nghiên cứu bảo tồn quỹ gen virus cường độc dịch tả vịt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
-----------

-----------

NGUYỄN THỊ VINH THỦY

NGHIÊN CỨU BẢO TỒN QUỸ GEN
VIRUS CƯỜNG ĐỘC DỊCH TẢ VỊT

CHUYÊN NGÀNH : THÚ Y
MÃ SỐ

: 60.64.01.01

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. SỬ THANH LONG

HÀ NỘI – 2014


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tôi trực tiếp thực hiện
cùng với sự hướng dẫn của TS. Sử Thanh Long– Học viện Nông nghiệp Việt
Nam. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được
ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã
được chỉ rõ nguồn gốc. Mọi sự giúp đỡ đã được cảm ơn.
Hà Nội, tháng 10 năm 2014
Học viên

Nguyễn Thị Vinh Thủy

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page i


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành bản luận văn này, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi còn
nhận được nhiều sự quan tâm giúp đỡ của các cá nhân và tập thể.
Lời đầu tiên, tôi xin nói lời cảm ơn chân thành nhất tới TS. Sử Thanh
Long, PGS.TS. Nguyễn Bá Hiên – những người Thầy đã tận tình giúp đỡ tôi
trong suốt thời gian thực hiện đề tài, cũng như trong quá trình hoàn chỉnh luận
văn tốt nghiệp.
Đồng thời, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô trong bộ môn Ngoại
sản, bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm cũng như các thầy, cô trong khoa
Thú y đã tạo mọi điều kiện giúp tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể các thầy, cô giáo đã giảng dạy
tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của Trạm Thú y huyện Mê Linh,
Cán bộ lãnh đạo và nhân dân các xã, thị trấn thuộc huyện Mê nơi tôi tiến hành
điều tra nghiên cứu đề tài, đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho
tôi thực hiện đề tài này.
Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp
đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường.

Hà Nội, tháng 10 năm 2014
Học viên

Nguyễn Thị Vinh Thủy

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page ii


MỤC LỤC

Lời cam đoan

i

Lời cảm ơn

ii

Mục lục

iii

Danh mục các chữ viết tắt

vi

Danh mục bảng

vii

Danh mục hình

viii

MỞ ĐẦU

1

1

Tính cấp thiết của đề tài

1

2

Mục đích, yêu cầu

2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

1.1

Bệnh dịch tả vịt

3

1.1.1

Lịch sử và phân bố bệnh

3

1.1.2

Truyền nhiễm học

6

1.1.3

Triệu chứng và bệnh tích

7

1.1.4

Chẩn đoán

8

1.1.5

Biện pháp can thiệp và phòng bệnh dịch tả vịt

11

1.2

Virus gây bệnh dịch tả vịt

13

1.2.1

Hình thái, kích thước

14

1.2.2

Sức đề kháng

14

1.2.3

Độc lực

15

1.2.4

Đặc tính nuôi cấy

15

1.3

Miễn dịch chống virus dịch tả vịt

16

1.3.1

Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu

16

1.3.2

Các loại kháng thể chống virus dịch tả vịt

17

1.3.3

Độ dài miễn dịch

19

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page iii

Chương 2 NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

22

2.1

Nội dung nghiên cứu

22

2.1.1

Thu thập và phân lập virus dịch tả vịt cường độc từ vịt nhiễm
bệnh trong tự nhiên

2.1.2

22

Nghiên cứu đặc tính sinh học của các chủng virus dịch tả vịt
cường độc đã thu thập và phân lập được

22

2.1.3

Đánh giá lại chất lượng chủng virus dịch tả vịt cường độc VG-O4

22

2.2

Nguyên liệu

22

2.3

Phương pháp nghiên cứu

23

2.3.1

Phương pháp điều tra bệnh dịch tả vịt

23

2.3.2

Phân lập virus dịch tả vịt

23

2.3.3

Phương pháp xác định đặc tính sinh học của virus dịch tả vịt

23

2.3.3

Phương pháp xác định chỉ số EID50 (liều gây nhiễm 50% phôi)
của chủng virus dịch tả vịt.

2.3.4

24

Phương pháp xác định chỉ số LD50 (liều gây chết 50% động vật
thí nghiệm) của chủng virus cường độc dịch tả vịt cần kiểm tra.

25

2.3.5

Phương pháp giám định chủng virus dịch tả vịt bằng kỹ thuật PCR

25

2.4

Phương pháp xử lý số liệu

28

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1

29

Kết quả thu thập và phân lập virus dịch tả vịt cường độc được lấy
từ các bệnh phẩm ngoài tự nhiên

