phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây diệp hạ châu (phyllanthus amarus l.) mọc hoang tại tỉnh sóc trăng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

- - -   - - -

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH
TRONG CÂY DIỆP HẠ CHÂU (Phyllanthus amarus L.)
MỌC HOANG TẠI TỈNH SÓC TRĂNG

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN:
PGS.TS NGUYỄN HỮU HIỆP

SINH VIÊN THỰC HIỆN:
TRẦN THỊ DIỆU NGUYÊN
MSSV: 3113738
LỚP: Vi Sinh Vật Học K37

Cần Thơ – Tháng 12/2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

- - -   - - -

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH
TRONG CÂY DIỆP HẠ CHÂU (Phyllanthus amarus L.)
MỌC HOANG TẠI TỈNH SÓC TRĂNG

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN:
PGS.TS NGUYỄN HỮU HIỆP

SINH VIÊN THỰC HIỆN:
TRẦN THỊ DIỆU NGUYÊN
MSSV: 3113738
LỚP: Vi Sinh Vật Học K37

Cần Thơ – Tháng 12/2014


PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
(ký tên)

SINH VIÊN THỰC HIỆN
(ký tên)

PGS.TS Nguyễn Hữu Hiệp

Trần Thị Diệu Nguyên

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………
Cần Thơ, ngày tháng năm 2014
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(ký tên)


LỜI CẢM TẠ
Trong thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp tại trường Đại học Cần Thơ, tôi đã
nhận được rất nhiều sự quan tâm và động viên từ gia đình, sự hướng dẫn và chỉ dạy tận
tình của quý Thầy, Cô cùng sự giúp đỡ nhiệt tình của các bạn. Để hoàn thành được
luận văn tốt nghiệp này, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:
Quý Thầy Cô tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại
học Cần Thơ đã truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực
hiện luận văn.
PGS.TS Nguyễn Hữu Hiệp, Phó Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh học Vi sinh
vật, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ người Thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong
suốt quá trình học tập, xây dựng đề cương nghiên cứu, thực hiện thí nghiệm và hoàn
thành luận văn này.
Cán bộ quản lý tại phòng thí nghiệm vi sinh vật cùng bạn bè đã giúp đỡ, động
viên và chia sẻ những khó khăn giúp tôi hoàn thành tốt luận văn này.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc đến cha, mẹ đã luôn ủng hộ tôi về
mọi phương diện, là sức mạnh tinh thần giúp tôi vươn lên trong cuộc sống.
Xin kính chúc quý Thầy, Cô và các bạn sinh viên luôn dồi dào sức khỏe và luôn
thành công.
Cần Thơ, ngày

tháng

năm 2014

Trần Thị Diệu Nguyên


Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37-2014

Trường Đại học Cần Thơ

TÓM TẮT
Diệp hạ châu (Phyllanthus amarus L.) được biết đến như một loại dược liệu quý
có tính kháng khuẩn mạnh được sử dụng trong y học, nhưng các nghiên cứu trước đây
chỉ sử dụng dịch trích mà chưa quan tâm nhiều đến vi khuẩn nội sinh có trong cây. Vì
vậy, việc phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh có các đặc tính tốt trong cây Diệp hạ
châu được thực hiện.
Hai mươi dòng vi khuẩn nội sinh đã được phân lập từ rễ, thân, lá và trái của cây
Diệp hạ châu mọc hoang tại huyện Long Phú, tỉnh Sóc Trăng. Phần lớn vi khuẩn đều
có khuẩn lạc dạng tròn, bìa nguyên, độ nổi mô, màu trắng, dạng hình que, gram âm và
có khả năng chuyển động. Kết quả khảo sát cho thấy, tất cả các dòng vi khuẩn này đều
có khả năng cố định đạm, sinh tổng hợp IAA. Nổi bật là hai dòng SR1 và SR5 có khả
năng tổng hợp lượng NH4+ cao nhất (0,92 µg/mL và 0,91 µg/mL) vào ngày thứ 6 và
tổng hợp lượng IAA cao nhất (7,60 µg/mL và 7,44 µg/mL) vào ngày thứ 2. Bên cạnh
khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA, đặc biệt dòng SR8 còn có khả năng hòa tan
lân cao. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn cho thấy, 11 dòng có khả năng kháng
Escherichia coli, trong đó 5 dòng ST3, SL2, SL5, SQ2 và SQ3 còn có khả năng kháng
Aeromonas hydrophila. Dòng SR5 và SL5 có khả năng kháng mạnh nhất với vi khuẩn
E. coli, dòng SL2 kháng mạnh nhất với A. hydrophila.

Kết quả giải trình tự gen 16S−rRNA, dòng SR5, SL2 và SL5 được nhận diện
theo thứ tự là Klebsiella terrigena dòng NBRC 14941; Bacillus amyloliquefaciens
dòng NRRL B−14393 và Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum dòng FZB42
với tỷ lệ đồng hình lần lượt là 97%; 96%; 97%.
Từ khóa: Ammonium, Diệp Hạ Châu, Hòa tan lân, IAA, Kháng khuẩn, Vi khuẩn nội
sinh

Chuyên ngành Vi sinh vật học

i

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37-2014

Trường Đại học Cần Thơ

MỤC LỤC
Trang
PHẦN KÝ DUYỆT ..........................................................................................................
LỜI CẢM TẠ...................................................................................................................
TÓM TẮT ....................................................................................................................... i
MỤC LỤC ......................................................................................................................ii
DANH SÁCH BẢNG.................................................................................................... vi
DANH SÁCH HÌNH ...................................................................................................vii
TỪ VIẾT TẮT ........................................................................................................... viii
CHƯƠNG I. GIỚI THIỆU ........................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề ............................................................................................................... 1
1.2 Mục tiêu đề tài ........................................................................................................ 2

CHƯƠNG II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU..................................................................... 3
2.1 Điều kiện tự nhiên của tỉnh Sóc Trăng. .............................................................. 3
2.1.1

Vị trí địa lý ..................................................................................................... 3

2.1.2

Đặc điểm địa hình .......................................................................................... 4

2.1.3

Khí hậu ........................................................................................................... 4

2.2 Sơ lược về Diệp hạ châu ....................................................................................... 4
2.2.1

Mô tả .............................................................................................................. 5

2.2.2

Phân bố ........................................................................................................... 6

2.2.3

Thành phần hoá học ....................................................................................... 7

2.2.4

Tính kháng khuẩn của cây Diệp hạ châu ....................................................... 8

2.3 Sơ lược về vi khuẩn nội sinh .............................................................................. 10
2.3.1

Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh ...................................................... 10

2.3.1.1 Khả năng cố định đạm ............................................................................. 11
2.3.1.2 Khả năng hòa tan lân khó tan ................................................................... 11
2.3.1.3 Khả năng tổng hợp Auxin Indole-3-acetic acid (IAA) ............................ 13
2.3.1.4 Đối kháng sinh học .................................................................................. 13
2.3.2

Một số vi khuẩn nội sinh ............................................................................ 13

2.3.2.1 Vi khuẩn Klebsiella.................................................................................. 13
2.3.2.2 Vi khuẩn Bacillus ..................................................................................... 14

Chuyên ngành Vi sinh vật học

ii

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37-2014

Trường Đại học Cần Thơ

a.

