tuyển chọn nấm men có tiềm năng lên men rượu vang ca cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

TUYỂN CHỌN NẤM MEN
CÓ TIỀM NĂNG LÊN MEN RƯỢU VANG CA CAO

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

SINH VIÊN THỰC HIỆN

PGS.TS. NGUYỄN VĂN THÀNH

NGUYỄN THỊ THANH TÚ
MSSV: 3113766
LỚP: DA11Y3A1 K37

Cần Thơ, Tháng 8/2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

TUYỂN CHỌN NẤM MEN

CÓ TIỀM NĂNG LÊN MEN RƯỢU VANG CA CAO

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

SINH VIÊN THỰC HIỆN

PGS.TS. NGUYỄN VĂN THÀNH

NGUYỄN THỊ THANH TÚ
MSSV: 3113766
LỚP: DA11Y3A1 K37

Cần Thơ, Tháng 8/2014


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

SINH VIÊN THỰC HIỆN

(ký tên)

(ký tên)

PGS.TS. Nguyễn Văn Thành

Nguyễn Thị Thanh Tú

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN
……………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………..

Cần Thơ, ngày tháng

năm 2014

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(ký tên)

Chuyên ngành Vi sinh vật học khóa 37

i

Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

LỜI CẢM TẠ
Em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Văn Thành –

người Thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất để em có thể
hoàn thành đề tài nghiên cứu.
Xin gửi lời cảm ơn đến cố vấn học tập – Thầy Phạm Hồng Quang đã luôn giúp
đỡ, động viên em khi em gặp khó khăn trong học tập. Sự hỗ trợ nhiệt tình cùng những
lời khuyên của thầy đã giúp em hoàn thành tốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Chân thành cảm ơn anh Nguyễn Ngọc Thạnh và Bùi Hoàng Đăng Long – Cán
bộ phụ trách phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực đã đóng góp ý kiến, giúp đỡ
và tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đề tài.
Xin cảm ơn gia đình, anh chị cán bộ các phòng thí nghiệm của Viện Nghiên
cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Anh Chị học viên cao học và tất cả bạn bè lớp Vi
sinh vật học khóa 37 đã động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian qua.
Kính chúc quý thầy cô được nhiều sức khỏe, thành công trong công tác nghiên
cứu và luôn có những cống hiến quý báu cho sự nghiệp giáo dục và đào tạo.
Xin chân thành cảm ơn!

Chuyên ngành Vi sinh vật học khóa 37

ii

Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

TÓM LƯỢC
Với mục đích tuyển chọn dòng nấm men thuần chủng có hoạt lực lên men mạnh
thích hợp lên men rượu vang ca cao cũng như tận dụng sản phẩm phụ là dịch trái ca
cao cùng với hạt lên men, nghiên cứu được tiến hành trên cơ sở (i) Phân lập nấm men

thuần từ dịch trái ca cao lên men tự nhiên và hạt ca cao lên men thu được từ các
huyện Giồng Trôm, Chợ Lách và Thành phố - Bến Tre (ii) Khảo sát hoạt tính lên men
của các dòng nấm men, tuyển chọn dòng nấm men lên men mạnh nhất (iii) Khảo sát
các yếu tố (Brix, pH và mật số nấm men) ảnh hưởng đến khả năng lên rượu vang ca
cao. Kết quả nghiên cứu đã tuyển chọn được dòng nấm men DCL1 trong 18 dòng nấm
men đã phân lập, từ mẫu dịch ca cao lên men tự nhiên ở Chợ Lách – Bến Tre có hoạt
lực lên men cao hơn các dòng nấm men còn lại và cao hơn dòng nấm men 2.1 (đối
chứng) với độ rượu là (12,14 % v/v) và độ Brix sau lên men thấp (10,770Brix). Rượu
vang ca cao lên men từ nấm men tuyển chọn với dịch phối chế ban đầu: 240Brix, pH 4
và MSNM là 103 tế bào/mL, lên men ở nhiệt độ 300C và 10 ngày cho độ rượu cao nhất
(14,6 % v/v).
Từ khóa: dịch và hạt trái ca cao, phân lập, tuyển chọn, lên men, rượu vang ca
cao.

Chuyên ngành Vi sinh vật học khóa 37

iii

Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

MỤC LỤC
PHẦN KÝ DUYỆT ...................................................................................... i
LỜI CẢM TẠ ............................................................................................... ii
TÓM LƯỢC ................................................................................................. iii
MỤC LỤC .................................................................................................... iv

DANH SÁCH KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT .......................................... vii
DANH SÁCH BẢNG ................................................................................... viii
DANH SÁCH HÌNH .................................................................................... ix
CHƯƠNG I. MỞ ĐẦU................................................................................. 1
1.1. Đặt vấn đề............................................................................................ 1
1.2. Mục tiêu đề tài ..................................................................................... 1
1.3. Nội dung nghiên cứu............................................................................ 1
CHƯƠNG II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................... 2
2.1. Nguyên liệu ca cao............................................................................... 2
2.1.1. Phân loại thực vật cây ca cao......................................................... 2
2.1.2. Các giống ca cao ........................................................................... 3
2.1.3. Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng..................................... 4
2.2. Nấm men ............................................................................................. 5
2.2.1. Đặc điểm hình thái nấm men ......................................................... 5
2.2.2. Cấu tạo tế bào nấm men ................................................................ 6
2.2.3. Phân loại nấm men ........................................................................ 7
Các phương pháp thực nghiệm dùng để định tên nấm men .................. 7
1.

Quan sát hình thái tế bào nấm men và đo kích thước .................... 7

2.

Quan sát quá trình nẩy chồi của tế bào nấm men .......................... 8

3.

Quan sát đặc tính nuôi cấy............................................................ 9

4.

Nhuộm màu tế bào nấm men ........................................................ 10

5.

Xác định khả năng lên men các loại đường................................... 13

6.

