APS

: Ammonium persulfate

TEMET

: Tetramethylethylenediamine

GD

: Genetic distance

GS

: Genetic similarity

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page vi


ASI

: Anthesis-Silking Interval

CV%

: Coefficient of variation

TBE

: Tris-Boric-EDTA

TE

: Tris- EDTA

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page vii


DANH MỤC BẢNG, HÌNH
DANH MỤC BẢNG:
Bảng 1: Danh sách các dòng ngô sử dụng trong nghiên cứu .......................... 20
Bảng 2: Danh sách mồi SSR ......................................................................... 21
Bảng 2 (tiếp): Danh sách mồi SSR ................................................................ 22
Bảng 3: Thành phần phản ứng PCR .............................................................. 29
Bảng 4: Chu trình PCR.................................................................................. 29
Bảng 5: Khả năng chịu hạn của các dòng ngô trong vụ Đông 2013 tại Viện
Nghiên cứu Ngô..... .................................................................................... ...33
Bảng 6: Đặc điểm nông sinh học của các dòng ngô trong vụ Xuân 2014 tại
Viện Nghiên cứu Ngô.................................................................................... 36
Bảng 6 (tiếp): Đặc điểm nông sinh học của các dòng ngô trong vụ Xuân 2014
tại Viện Nghiên cứu Ngô............................................................................... 37
Bảng 7: Kết quả hệ số tương đồng di truyền của đề tài và một số nghiên cứu
khác............................................................................................................... 44
Bảng 8: Nồng độ và độ tinh sạch DNA tổng số của 28 dòng ngô .................. 47

Bảng 9: Thống kê số alen và hệ số PIC của 27 mồi SSR ............................... 50
Bảng 10: So sánh kết quả số allen/mồi SSR của đề tài và của ABIONETCIMMYT................ ...................................................................................... 51
Bảng 11: Tỷ lệ dị hợp tử và tỷ lệ khuyết số liệu của 28 dòng ngô.................. 53
Bảng 12: Hệ số tương đồng di truyền giữa các dòng ngô thông qua phân tích
chỉ thị SSR..................................................................................................... 55
DANH MỤC HÌNH:
Hình 1: Thí nghiệm so sánh khả năng chịu hạn của các dòng ngô trong vụ
Đông 2013 tại Viện Nghiên cứu Ngô ............................................................. 32
Hình 2: Hình thái cây của một số nguồn dòng ngô vụ Xuân 2014 tại Viện
Nghiên cứu Ngô ............................................................................................. 40

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page viii


Hình 3: Hình thái bắp của một số nguồn dòng ngô vụ Xuân 2014 tại Viện
Nghiên cứu Ngô ............................................................................................. 41
Hình 4: Sơ đồ phả hệ của 28 dòng ngô thông qua phân tích các đặc điểm hình
thái, nông học ................................................................................................. 45
Hình 5: Ảnh điện di DNA tổng số của 28 dòng ngô trên gel agarose 0.8%..... 46
Hình 6.1: Ảnh điện di sản phẩm SSR-PCR với mồi Phi374118 ...................... 47
Hình 6.2: Ảnh điện di sản phẩm SSR-PCR với mồi Phi101049 ...................... 48
Hình 6.3: Ảnh điện di sản phẩm SSR-PCR với mồi Phi227562 ...................... 48
Hình 6.4: Ảnh điện di sản phẩm SSR-PCR với mồi Phi109118 ...................... 48
Hình 7: Sơ đồ phả hệ của 22 nguồn dòng ngô thông qua phân tích chỉ thị phân
tử SSR ............................................................................................................ 54
Hình 8: Thống kê hệ số tương đồng di truyền của các dòng ngô .................... 56

