ảnh hưởng của tdz và naa đến sự nhân chồi và tạo rễ in vitro cây hoa thược dược (dahlia variabilis desf.)

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

NGUYỄN THỊ THÊM

ẢNH HƢỞNG CỦA TDZ VÀ NAA ĐẾN SỰ NHÂN
CHỒI VÀ TẠO RỄ IN VITRO CÂY HOA THƢỢC
DƢỢC (Dahlia variabilis Desf.)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Ngành: Hoa Viên và Cây Cảnh

Cần Thơ - 2012


TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp
Ngành: HOA VIÊN VÀ CÂY CẢNH

ẢNH HƢỞNG CỦA TDZ VÀ NAA ĐẾN SỰ NHÂN
CHỒI VÀ TẠO RỄ IN VITRO CÂY HOA THƢỢC
DƢỢC (Dahlia variabilis Desf.)

Cán bộ hƣớng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

Ths. Nguyễn Văn Ây

Nguyễn Thị Thêm
MSSV: 3083757
Lớp: Hoa Viên Cây Cảnh K34


TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp Kỹ sƣ ngành Hoa viên và Cây cảnh với đề tài: “Ảnh hƣởng
của TDZ và NAA đến sự nhân chồi và tạo rễ in vitro cây hoa thƣợc dƣợc
(Dahlia variabilis Desf.)” do sinh viên NGUYỄN THỊ THÊM thực hiện kính trình
lên hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp.

Cần Thơ, ngày…..tháng…..năm 2012
Cán bộ hƣớng dẫn

Nguyễn văn Ây

i


TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
Hội đồng chấm luận văn đã chấp thuận luận văn tốt nghiệp Kỹ sƣ ngành Hoa viên
và Cây cảnh với đề tài: “Ảnh hƣởng của TDZ và NAA đến sự nhân chồi và tạo
rễ in vitro cây hoa thƣợc dƣợc (Dahlia variabilis Desf.)”, do sinh viên Nguyễn
Thị Thêm thực hiện và bảo vệ trƣớc hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp
ngày….tháng….năm 2012.
Luận văn đã đƣợc hội đồng đánh giá ở mức: ………………………………………

Ý kiến hội đồng:
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
Cần Thơ, ngày……tháng……năm 2012
Chữ ký của thành viên hội đồng
Thành viên 1

........................

Thành viên 2

. ........................

Khoa Duyệt
Trƣởng khoa Nông Nghiệp & SHƢD

ii

Thành viên 3

.............................


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân và thầy hƣớng dẫn. Các
số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố
trong bất kỳ luận văn nào trƣớc đây.

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Thêm

iii


TIỂU SỬ CÁ NHÂN
1. LÝ LỊCH SƠ LƢỢC
Họ và tên: Nguyễn Thị Thêm

Giới tính: Nữ

Ngày sinh: 01/05/1989

Dân tộc: Kinh

Nơi sinh: Cần Thơ
Họ và tên cha: Nguyễn Văn Hiền
Họ và tên mẹ: Phan Thị Bót
Chỗ ở hiện nay: Ấp Thới Xuân, xã Trƣờng Thắng, huyện Thới Lai, thành phố Cần
Thơ
2. QUÁ TRÌNH HỌC TẬP
-

1996-2001: Học sinh Trƣờng tiểu học Thới Lai 5

-

2001-2005: Học sinh Trƣờng trung học cơ sở Thị Trấn Thới lai

-

2005-2008: Học sinh Trƣờng trung học phổ thông Thới Lai

-

2008-2012: Sinh viên Trƣờng Đại Học Cần Thơ, Khoa Nông nghiệp và Sinh
học ứng dụng, Ngành Hoa viên & Cây cảnh, khóa 34.

Cần Thơ, ngày…..tháng…..năm 2012
Ngƣời khai

Nguyễn Thị Thêm

iv


LỜI CẢM TẠ

Kính dâng!
Cha mẹ suốt đời tận tụy vì tƣơng lai của con
Xin tỏ lòng biết ơn đến!
Thầy Nguyễn Văn Ây đã tận tình giúp đỡ và hƣớng dẫn tôi trong suốt quá trình thực
hiện đề tài luận văn tốt nghiệp.
Thầy Phạm Phƣớc Nhẫn và cô Lê Minh Lý, cố vấn học tập của Lớp, cùng với quý
thầy cô Khoa Nông nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng đã tận tâm, dìu dắt, rèn luyện tôi
suốt những năm học tại trƣờng Đại Học Cần Thơ.
Chân thành cám ơn!
Cô Lê Hồng Giang, Cô Phan Thị Hồng Nhung, anh Mai Vũ Duy cùng với các anh

chị, các bạn sinh viên trong phòng thí nghiệm Nuôi Cấy Mô, Bộ Môn Sinh Lý-Sinh
Hóa, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trƣờng Đại Học Cần Thơ đã hết
lòng giúp đỡ.
Các bạn sinh viên lớp Hoa viên & cây cảnh K34 đã giúp đỡ động viên tôi trong
những năm tháng trên giảng đƣờng Đại Học.