Xác định hoạt tính phân giải Urea ................................................ 14

2.2.4. Đặc điểm sinh lý và sinh hóa của nấm men ................................... 14
2.2.5. Sinh sản nấm men ......................................................................... 15
2.2.6. Dinh dưỡng của nấm men.............................................................. 17
2.2.7. Nhu cầu dinh dưỡng của nấm men................................................. 17
Chuyên ngành Vi sinh vật học khóa 37

iv

Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

2.2.8. Sự trao đổi chất của nấm men........................................................ 18
2.2.9. Những nhân tố ảnh hưởng hoạt tính nấm men ............................... 19
2.2.10. Hệ vi sinh vật trong dịch trái ca cao............................................. 20
2.3. Quá trình lên men rượu vang ............................................................... 21

2.3.1. Khái quát......................................................................................... 21
2.3.2. Phản ứng thủy phân lớp thịt bao quanh hạt ca cao ........................... 21
2.3.3. Phản ứng sinh hóa xảy ra bên trong hạt ca cao ................................ 22
2.3.4. Cơ chế của quá trình lên men ca cao ............................................... 22
2.4. Một số nghiên cứu về đề tài phân lập, tuyển chọn và ứng dụng nấm
men tự nhiên lên men rượu vang................................................................. 22
CHƯƠNG III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 24
3.1. Phương tiện nghiên cứu ....................................................................... 24
3.1.1. Địa điểm nghiên cứu ....................................................................... 26
3.1.2. Thiết bị và dụng cụ.......................................................................... 24
3.1.3. Hóa chất.......................................................................................... 24
3.1.4. Nguyên vật liệu .............................................................................. 24
3.1.5. Phương pháp thí nghiệm ................................................................. 25
3.2. Phương pháp nghiên cứu...................................................................... 25
3.2.1. Thí nghiệm 1: Phân lập nấm men từ dịch ca cao và hạt ca cao lên men tự
nhiên ......................................................................................................... 25

3.2.2. Thí nghiệm 2: Tuyển chọn một số dòng nấm men có tiềm năng
cao nhất để lên men rượu vang ................................................................. 26
3.2.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của độ Brix, pH và mật số nấm men
đến khả năng lên men rượu vang ca cao từ nấm men tuyển chọn .............. 29
CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................. 31
4.1. Thí nghiệm 1: Phân lập nấm men từ dịch ca cao và hạt ca cao lên
men tự nhiên............................................................................................... 31
4.1.1. Kết quả phân lập nấm men .............................................................. 31
4.1.2. Đặc điểm sinh lý của 18 dòng nấm men .......................................... 37
4.2. Thí nghiệm 2: Tuyển chọn dòng nấm men có tiềm năng cao nhất để
lên men rượu vang ..................................................................................... 40
4.2.1. Chiều cao cột khí CO2 ở ống Durham ............................................ 40
Chuyên ngành Vi sinh vật học khóa 37

v

Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

4.2.2. Khả năng lên men của các dòng nấm men ....................................... 41
4.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của độ Brix, pH và mật số nấm men
đến khả năng lên men rượu vang ca cao từ nấm men tuyển chọn ................ 43
CHƯƠNG V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................... 45
5.1. Kết luận ............................................................................................... 45
5.2. Đề nghị................................................................................................ 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................ 46
PHỤ LỤC

Chuyên ngành Vi sinh vật học khóa 37

vi

Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

DANH SÁCH KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Kí hiệu

Nội dung

2.1

Dòng nấm men đối chứng của viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

HGT1

Dòng nấm men hình oval nhỏ phân lập từ hạt trái ca cao lên men ở Giồng Trôm – Bến Tre

HGT2

Dòng nấm men hình elip ngắn phân lập từ hạt trái ca cao lên men ở Giồng Trôm – Bến Tre

HGT3

Dòng nấm men hình cầu phân lập từ hạt trái ca cao lên men ở Giồng Trôm – Bến Tre

HGT4

Dòng nấm men hình elip dài phân lập từ hạt trái ca cao lên men ở Giồng Trôm – Bến Tre

HGT5

Dòng nấm men hình cầu nhỏ phân lập từ hạt trái ca cao lên men ở Giồng Trôm – Bến Tre

DGT1

Dòng nấm men hình cầu lớn phân lập từ dịch trái ca cao lên men tự nhiên ở Giồng Trôm –
Bến Tre

DGT2

Dòng nấm men hình oval phân lập từ dịch trái ca cao lên men tự nhiên ở Giồng Trôm –
Bến Tre

DGT3

Dòng nấm men hình elip dài phân lập từ dịch trái ca cao lên men tự nhiên ở Giồng Trôm –
Bến Tre

HCL1

Dòng nấm men hình dài phân lập từ hạt trái ca cao lên men ở Chợ Lách – Bến Tre

HCL2

Dòng nấm men hình elip ngắn phân lập từ hạt trái ca cao lên men ở Chợ Lách – Bến Tre

HCL3

Dòng nấm men hình elip dài phân lập từ hạt trái ca cao lên men ở Chợ Lách – Bến Tre

HCL4

Dòng nấm men hình oval lớn phân lập từ hạt trái ca cao lên men ở Chợ Lách – Bến Tre

DCL1

Dòng nấm men hình oval nhỏ phân lập từ dịch trái ca cao lên men tự nhiên ở Chợ Lách –
Bến Tre

DCL2

Dòng nấm men hình cầu nhỏ phân lập từ hạt trái ca cao lên men ở Giồng Chợ Lách – Bến
Tre

HBT1

Dòng nấm men hình oval lớn phân lập từ hạt trái ca cao lên men ở Thành phố – Bến Tre

HBT2

Dòng nấm men hình elip dài phân lập từ hạt trái ca cao lên men ở Thành phố – Bến Tre

HBT3

Dòng nấm men hình cầu lớn phân lập từ hạt trái ca cao lên men ở Thành phố – Bến Tre

DBT1

Dòng nấm men hình cầu lớn phân lập từ dịch trái ca cao lên men tự nhiên ở Thành phố –
Bến Tre