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page ix


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Cây ngô (Zea mays L.) là một trong ba loại cây lương thực quan trọng
hàng đầu (lúa mì, lúa gạo và ngô) trên thế giới. Ở Việt Nam, ngô là cây lương
thực quan trọng đứng thứ 2 sau cây lúa và là nguyên liệu chính để sản xuất
thức ăn chăn nuôi (Trương Vĩnh Hải, 2012). Sản xuất ngô của Việt Nam hiện
chưa đáp ứng được nhu cầu trong nước, hàng năm nước ta vẫn phải nhập
khẩu hàng triệu tấn ngô hạt. Theo số liệu của Tổng cục hải quan về nhập khẩu
ngô, trong năm 2013 Việt Nam đã nhập gần 2.2 triệu tấn ngô, với tổng trị giá
lên tới gần 675 triệu đô la (Tổng Cục Hải quan, 2013). Mặt khác, khó khăn
trong phát triển trồng ngô ở Việt Nam là 80% diện tích sản xuất ngô nhờ nước
trời, nhiều vùng đất dốc, nghèo dinh dưỡng, năng suất ngô thiếu ổn định, tình
trạng giảm năng suất do hạn là rất lớn, ước tính sản lượng ngô thiệt hại do hạn
năm 2010 lên tới 30% (Dương Đình Tường, 2010).
Những năm qua, công tác chọn tạo giống ngô lai chịu hạn, ngắn ngày
được các nhà khoa học trong nước tập trung nghiên cứu; một số giống ngô
chịu hạn do Viện nghiên cứu Ngô tạo ra đã đưa vào sản xuất và thu được kết
quả cao như: LVN4, LVN99, LVN145, LVN885, LVN25, VN5885. Tuy
nhiên, kết quả chọn tạo giống ngô chín sớm, chịu hạn vẫn còn hạn chế. Để
phát triển sản xuất ngô ổn định cần phải đa dạng hóa bộ giống, chọn tạo
những bộ giống ngô ngắn ngày, chịu hạn phù hợp với các vùng sinh thái khác
nhau ở Việt Nam.
Trong công tác chọn tạo giống ngô lai, thông tin về đa dạng di truyền
của nguồn vật liệu là hết sức cần thiết cho chương trình chọn tạo giống.
Những thông tin di truyền ở mức hình thái (kiểu hình) và mức phân tử (kiểu
gen) sẽ giúp các nhà chọn giống đánh giá và chọn lọc nguồn vật liệu, thiết kế

sơ đồ lai tạo, rút ngắn thời gian chọn tạo giống mới, nhằm đưa nhanh ra

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 1


những bộ giống đáp ứng kịp thời nhu cầu sản xuất. Vì vậy chúng tôi thực hiện
đề tài: “Đánh giá đa dạng di truyền nguồn vật liệu ngô phục vụ công tác
chọn tạo giống ngô lai chín sớm, chịu hạn”.

2. Mục đích, yêu cầu của đề tài
2.1. Mục đích
Đánh giá đa dạng di truyền của các dòng ngô thuần ở mức hình thái, và
phân tử đồng thời thiết kế sơ đồ lai tạo các tổ hợp lai phục vụ công tác chọn
tạo giống ngô lai chín sớm, chịu hạn.

2.2. Yêu cầu
• Đánh giá đặc điểm nông sinh học các dòng ngô dùng phục vụ công
tác chọn giống ngô lai chín sớm, chịu hạn
• Đánh giá đa da dạng di truyền nguồn các dòng ngô phục vụ công tác
chọn tạo giống ngô lai chín sớm, chịu hạn và định hướng lai tạo
THL cho công tác chọn tạo giống tiếp theo

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
• Cung cấp thêm thông tin về đặc điểm di truyền của các dòng ngô
dùng trong nghiên cứu.
• Bổ sung thông tin hữu ích, có giá trị tham khảo trong phương pháp
đánh giá đa dạng di truyền nguồn gene ngô và khả năng ứng dụng
trong công tác chọn tạo giống ngô lai ở Việt Nam.

• Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ hỗ trợ công tác chọn tạo giống ngô
chín sớm, chịu hạn, giúp giảm khối lượng công việc đánh giá vật
liệu và rút ngắn thời gian tạo giống.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 2


Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Tổng quan về cây ngô

1.1.1. Giới thiệu chung về cây ngô
Theo hệ thống phân loại khoa học cây ngô thuộc giới thực vật, ngành
Magnoliophyta, lớp Liliopsida, bộ Poales, họ Poaceae, chi Zea, loài Zea
mays L. (Trung tâm dữ liệu thực vật Việt Nam, 2014). Kích thước bộ genome
của cây ngô khoảng 2.4 Gbp; bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội 2n=10
(Ensemblplants, 2014). Dựa vào cấu trúc nội nhũ của hạt, ngô được phân
thành 7 loài phụ: ngô đá, ngô răng ngựa, ngô nếp, ngô đường, ngô nổ, ngô
bột, ngô bọc.
Phổ thích nghi của cây ngô rất rộng, các nhà khoa học CIMMYT cho
rằng trên phạm vi toàn thế giới có 4 vùng sinh thái trồng ngô chính: vùng ôn
đới, cận nhiệt đới, vùng nhiệt đới cao (trên 2000 m so với mực nước biển) và
vùng nhiệt đới thấp (dưới 2000 m so với mực nước biển). Ở Việt Nam ngô là
cây trồng cạn, có thể trồng ở hầu hết các vùng sinh thái trên cả nước, trừ diện
tích đất không có khả năng luân canh với cây trồng cạn (Đường Hồng Dật,
2004).
Thời gian sinh trưởng (TGST) của cây ngô dài, ngắn khác nhau phụ

thuộc vào giống và từng vùng sinh thái. Trung bình TGST từ khi gieo đến khi
chín là 90 - 160 ngày. Theo quy phạm khảo nghiệm giá trị canh tác và giá trị
sử dụng, giống ngô 10TCN 341 : 2006, các giống ngô được phân nhóm theo
thời gian sinh trưởng như sau:
Vùng
Nhóm giống