Bacillus amyloliquefacien ............................................................................ 15

b.

Bacillus cereus ............................................................................................. 15

c.

Bacillus subtilis ............................................................................................ 16

2.3.2.3 Vi khuẩn Azospirillum ............................................................................. 17
2.3.2.4 Vi khuẩn Pseudomonas ............................................................................ 18
2.4 Một số đặc tính của vi khuẩn thử nghiệm ........................................................ 18
2.4.1

Escherichia coli ............................................................................................ 18

2.4.2

Aeromonas hydrophila ................................................................................. 20

2.5 Tình hình nghiên cứu trong nước và thế giới ................................................... 21
2.5.1

Tình hình nghiên cứu trong nước ................................................................. 21

2.5.2

Tình hình nghiên cứu thế giới ...................................................................... 21

2.6 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) ................................................... 22
2.7 Điện di gel agarose .............................................................................................. 24
2.8 Phương pháp giải trình tự DNA ........................................................................ 25
CHƯƠNG III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 27
3.1 Địa điểm và thời gian .......................................................................................... 27
3.2 Vật liệu thí nghiệm .............................................................................................. 27
3.3 Phương tiện và thiết bị ....................................................................................... 27
3.4 Hóa chất ............................................................................................................... 28
3.5 Phương pháp nghiên cứu ................................................................................... 33
3.5.1

Thu thập và xử lý mẫu .................................................................................. 33

3.5.2

Phân lập vi khuẩn nội sinh ........................................................................... 33

3.5.3

Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn ....................... 34

3.5.4

Đo kích thước tế bào vi khuẩn ..................................................................... 34

3.5.5

Nhuộm Gram vi khuẩn ................................................................................. 35

3.5.6

Thí nghiệm khảo sát khả năng tổng hợp NH4+............................................. 36

3.5.7

Thí nghiệm khảo sát khả năng tổng hợp IAA .............................................. 38

3.5.8

Đánh giá khả năng hòa tan lân khó tan ........................................................ 40

3.5.9

Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn ............................................................. 40

3.5.10 Nhận diện một số dòng vi khuẩn nội sinh .................................................... 41
3.5.11 Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................ 43

Chuyên ngành Vi sinh vật học

iii

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37-2014

Trường Đại học Cần Thơ

CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 44

4.1.

Kết quả phân lập vi khuẩn ............................................................................ 44
4.1.1. Đặc điểm khuẩn lạc .................................................................................. 46
4.1.2. Đặc điểm tế bào vi khuẩn ......................................................................... 48

4.2. Kết quả khảo sát khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn đã phân lập
dựa trên lượng NH4+ (ammonium) tổng hợp được. ................................................. 50
4.2.1. So sánh khả năng tạo ammonium của các dòng vi khuẩn được phân lập từ rễ cây
Diệp hạ châu (Nhóm 1) ................................................................................................. 52
4.2.2. So sánh khả năng tạo ammonium của các dòng vi khuẩn phân lập được từ lá của
cây Diệp hạ châu (Nhóm 2) ......................................................................................... 553
4.2.3. So sánh khả năng tạo ammonium của các dòng vi khuẩn phân lập được từ thân
và trái của cây Diệp hạ châu (Nhóm 3) ......................................................................... 55
4.2.4.So sánh khả năng tạo ammonium của các dòng vi khuẩn triển vọng nội sinh trong
cây Diệp hạ châu............................................................................................................ 56
4.3. Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp indol−3−acetic acid (IAA) của các dòng
vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây Diệp hạ châu....................................................... 57
4.3.1. So sánh khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phân lập được từ rễ cây
Diệp hạ châu (Nhóm 1) ................................................................................................. 59
4.3.2. So sánh khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phân lập được từ lá cây
Diệp hạ châu (Nhóm 2) ................................................................................................. 60
4.3.3. So sánh khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phân lập được từ thân và
trái cây Diệp hạ châu (Nhóm 3) .................................................................................... 61
4.3.4. .So sánh khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn triển vọng nội sinh trong
cây Diệp hạ châu............................................................................................................ 63
4.4. Kết quả khảo sát khả năng hòa tan lân ở các dòng vi khuẩn phân lập được
trên môi trường PDA .................................................................................................. 64
4.5. Kết quả khả năng kháng khuẩn ở các dòng vi khuẩn ...................................... 65
4.5.1. Khả năng kháng khuẩn với vi khuẩn gây bệnh ở đường ruột (E. coli) ............... 65

4.5.2. Khả năng kháng khuẩn với vi khuẩn gây bệnh A. hydrophila ............................ 68
4.6. Kết quả nhận diện một số dòng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR ........................ 71

Chuyên ngành Vi sinh vật học

iv

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37-2014

Trường Đại học Cần Thơ

CHƯƠNG V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................. 74
5.1. Kết luận ................................................................................................................. 74
5.2. Đề nghị ................................................................................................................... 74
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 75
PHỤ LỤC .........................................................................................................................
Phụ lục 1: Kết quả thí nghiệm. .......................................................................................
Phụ lục 2: Hình biểu đồ đường chuẩn NH4+ và IAA ....................................................
Phụ lục 3: Kết quả thống kê ...........................................................................................
Phụ lục 4. Kết quả giải trình tự ......................................................................................