NT

Nghiệm thức

PGA

Môi trường nuôi cấy Potato (khoai tây) – Glucose – Agar

MSNM

Mật số nấm men

PE

Polyester

PG

Propylene Glycol

PPO

Enzyme Polyphenoloxydase

EMP

Embden Meyerhof Parnas – chu trình đường phân

Chuyên ngành Vi sinh vật học khóa 37

vii

Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1. Phân loại thực vật cây ca cao........................................................... 2
Bảng 2. phân loại ca cao.............................................................................. 2
Bảng 3. Thành phần hóa học của vỏ ca cao .................................................. 4
Bảng 4. Thành phần hóa học của lớp cơm nhầy ca cao................................. 4
Bảng 5. Thành phần hóa học của dịch ca cao ............................................... 5
Bảng 6. Hóa chất.......................................................................................... 26
Bảng 7. Khả năng lên men đường glucose và saccharose của 18 dòng nấm
men phân lập................................................................................................ 40
Bảng 8. Chiều cao cột khí CO2 ở ống Durham (cm) ..................................... 42
Bảng 9. Độ Brix, pH và độ cồn trung bình sau thời gian lên men 10 ngày.... 43
Bảng 10. Độ Brix, pH và độ cồn trung bình sau thời gian lên men 10 ngày.. 45

Chuyên ngành Vi sinh vật học khóa 37

viii

Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

DANH SÁCH HÌNH
Hình 1. Cây ca cao ...................................................................................... 2
Hình 2. Cấu tạo hạt ca cao........................................................................... 5
Hình 3.Nấm men nẩy chồi........................................................................... 16
Hình 4. Nấm men phân cắt.......................................................................... 17
Hình 5. Bố trí thí nghiệm tổng quát ............................................................. 27
Hinh 6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân lập nấm men từ dịch ca cao và hạt ca cao 28
Hình 7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tuyển chọn dòng nấm men có tiềm năng
cao nhất để lên men rượu vang .................................................................... 30
Hình 8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của độ Brix, pH và mật số
nấm men đến khả năng lên men rượu vang ca cao từ nấm men tuyển chọn.. 32
Hình 9. Hình dạng tế bào nấm men (vật kính 100) phân lập từ dịch trái ca
cao lên men tự nhiên ở Chợ Lách (Bến Tre) ............................................... 33
Hình 10. Hình dạng tế bào nấm men (vật kính 100) phân lập từ hạt trái ca
cao được nuôi tăng sinh ở Chợ Lách (Bến Tre) ........................................... 34
Hình 11. Hình dạng tế bào nấm men (vật kính 100) phân lập từ dịch trái ca
cao lên men tự nhiên ở Giồng Trôm (Bến Tre) ............................................ 35
Hình 12. Hình dạng tế bào nấm men (vật kính 100) phân lập từ hạt trái ca
cao được nuôi tăng sinh ở Giồng Trôm (Bến Tre) ....................................... 37
Hình 13. Hình dạng tế bào nấm men (vật kính 100) phân lập từ dịch trái ca
cao lên men tự nhiên ở Thành phố (Bến Tre)............................................... 38
Hình 14. Hình dạng tế bào nấm men (vật kính 100) phân lập từ hạt ca cao
được nuôi tăng sinh ở Thành phố (Bến Tre) ................................................ 39
Hình 15. Sự thay đổi màu sắc khi thử nghiệm trên môi trường Christensen
của 18 dòng nấm men.................................................................................. 41
Hình 16. Biểu đồ thể hiện độ Brix và độ cồn của rượu vang sau lên men .... 44
Hình 17. Biểu đồ mặt đáp ứng độ cồn với độ Brix và pH ............................ 48
Hình 18. Biều đồ đường mức độ cồn với độ Brix và pH.............................. 48

Chuyên ngành Vi sinh vật học khóa 37

ix

Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

CHƯƠNG I
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Ca cao có nguồn gốc từ Trung và Nam châu Mỹ. Ca cao là loại cây công nghiệp
đã từng có mặt tại Việt Nam, nhưng không mang lại hiệu quả kinh tế cao. Những năm
gần đây, do được sự hợp tác và đầu tư của Hà Lan, Mỹ, cây ca cao đang dần “sống” lại
và trở thành mục tiêu cho bà con nông dân cũng như các nhà sản xuất chuyên chế biến
các loại hạt giàu giá trị dinh dưỡng này. Tuy nhiên, hạt ca cao trước khi lên men phải
qua công đoạn ép tách nước từ lớp cơm nhầy của hạt để đảm bảo chất lượng hạt sau
lên men.
Trong quá trình lên men, đã tạo ra một loại phế liệu là dịch từ cơm ca cao.
Nhưng loại dịch trái này tương đối giàu giá trị dinh dưỡng vì nó chứa protein, muối
khoáng và hàm lượng đường cao lại có vị chua ngọt hài hòa, hương thơm thoang
thoảng nên rất thích hợp để lên men rượu vang. Ngoài ra, việc sản xuất vang từ hạt ca
cao còn mang ý nghĩa đa dạng hóa sản phẩm giúp cải thiện đời sống, tăng năng suất.
Trên thế giới, nhất là các nước Châu Âu, rượu vang đã có từ lâu đời và được
dùng rất phổ biến. Còn ở nước ta, việc tiêu thụ rượu vang tuy không mạnh nhưng từng
bước được người tiêu dùng ưa chuộng do có độ cồn nhẹ, hương vị thơm tự nhiên, có
tác dụng kích thích tiêu hoá và rượu vang dần dần được chọn thay cho các loại rượu
mạnh (Vũ Công Hậu, 1987) trong các dịp lễ tết. Tuy nhiên, công nghiệp sản xuất rượu

vang nước ta còn nhiều hạn chế, quy mô sản xuất chủ yếu dưới dạng thủ công, lên men
tự nhiên chưa có cơ sở khoa học cũng như phương pháp hợp lý dẫn đến năng suất và
chất lượng sản phẩm chưa cao.
Để giải quyết các vấn đề đó, đề tài “Tuyển chọn dòng nấm men có tiềm năng
lên men rượu vang ca cao” được tiến hành.
1.2. Mục tiêu đề tài
Tuyển chọn dòng nấm men có hoạt lực lên men cao thích hợp với lên men rượu
vang ca cao.
1.3. Nội dung nghiên cứu
 Phân lập được một số dòng nấm men có trong dịch và hạt ca cao lên men tự
nhiên.