Phía Bắc ( vụ
Xuân)

Tây Nguyên (vụ
Hè)

Duyên hải miền Trung
và Nam Bộ (vụ Hè)

Chín sớm
Chín trung bình
Chín muộn

Dưới 105 ngày
105 - 120 ngày
Trên 120 ngày

Dưới 95 ngày
95 - 110 ngày
Trên 110 ngày

Dưới 90 ngày
90 - 100 ngày

Trên 100 ngày

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 3


1.1.2. Giá trị của cây ngô
Ngô là cây ngũ cốc quan trọng có giá trị kinh tế cao, đứng thứ ba sau
lúa mì và lúa gạo. Sản lượng ngô sản xuất hàng năm góp phần nuôi sống gần
1/3 dân số trên toàn cầu. Ngô được sử dụng chủ yếu làm thức ăn cho gia súc,
lương thực, thực phẩm cho người, nguyên liệu cho công nghiệp (rượu ngô,
sản xuất ethanol để chế biến xăng sinh học, thậm chí còn còn chế biến tạo ra
một số vật dụng đồ dùng như điện thoại, đồ trang sức của phụ nữ…). Ngoài
ra, một số bộ phận của ngô có chứa các chất có vai trò như một loại thuốc
chữa bệnh, làm chất đốt (Ngân hàng kiến thức trồng ngô, 2014).
1.2

Ảnh hưởng của hạn đối với sản xuất ngô

Hạn cũng giống như các nhân tố stress khác, đều có ảnh hưởng xấu đến
năng suất cây trồng. Chịu hạn trong nông nghiệp ám chỉ khả năng cây trồng
sinh trưởng phát triển và sản xuất mang lại hiệu quả kinh tế trong điều kiện
hạn chế về nguồn nước (Fischer và cs, 1982). Ngô là cây quang hợp C4 và tạo
lượng sinh khối rất cao trong quá trình sinh trưởng phát triển.Trong suốt chu
kỳ sống 80-110 ngày, ngô cần 500-800 ml nước. Yêu cầu nước của ngô trong
giai đoạn trỗ cờ là 135 ml nước/tháng (4.5 ml nước/ngày), nhu cầu nước có
thể tăng lên 195 ml nước/tháng (6.5 ml nước/ngày) ở điều kiện gió nóng
(Jamieson và cs, 1995). Theo như khái niệm hạn của Fischer và cộng sự
(1982) thì bất cứ khi nào nhu cầu nước của cây ngô không được đáp ứng với

lượng cần thiết tương ứng với từng giai đoạn sinh trưởng có nghĩa là đã trải
qua thời kỳ hạn.
Đối với sản xuất ngô ở vùng nhiệt đới như các nước Châu Á và ở vùng
ôn đới như Mỹ và các nước Châu Âu thì hạn là nhân tố stress phi sinh học
quan trọng nhất gây hạn chế và mất ổn định trong sản xuất ngô hạt
(Edmeades, 2013). Năng suất ngô trong điều kiện khô hạn sụt giảm nhiều hay
ít tùy thuộc vào thời điểm xảy ra hạn hán (Heinigre, 2000). Hạn có ảnh hưởng
nhiều nhất đến năng suất ngô ở giai đoạn thụ phấn (trỗ cờ phun râu) ở mức
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 4


trung bình 6.8% năng suất/ngày, thứ 2 là giai đoạn vào chắc hạt ở mức trung
bình 4.0-4.2% năng suất/ngày ( />Tỷ lệ đất trồng trọt có tưới tiêu ở các quốc gia trên thế giới là rất thấp,
hầu hết ở dưới 10% ngoại trừ Mỹ 14%, Trung Quốc 40% và Egypt gần 100%.
Vì vậy hạn hán là yếu tố quan trọng mà tất cả các quốc gia sản xuất nông
nghiệp cần phải quan tâm. Hàng năm, hạn hán gây thất thu khoảng 15% tiềm
năng sản lượng ngô trong điều kiện tưới tiêu tốt, tương đương với 120 triệu
tấn ngũ cốc. Sản xuất toàn cầu ước tính bị mất hàng năm do tác hại của hạn
vào đầu những năm 1990 ở những vùng trồng ngô không phải là vùng ôn đới
khoảng 19 triệu tấn, giảm khoảng 15% sản lượng. Sản xuất ngô bị thiệt hại có
thể còn nghiêm trọng hơn nhiều, tác hại do tình trạng hạn hán gây ra ở các
nước Châu Phi giai đoạn 1991 – 1992 đã làm giảm sản lượng ngô khoảng
60%. Thiệt hại sản lượng ngô do hạn ở Mỹ, nước sản xuất 38% sản lượng ngô
thế giới năm 2012 là 21%. 27 quốc gia Châu Âu sản lượng ngô bị mất do hạn
là 12.5% (Edmeades, 2013). Hạn gây mất ổn định về sản lượng ngô ở đa số
vùng bán sa mạc Châu Phi, nơi điều kiện tưới tiêu không khả thi. Theo báo
Nông Nghiệp 19/7/2010, ước tính sản lượng ngô thiệt hại do hạn ở Việt Nam
lên tới 30% vì trên 80% diện tích ngô trồng trong điều kiện không tưới (0.60.7 triệu ha) (Dương Đình Tường, 2010).