3.1.1

29

Tình hình dịch bệnh Dịch tả vịt tại huyện Mê Linh trong những
năm gần đây

29

3.1.2

Phân lập virus cường độc dịch tả vịt tại địa phương

39

3.1.3

Phân lập virus cường độc dịch tả vịt trên phôi vịt

41

3.2

Khảo sát một số đặc tính sinh học của virus dịch tả vịt cường độc

44

3.2.1

Khả năng thích ứng và ổn định của chủng virus dịch tả vịt trên
phôi vịt

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

44
Page iv


3.2.2

Kết quả xác định chỉ số ELD50 chủng virus cường độc dịch tả vịt

52

3.2.3

Kết quả xác định chỉ số EID50 của chủng virus cường độc dịch tả vịt

55

3.2.4

Kết quả xác định chỉ số LD50 của chủng virus cường độc dịch tả vịt

58

3.3

Giám định chủng virus cường độc dịch tả vịt ML- 14 bằng kỹ
thuật PCR

61

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

64

1

Kết luận

64

2

Đề nghị

65

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

66

Page v


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CPE

: Cytopathic pathogene effect

Cs

: cộng sự

DEF

: Duck Embryo Fibroblast

DEV

: Duck enteritis virus

DNA

: Dezoxy nucleic acid

DVE

: Duck virus enteritis

ELD50

: 50 percent Embryo Lethal Dose

EID50

: 50 percent Embryo Infective Dose

KIR

: Killer cell Inhibitory Receptor

LD50

: 50 percent Lethal Dose

MHC

: Major Histocompatibility Complex

OIE

: Office International des Epizooties

PBS

: Phosphate Buffered Saline

PCR

: Polymerase chain reaction

p

: page

SN

: Serum Neutralization

Tr

: trang

VSV-TN

: Vi sinh vật - Truyền nhiễm

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page vi


DANH MỤC BẢNG
STT

Tên bảng

Trang

1.1

Tình hình bệnh dịch tả vịt ở một số nước Châu Á

3.1

Kết quả điều tra tình hình bệnh Dịch tả vịt năm 2012 tại

5

huyện Mê Linh

32

3.2

Kết quả điều tra tình hình mắc bệnh Dịch tả vịt năm 2013

33

3.3

Kết quả điều tra tình hình mắc bệnh Dịch tả vịt 6 tháng đầu năm 2014

35

3.4

Kết quả phân lập virus cường độc dịch tả vịt trên vịt

41

3.5

Kết quả phân lập virus cường độc dịch tả vịt trên phôi vịt

43

3.6

Kết quả cấy truyền virus cường độc dịch tả vịt ML-14 trên phôi vịt

46

3.7

Kết quả cấy truyền virus cường độc dịch tả vịt VG-2004 trên
phôi vịt

3.8

49

Kết quả kiểm tra bệnh tích đại thể trên phôi sau khi gây nhiễm
virus cường độc dịch tả vịt VG-2004

3.9

51

Kết quả kiểm tra bệnh tích đại thể trên phôi sau khi gây nhiễm

virus cường độc dịch tả vịt phân lập tại Mê Linh

3.10

51

Kết quả xác định chỉ số ELD50 của chủng virus cường độc dịch tả
vịt VG-2004

3.11

53

Kết quả xác định chỉ số ELD50 của chủng virus cường độc dịch tả
vịt phân lập tại Mê Linh

3.12

54

Kết quả xác định chỉ số EID50 của chủng virus cường độc dịch tả
vịt VG-2004

3.13

56

Kết quả xác định chỉ số EID50 của chủng virus cường độc dịch tả
vịt ML-14

3.14

57

Kết quả xác định chỉ số LD50 của chủng virus cường độc dịch tả
vịt VG-04

3.15

59

Kết quả xác định chỉ số LD50 của chủng virus cường độc dịch tả
vịt ML-14

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

60
Page vii


DANH MỤC HÌNH
STT

Tên hình

Trang

1.1

Bản đồ phân bố bệnh dịch tả vịt trên TG (2011)

1.2

Cấu trúc virus Herpesviridae

3.1

Biểu đồ so sánh tỷ tệ vịt chết do mắc dịch tả vịt ở từng lứa tuổi

4
14

qua 3 năm tại huyện Mê Linh.

36

3.2

Triệu chứng vịt bị mắc bệnh Dịch tả vịt

38

3.4

Triệu chứng vịt bị liệt chân khi mắc bệnh Dịch tả vịt

38

3.5

Bệnh tích vịt bị mắc bệnh Dịch tả vịt:

39

3.6

Bệnh tích vịt bị mắc bệnh Dịch tả vịt. gan, lách xuất huyết, hoại tử

39

3.7

Bệnh tích vịt bị mắc bệnh Dịch tả vịt màng bao tim xuất huyết,
hậu môn xuất huyết.

39

3.7

Ruột xuất huyết, loét, đóng vảy

40

3.8

Ruột xuất huyết hình vòng nhẫn

40

3.9

Phôi vịt bị nhiễm virus dịch tả vịt (bên trái) xuất huyết, còi cọc

42

3.10

Sản phẩm PCR của đoạn gen AND- polymerase virus dịch tả vịt
cường độc phân lập tại huyện Mê Linh, TP. Hà Nội, có sử dụng
cặp mồi đặc hiệu DEV-7F/ DEV-7R (OIE – 2012).