Chuyên ngành Vi sinh vật học khóa 37

1

Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

 Tuyển chọn dòng nấm men tự nhiên có hoạt lực lên men cao, thích hợp với lên
men rượu vang ca cao.
 Khảo sát điều kiện lên men (bao gồm tổ hợp các nhân tố pH, độ Brix và mật số
nấm men) cho lên men rượu vang ca cao đạt chất lượng cao.

Chuyên ngành Vi sinh vật học khóa 37

2

Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

CHƯƠNG II
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Nguyên liệu ca cao
Trái ca cao được lấy từ Bến Tre có màu vàng đỏ, chủ yếu là giống Forastero.
2.1.1. Phân loại thực vật cây ca cao
Cây ca cao có tên khoa học là Theobroma cocoa L. Là loài duy nhất trong số 22
loài của thứ Theobroma được trồng và sản xuất.
Bảng 1. Phân loại thực vật cây ca cao
Giới

Plantae

Ngành

Magnoliophyta

Lớp

Magnoliopsida

Phân lớp

Bộ

Dilleniidae
Malvales

Họ

Sterculiaceae

Giống

Theobroma

Loài

T. Cacao

(Theo nguồn: />
Hình 1. Trái ca cao

2.1.2. Các giống ca cao
Bảng 2. Phân loại ca cao
Quần thể

Thành phần
Vỏ

Hạt

Giá trị

Forastero

Criolo

Trinitario

Độ cứng

Mềm, xốp

Cứng

Phần nhiều cứng

Màu sắc

Đỏ-vàng

Xanh-vàng

Xanh-đỏ-tím-vàng

Số hạt/ trái

23 – 30

>30

>30

Màu tử điệp

Trắng ngà

Tím nhạt -> tím thẫm

Nhiều màu, ít đốm trắng

Hình dạng

Hơi tròn

Hơi dẹp

Chất lượng

Rất thơm, ít đắng

Trung bình

Ttrung gian giữa 2 nhóm
trên

Thương phẩm

Cao nhất

80 % sản lượng thế

10 -> 15 sản lượng thế

giới

giới

(Theo nguồn: Đào Kim Ngọc, 2013)
Chuyên ngành Vi sinh vật học khóa 37

3

Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

2.1.3. Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng ca cao
Trái ca cao có 3 thành phần chính: vỏ, cơm ca cao và hạt ca cao
2.1.3.1. Vỏ
Chiếm phần lớn trọng lượng trái ca cao (70 – 78 %).
Bảng 3. Thành phần hóa học vỏ ca cao
Thành phần

Trung bình
(% của tổng lượng chất khô)

Protein

6,25

Xơ

27,3

Tro

8,10

Na

0,01

K

3,20

Ca

0,44

P

0,09

(Theo nguồn: Đào Kim Ngọc, 2013)

Ngoài ra, nó còn chứa 3 – 4 % kali trên trọng lượng khô. Chính vì vậy, đây là
nguồn cung cấp phân bón giàu kali. Tro đốt từ vỏ ca cao được dùng làm xà phòng.

Vỏ ca cao khô, xay nhỏ dùng làm thức ăn cho bò, dê và cừu với tỷ lệ 50 % khẩu
phần, heo 30 %, gà 20 %. Bột vỏ ca cao có thể thay thế bắp với tỷ lệ trộn 35 % (Theo
Bo Gohl, 1981).
2.1.3.2. Cơm ca cao
Hạt ca cao được bao quanh bởi cơ chất dịch cơm nhầy. Lớp cơm nhầy có vị chua,
ngọt, thơm đặc trưng.
Bảng 4. Thành phần hóa học của lớp cơm nhầy ca cao
Thành phần

Đường

Pentosan

Alitannin

Muối

Tỷ lệ (%)

10 – 13

2–3

1 – 1,5

7 – 10

(Theo nguồn: Đào Kim Ngọc, 2013)

Chuyên ngành Vi sinh vật học khóa 37

4

Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

Bảng 5. Thành phần hóa học của dịch ca cao
Thành phần

Forastero

Trinitario

Fructose (mg/mL)

62

42

Glucose (mg/ mL)

41

24

Sucrose (mg/mL)

32

21

Protein (mg/mL)

6

6

Muối khoáng (mg/mL)

8

8

Ethanol (% v/v)

0,5

0,3

Acid citric (mg/mL)

2,4

2,1

Acid lactic (mg/mL)

0,3

0,3

Acid acetic (mg/mL)

0,4

0,4

pH

3,7

4,8

(Theo nguồn: Đào Kim Ngọc, 2013)

2.1.3.3. Hạt ca cao
Là thành phần chính của trái ca cao. Trong trái thường có 5 hàng hạt bám quanh
cùi. Mỗi hạt có lớp vỏ nhầy bao quanh.

Hình 2. Cấu tạo hạt ca cao
(Theo nguồn: />
2.2. Nấm men
2.2.1. Đặc điểm hình thái nấm men
Tế bào nấm men có dạng hình cầu, hình elip, hình ovan, hình quả chanh, hình
trụ, hình chùy hoặc hình sợi. Trong các giai đoạn phát triển và điều kiện môi trường
xung quanh, nấm men có thể thay đổi hình dạng và kích thước. Tuy nhiên, hình thái

của nấm men không thay đổi chỉ ở các giống nuôi cấy khi còn trẻ trong các môi trường
dinh dưỡng tiêu chuẩn.
Kích thước của tế bào nấm men tương đối lớn so với các vi sinh vật khác. Đường
kính khoảng 7 μm và chiều dài khoảng 8 - 12 μm. Trọng lượng riêng của tế bào nấm
men khoảng 1,055 – 1,060 (Lương Đức Phẩm, 2006).
Chuyên ngành Vi sinh vật học khóa 37