Khi nguồn nước sử dụng trong nông nghiệp ngày càng hạn chế, sự phát
triển các giống chịu hạn có ý nghĩa hết sức quan trọng. Trong điều kiện hạn,
giống ngô cải tiến có thể thu hẹp được 15 – 25% năng suất chênh lệch. Cùng
với giống, nếu biện pháp kỹ thuật canh tác được cải tiến hiệu quả thì có thể
khắc phục thêm 15 – 25% nữa. Phần năng suất giảm còn lại chỉ có thể vượt
qua được nhờ nước tưới (Bänziger và Lafitte, 1997).

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 5


1.3.

Nghiên cứu đa dạng di truyền.

1.3.1. Đa dạng di truyền.
Đa dạng di truyền là toàn bộ các đặc điểm di truyền của một loài hoặc
một chi (Rauf và cs, 2010). Sự mất đa dạng di truyền ở bất kỳ một quần thể
nào có thể hạn chế cơ hội sống sốt của quần thể đó và đòi hỏi con người phải
lỗ lực nhiều hơn trong hoạt động sản xuất nông nghiệp để đảm bảo sản xuất
có kết quả tốt (Trethowan và Mujeeb-Kazi 2008). Nhiều nhà nghiên cứu chỉ
ra giá trị của đa dạng di truyền trong việc cung cấp hàng rào di truyền chống
lại stress sinh học và phi sinh học (Adeyemo và cs, 2012). Nghiên cứu đa
dạng di truyền là yếu tố quyết định thành công trong lai giống thực vật. Đa
dạng di truyền giúp nhận biết khả năng kết hợp có ý nghĩa của nguồn vật liệu
cây bố mẹ trong lai giống để tạo ra con lai có tiềm năng di truyền tối đa
(Aremu, 2011). Trong nghiên cứu đa dạng di truyền có thể sử dụng nguồn dữ
liệu khác nhau để đánh giá như dữ liệu hình thái, dữ liệu hóa sinh (protein) và
dữ liệu phân tử.

1.3.2. Nghiên cứu đa dạng di truyền sử dụng dữ liệu hình thái
Các đặc điểm hình thái trong phân loại sinh vật được sử dụng từ rất
sớm. Nguyên tắc cơ bản của phương pháp này là: hai đơn vị phân loại (taxon)
càng có nhiều đặc điểm chung, càng giống nhau thì quan hệ giữa hai taxon
càng gần gũi nhau. Người ta thường kết hợp nhiều đặc điểm để làm tăng giá
trị tin cậy của kết quả so sánh. Các chỉ thị hình thái có ưu điểm là tiện lợi,
nhanh chóng, kinh tế, nhưng việc lựa chọn và cân nhắc giá trị sử dụng các đặc
điểm phân loại là một trong những khâu khó khăn nhất, không chỉ đòi hỏi
kiến thức mà còn đòi hỏi kinh nghiệm và sự khéo léo của các nhà phân loại
học.
Dữ liệu hình thái là chỉ thị tốt cho nghiên cứu đa dạng di truyền nhưng
đôi khi có thể gây nhầm lẫn do chịu ảnh hưởng của điều kiện môi trường khác
nhau (Fairbanks và Andersen, 1996).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 6


1.3.3. Nghiên cứu đa dạng di truyền sử dụng chỉ thị hóa sinh
Dữ liệu protein được sử dụng trong đánh giá đa dạng di truyền phổ biến
là dữ liệu của các isozyme. Isozyme là các enzyme cùng thực hiện xúc tác cho
một loại phản ứng đặc thù. Cho đến nay chỉ thị isozyme đã được sử dụng
nhiều thập kỷ để ước lượng khoảng cách di truyền (Tanksley, 1983). Chỉ thị
isozyme thể hiện bản chất tự nhiên của enzyme do có sự khác nhau nhỏ trong
trình tự aminoacid và gây ra sự di chuyển khác nhau trường diện di. Sự khác
nhau về chuyển động điện của các isozyme thể hiện sự khác nhau cơ bản
trong DNA mã hóa cho enzyme. Mỗi enzyme chiếm một locus khác nhau
trong genome. Vài isozyme được phân tích sự giống nhau và khác nhau về
chuyển động điện có thể so sánh sự khác nhau về di truyền trong số các kiểu
gen cần kiểm tra. Isozyme được sử dụng hiệu quả trong nhiều nghiên cứu,