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

62

Page viii


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Dịch tả vịt là một bệnh truyền nhiễm cấp tính lây lan mạnh của loài thủy
cầm do một loại ADN virus thuộc nhóm Herpesvirus gây ra. Đây là một trong
những bệnh gây thiệt hại nặng nề nhất cho ngành chăn nuôi vịt. Bệnh gây nên
tình trạng bại huyết, xuất huyết cho vịt với tỷ lệ chết cao lên đến 90%. Theo
Quyết định số 63/2005/QĐ-BNN và Quyết định số 64/2005/QĐ–BNN được
Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành ngày 13/10/2005 thì bệnh
dịch tả vịt được coi là bệnh nguy hiểm của động vật, phải áp dụng các biện
pháp phòng bệnh bắt buộc. Bệnh dịch tả vịt là một trong 7 bệnh phải tiêm
phòng bắt buộc và yêu cầu tỷ lệ tiêm phòng phải đạt 100%.
Để phòng chống có hiệu quả đối với bệnh dịch tả vịt, việc thu thập và lưu

giữ nguồn gen của các virus gây bệnh với mục đích cung cấp giống cho việc chế
tạo kháng huyết thanh, kháng nguyên dùng trong chẩn đoán nhanh bệnh lựa
chọn các chủng cường độc tiêu chuẩn phục vụ cho nghiên cứu kiểm nghiệm
vacxin. Nhiều loại vacxin dịch tả vịt đã được sản xuất và lưu hành trên thị trường
Việt Nam. Song việc sử dụng vacxin chủ yếu lại do người chăn nuôi quyết định.
Hơn nữa do khâu chăn nuôi chưa hợp lý, vệ sinh phòng bệnh chưa triệt để đã
ảnh hưởng rất nhiều đến hiệu quả bảo hộ của vacxin. Theo một số tài liệu đã
công bố, mặc dù virus dịch tả vịt chỉ có một serotype duy nhất trên thế giới
nhưng tại Việt Nam có thể có 2 subtype virus dịch tả vịt. Việc phân lập, nghiên
cứu virus dịch tả vịt từ thực địa tại Việt Nam là công việc cấp thiết nhằm làm rõ
loại virus lưu hành, mức độ độc lực và tiến tới phục vụ cho công tác nghiên cứu
và sản xuất vacxin phù hợp.
Hiện nay bộ môn Vi Sinh Vật – Truyền nhiễm, khoa Thú y, Học viện
Nông nghiệp Việt Nam đang có giống virus cường độc dịch tả vịt VG-04 và
Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc Thú y Trung ương I - Cục Thú y lưu giữ giống
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 1


vius cường độc chủng 7/69 phục vụ cho việc nghiên cứu và sản suất vacxin phòng
bệnh dịch tả vịt. Chủng virus này được bảo quản trong điều kiện lạnh sâu -86oC ở
dạng nước trứng tươi và dạng động khô.
Tuy nhiên, chủng virus này nếu không được bảo quản tốt sẽ thay đổi
đặc tính sinh học, nhất là tính kháng nguyên, không ổn định độc lực (từ cường
độc có thể giảm tính độc) dẫn đến không ổn định chất lượng cho việc sản xuất
vacxin và các chế phẩm sinh học. Vì vậy chủng virus tuyển chọn này cần
được lưu giữ và bảo tồn trong điều kiện tối ưu nhất, đảm bảo sự ổn định lâu
dài các đặc tính sinh học để phục vụ yêu cầu nghiên cứu.
Xuất phát từ tình hình thực tế, từ vấn đề cấp bách của thực tiễn sản xuất

chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu bảo tồn quỹ gen virus
cường độc Dịch tả vịt”.
2. Mục đích, yêu cầu
- Phân lập được chủng virus cường độc từ các mẫu bệnh phẩm được lấy
từ các đàn vịt nhiễm bệnh ngoài tự nhiên. Đánh giá đặc tính sinh học và đưa ra
kết luận về việc chọn lọc và bảo tồn chủng virus mới phân lập có khả năng sản
xuất chế phẩm sinh học, có ý nghĩa trong việc nghiên cứu khoa học về thú y.
- Đánh giá được tính ổn định đặc tính sinh học, sinh học phân tử của
chủng giống virus dịch tả vịt cường độc VG-04.
- Bảo tồn được nguồn gen của chủng virus dịch tả vịt cường độc đã
chọn lọc.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 2


Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Bệnh dịch tả vịt
Dịch tả vịt (Pestisanatum) là một bệnh truyền nhiễm có tính lây lan
mạnh của loài thuỷ cầm do một loại Herpesvirus thuộc họ Herpesvirideae gây
ra với đặc điểm là xuất huyết nội tạng và ỉa chảy nặng nề (Nguyễn Như
Thanh và cs., 2001).
1.1.1. Lịch sử và phân bố bệnh
Bệnh dịch tả vịt xuất hiện vào năm 1923 tại Hà Lan với triệu chứng ủ
rũ, khát nước và chết sau 1 ngày. Baudet (1923) khi nghiên cứu về bệnh này
và đi đến kết luận có thể nguyên nhân do một loại virus.
Năm 1949, tại Hội nghị Thú y thế giới lần thứ XIV, Jansen và Kunst đã
đề nghị gọi tên bệnh là Duck virus enteritis (DVE) (OIE, 2000).
Tại châu Âu, do sự lây lan rộng của virus cúm gia cầm nên chính phủ

các nước châu Âu, đặc biệt là Đức đã đề cao biện pháp cách ly thuỷ cầm bằng
lưới trong khoảng thời gian từ 20/10/2005-15/12/2005. Tuy nhiên tỷ lệ chết
đã tăng đột biến trong những ngày này. Tổng cộng có 17/124 (14%) loài chim
trưởng thành và 149/184 (81%) loài chim 1 năm tuổi bị chết. Phản ứng trung
hoà sử dụng kháng huyết thanh dịch tả vịt đã phát hiện vịt và các loài chim
chết do bệnh dịch tả vịt (Kaleta E.F. & cs., 2007).
Tại châu Mỹ, vụ dịch đầu tiên xảy ra trên đàn thuỷ cầm hoang ở Mỹ
xuất hiện vào tháng 1 và 2 năm 1973, tại hồ Andes, miền nam Dakota làm gần
40% của 100.000 loài thuỷ cầm trú đông, hầu hết là vịt trời đã bị chết.
Tại châu Á, năm 1944 bệnh xảy ra ở Ấn Độ và tái phát vào năm 1963.
Năm 1968, Jansen công bố bệnh xảy ra ở Trung Quốc.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 3