v


MỤC LỤC
TRANG CHẤP NHẬN LUẬN VĂN CỦA CÁN BỘ HƢỚNG DẪN
TRANG CHẤP NHẬN LUẬN VĂN CỦA HỘI DỒNG
LỜI CAM ĐOAN
TIỂU SỬ CÁ NHÂN
LỜI CẢM TẠ
MỤC LỤC
DANH SÁCH BẢNG
DANH SÁCH HÌNH
DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
TÓM LƢỢC
MỞ ĐẦU
CHƢƠNG 1. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU
1.1 Nguồn gốc, phân bố, giá trị của cây thƣợc dƣợc

i
ii
iii
iv
v
vi

viii
ix
x
xi
1
2
2

1.1.1 Nguồn gốc và phân bố

2

1.1.2 Đặc điểm thực vật

2

1.1.3 Giá trị kinh tế

3

1.1.4 Các phƣơng pháp nhân giống cây thƣợc dƣợc

4

1.2 Phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

4

1.2.1 Môi trƣờng nuôi cấy

4

1.2.2 Sơ lƣợc về kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật

8

1.2.3 Ƣu điểm và khuyết điểm của nuôi cấy mô thực 9
vật
1.2.4 Các giai đoạn vi nhân giống

9

1.2.5 Phƣơng pháp vi nhân giống

11

1.3 Một số nghiên cứu về các cây thuộc họ Cúc (Asteraceae)
CHƢƠNG 2. PHƢƠNG TIỆN V PHƢƠNG PH P

12
14

2.1 Phƣơng tiện nghiên cứu

14

2.1.1 Vật liệu

14

2.1.2 Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm

14

2.1.3 Điều kiện thí nghiệm

14

2.1.4 Thiết bị và hóa chất

14

2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu

15

2.2.1 Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy
vi

15


2.2.2 Chuẩn bị mẫu cấy

15

2.2.3 ố tr th nghiệm

15

2.3 Xử l số liệu

17

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Hiệu quả của TDZ lên sự nhân chồi thƣợc dƣợc in vitro

18
18

3.1.1 Số chồi gia tăng

18

3.1.2 Số lá gia tăng

21

3.1.3 Chiều cao gia tăng (cm)

22

3.2 Hiệu quả của NAA lên hả năng tạo rễ chồi thƣợc dƣợc in 24
vitro
3.2.1 Tỷ lệ (%) chồi tạo rễ

24

3.2.2 Số rễ/chồi

25

3.2.3 Chiều dài rễ (cm)

26

3.2.4 Số lá gia tăng

27

3.2.5 Chiều cao gia tăng (cm)

28

CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN V ĐỀ NGHỊ

30

4.1 Kết luận

30

4.2 Đề nghị

30

T I LIỆU THAM KHẢO
PHỤ CHƢƠNG

vii

DANH SÁCH BẢNG
Bảng
3.1

Tựa bảng

Trang

Ảnh hƣởng của TDZ lên sự gia tăng số chồi thƣợc dƣợc theo thời gian

18

(tuần sau khi cấy)

3.2

Ảnh hƣởng của TDZ lên sự gia tăng số lá thƣợc dƣợc theo thời gian (tuần

21

sau khi cấy)

3.3

Ảnh hƣởng của TDZ lên sự gia tăng chiều cao (cm) chồi thƣợc dƣợc theo

22

thời gian (tuần sau khi cấy)

3.4

Ảnh hƣởng của NAA lên sự tạo rễ của chồi thƣợc dƣợc vào thời điểm 3

25

tuần sau khi cấy

3.5

Ảnh hƣởng của NAA lên sự gia tăng số lá thƣợc dƣợc theo thời gian (tuần

28

sau khi cấy)

3.6

Ảnh hƣởng của NAA lên sự gia tăng chiều cao (cm) chồi thƣợc dƣợc theo
thời gian (tuần sau khi cấy)

viii

29


DANH SÁCH HÌNH

Hình

Tên hình

Trang

1.1

Thƣợc dƣợc đỏ (Dahlia variabilis Desf.)

2

2.1

Vật liệu thí nghiệm (chồi non thƣợc dƣợc)

13

3.1

Sự sinh trƣởng của chồi thƣợc dƣợc 4 tuần sau khi cấy trên môi
trƣờng MS có các nồng độ TDZ khác nhau

20

3.2

Sự phát triển chiều cao và số lá thƣợc dƣợc vào thời điểm 4 tuần sau khi
cấy trên môi trƣờng MS có nồng độ TDZ khác nhau

23

3.3

Rễ thƣợc dƣợc ở 3 tuần sau khi cấy trên môi trƣờng MS có nồng độ NAA
khác nhau

26

ix


DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
MS
TDZ
NAA
HgCl2
ctv
α-NAA

:
:
:
:
:
:

Murashige & Skoog 1962
Thidiazuron
Naphthalene acetic acid

Clorua thủy ngân
Cộng tác viên
alpha-naphthalene acetic acid

x


NGUYỄN THỊ THÊM. 2012. “Ảnh hƣởng của TDZ và NAA đến sự nhân chồi và
tạo rễ in vitro cây hoa thƣợc dƣợc (Dahlia variabilis Desf.)”. Luận văn tốt nghiệp
đại học ngành Hoa viên - cây cảnh, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng,
Trƣờng Đại Học Cần Thơ. Cán bộ hƣớng dẫn: ThS. Nguyễn Văn Ây.