Chuyên ngành Vi sinh vật học

v

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37-2014

Trường Đại học Cần Thơ

DANH SÁCH BẢNG
Tên Bảng

Trang

Bảng 1: Thành phần các chất trong phản ứng PCR....................................................... 30
Bảng 2: Môi trường PDA .............................................................................................. 30
Bảng 3: Môi trường NFb (Krieg và Dobereiner, 1984) ................................................ 31
Bảng 4: Thành phần dung dịch vi lượng ....................................................................... 31
Bảng 5: Thành phần dung dịch Vitamin........................................................................ 32
Bảng 6: Môi trường NBRIP đặc (Nautiyal, 1999) ........................................................ 32
Bảng 7: Chu kỳ phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen của vi khuẩn nội sinh ................ 42
Bảng 8. Vị trí phân lập và địa điểm thu mẫu ................................................................. 45
Bảng 9. Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường PDA ... 48
Bảng 10. Đặc điểm tế bào của các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường PDA ....... 49
Bảng 11: Khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn .............................................. 51
Bảng 12: Lượng IAA của các dòng vi khuẩn tạo ra ...................................................... 58
Bảng 13: Lượng IAA của các dòng vi khuẩn phân lập từ lá ......................................... 60
Bảng 14: Lượng IAA của các dòng vi khuẩn phân lập từ thân và trái .......................... 62
Bảng 15. Hiệu quả hòa tan lân của dòng vi khuẩn ........................................................ 65
Bảng 16. Khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn với vi khuẩn E. coli .................. 66
Bảng 17. Khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn với vi khuẩn A. hydrophila.. 69
Bảng 18. Kết quả giải trình tự một số dòng vi khuẩn triển vọng .................................. 71

Chuyên ngành Vi sinh vật học

vi

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37-2014

Trường Đại học Cần Thơ

DANH SÁCH HÌNH
Tên Hình

Trang

Hình 1. Bản đồ hành chính tỉnh Sóc Trăng ..................................................................... 3
Hình 2. Cây Diệp Hạ Châu (Phyllanthus amarus L.) ..................................................... 5
Hình 3.Công thức hóa học của Phyllanthin ..................................................................... 7
Hình 4. Nhuộm gram E. coli ......................................................................................... 19
Hình 5. Nhuộm gram Aeromonas hydrophyla .............................................................. 20
Hình 6. Sự thay đổi màu của dãy dung dịch NH4+ chuẩn từ nồng độ thấp đến nồng độ
cao theo phương pháp Indophenol Blue ........................................................................ 38
Hình 7. Sự thay đổi màu của dãy dung dịch IAA chuẩn từ nồng độ thấp đến nồng độ
cao theo phương pháp Salkowski .................................................................................. 40
Hình 8: Môi trường NFb bán đặc (a) và vòng pellicle sau khi chủng vi khuẩn (b) ...... 44
Hình 9: Một số khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập được trên môi trường PDA .............. 47
Hình 10.Vi khuẩn Gram âm (dòng SR6) và vi khuẩn Gram dương (dòng SL2) .......... 49
Hình 11. Lượng ammonium của các dòng vi khuẩn phân lập từ rễ .............................. 53
Hình 12. Lượng ammonium của các dòng vi khuẩn phân lập từ lá .............................. 54
Hình 13. Lượng ammonium của các dòng vi khuẩn phân lập từ thân và trái ............... 55

Hình 14. Lượng ammonium do các dòng vi khuẩn triển vọng tổng hợp ...................... 56
Hình 15. Lượng IAA của các dòng vi khuẩn phân lập từ rễ ......................................... 59
Hình 16: Hàm lượng IAA trung bình của các dòng vi khuẩn triển vọng ...................... 63
Hình 17: Vòng halo do dòng SR8 tạo ra khi chủng vào trong môi trường NBRIP. ..... 64
Hình 18: Khả năng kháng khuẩn của dòng SL5 và SR5 với vi khuẩn E. coli ............. 67
Hình 19: Khả năng đối kháng của dòng SL2 và ST3 với A. hydrophila ....................... 69
Hình 20: Phổ điện di các dòng vi khuẩn với cặp mồi 16S-rRNA ................................. 71

Chuyên ngành Vi sinh vật học

vii

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37-2014

Trường Đại học Cần Thơ

TỪ VIẾT TẮT
BLAST:

Basic Local Alignment Search Tool

CTAB:

Cetyltrimethyl ammonium bromide

DNA:

Deoxyribonucleic Acid

dNTP:

Deoxyribonucleotide triphosphate

ĐBSCL:

Đồng bằng sông Cửu long

EDTA:

Ethylen Diamine Tetra Acetic Acid

IAA:

Indole-3-acetic acid

NBRIP:

National Botanical Research Institute's phosphate

NCBI:

National Center for Biotechnology information

OD:

Optical Density

PCR:

Polymerase Chain Reaction

PDA:

Potato dextrose agar

PGPR:

Plant growth - promoting rhizobacteria

RNA:

ribonucleic acid

STT:

Số thứ tự

TE:

Tris-EDTA

VKNS:

Vi Khuẩn Nội Sinh

Chuyên ngành Vi sinh vật học

viii

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37-2014

Trường Đại học Cần Thơ

CHƯƠNG I. GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Trong thiên nhiên, có rất nhiều cây cỏ có chất kháng khuẩn và Việt Nam có
nguồn dược liệu vô cùng phong phú. Chúng thường là những cây cỏ rất quen thuộc,
mọc hoang dại hoặc được trồng ngay trong vườn nhà. Nhiều cây thuốc đã được các
nhà khoa học nghiên cứu và tìm thấy những chất kháng khuẩn có tác dụng diệt nhiều
loại vi khuẩn.
Diệp hạ châu (Phyllanthus amarus L.) là loài thuốc quý có khả năng chữa trị
nhiều bệnh như: khôi phục chức năng gan, điều hòa huyết áp, lợi mật, diệt khuẩn, chữa
viêm răng, mụn nhọt, lở ngứa, tiêu hóa, hạn chế tác động sinh trưởng của virus (đặc
biệt là virus viêm gan B).
Theo Patel et al. (2011), chất chiết với cồn của P. amarus được chứng minh là có
hoạt tính cao nhất chống lại Salmonella typhi qua phương pháp khuếch tán trên thạch
với đường kính vòng vô khuẩn là 8,0 mm so với đường kính vòng vô khuẩn của
ciprofloxacin, ofloxacin và amoxicillin lần lượt là 9,0; 6,0 và 4,0 mm. Dịch chiết thân
lá của Diệp hạ châu có đặc tính kháng khuẩn đối với Bacillus cereus ATCC 11778, B.
subtilis ATCC 6633, Bacteroides fragilis ATCC 25285, E. faecalis ATCC 29212, E.
coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853, S. aureus ATCC 25923, S.
pidermidis ATCC 12228 và Streptococcus pyogenes ATCC 19615 với nồng độ ức chế
tối thiểu (MIC) từ 0,25 đến 16 mg/mL. Kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học đã
xác định trong lá của Diệp hạ châu đắng có chứa nhiều nhóm hoạt chất. Trong đó,