Hình 1.1: Bản đồ phân bố bệnh dịch tả vịt trên TG (2011)
* Bệnh dịch tả vịt ở Việt Nam
Năm 1999, Nguyễn Đức Hiền (2005) đã mổ khám trên 1176 vịt trong
đó 455 vịt được chẩn đoán là mắc bệnh dịch tả vịt.
Theo thống kê của OIE (2006); Việt Nam là một trong những nước bị
bệnh dịch tả vịt gây thiệt hại nặng nề nhất. Năm 1999, bệnh đã làm chết
51.752 trong tổng số 123.851 vịt. Năm 2000, có 2.964 vịt chết vì bệnh dịch tả
vịt trong tổng số 6.747 vịt. Năm 2001 phát hiện có 24.478 vịt chết trong
46.993 vịt. Năm 2002, bệnh xảy ra ở 33.831 vịt gây chết 15.680 con và năm
2004 số vịt chết vì bệnh dịch tả vịt là 22.447 (xem bảng 1.1).

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 4


Bảng 1.1 Tình hình bệnh dịch tả vịt ở một số nước châu Á
Năm
1996

1997
1998

1999

Quốc gia

Số vịt mắc bệnh

Malaysia

138400

22430

Singapore

3000

400

Trung Quốc

2000

1100

Ấn Độ

424

17

Malaysia

770

770

Malaysia

100

100

Ấn Độ

1215

119

Malaysia

2500

50

Nepal

100

74

123851

51752

Ấn Độ

141

85

Việt Nam

6747

2964

Ấn Độ

1434

396

Malaysia

790

790

Thái Lan

1414

998

Việt Nam

46993

24478

Ấn Độ

1660

681

Việt Nam

33831

15680

Ấn Độ

2430

888

Thái Lan

3693

1121

Ấn Độ

2857

879

Thái Lan

4500

4120

Việt Nam

41762

22447

Việt Nam
2000

2001

2002
2003

2004

Số vịt chết

(Nguồn: Annual animal disease status)

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 5


Như vậy, bệnh dịch tả vịt là căn bệnh cần được quan tâm, nghiên cứu
sâu nhằm góp phần giảm thiệt hại về kinh tế cho người chăn nuôi.
1.1.2. Truyền nhiễm học
1.1.2.1. Loài mắc bệnh
Bệnh dịch tả vịt là bệnh của nhiều loài vịt: vịt trời, vịt mỏ nhọn, vịt đầu
đỏ, … Các loài thuỷ cầm khác như ngan, ngỗng, thiên nga và một số loài
chim hoang dã cũng cảm nhiễm bệnh (Friend and G.L. Pearson, 1973),
(Docherty D.E. & Franson C.J., 1992).
Trong phòng thí nghiệm, vịt con là cảm nhiễm nhất đối với bệnh. Virus

dịch tả vịt có khả năng nhân lên ở gà nhỏ hơn 2 tuần tuổi (Jansen, 1968).
1.1.2.2. Mùa vụ phát bệnh
Bệnh dịch tả vịt xảy ra nhiều nhất vào tháng 4-6. Sự bùng nổ dịch bệnh
phụ thuộc vào điều kiện thời tiết, mùa sinh sản của vịt và ảnh hưởng của nhân
tố stress.
Ở Việt Nam bệnh dịch tả vịt xảy ra quanh năm nhưng phát triển mạnh
vào thời vụ chăn nuôi vịt và trùng với thời vụ thu hoạch lúa: Vụ xuân tháng 56, vụ mùa tháng 9-10 (Phạm Sỹ Lăng và cs., 2011).
1.1.2.3. Lứa tuổi mắc bệnh
Bệnh xảy ra ở vịt mọi lứa tuổi, tuy nhiên vịt từ 15 ngày tuổi trở đi bị
nhiễm nhiều nhất.
1.1.2.4. Chất chứa virus
Ở vịt bị nhiễm bệnh, virus có trong máu, các cơ quan phủ tạng, nhiều nhất
là ở gan, lách và óc. Tại Việt Nam đã nghiên cứu sự nhân lên của virus ở cơ thể
vịt bị gây nhiễm nhân tạo. Sau khi gây nhiễm virus 24 giờ, virus đã nhân lên,
xâm nhập vào máu nhưng số lượng còn ít. Đến 48 giờ, virus đã xuất hiện trong
nước mắt, nước mũi. Và đến 72 giờ, khi vịt bị bệnh nặng, bắt đầu ỉa chảy thì tế
bào niêm mạc đường tiêu hoá do tác động của virus bị huỷ hoại, tróc ra cùng với
dịch tiết có nhiều virus, theo phân bài xuất ra ngoài. Vịt bệnh mang virus rất lâu
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 6