thường có hiệu quả hơn khi sử dụng để so sánh mối quan hệ giữa các loài hơn
là dùng đánh giá đa dạng di truyền trong cùng một loài và mỗi isozyme yêu
cầu phương pháp khác nhau để phát hiện vì vậy sử dụng isozyme trong
nghiên cứu đồng nghĩa với việc phải có nhiều trang thiết bị, nắm được nhiều
kỹ thuật phân tích tương ứng với mỗi enzym đó (Fairbanks và Andersen,
1996). Đối với dữ liệu về isozyme tương đối ít và thường biểu hiện ở những
giai đoạn phát triển nhất định là khó khăn cho các nhà nghiên cứu. Ngày nay
việc sử dụng dữ liệu isozyme trong đánh giá đa dạng di truyền ở thực vật so
với các phương pháp khác như dữ liệu hình thái và chỉ thị phân tử có phần
hạn chế hơn.
1.3.4. Nghiên cứu đa dạng di truyền sử dụng chỉ thị phân tử
Hiện nay, dữ liệu phân tử được sử dụng phổ biến trong đánh giá đa
dạng di truyền. Phương pháp phân tử sử dụng phương thức phân tích đơn giản
cho tất cả các loại chỉ thị DNA và có ưu điểm vượt trội hơn phân tích isozyme
trong đánh giá đa dạng di truyền vì có thể phân tích số lượng lớn các chỉ thị
khi so sánh các kiểu gen (Fairbanks và Andersen, 1996). Sự phát triển các
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 7


công cụ chỉ thị phân tử gắn liền với sự phát triển của ngành di truyền phân tử
và công nghệ sinh học. Ứng dụng của các chỉ thị phân tử trong chọn giống
thực vật có thể chia làm 3 loại chính:
-Xác định đặc trưng của kiểu gen bằng phương pháp lấy dấu vân tay
DNA.
-Phân tích di truyền của các tính trạng mục tiêu, nhận biết vùng
genome 8equ quan đến sự biểu hiện của tính trạng mục tiêu
-Cải tiến giống cây trồng thông qua sự hỗ trợ chọn lọc của chỉ thị phân
tử (MAS).

Cơ sở của hai ứng dụng đầu tiên là tiền đề cho nghiên cứu đa dạng di
truyền các kiểu gen, do đó cho phép nhóm các kiểu gen vào các nhóm ưu thế
lai và giúp hiểu biết hơn về di truyền của các tính trạng nông học quan tâm
(Ribaut và cs, 2002).
Các chỉ thị phân tử được phát triển khá đa dạng, trong đó được ứng
dụng phổ biến trong đánh giá đa dạng di truyền thực vật như: dữ liệu các chỉ
thị RFLP (restriction fragment lengthpolymorphisms) được phát minh bởi
Botstein và cộng sự năm 1980), RAPD (random amplified polymorphic
DNA) được phát minh bởi Williams và cộng sự năm 1990, AFLP (amplified
fragment length polymorphisms) được phát minh bởi Zabeau và Vos năm
1993, và dữ liệu các chỉ thị SSR (simple sequence repeats) được phát minh
bởi Tautz năm 1989 (Garcia và cs, 2004).
a)

Chỉ

thị

phân

tử

RFLP

(Restriction

Fragment

Length

Polymorphisms)
Kỹ thuật RFLP là chỉ thị đồng trội, thực hiện dựa trên cơ sở phương
pháp lai Southern, sử dụng trình tự bảo thủ đặc trưng cho từng locus của loài
để thiết kế mẫu dò. Các đa hình RFLP sinh ra bởi đột biến tự nhiên ở những
điểm nhận biết của cắt enzyme giới hạn trong hệ gen (Lã Tuấn Nghĩa và cs,
2004).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 8


Mỗi một loài sinh vật có một bộ DNA đặc hiệu trong cấu trúc, sự thay
đổi, mất đi hay thêm vào các nucleotide khác nhau tùy thuộc vào đặc điểm
riêng của mỗi họ, giống, loài, thậm chí mỗi cá thể. Vì vậy khi dùng enzyme
cắt giới hạn để cắt phân tử DNA hệ gen của các đối tượng khác nhau, nếu như
có đa hình các đoạn cắt hạn chế thì các đoạn DNA cần kiểm tra đa hình (các
đoạn DNA có đoạn trình tự bổ sung với DNA mẫu dò) ở các đối tượng sau
khi bị cắt sẽ có chiều dài khác nhau. Sau đó dùng kỹ thuật lai Southern người
ta có thể nhận biết được những đoạn DNA có chiều dài khác nhau này.
Chỉ thị RFLP có độ chính xác cao nhưng do thực hiện dựa trên cơ sở
kỹ thuật lai Southern nên khá phức tạp và tốn thời gian.
b)

Chỉ thị RAPD (Random amplified polymorphic DNA).