TÓM LƢỢC
Đề tài: “Ảnh hƣởng của TDZ và NAA đến sự nhân chồi và tạo rễ in vitro cây
hoa thƣợc dƣợc (Dahlia variabilis Desf.)” đƣợc thực hiện nhằm tìm ra nồng độ
TDZ và NAA thích hợp cho giai đoạn nhân chồi và tạo rễ in vitro cây hoa thƣợc
dƣợc. Thí nghiệm đƣợc thực hiện tại phòng Nuôi cấy mô, Bộ môn Sinh lý-Sinh
hóa, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trƣờng Đại học Cần Thơ, từ
tháng 01 đến tháng 06 năm 2012. Kết quả thí nghiệm cho thấy: (i) Trong giai
đoạn nhân chồi hoa thƣợc dƣợc, sử dụng môi trƣờng Murashige & Skoog không
bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng thực vật để nhân chồi đạt số chồi đạt đƣợc cao
nhất (2,93 chồi sau 4 tuần nuôi cấy). Trên môi trƣờng này các chồi in vitro sinh
trƣởng và phát triển tốt. (ii) Sử dụng môi trƣờng cơ bản MS bổ sung than hoạt
tính 2 g/l và không bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng hoặc môi trƣờng MS bổ
sung than hoạt t nh 2 g/l và NAA 0,5 mg/l để tạo rễ cho chồi hoa thƣợc dƣợc in
vitro đã cho tỷ lệ tạo rễ cao (tƣơng ứng là 90,5% - 100%) và số rễ cao (tƣơng
ứng là 10,3 và 12,5 rễ) rễ phát triển tốt so với các nghiệm thức còn lại. Về mặt lý
thuyết, trong một năm có thể tạo ra từ 1.060.000 – 1.172.000 cây in vitro từ một
chồi ban đầu.

Từ khóa: cây hoa thƣợc dƣợc, TDZ, NAA, nhân chồi, tạo rễ

xi


MỞ ĐẦU
Khi xã hội ngày càng phát triển, thì con ngƣời đòi hỏi càng cao về nhu cầu
tinh thần. Hoa và cây cảnh không chỉ mang giá trị thẩm mỹ mà còn mang giá trị tình
cảm rất lớn đem lại sự thoải mái, thƣ giãn cho con ngƣời. Do đó, nó đã thúc đẩy con
ngƣời tìm tòi nghiên cứu ra nhiều giống hoa mới và nhiều phƣơng pháp sản xuất
đem lại hiệu quả kinh tế hơn.
Hoa thƣợc dƣợc (Dahlia variabilis Desf.) là một loài hoa to, đẹp, đa dạng về
chủng loại, màu sắc mà còn khá bền nên là loại hoa rất đƣợc ƣa chuộng. Thƣợc
dƣợc đƣợc chọn làm quốc hoa ở Mexico, cũng là loài hoa ch nh thức của thành phố
Seattle, bang Washington ở Mĩ. Trên thế giới các nhà chọn giống thực vật đã t ch
cực trong việc nhân giống thƣợc dƣợc để tạo ra hàng trăm giống mới. Tuy nhiên, ở
nƣớc ta việc nhân giống loài cây này chủ yếu bằng phƣơng pháp truyền thống nên
chƣa mang lại hiệu quả cao, số lƣợng giống rất hạn chế và khó giữ đƣợc những đặc
tính tốt của cây mẹ.
Khoa học phát triển không ngừng đem lại nhiều thành tựu to lớn phục vụ cho
con ngƣời. Một trong những tiến bộ mang nghĩa quan trọng đó chính là kỹ thuật
nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Kỹ thuật này đã đƣợc phát triển mạnh mẽ và có khá
nhiều ứng dụng quan trọng trong việc chọn giống, nhân giống và phục hồi
giống…(Nguyễn Bảo Toàn, 2010). Nuôi cấy mô là một công cụ nhân giống tích
cực, tạo đƣợc cây sạch bệnh, có hệ số nhân cao và thời gian sản xuất đƣợc rút ngắn.
Nhiều loại hoa đƣợc đƣa vào nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô và đạt đƣợc
hiệu quả nhƣ mong đợi.
Vì vậy, đề tài “Ảnh hƣởng của TDZ và NAA đến sự nhân chồi và tạo rễ in vitro
cây hoa thƣợc dƣợc (Dahlia variablis Desf)” đƣợc thực hiện nhằm tìm ra nồng độ
TDZ và NAA thích hợp cho giai đoạn nhân chồi và tạo rễ in vitro cây hoa thƣợc

dƣợc, góp phần hoàn chỉnh quy trình vi nhân giống loại hoa này, đáp ứng nhu cầu
tiêu thụ.