và có thể tái phát bệnh ở thể ẩn tính. Người ta có thể phát hiện bệnh bằng kiểm
tra nốt rộp ở mặt dưới của lưỡi vịt.
1.1.2.5. Đường xâm nhập và cách lây lan
Trong thí nghiệm, có thể gây bệnh bằng cách tiêm dưới da, bắp thịt,
tiêm tĩnh mạch hoặc nhỏ mũi. Trong tự nhiên, đường xâm nhập chủ yếu của
virus dịch tả vịt là đường tiêu hoá. Bệnh lây lan nhanh, mạnh theo phương
thức truyền lây gián tiếp nhưng phương thức truyền lây trực tiếp từ mẹ sang

con cũng có thể xảy ra (Burgess E.C & TM Yuill, 1981).
1.1.3. Triệu chứng và bệnh tích
1.1.3.1. Triệu chứng
Thời gian nung bệnh đối với bệnh dịch tả vịt là 3-4 ngày, có thể dài hơn
hoặc ngắn hơn phụ thuộc vào bệnh lần đầu tiên xảy ra hay đã từng xảy ra đối
với đàn vịt.
Ở đàn vịt, nhiều con tự nhiên lờ đờ, rớt lại sau đàn. Ở đàn vịt đẻ khi bệnh
xuất hiện sản lượng trứng giảm xuống hoặc ngừng đẻ. Vịt bệnh thường ủ rũ, bỏ
ăn, đứng một chân, đầu rúc vào cánh. Vịt thường sưng mi mắt, niêm mạc mắt
đỏ. Lúc đầu chảy nhiều nước mắt, sau nước mắt đặc lại có màu vàng như mủ
đóng đầy khoé mắt. Vịt bệnh có khi khó thở, tiếng thở khò khè. Từ mũi chảy ra
chất niêm dịch lúc đầu trong, sau đặc lại. Nhiều con đầu sưng to, sờ nắn có cảm
giác mềm như quả chuối chín. Hầu, cổ cũng có thể sưng do tổ chức liên kết dưới
da bị phù thũng. Lúc mới bị bệnh, vịt khát nên uống nhiều nước. Sau vài ngày
vịt ỉa chảy, phân rất loãng, có mùi khắm và có màu trắng xanh. Hậu môn bẩn,
lông dính bết đầy phân (Nguyễn Như Thanh và cs., 2001).
1.1.3.2. Bệnh tích
Bệnh tích của bệnh dịch tả vịt đặc trưng là ở đường tiêu hoá có những
chấm xuất huyết, nhiều nhất là ở cuống mề và trực tràng, bên trên phủ lớp
màng giả khó bóc. Ruột non xuất huyết thành những vòng nhẫn nhìn từ ngoài

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 7


vào thấy có màu nâu hoặc tím rất đặc trưng (Trần Minh Châu, 1996).
Nguyễn Đức Hiền (1999) công bố tỷ lệ bệnh tích đặc trưng trên vịt thực
nghiệm, trong đó: Niêm mạc mắt xuất huyết (95,45%); phổi viêm, tụ máu,
thuỷ thũng (95,45%); dạ dày tuyến xuất huyết (100%); ruột non xuất huyết

viêm loét (100%); ruột già xuất huyết viêm loét (97,73%); lách tụ máu có nốt
hoại tử và gan xuất huyết có nốt hoại tử (100%).
1.1.4. Chẩn đoán
Để chẩn đoán bệnh dịch tả vịt có nhiều phương pháp được sử dụng,
dưới đây là sơ đồ chẩn đoán bệnh dịch tả vịt theo tiêu chuẩn ngành của Bộ
Nông nghiệp và phát triển nông thôn 10 TCVN 815-2006
1.1.4.1. Chẩn đoán lâm sàng
Dựa vào dịch tễ, triệu chứng, bệnh tích đặc trưng của bệnh.
1.1.4.2. Chẩn đoán virus học
a. Phát hiện virus
Xử lý bệnh phẩm:
- Mẫu gan, lách, thận được xử lý thành huyễn dịch 10% với PBS
(Phosphate Buffered Saline) có chứa 200 UI/ml Penicillin và 200 mg/ml
Streptomycin.
- Ly tâm 2.000 vòng/15ph, lấy dịch trong ở trên.
- Kiểm tra vô trùng: Trên môi trường nước thịt BHI, hoặc trên môi
trường thạch máu.
b. Phân lập virus
* Phân lập trên vịt con: Tiêm huyễn dịch bệnh phẩm đã được xử lý như
trên cho vịt con (0,7-1 kg) với liều 0,5 ml/con vào dưới da hay bắp lườn. Nếu
bệnh phẩm có virus dịch tả vịt, vịt sẽ biểu hiện triệu chứng, bệnh tích đặc
trưng của bệnh dịch tả vịt giống như đã mô tả ở phần 1.1.3.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 8


Kiểm tra
lâm sàng

Đặc điểm
dịch tễ học

Lấy mẫu
bệnh phẩm

Phát hiện
kháng thể (SN)

Phát hiện virus

Phân lập virus

(-)

Giám định
(VN)

(-)

PCR

(+)

(+)