RAPD nghĩa là kỹ thuật nhân ngẫu nhiên đa hình các đoạn DNA sử
dụng mồi đơn dựa trên cơ sở phản ứng PCR. Kỹ thuật RAPD sử dụng những
đoạn mồi ngắn (khoảng 10 nucleotide) được tổng hợp ngẫu nhiên. Trong phản
ứng PCR, các mồi RAPD gắn vào DNA khuôn ở bất kỳ vị trí nào có trình tự
bổ sung với nó. Sản phẩm PCR được chạy điện di trên gel agarose 2% nhuộm

cùng EtBr để phân tách các băng DNA và phát hiện các băng DNA dưới tia
9equ của đèn cực tím (Lã Tuấn Nghĩa và cs, 2004). Do tính ngẫu nhiên nên
có thể có rất nhiều băng DNA đa hình có kích thước khác nhau được nhân
bản sau phản ứng PCR phụ thuộc vào trình tự mồi và thời gian kéo dài phản
ứng. Chỉ thị phân tử RAPD trong đánh giá tính đa dạng di truyền chính là dựa
vào việc phân tích, so sánh các đoạn DNA đa hình của các đối tượng nghiên
cứu để thấy được sự giống và khác nhau trong cấu trúc genome của mỗi đối
tượng.
Chỉ thị RAPD là chỉ thị trội bởi nó biểu hiện sự có mặt hay vắng mặt
những băng DNA, vì vậy không phân biệt được thể đồng hợp tử hay dị hợp
tử. Ưu điểm của RAPD là không cần phải biết trước thông tin về trình tự

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 9


DNA để thiết kế mồi, rẻ tiền, nhanh gọn. Tuy nhiên do sử dụng mồi ngắn và
nhiệt độ bắt cặp thấp (khoảng 34-37oC) nên độ chính xác kém.
c)

Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms)

AFLP có nghĩa là đa hình độ dài các đoạn DNA được khuếch đại chọn
lọc. Kỹ thuật này được phát triển trên nguyên lý PCR để nhân bản những
đoạn DNA đã được cắt bằng enzyme cắt giới hạn. Điểm cơ bản nhất của kỹ
thuật này là sự thiết kế mồi PCR đặc trưng (Lã Tuấn Nghĩa và cs, 2004).
Quy trình thiết kế mồi đặc trưng như sau:
Bước 1: DNA được cắt bằng enzyme cắt giới hạn, thường là enzyme
EcoRI (nhận biết 6 nucleotide) và MseI (nhận biết 4 nucleotide), tạo thành vô

số mảnh DNA có kích thước khác nhau, mỗi mảnh đều biết trước trình tự
nucleotide hai đầu đoạn cắt
Bước 2: Dựa vào trình tự ở hai đầu đoạn cắt, thiết kế các đoạn gắn
(adapter) và gắn chúng vào mỗi đầu.
Bưới 3: Dựa vào trình tự adapter, người ta thiết kế mồi PCR. Mồi gồm
2 phần: một phần có trình tự nucleotide bổ sung với adapter và phần kia là
những nucleotide được thêm vào tùy ý, thông thường từ 1-3 nucleotide.
Kỹ thuật AFLP được phát triển bởi sự kết hợp các yếu tố kỹ thuật
RFLP và phản ứng PCR để nhân các đoạn DNA được cắt bởi enzyme cắt giới
hạn. Sản phẩm PCR của mỗi mồi ở mỗi mẫu nghiên cứu sẽ xuất hiện băng
DNA nếu không có đột biến tại điểm cắt của enzyme cắt giới hạn và có trình
tự nucleotide bổ sung với trình tự được thêm vào của mỗi cặp mồi, ngược lại
sẽ không xuất hiện băng DNA.
Về cơ bản AFLP là chỉ thị trội, có khả năng đánh giá đa hình trên toàn
bộ genome. Tuy nhiên kỹ thuật AFLP cũng giống như kỹ thuật RFLP khá
phức tạp và tốn nhiều thời gian.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 10


d)

Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeats)