5

Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

2.2.2 Cấu tạo tế bào nấm men
Nấm men là sinh vật đơn bào, tế bào nấm men cơ bản giống như ở động vật và thực vật.
So sánh cấu tạo tế bào nấm men với vi khuẩn ta thấy có sự tiến hóa nhảy vọt từ nhân sơ lên
nhân chuẩn. Cấu tạo của tế bào nấm men phức tạp, bao gồm các thành phần sau:
Vỏ tế bào: mang điện, có thể đàn hồi để định hình và bảo vệ tế bào chống lại các
tác động bên ngoài và chất độc. Tác dụng của vỏ tế bào là giữ áp suất thẩm thấu nội
bào, điều chỉnh các chất dinh dưỡng (hợp chất có phân tử lượng thấp, muối khoáng) đi
qua các lỗ nhỏ vào trong tế bào. Ở vùng giữa vỏ thành tế bào với màng tế bào chất có
nhiều loại enzyme, chủ yếu là enzyme thủy phân.
Màng tế bào chất: bao quanh tế bào chất, chiều dày không quá 0,1 nm. Chức
năng của màng tế bào chất: rào chắn thẩm thấu, điều chỉnh chất dinh dưỡng từ môi
trường vào trong tế bào, cho các sản phẩm trao đổi chất ra ngoài tế bào, thực hiện sinh
tổng hợp một số hợp phần của tế bào, là nơi khu trú của một số enzyme và cơ quan tử
của tế bào như riboxom. Sự vận chuyển chất qua màng liên quan đến tính thấm của

màng. Đặc tính này phụ thuộc trước hết vào enzyme phospholipase và lipase.
Tế bào chất: còn gọi là nguyên sinh chất, cấu trúc không đồng nhất, ở thể keo,
chứa tất cả cấu trúc cơ bản của tế bào: riboxom, mạng lưới nội chất, ty thể, các chất dự
trữ.
Microxom hay lipoxom: ở đây xảy ra các quá trình sinh tổng hợp protein cho tế
bào từ các acid amin đã được hoạt hóa ở hệ thống ty thể. Các acid amin này nối với
nhau theo lệnh của nhân, được chuyển qua ARN đi vào các phản ứng sinh tổng hợp
protein.
Ty thể: dạng hạt nhỏ, dạng que hay dạng sợi mảnh, dài khoảng 0,2 – 7,5 μm, phân
bố trong tế bào chất ở giữa khoảng vỏ tế bào và không bào. Những chất dinh dưỡng thấm
vào nội bào được hấp thụ và tích lũy bởi ty thể sẽ nhanh chóng thành dạng đậm đặc
nhờ các enzyme tương ứng tham gia. Chức năng của ty thể là nơi thực hiện các phản
ứng năng lượng quan trọng như: quá trình phosphoryl hóa, chu trình Krebs, hoạt hóa
acid amin đi vào riboxom để tham gia quá trình sinh tổng hợp protein, hoạt hóa các
chất béo và nhiều hợp chất khác.
Không bào: chứa dịch bào. Dịch bào chứa các chất điện ly hòa tan trong nước,
protein, chất béo, carbohydrate, enzyme, K, Na, Mg, Ca và muối của chúng.
Chuyên ngành Vi sinh vật học khóa 37

6

Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

Nhân: bao gồm vỏ, hạch nhân và chất nhân.
Vỏ nhân tham gia vào điều hòa các quá trình trong nhân bằng cách thay đổi tính

thấm và thông báo trực tiếp giữa nhân với môi trường bên ngoài tế bào, giữa nhân và
tế bào chất (Lương Đức Phẩm, 2006).
2.2.3 Phân loại nấm men
Thuật ngữ nấm men (yeast, levure) chỉ là tên chung để chỉ nhóm vi nấm thường
có cấu tạo đơn bào và thường sinh soi nẩy nở bằng phương pháp nẩy chồi (budding).
Nấm men không thuộc về một taxon phân loại nào nhất định, chúng có thể thuộc
ngành Nấm túi (Ascomycota) hoặc ngành Nấm đảm (Basidiomycota).
(Nguồn: Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, 2006)
Các phươnng pháp thực nghiệm dùng để định tên nấm men
1. Quan sát hình thái tế bào nấm men và đo kích thước
Khi xác định hình thái và kích thước tế bào nấm men người ta thường nuôi cấy
nấm men trong môi trường thạch - mạch nha và môi trường mạch nha dịch thể. Nếu sử
dụng các môi trường khác thì hình thái và kích thước tế bào nấm men có thể thay đổi,
không phù hợp với hình thái và kích thước tiêu chuẩn đã được ghi trong bảng phân
loại. Môi trường mạch nha: Lấy lúa đại mạch đã ủ cho nẩy mầm (loại nhập khẩu dùng
để làm bia), đem phơi khô rồi xay nhỏ thành bột. Cân 1 kg bột này, thêm 3 lít nước,
giữ ở 600C để đường hoá cho đến khi hết tinh bột (thử với dịch Lugol không thấy có
màu xanh lam). Lọc lấy dịch trong có thể thêm 3 lòng trắng trứng rồi trộn đều, đun sôi
rồi lọc lấy dịch trong. Điều chỉnh bằng nước để có nồng độ đường đạt 6 o Baume. Phân
vào các dụng cụ thuỷ tinh đã khử trùng. Nếu làm môi trường đặc thì thêm 2% thạch.
Tốt nhất là dùng mầm đại mạch, nếu không thì có thể dùng mầm lúa. Nồng độ thích
hợp để nuôi cấy nấm men dùng khi phân loại là 5,7 o Baume. Có tài liệu lại sử dụng
nồng độ 5 – 80 Baume. Nấm men được nuôi cấy trong các ống nghiệm thạch nghiêng
hoặc các ống nghiệm đựng 3 ml môi trường dịch thể. Nuôi cấy ở 25 – 300C trong 3
ngày, sau đó lấy ra làm tiêu bản và quan sát. Muốn đo kích thước tế bào nấm men
người ta thường sử dụng trắc vi thị kính). Số tế bào nấm men được đo không ít hơn 20.
Chú ý là phải đo các tế bào trưởng thành chứ không đo các chồi mới nảy sinh. Tế bào
nấm men có hình thái và kích thước khác nhau tuỳ loài, tuỳ chi. Chúng có thể có hình
cầu, hình bầu dục, hình trứng, hình quả chanh châu Âu, hình ống v.v... Khi quan sát tế
Chuyên ngành Vi sinh vật học khóa 37