đáng chú ý có hợp chất hypophyllanthin, phyllantin, lignan,…
Cũng như những loại cây trồng khác thì cây dược liệu cũng có vi khuẩn nội sinh.
Chúng có khả năng kích thích cây phát triển tốt thông qua khả năng cố định đạm, hòa
tan lân, sản xuất hoocmon tăng trưởng làm giảm chi phí sản xuất. Đặc biệt chúng còn
có khả năng sản xuất trực tiếp các hợp chất kháng khuẩn tự nhiên (Strobel et
al., 2003).
Tuy nhiên, việc nghiên cứu tập đoàn vi sinh vật sống nội sinh trong cây dược liệu
chưa được quan tâm nhiều. Đề tài: “Phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây Diệp hạ châu
(Phyllanthus amarus L.) mọc hoang tại tỉnh Sóc Trăng” được thực hiện để tuyển chọn
các dòng vi khuẩn nội sinh có ích cho sự phát triển của cây trồng, đặc biệt là đặc tính
kháng khuẩn ứng dụng trong lĩnh vực y học.
Chuyên ngành Vi sinh vật học

1

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37-2014

Trường Đại học Cần Thơ

1.2 Mục tiêu đề tài
Phân lập và tuyển chọn được các dòng vi khuẩn nội sinh sống trong cây Diệp hạ
châu (Phyllanthus amarus L.) mọc hoang ở huyện Long Phú − Sóc Trăng có các đặc
tính tốt như: tính kháng khuẩn, khả năng cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp IAA.

Chuyên ngành Vi sinh vật học

2

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37-2014

Trường Đại học Cần Thơ

CHƯƠNG II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Điều kiện tự nhiên của tỉnh Sóc Trăng.
2.1.1 Vị trí địa lý
Tỉnh Sóc Trăng nằm ở cửa Nam sông Hậu, cách thành phố Hồ Chí Minh 231 km,
cách Cần Thơ 62 km; nằm trên tuyến Quốc lộ 1A nối liền các tỉnh Cần Thơ, Hậu
Giang, Bạc Liêu và Cà Mau. Quốc lộ 60 nối Sóc Trăng với các tỉnh Trà Vinh, Bến Tre
và Tiền Giang.
- Vị trí tọa độ: 9o12’ - 9o56’ vĩ Bắc và 105 o33’ - 106 o23’ kinh Đông.
- Diện tích tự nhiên 3.311,7629 km2 (chiếm khoảng 1% diện tích cả nước
và 8,3% diện tích của khu vực đồng bằng sông Cửu Long).
- Đường bờ biển dài 72 km và 3 cửa sông lớn: Định An, Trần Đề và Mỹ
Thanh đổ ra Biển Đông.
(Nguồn: , truy cập ngày 30/8/2014)

Hình 1. Bản đồ hành chính tỉnh Sóc Trăng
(Nguồn: truy cập ngày 30/8/2014)

Chuyên ngành Vi sinh vật học

3

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37-2014

Trường Đại học Cần Thơ

2.1.2 Đặc điểm địa hình
Sóc Trăng có địa hình thấp và tương đối bằng phẳng. Độ cao cốt đất tuyệt đối từ
0,4 - 1,5 m, độ dốc thay đổi khoảng 45 cm/km chiều dài. Nhìn chung địa hình tỉnh Sóc
Trăng có dạng lòng chảo, cao ở phía sông Hậu và biển Đông thấp dần vào trong, vùng
thấp nhất là phía Tây và Tây Bắc. Tiểu địa hình có dạng gợn sóng không đều, xen kẽ
là những giồng cát địa hình tương đối cao và những vùng thấp trũng nhiễm mặn, phèn.
Đó là những dấu vết trầm tích của thời kỳ vận động biển tiến và lùi tạo nên các giồng
cát và các bưng trũng ở các huyện Mỹ Tú, thị xã Sóc Trăng, Mỹ Xuyên, Long Phú và
Vĩnh Châu. Vùng đất phèn có địa hình lòng chảo ở phía Tây và ven kinh Cái Côn có
cao trình rất thấp, từ 0 - 0,5 m, mùa mưa thường bị ngập úng làm ảnh hưởng tới hoạt
động sản xuất và đời sống nhân dân trong vùng. Vùng cù lao trên sông Hậu cũng có
cao trình thấp, thường bị ngập khi triều cường, vì vậy để đảm bảo sản xuất phải có hệ
thống đê bao chống lũ.
(Nguồn: , truy cập ngày 30/8/2014)

2.1.3 Khí hậu
Sóc Trăng nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới chịu ảnh hưởng gió mùa, hàng năm
có mùa khô và mùa mưa rõ rệt, mùa mưa từ tháng 5 đến tháng 10, mùa khô từ tháng
11 đến tháng 4 năm sau. Nhiệt độ trung bình hàng năm là 26,8 oC, ít khi bị bão lũ.
Lượng mưa trung bình trong năm là 1,864 mm, tập trung nhất từ tháng 8, 9, 10, độ ẩm
trung bình là 83%, thuận lợi cho cây lúa và các loại hoa màu phát triển.
(Nguồn: , truy cập ngày 30/8/2014)

2.2 Sơ lược về Diệp hạ châu

Diệp hạ châu thuộc chi Phyllanthus, họ thầu dầu Euphorbiaceae. Bộ này có hơn
6500 loài thuộc 300 chi. Euphorbiaceae là bộ lớn từ những cây thân thảo đến cây bụi
hay cây gỗ nhỏ (Lewis et al., 1977).

Chuyên ngành Vi sinh vật học

4

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37-2014

Trường Đại học Cần Thơ

Tên gọi:
Tên khoa học: Phyllanthus amarus Schum. et Thonn, tên đồng danh
khác Phyllanthus niruri auct., non L. (Phạm Hoàng Hộ, 1999).
Tên thông thường: Diệp hạ châu đắng, chó đẻ thân xanh, trân châu thảo, diệp
hòe thái, lão nha châu,…
Khóa phân loại:
Giới: Plantae
Ngành: Magnoliophyta
Lớp: Magnoliopsida
Bộ: Euphorbiales
Họ: Euphorbiaceae
Chi: Phyllanthus
Loài: Phyllanthus amarus Schum. et Thonn.
(Phạm Hoàng Hộ, 1999).
2.2.1 Mô tả

Diệp hạ châu (Phyllanthus amarus L.). Cỏ nhất niên cao đến 60 cm, thân tròn,
láng; nhánh ngắn 5-6 cm, mang lá nhỏ. Lá có phiến tròn dài, to 5-11 x 3-6 mm, tà 2
đầu, gân phụ mảnh, 4 cặp, lá bẹ hẹp, nhọn. Hoa ở nách lá. Nang tròn to 3 mm; trái có
sọc dọc ở lưng, n = 13 (Phạm Hoàng Hộ, 1999).