SSR là kỹ thuật khuếch đại các đoạn trình tự lặp lại đơn giản, các trình
tự lặp lại đơn giản khá phổ biến trong bộ gen của sinh vật nhân chuẩn. Các
nhóm nucleotide lặp lại này thường có trình tự không vượt quá 5 nucleotide
như (TG)n hoặc (AAT)n. Những đoạn DNA lặp lại như vậy được gọi là

microsateline hay còn có tên khác như: SSLPs (single 11equence length
polymorphisms), SSR (simple sequence repeats), STRs (Simple Tandem
Repeats) có trình tự hai đầu đặc trưng cho mỗi đoạn, bởi vậy trình tự đặc
trưng cho mỗi đầu của đoạn lặp lại này được sử dụng để thiết kế mồi cho
phản ứng PCR (Lã Tuấn Nghĩa và cs, 2004).
Vùng có DNA lặp lại thường kém ổn định hơn các vùng khác; các cá
thể khác nhau, trình tự đó được lặp lại với số lần khác nhau là nguyên nhân
phát sinh tính đa hình.
Các đa hình SSR được sinh ra do mồi SSR khuếch đại vùng DNA lặp
lại có trình tự bổ sung với hai đầu của vùng này trong phản ứng PCR và phát
hiện các băng SSR đa hình thông qua điện di, nhuộm huỳnh quang sau đó
quan sát dưới đèn cực tím.
Kỹ thuật SSR đơn giản, tiện lợi và rất hữu ích trong nghiên cứu
genome vì chúng được thiết kế mồi dựa trên những vùng mã hóa có tính bảo
thủ cao trong hệ gen (Varshney và cs, 2005). Hơn nữa chỉ thị SSR thường chỉ
khuếch đại các locus đặc trưng cho sự đa dạng của các loài trong 1 chi, đôi
khi 1 họ (Plaschke và cs, 1995). Tuy nhiên nhược điểm của chỉ thị này là quá
trình thiết kế mồi rất tốn kém.
1.4.

Nghiên cứu đa dạng di truyền trên đối tượng cây ngô

Các công cụ sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền cây ngô khá
phổ biến gồm chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử DNA.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 11

1.4.1. Nghiên cứu đa dạng di truyền cây ngô sử dụng chỉ thị hình
thái.
Cây ngô biểu hiện tính đa dạng rất cao về đặc điểm hình thái và sinh lý.
Sự tồn tại lâu dài được tác động bởi nhiều thế hệ loài người gieo trồng ở các
vùng miền trên trái đất đã làm tăng mức độ khác biệt, tăng biên độ thay đổi
đặc tính của cây ngô. Đa dạng di truyền của cây ngô được thể hiện ở tất các
tính trạng của cây, bông cờ và bắp, loài phụ (ngô đá, ngô răng ngựa, ngô nếp,
ngô thường, ngô nổ, ngô bột, ngô bọc). Đặc biệt sự biến động lớn nhất ở cây
ngô thể hiện ở cấu trúc nội nhũ của hạt; vì vậy việc phân loại thực vật cây
trồng này một phần dựa vào đặc điểm của hạt.
Ngày nay cùng với sự ra đời và phát triển của ứng dụng chỉ thị phân tử
thì chỉ thị hình thái vẫn được cho là không thể thiếu trong nghiên cứu đa dạng
di truyền cây ngô, phục vụ công tác lưu giữ, bảo tồn sự đa dạng di truyền
nguồn gen cho các chương trình lai tạo giống ngô lai.
Ranatunga và cs (2009) đã phân tích đa dạng di truyền của 43 dòng ngô
thông qua 8 tính trạng chất lượng và 10 tính trạng số lượng. Tám tính trạng
chất lượng dùng trong nghiên cứu gồm: màu của mày bao phấn, màu râu, màu
lá, lớp lông bẹ lá, dạng bắp, màu hạt, dạng hạt, dạng đỉnh hạt. Trong 8 tính
trạng, tính trạng lớp lông bẹ lá không cho kết quả đa hình trong số 43 dòng
ngô, tính trạng màu râu, dạng bắp, màu hạt, dạng đỉnh hạt, dạng hạt có mức
độ khác nhau về kiểu hình rất dễ nhận thấy. Kết quả phân tích cụm 43 dòng
ngô thông qua các tính trạng số lượng tạo thành 2 nhóm chính: nhóm một
gồm 19 kiểu gen và nhóm còn lại gồm 24 kiểu gen. Hệ số tương đồng di
truyền dao động từ 0.22-0.78. Mười tính trạng số lượng dùng đánh giá đa
dạng di truyền 43 dòng ngô gồm: số nhánh cờ, chiều cao cây, chiều cao đóng
bắp, ngày trỗ cờ, ngày phun râu, dài bắp, đường kính bắp, số hàng hạt, số
hạt/hàng, khối lượng 1000 hạt. Kết quả 43 nguồn gen ngô phân thành 2 nhóm,
nhóm một gồm 39 kiểu gen và nhóm hai gồm 4 kiểu gen.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 12