1


CHƢƠNG 1
LƢỢC HẢO T I LIỆU
1.1 Nguồn gốc, phân bố, giá trị của cây thƣợc dƣợc
1.1.1 Nguồn gốc và phân bố
Cây hoa thƣợc dƣợc có tên khoa học là Dahlia variablis Desf, thuộc họ cúc
(Asteraceae). Theo Phạm Văn Duệ (2005), cây thƣợc dƣợc có nguồn gốc ở Mehico
và có tên gọi là Chichipathi. Cây hoa thƣợc dƣợc đƣợc mang tên Dahlia là tên nhà
thực vật học ngƣời Thụy Điển.
Thƣợc dƣợc đƣợc trồng ở các vùng núi Châu Mỹ từ Mehico đến Colombia và
du nhập vào Tây Ban Nha từ năm 1788, rồi sang Pháp và đƣợc trồng chính thức tại
Pháp năm 1979, từ đó đƣợc đem trồng ở nhiều nƣớc hác (Võ Văn Chi, 2003).
Theo Phạm Văn Duệ (2005), hoa thƣợc dƣợc đƣợc nhập vào Việt Nam đầu thế kỷ
XX.
1.1.2 Đặc điểm thực vật
Thƣợc dƣợc là cây thân thảo sống nhiều năm nhờ các rễ hình thoi hay dạng
củ, hợp thành bó ở cổ rễ, chứa đầy chất dự trữ hydrocarbon (inulin). Thân rỗng,
phân nhánh, nhẵn hay có lông tơ, cao 0,3 - 2 m hay hơn. Lá dạng lông chim không
đều, có lá chét hình trái xoan, có răng men theo cuống, có khi nguyên hay xẻ lông
chim, màu lục hay màu xanh lục đậm ở mặt trên, nhạt ở mặt dƣới, cuống lá rộng
(Võ Văn Chi, 2003), (Hình 1.1).
Mỗi cánh hoa là một hoa nhỏ đầy đủ, hoa nhỏ không có cuống và gắn thẳng
vào đế chung. Mỗi hoa nhỏ có một vảy là lá bắc. Đặc điểm hoa thƣợc dƣợc có bao
phấn ch n trƣớc nhụy nên không thể tự thụ đƣợc. Để có hạt thì cây phải giao phấn,
do đó cây con mọc từ hạt thƣờng khác với cây mẹ (Phạm Văn Duệ, 2005).

Thƣợc dƣợc ƣa sáng, nếu đủ nắng thì màu hoa càng đẹp, củ giống khỏe.
Nhƣng cây lại thích khí hậu mát mẻ, nhiệt độ trung bình hông cao hơn 30˚C,
không thấp dƣới 10˚C, độ ẩm 60 - 70%.
Theo Võ Văn Chi (2003) sơ bộ có thể chia làm các dạng màu nhƣ sau:
- Thƣợc dƣợc trắng:

2


+ Trắng sữa: cây thấp hoa to, ít làm thành cụm hình đầu, đƣờng kính 20-30
cm.
+ Trắng trong: cây cao, hoa to, làm thành cụm hình đầu, đƣờng kính 15-20
cm.
- Thƣợc dƣợc vàng: gồm loại vàng đậm, vàng nhạt, cánh môi phẳng và cuốn
(nhƣ tai chuột).
- Thƣợc dƣợc đỏ: gồm loại đỏ tƣơi và đỏ thẫm.
- Thƣợc dƣợc nhung: có cánh môi đỏ đậm, phớt đen.
- Thƣợc dƣợc cánh sen: có cánh môi màu hồng đậm, màu hồng nhạt.
- Thƣợc dƣợc vằn: có cánh môi màu đỏ viền trắng.
- Thƣợc dƣợc vàng cam: cánh môi rộng, dài, màu da cam.
- Thƣợc dƣợc tím: có cánh môi tím nhạt đến đậm bóng.

Hình 1.1: Thƣợc dƣơc đỏ (Dahlia variablis Desf)
(Nguồn: />
1.1.3 Giá trị kinh tế
Cây hoa thƣợc dƣợc thƣờng đƣợc dùng để trang trí trong công viên, công trình
đô thị, hu vui chơi giải trí. Ngoài ra, nó còn đƣợc trồng trong các luống hoa, bồn
hoa, làm đẹp cho khu nhà ở, sân vƣờn. Thƣợc dƣợc còn là một trong những loại hoa
trồng chậu có giá trị kinh tế cao.
3