Kết luận bệnh

Sơ đồ 1.1: Sơ đồ chẩn đoán bệnh dịch tả vịt

* Phân lập trên trứng vịt có phôi
- Tiêm 0,2ml huyễn dịch bệnh phẩm đã xử lý vào xoang niệu mô hoặc
màng nhung niệu phôi vịt 9-11 ngày: 5 phôi/mẫu bệnh phẩm.
- Trứng được ấp tiếp ở tủ ấp 370C. Soi trứng, loại bỏ những phôi chết
trong khoảng 24h sau khi tiêm.
- Virus dịch tả vịt gây chết phôi sau 4-10 ngày với đặc trưng: Xuất
huyết lan rộng.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 9


- Thu hoạch gan phôi và nước niệu để giám định virus.
* Phân lập trên tế bào xơ phôi vịt (Duck Embryo Fibroblast-DEF)
- Cấy tế bào DEF trên các lọ nuôi cấy T25 hoặc đĩa nuôi cấy (đĩa nuôi
cấy 6 lỗ, 24 lỗ), sau 2-3 ngày tế bào mọc thành thảm (khoảng 70%) thì gây
nhiễm huyễn dịch bệnh phẩm đã xử lý: 500µl/lỗ hoặc lọ. Việc cấy chuyển 2
lần là cần thiết trong quá trình phân lập.
- Quan sát bệnh tích tế bào (CPE-Cytopathic pathogene effect): đặc
trưng với đám tế bào to, tròn và trở nên hoại tử sau 2-4 ngày sau đó.
- Thu hoạch hỗn dịch tế bào, đông tan, ly tâm và thu phần nước trong
cho giám định virus.
c. Phương pháp giám định virus
* Phương pháp trung hoà trên trứng vịt có phôi (VN-Virus
Neutralization):
- Chuẩn bị:
+ Pha loãng virus phân lập: Nồng độ 10-1-10-9 với dung dịch PBS.
+ Lô đối chứng dương: Trộn kháng huyết thanh dương tính dịch tả vịt
với các nồng độ virus đã pha loãng theo tỷ lệ 1:1.
+ Lô đối chứng âm: Trộn huyết thanh âm tính với các nồng độ virus đã

pha loãng theo tỷ lệ 1:1.
+Ủ hỗn hợp trên ở nhiệt độ 370C/1giờ.
- Tiến hành:
+ Tiêm hỗn hợp trên vào xoang niệu mô phôi trứng (0,2ml/phôi), 5
phôi/nồng độ.
+ Phôi được ấp tiếp ở tủ ấp 370C trong 10 ngày. Loại bỏ những phôi
chết trước 24h.
+ Phôi chết trong 4-10 ngày, có bệnh tích còi cọc, xuất huyết lan rộng.
- Đánh giá kết quả:
+ Tính toán chỉ số trung hoà NI (neutralization index). Nếu kết quả

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 10


phân lập và giám định dương tính với kháng huyết thanh chuẩn (bằng phương
pháp trung hoà VN), kết luận có virus dịch tả vịt.
* Phương pháp trung hoà trên tế bào xơ phôi vịt (DEF):
- Chuẩn bị:
+ Tế bào DEF trên đĩa nuôi cấy tế bào 96 lỗ đã nuôi cấy được 2-3 ngày.
+ Pha loãng virus phân lập: các nồng độ 10-1-10-9 với môi trường nuôi cấy
MEM.
+ Lô đối chứng dương: Trộn kháng huyết thanh dương tính dịch tả vịt
với các nồng độ virus đã pha loãng theo tỷ lệ 1:1.
+ Lô đối chứng âm: trộn huyết thanh âm tính với các nồng độ virus đã
pha loãng theo tỷ lệ 1:1.
- Tiến hành:
+ Gây nhiễm hỗn hợp trên vào đĩa đã nuôi cấy tế bào DEF (đĩa 96 lỗ),
100µl/lỗ, 8 lỗ/nồng độ.

+Ủ đĩa nuôi cấy ở tủ ấm CO2 ở 370C/1giờ.
+ Đổ bỏ hỗn hợp trên, cho môi trường nuôi cấy MEM 100µl/lỗ.
+ Tiếp tục ủ đĩa nuôi cấy ở tủ ấm CO2 ở 370C.
+ Kiểm tra bệnh lý tế bào (CPE) trong 3-7 ngày với biểu hiện tế bào co
tròn và tụ lại thành đám, thời gian lâu tế bào có hiện tượng hoại tử.
- Đánh giá kết quả:
+ Tính toán chỉ số trung hoà NI (neutralization index). Nếu thuỷ cầm
chưa tiêm phòng, phát hiện có kháng thể dịch tả vịt (bằng phương pháp trung
hoà SN), kết luận thủy cầm đã nhiễm virus dịch tả vịt.
1.1.4.3. Chẩn đoán bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
1.1.5. Biện pháp can thiệp và phòng bệnh dịch tả vịt
1.1.5.1. Biện pháp can thiệp
Bệnh dịch tả vịt là bệnh không chữa được. Tuy nhiên với đàn vịt mới
chớm mắc vài con thì có thể can thiệp bằng cách tiêm vacxin nhược độc cho
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 11