Beyene và cs (2005) nghiên cứu mối quan hệ di truyền giữa các nguồn
vật liệu ngô bản địa của Ethiopian bằng phương pháp hình thái với 15 tính
trạng cho giá trị khoảng cách di truyền giữa các kiểu gene dao động từ 0.10.68, trung bình 0.3.
Ngô Hữu Tình và cs (1996) đã dựa trên những tính trạng số lượng của
tập đoàn các giống ngô địa phương để phân tích chúng thành các nhóm khác
nhau: 18 giống đá vàng miền Bắc phân thành 3 nhóm cách biệt di truyền. 10
giống đá vàng miền Nam được phân thành 4 nhóm. 11 giống đá trắng miền
Bắc được phân thành 3 nhóm. 14 giống nếp trắng miền Bắc được phân thành
3 nhóm. 28 giống nếp trắng miền Nam được phân thành 4 nhóm. 11 giống
nếp vàng Việt Nam được phân thành 3 nhóm. 10 giống nếp tím Việt Nam
phân thành 3 nhóm. 9 giống ngô nổ Việt Nam phân thành 2 nhóm.
Dựa trên 13 chỉ tiêu hình thái Mai Xuân Triệu đã đánh giá đa dạng di
truyền và phân nhóm ưu thế lai của 24 dòng ngô có nguồn gốc khác nhau. Kết
quả 24 dòng ngô thuần được phân thành 4 nhóm (Mai Xuân Triệu, 1998).
Khuất Hữu Trung (2009) cũng đã tiến hành nghiên cứu đa dạng di
truyền ở mức hình thái 78 dòng ngô thuần chọn tạo bằng phương pháp nuôi
cấy bao phấn. Kết quả phân tích đã chỉ ra hệ số tương đồng di truyền giữa các
cặp dòng ngô trong cả tập đoàn dao động 0.13-0.52. 78 dòng ngô được phân
thành 4 nhóm khác nhau.
1.4.2. Nghiên cứu đa dạng di truyền cây ngô sử dụng chỉ thị phân
tử.
Sử dụng chỉ thị phân tử trong phân tích đa dạng di truyền cây ngô có
thể được thực hiện bởi các kỹ thuật khác nhau: RFLP, RAPD, AFLP, SSR…
mỗi kỹ thuật có ưu điểm và nhược điểm riêng. Lựa chọn loại chỉ thị phân tử
nào trong đánh giá đa dạng di truyền cây ngô sẽ phụ thuộc vào độ chính xác,
mức độ phức tạp của từng kỹ thuật, giá thành và điều kiện trang thiết bị của
từng phòng thí nghiệm.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 13


Li và cs (2004) đã đánh giá đa dạng di truyền của 60 dòng ngô có
nguồn gốc từ Ý và Trung Quốc sử dụng 20 mồi AFLP, kết quả thu được 487
băng DNA đa hình, trung bình mỗi mồi AFLP khuếch đại 24.4 băng DNA đa
hình. Kết quả phân tích cụm của 60 dòng ngô này có thể phân thành 5 nhóm
và cả 5 nhóm hầu hết phù hợp phân thành các nhóm ưu thế lai.
Adeyemo và cs (2012) đánh giá đa dạng di truyền của 38 dòng ngô
nhiệt đới sử dụng 85 chỉ thị SSR. 75/85 chỉ thị SSR dùng để đánh giá cho kết
quả đa hình ở 38 dòng ngô và khuếch đại tổng số 297 allen. Giá trị PIC
(polymorphic information content) thu được từ các mồi cho đa hình dao động
từ 0.17-0.84 với giá trị trung bình 0.56. Số allen đa hình trên một locus dao
động trong khoảng từ 2-11, trung bình là 3.96. Giá trị khoảng cách di truyền
trong tất cả các cặp dòng ngô từ 0.007–0.59, với giá trị trung bình 0.45. Kết
quả phân tích cụm dựa trên dữ liệu SSR chia 38 dòng ngô thành 2 nhóm chính
phù hợp với nguồn gốc các dòng.
Carvalho và cs (2004) sử dụng 32 chỉ thị RAPD để phân tích đa dạng di
truyền của 81 kiểu gen; kết quả khuếch đại 255 băng DNA trong đó có 184
băng đa hình chiếm 72.2%, hệ số tương đồng di truyền từ 0.78-0.9. Dữ liệu
RAPD phân tích bằng phương pháp UPMGA cho kết quả 81 kiểu gen phân
làm 2 nhóm chính có mối tương quan với màu sắc hạt.
Tương tự, Benchimol và cs (2000) đã đánh giá đa dạng di truyền các
dòng ngô nhiệt đới gồm 8 dòng có nguồn gốc từ Thái Lan và 10 dòng có
nguồn gốc từ Brazil sử dụng 185 mẫu dò/emzym thu được 973 băng đa hình,
trung bình 5.26 allen/locus.
Trên đối tượng cây ngô đã có số lượng khá phong phú các locus SSR
cùng với thông tin trình tự mồi công bố trên cơ sở dữ liệu của cây ngô Maize

GDB (Maize Genetics DNA Genomics Database) là thuận lợi cho các nhà
nghiên cứu.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 14