Rễ cây thƣợc dƣợc đƣợc sử dụng làm thuốc tiêu viêm, chống đau. Ở Vân Nam
(Trung Quốc), ngƣời ta dùng để trị đau răng, viêm tuyến mang tai (Võ Văn Chi,
2003).
1.1.4 Các phƣơng pháp nhân giống cây thƣợc dƣợc
Theo Ngọc Hà (2011) cây thƣợc dƣợc đƣợc nhân giống chủ yếu bằng cách
giâm cành, một số ít trồng từ củ, và gieo hạt chỉ áp dụng với nhóm hoa cánh đơn.
Nhân giống bằng phƣơng pháp giâm cành là phƣơng pháp đơn giản, dễ làm, không
đòi hỏi kỹ thuật phức tạp. Nếu nhân giống bằng củ thì cây con giữ đƣợc kiểu gene
của cây mẹ, và cây mọc từ củ thì tuổi sinh lý trẻ, mầm khỏe. Tuy nhiên khó bảo
quản củ và thời gian trồng từ củ đến có hoa lâu (Phạm Văn Duệ, 2005). Phƣơng
pháp gieo hạt thƣờng áp dụng để trồng hoa bán vào dịp Tết vì dễ xác định ngày
trồng và khả năng cho hoa vào đúng dịp Tết rất cao.
1.2 Phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.2.1 Môi trƣờng nuôi cấy
Theo Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị Thuỷ Tiên (2002), mô thực vật nuôi cấy
trong môi trƣờng cũng cần chất dinh dƣỡng nhƣ cây cần đất. Thành phần môi
trƣờng nuôi cấy thay đổi theo từng loài và bộ phận nuôi cấy. Tuỳ theo mục đ ch của
ngƣời nghiên cứu mà mô nuôi cấy đƣợc duy trì ở trạng thái mô sẹo (callus), tạo rễ,
tạo mầm hay muốn tái sinh thành cây hoàn chỉnh, môi trƣờng nuôi cấy phải thay đổi
nhiều hay t (Vũ Văn Vụ, 1999). Tuy vậy, tất cả các môi trƣờng nuôi cấy có các
thành phần cơ bản nhƣ: nƣớc, đƣờng làm nguồn cung cấp carbon, muối hoáng đa
lƣợng, muối hoáng vi lƣợng, vitamin, chất điều hoà sinh trƣởng. Ngoài ra, còn
thêm các thành phần hữu cơ có thành phần hoá học xác định (acid amin, EDTA…)
hoặc không xác định nhƣ nƣớc dừa. Tuỳ theo môi trƣờng nuôi cấy mà bổ sung hàm
lƣợng agar thích hợp.
 Nƣớc
Phẩm chất nƣớc là điều kiện quan trọng trong nuôi cấy mô. Nƣớc sử dụng
trong nuôi cấy mô là nƣớc cất một lần, trong một số trƣờng hợp ta sử dụng nƣớc cất

2 lần hoặc khử khoáng (Nguyễn Bảo Toàn, 2010).
 Đƣờng
Hầu hết các mô nuôi cấy là dị dƣỡng không có khả năng tổng hợp carbon.
Trong phần lớn các môi trƣờng nguồn carbon và năng lƣợng chủ yếu là đƣờng
4


sucrose và glucose (20 - 40 g/l) (Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
Ngoài ra, đƣờng còn đóng vai trò là chất thẩm thấu chính của môi trƣờng. Khi sử
dụng đƣờng sucrose trong nuôi cấy nó đƣợc thuỷ phân hoàn toàn một phần thành
monosaccharide: glucose và fructose (Nguyễn Bảo Toàn, 2010). Loại đƣờng hay sử
dụng là saccharose và glucose. Nhƣng hiện nay saccharose đƣợc dùng phổ biến hơn
(Lâm Ngọc Phƣơng, 2010).


hoáng đa lƣợng

Theo Lê Văn Hòa và ctv. (1999), hoáng đa lƣợng rất cần cho cây, có ảnh
hƣởng rất tốt cho sự hấp thu của mô cấy và chúng hông gây độc. Các nguyên tố đa
lƣợng cần phải cung cấp là Nitrogen (N), Phosphorus (P), Potasium (K),
Magnesium (Mg), Calcium (Ca), Lƣu huỳnh (S)… Đối với cây trồng, các chất vô
cơ đóng vai trò rất quan trọng. Ví dụ: Mg2+ là thành phần của phân tử diệp lục, Ca2+
là thành phần của màng tế bào, N là thành phần quan trọng của amino acid, vitamin,
protein và các nucleic acid.
Nitơ thì thông thƣờng đƣợc cung cấp nhƣ ion nitrat (từ KNO3) và ion
amonium (từ NH4NO3). Về mặt lý thuyết, có sự thuận lợi khi cung cấp nitơ từ ion
amonium và nitrat nhƣng thực tế thì hàm lƣợng nitơ cần phải đƣợc giảm khi kết hợp
với các phân tử đa lƣợng vì nếu nhƣ nồng độ cao ion amonium sẽ gây độc cho cây
trồng (Butenko, 1964; trích bởi Nguyễn Đức Thành, 2000).
Theo Curir và ctv. (1986), đã nhận thấy tỷ lệ nhân cao hơn ở nhiều loài khác

nhau hi hàm lƣợng ammonium (NH4+) của môi trƣờng giảm. Hơn nữa sự tăng
nồng độ của Ca, Mg, Fe và Mn trong môi trƣờng cải tiến ảnh hƣởng đến chất lƣợng
vi chồi (Pati và ctv., 2006).