Hình 2. Cây Diệp Hạ Châu (Phyllanthus amarus L.)
(Hình chụp, ngày 17/10/2014)

Chuyên ngành Vi sinh vật học

5

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37-2014

Trường Đại học Cần Thơ

Có 3 loại Diệp hạ châu:
 Cây Diệp hạ châu thân xanh (Diệp hạ châu đắng) Phyllanthus niruri (tên dồng
nghĩa Phyllanthus amarus): Toàn thân có màu xanh tươi, cành ngắn, rất ít phân
nhánh, phiến lá có màu xanh nhạt, ngắn và mỏng hơn Diệp hạ châu thân đỏ.
Khi nhai có vị đắng nên trong đông y được gọi là cây Diệp hạ châu đắng.
 Cây Diệp hạ châu đỏ (Diệp hạ châu ngọt) Phyllanthus urinaria: thân có màu
hanh đỏ và thường đậm nơi gốc cành, phân nhánh rất nhiều, phiến lá có màu
xanh hơi đậm, dài và dày hơn cây Diệp hạ châu thân xanh. Khi nhai có vị ngọt
nên trong đông y được gọi là cây Diệp hạ châu ngọt.
 Một loài Diệp hạ châu nữa là Phyllanthus sp. Có màu xanh đậm, lá rời rạc,
phiến lá hẹp và chóp nhọn hơn so với hai loài kia. Loài này không được dùng

để làm thuốc.
2.2.2 Phân bố
Diệp hạ châu có nguồn gốc xa xưa ở vùng nhiệt đới Nam Mĩ và hiện nay phân
bố rải rác khắp các vùng nhiệt đới. Ở Châu Á, vùng phân bố của Diệp hạ châu gồm các
nước Ấn Độ, Malaysia, Philippin, Indonesia, Thái Lan, Campuchia, Lào, Việt Nam,
Nam Trung Quốc và cả ở vùng đảo Salawesi. Ở Việt Nam, Diệp hạ châu cũng thấy rải
rác khắp nơi, từ các tỉnh ở vùng đồng bằng, ven biển, các đảo lớn đến các tỉnh ở trung
du và miền núi, có độ cao dưới 800m. Ở các nước Đông Nam Á, độ cao phân bố này
có thể đến 1000m (Van Holthoon et al., 1999).
Diệp hạ châu là cỏ dạy phổ biến và phát triển tốt trên đất ẩm ướt, nơi râm và
nắng (Cabieses, 1993; Nanden-Amattaram, 1998).
Cây ưa sáng, có thể hơi chịu bóng khi còn nhỏ hoặc mọc xen lẫn với những loại
cây cỏ khác. Cây thường mọc ở đất ẩm trong vườn, ruộng trồng hoa màu, ven đường
đi hay trên nương rẫy. Cây con mọc từ hạt thường xuất hiện vào khoảng cuối mùa
xuân, sinh trưởng nhanh trong vòng 2 tháng của mùa hè, sau đó ra hoa quả và tàn lụi.
Toàn bộ vòng đời của cây chỉ kéo dài 3−4 tháng, hạt của Diệp hạ châu tồn tại trên mặt
đất 7 – 8 tháng vẫn còn sức nẩy mầm (Ðỗ Huy Bích et al., 2004).
Phyllanthus amarus thường được xác định nhầm với cây Phyllanthus niruri L.
về hình dạng, cấu trúc và dược tính. Phyllanthus niruri đạt chiều dài 60 cm, trái lớn
hơn, hạt có màu nâu đậm và mụn cơm (Morton et al., 1981).

Chuyên ngành Vi sinh vật học

6

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37-2014

Trường Đại học Cần Thơ

2.2.3 Thành phần hoá học
Trong lá Phyllanthus amarus chứa một chất đắng là phyllanthin, không có
quinin hoặc alcaloid khác. Lá khô chứa các chất đắng hypophyllanthin (0,05%) và
phyllanthin (0,35%) gây độc đối với cá và ếch. Ngoài ra, trong cây có chứa niranthin,
nitetralin và phyteralin (Ðỗ Huy Bích et al., 2004).

Hình 3. Công thức hóa học của Phyllanthin
(Nguồn:

/>
truy

cập

ngày

24/11/2014)

Từ phần trên mặt đất của cây Diệp hạ châu đắng bằng các phản ứng định tính đã
phát hiện có chứa các nhóm chất có hoạt tính sinh lý cao là đường khử, alkaloid,
saponin, steroid, flavonoid, cumarin và các chất polyphenol khác. Trong đó, 4 chất có
hoạt tính sinh học cao trong cây Diệp hạ châu: β-sitosterol, hidroxymetylfufural, acid
galic và kampherol (Ngô Đức Trọng và Phạm Văn Thỉnh, 2008).
Các chất hypophyllanthin, phyllanthin đây là hai lignan đã được chứng minh là có
hoạt tính bảo vệ gan trên mô hình gây độc tế bào gan bằng CCl4 và D-GalN/TNF
(Nguyễn Văn Đậu, 2003).
Từ dịch chiết aceton của Diệp hạ châu đắng, các nhà khoa học Đài Loan đã tách
được geraniin và 1,3,4,6-tetra-O-galloyl-β-D-glucose (Chien-Min Yang và Hua-Yew

Cheng, 2007). Các thí nghiệm in vitro đã chỉ ra hai chất này có hoạt tính chống lại virus
bệnh mụn rộp ngoài da và không gây độc.
Từ loài Diệp hạ châu đắng ở Đài Loan đã tìm được các hợp chất sau: phyllanthin,
phyltetralin,

trimetyl-3,4-dehydrochebulate,

metylgallat,

rhamnocitrin,

methyl

brevifolincarboxylat, β-sitosterol-3-O-β-d-glucopyranosid, quercitrin và rutin (ChienMin Yang và Hua-Yew Cheng, 2007).
Chuyên ngành Vi sinh vật học