7

Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

bào nấm men dưới kính hiển vi có thể phân biệt được thành tế bào, tế bào chất, không
bào (vacuole) và các hạt dị nhiễm (metachromatic granules). Thành tế bào nấm men
thẫm hơn so với nguyên sinh chất, còn không bào thường có hình tròn, màu nhạt hơn.
Các hạt dị nhiễm thường bắt ánh sáng mạnh hơn, chúng lắc lư trong nguyên sinh chất
theo chuyển động Brown. Kích thước của tế bào nấm men khác nhau rất nhiều tuỳ loài
thuỳ chi, tuỳ điều kiện sinh trưởng và có thể thay đổi trong khoảng 1 – 5 x 5 – 30 µm
hay có khi dài hơn nữa. Kích thước tế bào của các loại nấm men thông thường vào
khoảng 4 – 5 µm (Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, 2006).
2. Quan sát quá trình nẩy chồi của tế bào nấm men
(sử dụng cho tế bào nấm men dinh dưỡng không có dạng sợi - non filamelletous
vegetative cells).
Cấy một vòng que cấy tế bào nấm men một ngày tuổi vào bình nón loại 100ml
chứa 30ml môi trường dịch thể (môi trường nước chiết mạch nha, môi trường cao nấm
men-pepton-glucoza hay môi trường mạch nha - cao nấm men - glucoza - pepton).
Môi trường mạch nha - cao nấm men - glucoza - pepton:
Nuôi cấy trong bình nón ở 25 – 280C sau 2 – 3 ngày
Cao mạch nha (malt extract)

3g

Cao nấm men (yeast extract)

3g

Glucose

10g

Pepton

5g

Nước

1000mL

Tiến hành lấy mẫu quan sát. Khi quan sát dưới kính hiển vi cần phân biệt được là nấm
men sinh sản theo cách nảy chồi hay phân cắt hoặc cả hai.
- Nếu nẩy chồi thì chồi xuất hiện ở đâu? ở cả hai đầu (hai cực) hay ở vị trí bất kỳ
nào trên tế bào? Số lượng chồi trên tế bào mẹ?
- Chồi con sau khi phát triển có rời khỏi tế bào mẹ hay không?
- Dạng và kích thước của tế bào? Chú ý: phương pháp này phải dùng với các môi
trường xác định và ở pha sinh trưởng logarit của tế bào. (Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn
Đình Quyến, 2006).

Chuyên ngành Vi sinh vật học khóa 37

8

Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

3. Quan sát đặc tính nuôi cấy
Để quan sát các đặc tính nuôi cấy của nấm men người ta thường cấy nấm men
lên môi trường dịch thể, môi thường thạch nghiêng và môi trường thạch đĩa (hoặc
dùng chai Roux). Cấy nấm men vào các ống nghiệm đựng 3ml môi trường mạch nha
10-150 Baling (xem phần “Quan sát hình thái tế bào nấm men và đo kích thước”).
Nuôi cấy ở 250C rồi sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 198 giờ lấy ra quan sát. Cần quan sát
xem nấm men có phát triển ở bề mặt dịch thể hay không. Nếu có thì chúng tạo thành
váng phủ kín, váng phủ không kín hay tạo thành một vòng quanh thành ống nghiệm.
Nấm men có lắng xuống thì quan sát xem cặn có dạng xốp, dạng nhày hay dạng rắn
chắc. Quan sát xem chất dịch vẫn trong hay đã trở nên đục. Dùng tay đập khẽ vào đáy
ống xem cặn có nổi lên hay không (nếu cặn xốp thì dễ nổi lên, nếu cặn rắn chắc thì
khó nổi lên). Dùng que cấy khều cặn, nếu cặn nhày thì dễ khều lên cả tảng, nếu không
thì khó khều. Nếu có váng thì cần quan sát xem bề mặt váng như thế nào, khô hay ướt,
phẳng mịn hay nhăn nheo và cũng cần quan sát xem váng dày hay mỏng. Để quan sát
sự phát triển của nấm men trên môi trường thạch nghiêng ta cấy nấm men lên trường
thạch - mạch nha 12-150 Baling sau đó để ở tủ ấm 25-300C. Quan sát ở ngày nuôi cấy
thứ 3 và thứ 14. Chú ý quan sát xem bề mặt của vết cấy là trơn nhẵn hay xù xì, ướt
bóng hay khô, có nếp nhăn hay không, màu sắc thế nào, mép thẳng hay mép răng cưa
v.v... Để quan sát khuẩn lạc ta đem môi trường thạch - mạch nha hoặc môi trường
gelatin - mạch nha phân vào các hộp Petri hay bình Roux, bình Kolle. Dùng que cấy
có đầu nhọn cấy nấm men thành một chấm ở chính giữa. Trước khi cấy cần làm khô bề
mặt (lớp thạch nên đổ dầy khoảng 5mm). Nuôi cấy ở 250C trong 14 đến 30 ngày. Lấy
ra quan sát khuẩn lạc lớn. Cần chú ý miêu tả:
- Kích thước khuẩn lạc (vẽ hình).

- Chiều dày khuẩn lạc (phải vẽ hình cắt ngang khuẩn lạc).
- Có tạo thành những vòng đồng tâm hay không?
- Có những hình tia phóng xạ hay không? (từ tâm đến giữa hay từ giữa đến
mép?)
- Giữa khuẩn lạc lồi lên, lõm xuống hay phẳng?
- Bề mặt trơn, nhẵn, bóng, ướt hay xù xì, ráp, có cấu tạo nhung hay gai, có nếp
nhăn hay không?
Chuyên ngành Vi sinh vật học khóa 37

9

Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

- Màu sắc khuẩn lạc.
(Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, 2006)
4. Nhuộm màu tế bào nấm men:
Muốn quan sát tế bào nấm men một cách tỷ mỷ hơn người ta thường sử dụng các
loại thuốc nhuộm để nhuộm cả tế bào hoặc một số phần tế bào nấm men. Có thể dùng
một trong những loại dung dịch thuốc nhuộm sau đây:
- Thuốc nhuộm safranin:
Dịch safranin 2,5% (trong cồn 95%)

