PP tạo cây kháng sâu BT

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

PHƯƠNG PHÁP TẠO CÂY
KHÁNG SÂU BT


Nội dung
Giới thiệu về
Bacillus
Thurigiensis
Thực vật chuyển
gen BT

• Đặc điểm hình thái; sinh trưởng và phát triển
• Các loại độc tố và cơ chế tác động của tinh
thể độc lên côn trùng

• Khái niệm, mục đích
• Các bước tạo giống cây chuyển gen
trong PTN

Thực trạng cây trồng
chuyển gen Bt hiện
nay

• Tính hữu hiệu
• Thành tựu đạt được

Tổng kết

• Kết luận
• Câu hỏi trắc nghiệm
• Tài liệu tham khảo


Giới thiệu về Bacillus Thurigiensis


ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI
• Là trực khuẩn sinh bào
tử, hiếu khí không bắt
buộc, Gram dương,
• Kích thước: 3-6 µm có
tiên mao, chuyển động
được.
• Tế bào đứng riêng rẽ
hoặc xấp thành từng
chuỗi


ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI
• Nhiệt độ sinh trưởng từ
15oC-45OC
• Bào tử Bt có dạng hình
trứng dài 1,6-2 µm, có
thể nảy mầm thành tế
bào sinh dưỡng.

• Tinh thể protein được
tạo ra trong giai đoạn

tạo bào tử, kích thước
0,6 – 2 µm .Tinh thể có
kích thước 0,6 x 2 µm.
Bản chất là protein.


SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN
• Phân bố

35%

30%

16%


SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN


SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN

Các giai đoạn của quá trình tạo bào tử


CÁC LOẠI ĐỘC TỐ CỦA VI KHUẨN BT
• Ngoại độc tố α (α – exotoxyn)
hay phospholpara C.
• Ngoại độc tố β (β – exotoxyn)
hay độc tố bền nhiệt.
• Ngoại độc tố γ (γ – exotoxyn)

hay độc tố tan trong nước.
• Nội độc tố δ (δ – exotoxyn) hay
tinh thể độc.


CƠ CHẾ TÁC ĐỘNG CỦA CÁC TINH THỂ ĐỘC LÊN CÔN TRÙNG


Thực vật chuyển gen Bt


KHÁI NIỆM, MỤC ĐÍCH
• Quá trình đưa một
DNA ngoại lai vào hệ
gen của một sinh vật
được gọi là quá trình
biến nạp. Những cây
được biến nạp được
gọi là cây biến đổi
gen


KHÁI NIỆM, MỤC ĐÍCH


CÁC BƯỚC TẠO GIỐNG CÂY CHUYỂN GEN TRONG
PHÒNG THÍ NGHIỆM


Bước 1: Xác định, phân lập và xử lý gen cần chuyển

• Xác định sự định vị của gen độc tố
• Phá vỡ các tế bào B. thuringiensis được nuôi
trong môi trường thí nghiệm
• DNA tế bào tổng số được phân lập và tách thành
các phân đoạn DNA plasmid và DNA nhiễm sắc
thể bằng ly tâm gradient CsCl


Bước 1: Xác định, phân lập và xử lý gen cần chuyển

• Xác định plasmid của B. Thuringiensis mang gen tiền
độc tố sau đó gắn vào vị trí BamHI của pBR322. Sau đó
các vector được biến nạp vào E.coli và các khuẩn lạc
được sàng lọc miễn dịch
• Khi gen tiền độc tố đã phân lập được dùng làm đầu dò
lai DNA, plasmid 71 kb của B. thuringiensis được phát
hiện là mã hóa cho gen đó.
• Plasmid mang gen tiền độc tố B. thuringiensis sau khi
được phân lập được xử lý bằng enzyme giới hạn Hind
III.


Bước 2: Thiết kế plasmid mang gen Bt
• Xử lí vector: cắt vector
bằng enzyme giới hạn
Hind III cùng loại với
enzyme đã cắt plasmid
mang gen tiền độc tố Bt.
• Khử nhóm phosphate

bằng enzyme alkanline
phosphotase để tránh
hai đầu vector đóng kín
trở lại.

Vector nhân dòng mang
gen độc tố diệt sâu B.
thuringiensis


Bước 3: Gắn gen cần chuyển vào vector tạo DNA tái tổ hợp

• Sau khi được cắt ngắn, gen tiền độc tố của Bt
được đặt dưới sự kiểm soát phiên mã của
promoter 35S mạnh của virus khảm xúp lơ và
vị trí polyadenyl hóa kết thúc phiên mã
nopalin synthase, sau đó được nhân dòng
vào vùng T- DNA của một vector plasmid
kiểu đồng cài nhập.
• Enzyme DNA ligase của E.coli hoặc phage T4
được sử dụng để hoàn chỉnh phân tử lai.


Bước 4 : Nhân dòng DNA tái tổ hợp

• Nhân dòng DNA tái
tổ hợp được thực
hiện trong vi khuẩn
E. coli,
• Vector sẽ được

biến nạp vào E.coli
bằng phương pháp
hóa biến nạp


Bước 5: Biến nạp vào tế bào thực vật

• Có nhiều cách chuyển
gen vào tế bào bao
gồm:
– Phương pháp chuyển
gen gián tiếp
– Phương pháp chuyển
gen trực tiếp


Bước 6: Chọn lọc và tái sinh cây chuyển gen


Bước 7: Phân tích xác nhận cây chuyển gen và đánh giá mức độ biểu
hiện của gen.

• Cần thực hiện các thí
• Một cây sau biến nạp
nghiệm để chứng
sinh trưởng trên môi
trường chọn lọc thì chưa minh sản phẩm của
đủ cơ sở để nói là một
gen
biến nạp thành công

PCR

Southern Blot


Bước 8: Mô hình trồng trọt, khảo nghiệm và đảm bảo tính an toàn sinh
ọc

• Bố trí các vùng bên cạnh trồng cây không
chuyển gen Bt
• Triển khai các gen kháng côn trùng khác
nhau
• Dùng các loại độc tố Bt. cho các receptor
đích khácnhau.
• Dùng các promoter khác nhau để điều chỉnh
sự biểu hiện của các gen Bt..
• Cần có chiến lược tiếp tục tạo ra những loại
cây trồng kháng.


CÁC BƯỚC TẠO GIỐNG CÂY CHUYỂN GEN TRONG PHÒNG THÍ
NGHIỆM


Thực trạng cây trồng chuyển
gen Bt hiện nay