toàn đàn. Những vịt chưa bị nhiễm virus nặng sẽ được bảo hộ bằng hiện
tượng cản nhiễm. Nếu tiêm sớm và kết hợp với chăm sóc đàn vịt tốt thì có thể
cứu được tới 90% vịt (Trần Minh Châu, 1980). Nên tăng cường thêm các biện
pháp chăm sóc bồi dưỡng nhằm tăng cường sức đề kháng cho vịt (sử dụng
chất điện giải và vitamin).
Theo Archie Hunter (2002) nếu có ổ dịch xảy ra, vịt khoẻ mạnh có tiếp
xúc với mầm bệnh phải được tiêm phòng vì vịt phát triển miễn dịch chỉ trong
một ngày sau khi tiêm phòng.
1.1.5.2. Phòng bệnh
* Vệ sinh phòng bệnh
Lê Hồng Mận (2005) khuyến cáo: Không chăn vịt, ngan, ngỗng từ nơi

có nhiều nguồn nước chảy tới để đề phòng sự lây nhiễm qua nguồn nước.
Phạm Quang Hùng (2003) nêu một số nguyên tắc phòng bệnh bằng vệ
sinh như sau:
- Chuồng trại vịt cách xa khu dân cư. Cổng trại phải có hố sát trùng
(thường sát trùng bằng Cloramin 3%). Hạn chế người đi lại, người ra vào trại
phải sát trùng giày dép, tay chân.
- Điều kiện nuôi dưỡng tốt, máng ăn, máng uống phải sạch sẽ. Thức ăn,
nước uống phải vệ sinh. Thực hiện tiêu độc, sát trùng dụng cụ, chuồng trại giữa
hai lứa vịt. Chú ý tiêu diệt chuột và các loài gặm nhấm quanh khu vực trại.
- Vịt mới mua về phải nuôi cách ly ít nhất 3 tuần lễ.
* Tiêm phòng bằng vacxin
+ Vacxin vô hoạt:
Để vô hoạt virus dịch tả vịt, trước đây thường dùng hoá chất là formol,
gần đây sử dụng chất BPC (β propiolactone). Tại Việt Nam đã chế thử vacxin
vô hoạt như: vacxin dịch tả vịt gan máu glyxerin tím, vacxin formol gan.
Theo OIE (2000) vacxin vô hoạt tạo được miễn dịch cho đàn vịt nhưng hiệu
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 12


lực thấp hơn so với vacxin nhược độc, hiện nay vacxin vô hoạt chỉ sử dụng
trong phòng thí nghiệm, chưa được áp dụng trong sản xuất.
+ Vacxin nhược độc:
Ngày nay người ta thường sử dụng chủng virus vacxin là virus nhược
độc dịch tả vịt thích nghi trên phôi vịt và virus dịch tả vịt chủng Jansen thích
nghi trên phôi gà và trên nuôi tế bào Fibroblast phôi gà một lớp. Đây là 2 loại
vacxin có độ an toàn cao và hiệu lực tốt, thời gian miễn dịch dài, sau khi tiêm
vacxin 9 tháng vịt vẫn còn miễn dịch. Vacxin sử dụng an toàn với cả vịt con
một ngày tuổi. Vacxin được chế biến dưới 2 dạng vacxin tươi và vacxin đông

khô (Lê Hồng Mận, 1999).
+ Với đàn vịt ở vùng dịch bị uy hiếp, cần tiêm phòng cho vịt con ngay
sau khi vịt nở.
+ Vịt nuôi thịt chỉ cần tiêm phòng 1 lần. Ở nơi không bị dịch uy hiếp,
có thể tiêm phòng cho vịt vào lúc vịt từ 2-3 tuần tuổi.
+ Theo Quyết định số 63/2005/QĐ-BNN của Bộ Nông nghiệp và Phát triển
Nông thôn việc tiêm phòng vacxin bắt buộc đối với bệnh dịch tả vịt gồm:
Đối tượng tiêm phòng: Vịt, ngan các lứa tuổi.
Phạm vi tiêm phòng: Các cơ sở chăn nuôi tập trung, chăn nuôi hộ gia
đình trong phạm vi cả nước.
Tiêm phòng định kỳ mỗi năm 2 lần, tuỳ theo lứa tuổi.
Liều lượng, đường tiêm, gia cầm trong diện tiêm theo sự hướng dẫn
của nhà sản xuất vacxin.
1.2. Virus gây bệnh dịch tả vịt
Virus gây bệnh dịch tả vịt là loại DNA virus thuộc họ Herpesvirideae
nhóm Herpesvirus. Virus chỉ có một serotyp được biết đến nhưng có nhiều
chủng có độc lực khác nhau tồn tại trong tự nhiên (Nguyễn Như Thanh và cs.,
2001). Theo Li H., Liu S., Kong X. (2006) virus gây bệnh dịch tả vịt có thể
được phân loại vào phân họ Alphaherpesvirinae trong họ Herpesviridae.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 13


Hình 1.2: Cấu trúc virus Herpesviridae
1.2.1. Hình thái, kích thước
Virus dịch tả vịt có hình thái gần tròn, có lớp vỏ bọc bên ngoài và có
một lõi ở giữa. Virus hoàn chỉnh có đường kính trung bình 60nm. Virus chưa
hoàn chỉnh có đường kính trung bình là 100nm.
1.2.2. Sức đề kháng