10mL

Nước cất

100mL

Muốn nhuộm nhân của tế bào nấm men có thể sử dụng phương pháp sau đây:
Lấy một giọt nước đặt lên 1 phiến kính. Dùng que cấy lấy một ít nấm men hoà
vào giọt nước đó rồi dàn thành vết mỏng. Làm khô tự nhiên. Thêm vài giọt dung dịch
picroformol, giữ vài phút sau đó rửa bằng cồn 70%. Ngâm tiêu bản vào trong dung
dịch FeNH4(SO4).12H2O 3% trong 4-7 giờ. Lấy tiêu bản ra dùng nước rửa sạch sau đó
lại ngâm vào dịch thuốc nhuộm hematoxilin 10% trong 24 giờ. Lấy ra rửa nước rồi lại
ngâm vào dịch FeNH4(SO4).12H2O cho đến khi vừa mất màu thì lấy ra rửa sạch bằng
nước, làm khô rồi soi kính. Nguyên sinh chất của tế bào nấm men có màu tro còn nhân
tế bào có màu đen.
- Dung dịch lục malachite:
Lục malachit (malachite green)

1g

Nước

100mL (không đun nóng)

- Dung dịch Lugol:
Iot

2g

Iodua Kali

4g

Nước cất

100mL

(Nghiền nhỏ I và KI trong cối sứ rồi sau đó dùng nước hoà tan dần).
- Dung dịch xanh methylen (methylene blue)
Xanh methylen

1g

Nước cất

1000mL

Chuyên ngành Vi sinh vật học khóa 37

10

Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

(Có thể pha thành dung dịch 1% sau đó lọc rồi dùng nước cất pha loãng thêm 10
lần nữa).
- Dung dịch fuchsin cacbolic:
Fuchsin kiềm (basic fuchsin)

0,1g

Cồn 900

10mL

Dung dịch phenol 3%

90mL

(Hoà tan fuchsin trong cồn, sau đó trộn đều vào dung dịch phenol).
Có thể dùng que cấy, phết dịch nuôi cấy nấm men thành một lớp mỏng trên phiến
kính sau đó làm khô, cố định và nhuộm đơn bằng xanh methylen hay fuchsin cacbolic
như khi nhuộm tiêu bản vi khuẩn. Thường người ta dùng lamelle (lá kính mỏng) để
quan sát tế bào nấm men. Lấy một phiến kính sạch nhỏ lên đó một giọt thuốc nhuộm
(xanh methylen chẳng hạn). Giọt thuốc nhuộm không nên to quá (về sau sẽ tràn khỏi
lamelle), cũng không nên nhỏ quá (tạo thành nhiều bọt khí khi đậy lamelle). Lấy một ít
nấm men đã nuôi cấy 2 – 3 ngày hoà vào giọt thuốc nhuộm. Đặt một cạnh của lamelle
sát vào phía ngoài giọt mẫu rồi hạ từ từ lamelle xuống cho giọt mẫu tràn đều khắp
lamelle. Nếu tràn ra ngoài thì dùng giấy lọc thấm bớt. Soi ở vật kính nhỏ trước, sau đó
chuyển sang vật kính lớn. Có thể căn cứ vào mức độ bắt màu đậm nhạt để phân biệt
được tế bào sống và tế bào chết. Muốn quan sát các hạt glycogen trong tế bào nấm
men thì nhuộm bằng dung dịch Lugol. Tế bào sẽ có màu vàng nhạt còn các hạt
glicogen có màu đỏ nâu. Muốn quan sát các giọt mỡ trong tế bào nấm men có thể làm
tiêu bản như sau:
Rỏ một giọt formalin lên phiến kính, dùng que cấy lấy một ít nấm men đã nuôi
cấy 48 – 72 giờ hoà vào giọt formalin. Để yên 5 phút sau đó thêm một giọt dung dịch
thuốc nhuộm xanh methylen, lại thêm một giọt thuốc nhuộm soudan III. Đặt lamelle
dưới kính hiển vi rồi quan sát ta sẽ thấy nguyên sinh chất của tế bào nấm men bắt màu
lam nhạt, không bào không bắt màu còn các giọt mỡ có màu đỏ hồng.

- Thuốc nhuộm soudan III:
Soudan III

0,05g

Cồn 90%

100mL

Cũng có thể nhuộm các giọt mỡ bằng phương pháp sau đây: Lấy thuốc nhuộm
đen Soudan B (Soudan black B) cho vào ống nghiệm. Dùng que cấy lấy một ít nấm
Chuyên ngành Vi sinh vật học khóa 37

11

Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

men hoà vào dịch thuốc nhuộm này. Giữ 20 phút. Lấy khoảng 2 vòng que cấy dịch
thuốc nhuộm có nấm men phết lên phiến kính. Làm khô tự nhiên. Nhuộm tiêu bản
trong 30 giây bằng dịch thuốc nhuộm safranin. Rửa nước, đợi khô rồi soi kính.
Nguyên sinh chất của tế bào nấm men sẽ có màu đỏ nhạt còn các giọt mỡ có màu đen
lam.
- Thuốc nhuộm đen Soudan B (theo Burdon):
Soudan black B

0,3g

Cồn 70%

100mL

(Trộn đều, để 24 giờ rồi mới sử dụng. Dùng trong vòng một tháng).
- Dung dịch nhuộm nhân tế bào:
+ Dung dịch picroformol:
Dung dịch acid picric bão hoà