7

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37-2014

Trường Đại học Cần Thơ

Các hợp chất trên đã được nghiên cứu một cách kỹ lưỡng về khả năng chống oxy
hóa và khả năng làm thuốc kháng viêm. Các chất phyllanthin, metylgallat, methyl
brevifolincarboxylat có khả năng chống oxy hóa tốt. Còn trong các thí nghiệm in vitro
khác, các chất còn lại đều có hoạt tính kháng viêm cao, ngoại trừ β-sitosterol-3-O-β-dglucopyranosid.
2.2.4 Tính kháng khuẩn của cây Diệp hạ châu

Diệp hạ châu ức chế DNA polymerase ở virus viêm gan B và virus viêm gan
khác, có hoạt tính in vitro và in vivo kháng virus viêm gan B và các virus có liên quan,
có hoạt tính in vitro đối kháng với enzyme transcriptase ngược với retrovirus, và có thể
có hoạt tính kháng lại retrovirus. Trong các nghiên cứu lâm sàng sơ bộ, những người
mang virus viêm gan B được điều trị với liều lượng hằng ngày 200mg trên toàn cây
Diệp hạ châu (loại bỏ rễ) trong 30 ngày. Kết quả 22/37 (59%) bệnh nhân được điều trị
đã mất kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B khi làm xét nghiệm ở 15 đến 29
ngày sau khi kết thúc điều trị, so với tỷ lệ 1/23 (4%) bệnh nhân đối chứng dùng
placebo có hiện tượng này. Một số đối tượng được theo dõi đến 9 tháng, không có
kháng nguyên bề mặt nào xuất hiện trở lại. Không thấy có hoặc có ít tác dụng độc. Tuy
vậy tác dụng của Diệp hạ châu trong việc điều trị những người mang virus viêm gan B
không rõ ràng, có cả những trường hợp thành công và thất bại được báo cáo. Cây cũng
có tính kháng khuẩn và kháng nấm (Ðỗ Huy Bích et al., 2004).
Một số công trình nghiên cứu sử dụng cây Diệp hạ châu kháng lại virus viêm
gan B:
 Năm 1961, phòng Đông Y Viện Vi trùng Việt Nam, nghiên cứu tác dụng kháng
sinh của cây Diệp hạ châu đắng thấy kết quả tác dụng kháng sinh như sau: Tụ
cầu trùng (0,5 cm), Typhi (0,9 cm), Flexneri (1,1cm), Sonnei (0 cm), Shiga
(1cm), Subtilis (0,4 cm), Coli (0 cm) (Đỗ Tất Lợi, 1997).
 Năm 1977, một nhóm bác sĩ Việt Nam, khoa Tiêu hoá, Gan, Mật đã sử dụng bài
thuốc gia truyền của Lương y Trần Xuân Thiện gồm 3 vị là Diệp hạ châu,
xuyên tâm liên, quả dành dành để điều trị cho những người có kết quả xét
nghiệm HBsAg (+). Sau một thời gian điều trị, kết quả xét nghiệm âm tính
được coi là khỏi. Tỷ lệ đạt 26/98 bệnh nhân. Ngoài ra, thuốc còn giúp cơ thể

Chuyên ngành Vi sinh vật học

8

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37-2014

Trường Đại học Cần Thơ

người dùng sản xuất kháng thể chống HBsAg (59/98 người). Liều điều trị trung
bình 4−5 tháng (Nguyễn Thượng Dong, 2001).
 Năm 1988, Blumberg và Thiogarajan công bố đã điều trị 37 bệnh nhân viêm
gan do virus B bằng Diệp hạ châu. Sau 3 ngày dùng thuốc, 22 bệnh nhân đạt kết
quả tốt và chứng minh Diệp hạ châu có chất ức chế men polymerase ADN của
virus viêm gan B (Đỗ Tất Lợi, 1997).
 Năm 2002, Nguyễn Bá Kinh và cộng sự đã công bố kết quả nghiên cứu lâm
sàng tại Bệnh viện Thanh Nhàn (Hà Nội), đã sử dụng chế phẩm LIV/94 (Diệp
hạ châu đắng là một trong 3 thành phần chính của thuốc) điều trị cho các bệnh
nhân viêm gan mãn tính trong 2 năm (2001−2002) đạt kết quả tốt. Thuốc có tác
dụng làm giảm và sạch HBsAg của bệnh nhân (Nguyễn Thượng Dong, 2001).
 Những công trình nghiên cứu hóa học gần đây về các loài Phyllanthus đã phát
hiện một vài lignan, flavonoid và tanin thủy phân có tác dụng bảo vệ gan, có
khả năng làm sạch phần lớn các kháng nguyên HBsAg, ức chế mạnh HIV
transcriptase ngược (Jangfang Quian, 1996).
 Các thí nghiệm in vitro của cây Diệp hạ châu với kháng nguyên HBsAg và với
tổn thương gan do cacbontetraclorit gây nên đã chứng minh Diệp hạ châu đắng
có khả chống virus viêm gan B. Cây Diệp hạ châu đắng có tác dụng kháng
khuẩn đối với tụ cầu vàng, trực khuẩn mủ xanh, trực khuẩn E. coli, Shigella
dysenteriae, S. flexneri, S. shigae, Moraxella và kháng nấm đối với Aspergillus
fumigatus (Đỗ Huy Bích et al., 2004).
 Cây Diệp hạ châu đắng có khả năng tác động rất tốt trên vi khuẩn gây bệnh trên
cá là Edwardsiella tarda gây áp xe gan thận, gây bệnh trên tôm càng xanh
(Quinn, 1994), Edwardsiella tarda còn lây nhiễm từ cá sang người gây tiêu

chảy, viêm hệ thống niệu, viêm màng não, viêm nội tâm mạc, viêm dạ dày ruột,
áp xe vòi trứng, áp xe vùng chậu; gây nhiễm khuẩn dạ dày ruột, viêm ruột già,
áp xe ở gan và bệnh kiết lỵ ở người (Janda et al., 1991).
 Các mầm bệnh này đã kháng rất nhiều kháng sinh mạnh và gây thiệt hại đáng
kể cho các nhà nuôi trồng thủy sản. Mặt khác, việc sử dụng kháng sinh điều trị
đã gây chi phí cao và sự tồn dư kháng sinh trong sản phẩm thủy sản ảnh hưởng
đến sức khỏe con người, còn là rào cản các doanh nghiệp Việt Nam trong xuất
khẩu. Phát hiện khả năng kháng các vi khuẩn gây bệnh trên cá của cây Diệp hạ
Chuyên ngành Vi sinh vật học