hoáng vi lƣợng

Khoáng vi lƣợng là những thành phần yêu cầu rất ít cho sự sinh trƣởng và phát
triển của cây và có nhiều vai trò khác nhau. Các thành phần vi lƣợng gồm có
mangan, đồng, sắt, coban, kẽm, bo, molypđen. Sự hiện diện của nguyên tố sắt đặc
biệt quan trọng cho quá trình tạo chồi và rễ bất định (Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị
Thủy Tiên, 2002). Trong nuôi cấy mô thƣờng sử dụng sắt vi lƣợng ở dạng phức hợp
chelate (Fe-EDTA). Ở dạng này sắt không bị tủa mà phóng thích từ từ vào môi
trƣờng nuôi cấy theo nhu cầu của mô thực vật (Nguyễn Văn Uyển và ctv., 1984).
Một số muối vi lƣợng thƣờng dùng là ZnSO4, CuSO4, CoCl2. Ngoài ra một số môi
trƣờng còn có muối nikel và amonium (Nguyễn Đức Thành, 2000).
5


 Vitamin
Theo Phan Thị Bích Trâm (2008), vitamin là những hợp chất hữu cơ mà chỉ
với một lƣợng nhỏ cũng có tác dụng đảm bảo cho sự sinh trƣởng và phát triển bình
thƣờng. Vitamin tham gia vào nhóm ghép của enzyme có tác động nhƣ một
coenzyme. Tất cả các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy trong ống nghiệm có khả
năng tổng hợp đƣợc hầu hết các vitamin nhƣng hông đủ về lƣợng. Do đó, phải bổ
sung thêm vitamin vào môi trƣờng nuôi cấy (Nguyễn Xuân Linh, 1998). Vitamin
thƣờng đƣợc sử dụng nhất là nicotinic acid, pyridoxine (B6), thiamine (B1), myoinositol, vitamin C thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ là chất chống oxy hóa.
Thiamine đƣợc sử dụng nhƣ là coenzyme trong biến dƣỡng carbohydrate.
Nicotinic đƣợc sử dụng nhƣ là coenzyme trong biến dƣỡng các chất nicotinamide
adenine dinucleotide (NAD) hay nicotinamide dinucleotide phosphate (NADP).

Pyridoxin là coenzyme trong phản ứng dị hóa amino acid.
Myo-inositol là thành phần của phosphatidyl inositol và phytic acid hỗ trợ cho sự
sinh trƣởng của tế bào (Nguyễn Bào Toàn, 2010).
 Agar
Theo Nguyễn Xuân Linh (1998), chất đông cứng để làm giá thể cho môi
trƣờng nuôi cấy mô tế bào thực vật, ngƣời ta thƣờng sử dụng agar (thạch). Agar là
một loại polysaccharide của tảo biển. Ở 80˚C thạch ngậm nƣớc thành trạng thái
lỏng, nhƣng ở 40˚C thì trở về trạng thái rắn. Nồng độ sử dụng thƣờng là 6 - 8 g/l,
điều này đạt đƣợc nhờ các Polysaccharide kết hợp với các phần tử H2O tạo thành
polymere. Ngoài ra, agar còn có tác dụng khác nữa là cung cấp thêm Iod, làm giàu
hàm lƣợng Iod trong môi trƣờng. (Vũ Văn Vụ và ctv., 2006). Nếu nồng độ thạch
trong môi trƣờng nuôi cấy cao sẽ giới hạn sự phát triển của mô sẹo và ngƣợc lại làm
hạn chế sự trao đổi chất giữa môi trƣờng và mô nuôi cấy (Lâm Ngọc Phƣơng,
2010).
 Than hoạt tính
Theo Nguyễn Bảo Toàn (2010) than hoạt tính cho vào môi trƣờng nhằm mục
đ ch làm tối môi trƣờng nuôi cấy (môi trƣờng tạo rễ). Bên cạnh đó, còn có tác dụng
khử độc tố của môi trƣờng nuôi cấy bằng cách kết hợp với các hợp chất có gốc
phenol do cây tiết ra trong suốt quá trình nuôi cấy, hút các chất ức chế sự phát triển
của cây (Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
6


Tuy nhiên than hoạt t nh cũng có một số tác dụng hác nhƣ: than hoạt tính
cũng hút các chất hữu cơ nhƣ phytohormone, vitamin, sắt chelate, kẽm,… làm giảm
hiệu quả của chất điều hòa sinh trƣởng, vitamin và các khoáng (Vũ Văn Vụ và ctv.,
2006).
 Nƣớc dừa
Nƣớc dừa (nội nhũ lỏng) đã đƣợc xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ,
chất khoáng và chất ch th ch sinh trƣởng (George, 1993). Theo Hoàng Đức Cự