75 phần

Axetit acetic glacial

5 phần

Dung dịch fomol loãng

20 phần

+ Dung dịch ngâm FeNH4(SO4)2.12H2O
FeNH4(SO4)2.12H2O

3g

Nước

100mL

+ Dung dịch thuốc nhuộm hematoxilin
Hematoxilin

1g

Cồn

10mL

Nước

90mL

Hoà tan hematoxilin trong cồn, sau đó thêm nước, đậy nút bông rồi để 1 tháng
sau mới sử dụng.
Để quan sát tế bào nấm men có thể dùng dung dịch nigrozin 5%. Khi đó tế bào sẽ
không bắt màu, có thể phân biệt rõ trên một nền màu lam đen.
Để quan sát bào tử túi (tránh lầm với các không bào) có thể sử dụng một số các
phương pháp nhuộm bào tử đã được giới thiệu trong chương IV (phương pháp nghiên
cứu vi sinh vật học tập 1 NXB KHKT 1971). Cũng có thể nhuộm bào tử túi bằng
phương pháp sau đây: Rỏ 1 giọt nước lên phiến kính. Dùng que cấy lấy một ít nấm
men trộn vào giọt nước, dàn thành vết mỏng, để khô tự nhiên.
Chuyên ngành Vi sinh vật học khóa 37

12

Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

Cố định trên ngọn lửa bằng đèn cồn, nhuộm bằng dung dịch lục malachit. Nhuộm
2 phút, thường xuyên hơ trên ngọn lửa cho bốc hơi (không được đun sôi). Rửa nước
nhẹ, nhuộm thêm 30 giây bằng dung dịch safranin 0,5% trong nước. Nang bào tử sẽ
bắt màu xanh lục còn tế bào dinh dưỡng có màu hồng (Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn
Đình Quyến, 2006).
5. Xác định khả năng lên men các loại đường
Khả năng lên men các loại đường là một trong những chỉ tiêu quan trọng được sử
dụng để phân loại nấm men. Trong thí nghiệm này người ta thường sử dụng môi
trường nước chiết giá đậu hay môi trường chiết nấm men 0,5%.
- Cách làm môi trường nước chiết giá đậu: cân 200g giá đậu thêm 1000 mL
nước. Đun sôi 30 phút. Lọc lấy dịch trong rồi thêm nước cho đủ 1000mL.
- Cách làm môi trường nước chiết nấm men: cân 200g men bia ép (hay 100g men
bia khô) thêm 1000mL nước. Hấp bằng nồi hấp áp lực trong 15 phút ở nhiệt độ 1200C.
Lọc nóng qua nhiều lớp giấy lọc. Lại lọc nguội tới trong. Thêm nước cho đủ 1000mL.
Cũng có thể dùng cao nấm men với nồng độ sử dụng là 0,5%.
Cách tiến hành:
- Sử dụng ống nghiệm có kích thước 180 x16 mm. Đặt ngược một ống Durham
(50x6mm) (miệng của ống Durham chạm đáy ống nghiệm).
- Phân 10 – 15mL môi trường cơ sở (0,5% cao nấm men) và chứa từng nguồn
đường khác nhau, ở nồng độ 50mM (tương đương 1%) riêng với rafinoza 100mM
(tương đương 2%). Riêng ống kiểm tra là không có một nguồn đường nào. ống đối
chứng là D-glucoza. Các ống nghiệm chứa môi trường được khử trùng sau đó cấy vào
100μL (khoảng 2 giọt) dung dịch huyền phù nấm men có mật độ 107 tế bào/mL, để
250C sau một tuần.
- Quan sát việc tạo CO2 ở đáy ống Durham để biết nấm men có hay không có khả
năng lên men từng nguồn đường. Có nấm men chỉ có thể phát triển ở bề mặt dịch
huyền phù và chúng có khả năng đồng hoá các nguồn đường này.

- Chú ý: Theo phương pháp này một số trường hợp CO2 tạo ra thấp phải xác định
bằng điện cực CO2 hay dùng áp kế Warburg. Trong điều kiện có quá ít lượng đường
dùng làm thí nghiệm còn có thể hút môi trường chứa đường (và cấy nấm men) vào
những micropipet (hút đến 1/10mL). Đầu pipet sau đó được gắn bằng vaselin (đã trộn
Chuyên ngành Vi sinh vật học khóa 37

13

Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

thêm với một ít parafin). Nuôi cấy ở 25-300C và hằng ngày quan sát xem có bọt khí
sinh ra hay không, mức môi trường bị đẩy ra xa nhiều hay ít. Các thí nghiệm được tiến
hành đầu tiên bằng glucoza. Nếu nấm men có khả năng lên men glucoza thì hãy làm
tiếp thí nghiệm với các loại đường khác. Mỗi ngày quan sát kết quả lên men một lần,
quan sát trong 10 ngày liền (Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, 2006)
6. Xác định hoạt tính phân giải Urea (hay hoạt tính Ureaza)
- Môi trường Christensen:
Pepton :

1g

NaCl:

5g

KH2PO4 :

2g

Glucoza :

5g

Thạch:

20g

Nước:

1000mL

Đun tan môi trường, thêm 6ml dung dịch đỏ phenol (phenol red) có nồng độ
0,2% trong cồn. Khử trùng môi trường ở nồi hấp (1150C/15 phút). Đợi nguội đến 50 0C
thêm 100ml dung dịch urea (dung dịch 20% khử trùng riêng qua màng lọc). Phân vào
ống nghiệm thủy tinh vô trùng, làm thạch nghiêng. Sau đó cấy nấm men và giữ ở 260C
trong 7 ngày. Nếu nấm men có khả năng sinh ureaza để phân giải urea thì môi trường
sẽ chuyển màu đỏ xẫm. Cũng có thể tiến hành thí nghiệm với môi trường dịch thể
(Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, 2006).
2.2.4. Đặc điểm sinh lý và sinh hóa của nấm men
 Lên men 13 loại đường.
 Đồng hóa 46 nguồn carbon. Có thể dùng bộ kít chẩn đoán nhanh ID 32C
 (Bio Merieux SA, Marchy-l’Etoile).
 Tính chống chịu với 0,01% hoặc 0,1% cycloheximide (có thể bao gồm trong bộ
kit ID 32C).
 Đồng hóa 6 nguồn nitơ: nitrate, nitrite, ethylnamine hydrochloride, Llyzine,

cadaverine dihydrochloride, creatine.
 Sinh trưởng khi thiếu hụt một số vitamin (myo-Inositol, calcium pantothenate,
biotin, thiamine hydrochloride, pyridoxin hydrochloride, niacin, folic acid, paminobenzoic acid).
Chuyên ngành Vi sinh vật học khóa 37

14

Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học