9

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37-2014

Trường Đại học Cần Thơ

châu đắng sẽ góp phần không nhỏ trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản (Huỳnh
Kim Diệu và Lê Thị Loan Em, 2011).
2.3 Sơ lược về vi khuẩn nội sinh
Vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn sống toàn bộ hay một phần thời gian của chu kì
sống của chúng trong mô thực vật, không làm tổn thương mô mà những loại vi khuẩn
này có lợi ích đối với cây trồng (Kobayashi et al., 2000; Bandara et al., 2006). Nó có
giá trị trong nông nghiệp như một công cụ thực hiện cải tiến mùa màng
(Muthukumarasamy et al., 2002).
Từ vùng rễ, chúng xâm nhập vào mô thực vật xuyên qua vùng rễ theo 3 cách là:
bám ở bề mặt rễ và tìm cách chui vào rễ chính hay rễ bên (lateral roots), thông qua
lông hút, giữa các tế bào nhu mô rễ hay biểu bì rễ để sống nội sinh như: Azotobacter,

Bacillus, Beijerinckia, Derxia, Enterobacteriaeae (Klebsiella, Enterobacter, Pantonae),
Pseudomonas, Alcaligenes, Azoarcus, Burkholderia, Campylobacter, Herbaspirillum
Gluconacetobacter và Paenibacillus (Elmerich Claudine et al., 2007). Tuy nhiên, nó
cũng có thể xâm nhập vào các mô thông qua khí khẩu hay các vị trí bị tổn thương của
lá (Roos et al., 1983).
Sau khi xâm nhập vào cây chủ có thể tập trung tại vị trí xâm nhập hoặc di chuyển
đi khắp nơi trong cây đến các hệ mạch của rễ, thân, lá, hoa (Zinniel et al., 2002), thúc
đẩy các quá trình chuyển hóa trong cây, sự phát triển lông rễ một cách mạnh mẽ và
giảm sự kéo dài rễ (Harari et al., 1988). Hiện nay các nhà nghiên cứu quan tâm nhiều
đến những loài vi khuẩn nội sinh có đặc tính tốt như vi khuẩn có khả năng cố định nitơ
trong không khí (Xu et al., 1998), tổng hợp kích thích tố auxin (Barbieri et al., 1993),
giúp loại bỏ các chất gây ô nhiễm môi trường (Rosenblueth et al., 2006), tăng hàm
lượng các chất khoáng, tăng khả năng kháng bệnh (Fahey et al., 1991), hòa tan lân khó
tan cho cây trồng hấp thụ tốt chất dinh dưỡng (Lăng Ngọc Dậu et al., 2007).
2.3.1

Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh
Là nhóm vi khuẩn liên kết với thực vật, chúng hình thành sự liên hợp với cây chủ

của chúng bằng cách hình thành tập đoàn ở các mô bên trong. Đối với nông nghiệp,
phần lớn vi khuẩn nội sinh không gây hại cho sinh vật chủ mà ngược lại chúng còn
được xem là công cụ để cải tiến năng suất cây trồng nhờ tính sinh học của chúng
(Muthukumarasamy et al., 2002).

Chuyên ngành Vi sinh vật học

10

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37-2014

2.3.1.1

Trường Đại học Cần Thơ

Khả năng cố định đạm

Các quá trình cố định đạm sinh học tự nhiên nhờ vi khuẩn cố định đạm, hằng
năm trên thế giới có khoảng 160−176 triệu tấn nitơ trong khí quyển đã được cố định và
chuyển hóa thành nguồn phân đạm dưới các dạng khác nhau (Hardy et al., 1972;
Gibson, 1995). Lượng đạm này ước tính gấp khoảng 2 lần lượng phân bón sản xuất ra
hàng năm trên toàn thế giới. Cố định đạm sinh học là một quá trình được thực hiện bởi
vi khuẩn, trong đó nitơ phân tử được biến đổi thành dạng nguyên tử, sau đó thành dạng
đạm vô cơ phân tử ammonia, tiếp đó vi khuẩn sẽ chuyển hóa tiếp một phần thành dạng
đạm hữu cơ acid amin để sử dụng cho bản thân vi khuẩn. Quan hệ cộng sinh có vai trò
hết sức quan trọng trong sự ổn định chu trình dinh dưỡng nitơ, bổ sung nguồn đạm cho
đất và dinh dưỡng cây trồng, ổn định năng suất mùa vụ, phát triển bền vững sinh thái.
Đạm là chất dinh dưỡng rất cần thiết và quan trọng cho sự phát triển của thực
vật. Trong không khí có rất nhiều đạm (78%) nhưng cây trồng không hấp thu trực tiếp
được. Các vi sinh vật cố định đạm có khả năng khử đạm (N2) thành dạng đạm mà cây
trồng hấp thụ được nhờ sự xúc tác của enzyme nitrogenase. Enzyme nitrogenase cấu
tạo bởi hai thành phần: protein sắt và protein sắt-molybden. Như vậy cây trồng có thể
sử dụng nguồn đạm vô tận trong không khí nhờ sự giúp đỡ của các vi sinh vật cố định
đạm. Phản ứng khử N2 dưới sự xúc tác của enzyme nitrogenase có thể được viết tóm
tắt như sau:
N2 + 6e- + 12 ATP + 12H2O  3NH4+ + 12ADP + 12Pi + 4H+
Quá trình khử này bao gồm nhiều phản ứng nối tiếp nhau:
N2 +2H+  [NH=NH] + 2H+  [NH2-NH2] + 2H+ 2NH3

Ammonia được tạo ra trong chu trình tiếp tục đồng hóa tạo thành những acid
amin cung cấp cho cây trồng (Nguyễn Lân Dũng et al., 2007).
2.3.1.2

Khả năng hòa tan lân khó tan

Lân là nguyên tố dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của cây
trồng. Cây trồng chỉ có thể sử dụng được lân từ đất dưới dạng hòa tan trong đất. Vì
vậy, cây trồng chỉ có thể sử dụng được lân ở dạng dễ tiêu trong đất. Có nhiều loại đất
như đất đỏ bazan, đất đen...hàm lượng lân trong đất khá cao, nhưng cây không sử dụng
được vì lân ở dạng khó tan.
Nồng độ của lân hòa tan trong đất thông thường rất thấp, bình thường ở mức
1μg/mL hoặc ít hơn (10M H2PO4-) (Goldstein, 1994). Tế bào có thể sử dụng nhiều loại
Chuyên ngành Vi sinh vật học