Virrus mẫn cảm với ether, chloroform. Cồn 750, axit phenic 0,5% diệt virus
sau 30 phút. Virus ổn định ở pH từ 5 – 10 và bất hoạt khi pH < 3 và pH > 10.
Virus đề kháng kém với sức nóng: virus bị diệt ở 300C sau 2 giờ, ở
500C trong 90 – 120 phút; 560C trong 10 phút. Ở nhiệt độ phòng (220C) virus
sống được trong 30 ngày.
Với nhiệt độ lạnh virus tồn tại lâu hơn: 40C virus sống được 60 ngày; ở
-100C đến -200C virus tồn tại hàng năm. Trong điều kiện đông khô và bảo
quản lạnh, virus có thể tồn tại nhiều năm.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 14


1.2.3. Độc lực
Đã xác định được một số chủng virus dịch tả vịt có độc lực khác nhau:
- Hà Lan có chủng O độc lực mạnh nhất, sau đó đến các chủng W59,
W60, N.
- Việt Nam có chủng 769, 880 có độc lực mạnh nhất, sau đó là các
chủng NH, NB, C, T.
Nguyễn Đức Hiền (1999) phân lập một chủng virus gây bệnh dịch tả vịt
ở Cần Thơ và cho biết chủng virus này có độc lực cao, có khả năng gây bệnh
và gây chết vịt ở phòng thí nghiệm khi tiêm bắp với liều 103 ELD50/ml.
Nguyễn Ngọc Điểm (2005) cũng đã phân lập thành công chủng virus
cường độc dịch tả vịt VG-2004. Qua bước đầu khảo sát đặc tính sinh học của
chủng virus này tác giả cho biết virus dịch tả vịt chủng VG-2004 có độc lực
mạnh hơn virus dịch tả vịt chủng 769 do tác giả Trần Minh Châu phân lập.
1.2.4. Đặc tính nuôi cấy
Virus dịch tả vịt không có khả năng gây ngưng kết hồng cầu, không
hấp thụ hồng cầu. Trong tế bào phôi gà, vịt bị nhiễm virus, virus hình thành

tiểu thể bao hàm. Trong môi trường nuôi cấy tế bào, virus có khả năng hình
thành Plague. Khi có mặt bổ thể, kháng thể dịch tả vịt có khả năng làm tan tế
bào xơ phôi vịt bị nhiễm virus.
* Nuôi cấy trên phôi gà, vịt
Gây nhiễm vào màng nhung niệu hoặc xoang niệu của phôi vịt ấp 9 -14
ngày, 4 - 6 ngày sau phôi sẽ chết với bệnh tích: xuất huyết trên da vùng lưng,
đầu và dìa cánh, gan sưng tụ máu, xuất huyết, màng nhung niệu sưng dày.
Nếu cấy truyền liên tiếp 12 đời trên phôi gà, virus có thể thích nghi. Virus gây
chết phôi sau 6 – 7 ngày khi cấy vào xoang niệu mô.
Virus thích nghi trên phôi gà, vịt có sức gây bệnh giảm dần với vịt.
Người ta đã sử dụng các chủng virus nhược độc qua phôi gà để chế vacxin
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 15


phòng bệnh như chủng virus vacxin nhược độc Jansen, DP – EG – 2000.
* Nuôi cấy trên tế bào
Có thể nuôi cấy trên môi trường tế bào xơ phôi vịt hoặc xơ phôi gà,
virus gây hủy hoại tế bào sau 48 giờ gây nhiễm. Bệnh tích tế bào biểu hiện: tế
bào biến dạng, co tròn, phình to ra, nguyên sinh chất tan vỡ, nhân tập trung lại
và được bao bọc bởi một màng chung tạo ra thể hợp bào (Syncitium).
* Nuôi cấy trên động vật cảm thụ
Có thể dùng vịt con 1 ngày tuổi để nuôi cấy virus. 3-12 ngày sau vịt
chết với triệu chứng, bệnh tích điển hình của bệnh. Ngoài vịt con có thể dùng
ngan con, ngỗng con, gà con mới nở để gây bệnh.
1.3. Miễn dịch chống virus dịch tả vịt
1.3.1. Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu
Khả năng đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của vịt đối với virus dịch
tả vịt thể hiện bằng sự sản sinh các chất miễn dịch không đặc hiệu, bao gồm:

* Interferon: Là một chất do tế bào sinh ra có tác dụng ức chế sự nhân
lên của virus bằng cách giải thoát sự khống chế việc tổng hợp protein kháng
virus. Protein này có khả năng khống chế sự phiên dịch các thông điệp của
virus ở Ribosome của tế bào.
Jansen khi nghiên cứu về vai trò của Interferon và hiện tượng cản
nhiễm đã chứng minh vacxin còn phát huy tác dụng ngay cả khi vịt đã bị
nhiễm virus dịch tả vịt cường độc trước khi tiêm vacxin. Nếu nhiễm virus
cường độc dịch tả vịt trước 4 giờ thì trong 10 vịt được can thiệp bằng vacxin
sẽ sống 8 con. Nếu can thiệp vacxin lúc vịt nhiễm virus trước 8 giờ, 15 vịt
phát bệnh nhưng còn sống 3 con. Nếu vịt bị nhiễm bệnh từ 16 giờ trở lên, dù
tiêm vacxin vịt vẫn không được bảo hộ. Như vậy rõ ràng interferon có vai trò
quan trọng trong việc chống lại sự nhân lên của virus dịch tả vịt và hiện tượng
cản nhiễm là cơ sở khoa học cho việc can thiệp vacxin vào ổ dịch để nhanh
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 16