11

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37-2014

Trường Đại học Cần Thơ

lân nhưng lượng lớn nhất được hấp thụ là dạng HPO42- và H2PO4-. Dạng phổ biến của
lân hiện diện trong đất là dạng vô cơ như là apatite, hydroxyapatite, và oxyapatite.
Hầu hết đất nông nghiệp chứa lượng lớn lân, một phần đáng kể trong đó được
tích tụ là kết quả của việc bón phân lân thường xuyên. Tuy nhiên, một lượng lớn
phosphate vô cơ hòa tan cung cấp cho đất dưới dạng phân bón hóa học thì nhanh
chóng bị cố định và trở thành dạng khó sử dụng đối với cây. Hiện tượng cố định và kết

tủa P trong đất thường phụ thuộc lớn vào pH và dạng đất. Trong đất acid, lân bị cố
định bởi oxide và hydroxide của nhôm và sắt, trong khi ở đất kiềm nó bị cố định bởi
canxi, làm giảm hiệu quả của phân bón lân hòa tan, chẳng hạn super calcium
(Richardson, 1994).
Thành phần chính thứ hai của lân trong đất là vật chất hữu cơ. Trong hầu hết
đất, dạng lân hữu cơ có thể chiếm đến 30−50% tổng số P, nhưng nó có thể nằm trong
khoảng từ 5−95% (Paul và Clark, 1988). Phân hữu cơ trong đất chủ yếu ở dạng
inositol phosphate (phytate đất). Nó được tổng hợp bởi vi sinh vật và cây và là dạng
hữu cơ ổn định của P trong đất, chiếm trên 50% tổng số P hữu cơ (Dalal, 1977). Hợp
chất P hữu cơ khác trong đất là dạng phosphomonoeste, phosphodieste bao gồm
phospholipid, acid nucleic và phosphotrieste.
Nhiều loài vi khuẩn có khả năng chuyển hóa dạng lân khó tan trong đất như
calcium monohydrogen phosphate (CaHPO4), calcium monohydrogen dihydrat
phosphate (CaHPO4.2H2O), calcium orthophosphate (Ca3(PO4)2) thành dạng lân dễ tan
để cây trồng sử dụng. Vi khuẩn và nấm có khả năng chuyển hóa lân dạng khó tan đã
được phân lập trong các loại đất ở BĐSCL (Đặng Thị Huỳnh Mai và Cao Ngọc Điệp,
2002). Kucey et al. (1989), Rashid et al. (2004) giải thích sự hòa tan lân dạng khó tan
trong đất là do sự bài tiết của các acid hữu cơ và xác định tác nhân này làm giảm pH
đất, điều này rất quan trọng trong cơ chế hòa tan lân dạng khó tan trong đất. Sự có mặt
của các acid hữu cơ như: acid lactic, acid citric, acid gluconic, acid succinic, acid
fumaric, acid acetic, acid oxalic... trong đất cũng là nguyên nhân làm giảm pH đất.
Sự khoáng hóa của những hợp chất này được thực hiện bởi hoạt động của nhiều
phosphatase (còn được gọi là phosphohydrolase). Những phản ứng khử phosphoryl
liên quan đến sự thủy phân cầu nối phosphoeste hoặc phosphoanhydride.
Phosphohydrolase acid, không giống phosphatase kiềm, hoạt động xúc tác tối ưu ở giá
trị pH từ acid đến trung tính. Hơn thế nữa, chúng còn được phân nhóm thành

Chuyên ngành Vi sinh vật học

12

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37-2014

Trường Đại học Cần Thơ

phosphatase acid đặc hiệu hoặc không đặc hiệu, liên quan đến tính đặc hiệu cơ chất
của chúng. Phosphohydrolase đặc hiệu với những hoạt tính khác nhau bao gồm 3’nucleotidase, 5’-nucleotidase, hexose phosphatase và phytase. Một nhóm đặc hiệu của
enzyme giải phóng P có thể cắt cầu nối C-P từ phosphonate hữu cơ (Rossosilini et al.,
1998).
2.3.1.3

Khả năng tổng hợp Auxin Indole-3-acetic acid (IAA)

Auxin Indole-3-acetic acid là chất điều hòa chủ yếu của sự sinh trưởng thực vật;
IAA chi phối sự phân chia tế bào, sự giãn dài tế bào, phân hóa sinh mô, phát triển trái
và hạt, chi phối giai đoạn đầu sự phát triển của cây trồng. Tác động của auxin phụ
thuộc vào dạng tế bào, ở các nồng độ như nhau IAA kích thích đồng thời sự giãn dài
trục lá mầm, ngăn cản sự sinh trưởng của rễ chính, kích thích sự khởi đầu của rễ bên
và sự thành lập lông rễ (Theologis và Ray, 1982; Gray et al., 2001).
Một số loài của các giống Azospirillum, Gluconacetobacter và Pseudomonas là
những vi khuẩn cố định đạm nhưng nhờ vào khả năng tổng hợp auxin của chúng nên
cũng được xem là vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng thực vật (PGPR), góp phần
làm tăng sản lượng cây trồng (Kloepper et al., 1989).
2.3.1.4

Đối kháng sinh học

Vi khuẩn nội sinh có thể có khả năng làm yếu đi hay ngăn cản tác hại của các sinh
vật gây hại, điều này có thể dẫn đến hiện tượng gia tăng kháng bệnh (ISR = induced
systemic resistance) hay kích kháng (SAR = systemic-acquired resistance). Nhiều thí
nghiệm đã chứng minh vai trò của vi khuẩn nội sinh trong việc ngăn chặn tác hại của
nấm Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum trên bông vải (Chen et al., 1995); nấm
Fusarium oxysporum f. sp. pisi trên đậu pea (Benhamou et al., 1996).
2.3.2

Một số vi khuẩn nội sinh

2.3.2.1 Vi khuẩn Klebsiella
Vi khuẩn Klebsiella thuộc nhóm γ – Proteobacteria, là vi khuẩn gram âm, có
dạng hình que, không hay ít chuyển động, kết nang, sống kị khí không bắt buộc. Có
hai loài quan trọng là Klebsiella pneumoniae và Klebsiella oxytoca. Klebsiella được
đặt theo tên nhà vi khuẩn học người Đức thế kỷ 19, Edwin Klebs (1834−1913).

Chuyên ngành Vi sinh vật học

13

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học