(2006), trong thành phần nƣớc dừa có chứa các nhân tố dinh dƣỡng cần thiết cho sự
sinh trƣởng và phát triển của mô thực vật, nó không chỉ giàu các acid amin và các
hợp chất nitơ hử khác cần thiết mà còn chứa cytokynin. Diphenylurea (DPU) đƣợc
trích từ nƣớc dừa đƣợc sử dụng nhƣ là thành phần thêm vào trong vi nhân giống.
Chất này đƣợc chứng minh là cytokinin chính trong nƣớc dừa (Nguyễn Bảo Toàn,
2010). Nƣớc dừa kích thích sự phân bào là do sự hiện diện của zeatin riboside (Lê
Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn, 2005). Đối với đa số mẫu vật nuôi cấy, lƣợng nƣớc
dừa phù hợp nhất là từ 15 đến 20 % theo thể t ch môi trƣờng (Vũ Văn Vụ, 1999).
 Giá trị pH
pH thƣờng đƣợc hiệu chỉnh trong khoảng 5,5 - 6 trƣớc khi hấp khử trùng. pH
quyết định sự hòa tan của hoáng trong môi trƣờng. pH còn ảnh hƣởng đến sự hấp
thu hoáng trong môi trƣờng và ảnh hƣởng trên sự tạo gel của agar khi hấp khử
trùng. pH thấp (<4,5) môi trƣờng có agar khó tạo gel (Nguyễn Bảo Toàn, 2010). Độ
pH của môi trƣờng đƣợc điều chỉnh bằng dung dịch 10% KOH, NaOH, HCl. Có thể
đo pH bằng máy để bàn hoặc máy đo pH cầm tay. Thƣờng thì nhiệt độ cao sẽ làm
tăng t nh pH của môi trƣờng.
 Chất điều hòa sinh trƣởng
Chất điều hòa sinh trƣởng thực vật là những chất có hoạt tính sinh học rất lớn,
đƣợc tạo ra một lƣợng rất nhỏ để điều hòa các quá trình sinh trƣởng và phát triển
của thực vật. Gồm hai nhóm chất: auxin và cytokinin.
 Auxin
Auxin tự nhiên thƣờng tìm thấy ở thực vật là indole-3-acetic acid (IAA). Năm
1953, Went và Thimann chứng minh rằng auxin (IAA) kích thích sự tạo rễ (trích
bởi Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn, 2005). Theo Nguyễn Xuân Linh (1998)
auxin là các hợp chất kích thích sự giãn nở tế bào, sự hình thành mô sẹo và sự xuất
7


hiện rễ bất định. Các auxin có hiệu quả sinh lý ở nồng độ thấp từ 0,1 - 1 mg/l tùy
theo mục đ ch và vật liệu nuôi cấy. Hàm lƣợng auxin thấp sẽ kích thích sự phân hóa

rễ, ngƣợc lại ở hàm lƣợng auxin cao sẽ tạo mô sẹo (Vũ Văn Vụ, 1999).
Trên cơ sở các hoạt tính sinh học của auxin, công nghiệp hóa chất đã tổng hợp
đƣợc các chất hóa học có tác dụng giống IAA. Các chất này đƣợc gọi là auxin tổng
hợp, chúng đƣợc sử dụng trong nông nghiệp có tác dụng nhƣ chất điều hòa sinh
trƣởng thực vật (Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn, 2005). Theo Nguyễn Bảo Toàn
(2010) auxin tổng hợp đƣợc sử dụng rộng rãi nhất là indole-3-butyric acid (IBA),
hiện nay đƣợc chứng minh là xuất hiện trong tự nhiên trong cây, alpha-naphthalene
acetic acid (NAA) và 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid (2,4-D). Do IAA là auxin tự
nhiên, kém bền bởi nhiệt nên ít dùng, IBA và NAA thƣờng sử dụng cho quá trình
tạo rễ ở đa số các loại cây.
 Cytokinin
Theo Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn (2005) chức năng ch nh của
cytokinin là kích thích sự phân bào. Ngoài ra, cytokinin còn kích thích pha dãn dài
lẫn pha chuyên hóa. Khi có tác dụng của auxin ở các mức hác nhau, đối với các tế
bào tách rời (nuôi cấy mô) sự cân đối giữa auxin và cytokinin sẽ kích thích sự thành
lập callus, rễ và chồi. Cyto inin đƣợc tổng hợp ở rễ, từ đó vận chuyển lên chồi.
Chúng đóng vai trò ch nh trong sự thành lập chồi và cơ quan trong nuôi cấy mô.
Nồng độ cytokinin quá cao sẽ kích thích hình thành nhiều chồi nhỏ nhƣng những
chồi này không thể kéo dài ra, hoặc làm cho lá bị biến dạng hoặc làm cho chồi chứa
nhiều nƣớc (Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002). Các cyto inin thƣờng
dùng trong nuôi cấy mô là kinetin (6-furfurylaminopurin), BA (Benzyl adenine),
BAP (6-Benzyl amino purin). Ngoài các loại cytokinin trên, còn có Thidiazuron
(TDZ) là cytokinin có hoạt tính cao nhờ ít bị phân hủy bởi enzyme nội sinh so với
các loại cytokinin khác (Mor và ctv., 1982). Hiệu quả tăng nhanh chồi trong một số
loài khó nhân giống nhƣ Acer fremanii (Kerns và ctv., 1986) và Pyrus communis
(Singha và ctv., 1988). Bên cạnh đó, TDZ có hiệu quả cao gia tăng hình thành chồi
nách trong nhân chồi Rhododendron (Fellman và ctv., 1987).
1.2.2 Sơ lƣợc về kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật
Nuôi cấy mô tế bào thực vật (nuôi cấy thực vật in vitro) là quá trình nuôi cấy
thực vật trong ống nghiệm, khác với nuôi cấy in vivo là quá trình nuôi cấy thực vật

trong điều kiện tự nhiên. Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung
8


cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên
môi trƣờng dinh dƣỡng nhân tạo trong điều kiện vô trùng (Nguyễn Xuân Linh,
1998). Theo Lâm Ngọc Phƣơng (2009) ỹ thuật nuôi cấy mô thực vật là công cụ rất
tốt để nghiên cứu sinh học thực vật, những kỹ thuật này đã đƣợc ứng dụng nhanh
chóng vào thực tiễn khi các cây còn trong ống nghiệm. Nhân giống vô tính trong
ống nghiệm hay vi nhân giống là kỹ thuật đầy hứa hẹn. Nó sản xuất ra những cây
con giống với cây mẹ do sự kích thích những khả năng tự nhiên về nhân giống vô
tính của các loài thực vật, hoặc do việc cảm ứng sự sinh tạo cơ quan mới của chồi
và rễ. Vi nhân giống không thay thế các phƣơng pháp nhân giống truyền thống,
nhƣng bản thân nó có vị tr trong các lĩnh vực chất lƣợng cao.
1.2.3 Ƣu điểm và khuyết điểm của nuôi cấy mô thực vật
Theo Lâm Ngọc Phƣơng (2009) nuôi cấy mô thực vật có một số ƣu huyết điểm
sau:
 Ƣu điểm
- Tỉ lệ nhân giống cao;
- Số lƣợng chồi sinh trƣởng lớn;
- Một số cây thân gỗ khó nhân giống bằng phƣơng pháp giâm cành, chiết hoặc
ghép thì có thể đƣợc vi nhân giống;
- Kỹ thuật vi nhân giống dễ dàng tạo đƣợc những dòng cây sạch bệnh;
- Vi nhân giống có thể trẻ hóa và phục tráng những dòng, nó có thể dễ dàng
nhân dòng bằng cách giâm cành hoặc các kỹ thuật thông dụng khác;
- Các phƣơng pháp nuôi cấy mô là nền tảng của công nghệ di truyền.
 Khuyết điểm
- Phƣơng pháp này tƣơng đối đắt tiền hơn các phƣơng pháp nhân giống vô tính
khác;
- Không phải loại cây nào cũng có thể vi nhân giống;

- Môt số loài có thể có biến dị di truyền hoặc không di truyền khi vi nhân giống;
- Tất cả đợi chờ sự giống nhau khi vi nhân giống. Các loài không giống nhau có
thể đƣợc nhân giống rất hiệu quả nhƣng chỉ phát hiện sau này.
9


1.2.4 Các giai đoạn vi nhân giống
Đối với nhân giống vô tính trong ống nghiệm, quy trình nhân giống đƣợc chia
thành 4 giai đoạn:
 Nuôi cấy vô trùng (giai đoạn khởi đầu)
Đây là giai đoạn tối quan trọng, thậm chí quyết định toàn bộ quy trình nhân
giống in vitro. Mục đ ch của giai đoạn này là phải tạo đƣợc nguyên liệu thực vật vô
trùng để đƣa vào nuôi cấy in vitro. Để khử trùng mô thực vật, ngƣời ta thƣờng dùng
một số hóa chất nhƣ: HgCl2, Ca(OCl)2, NaOCl, H2O2… và tùy thuộc vào từng loại
mô thực vật mà chọn loại, nồng độ và thời gian xử lý hóa chất thích hợp (Nguyễn
Xuân Linh, 1998).
Theo Lâm Ngọc Phƣơng (2009) để tăng t nh linh động và khả năng xâm nhập
của hóa chất diệt khuẩn, thông thƣờng ngƣời ta xử lý mô cấy trong vòng 30 giây
trong rƣợu ethylic 70% sau đó mới xử lý với dung dịch diệt khuẩn. Đồng thời ngƣời
ta thêm các chất giảm sức căng bề mặt nhƣ Tween 80, Fotolfo, Teepol vào dung
dịch diệt nấm khuẩn.
Để chọn lọc mẫu vật thích hợp trong nuôi cấy khởi đầu cần lƣu

4 điểm sau:

2 Chọn loại cơ quan và vị trí mẫu ở cây.
3 Tuổi và tình trạng sinh lý tối ƣu của cơ quan.
4 Mùa thích hợp đề lấy mẫu vật.
5 Phẩm chất của cây để lấy mẫu vật.
 Giai đoạn II (giai đoạn nhân giống)

Theo Nguyễn Xuân Linh (1998) mục đ ch của giai đoạn này là tái sinh một cách
có định hƣớng các mô nuôi cấy. Quá trình này đƣợc điều khiển chủ yếu dựa vào tỉ
lệ các hợp chất Auxin/Cytokinin ngoại sinh đƣợc đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy. Tuy
nhiên bên cạnh điều kiện đó cũng cần quan tâm đến tuổi sinh lý của mẫu cấy.
Thƣờng các mô non, chƣa phân hóa có hả năng tái sinh cao hơn các mô trƣởng
thành đã chuyên hóa sâu. Ngƣời ta còn nhận thấy lấy mẫu cấy trong thời kỳ sinh
trƣởng mạnh của cây trong mùa sinh trƣởng cho kết quả rất khả quan trong tái sinh
chồi. Có nhiều kiểu để gia tăng tốc độ nhân nhƣ cấy mắt. Trong kỹ thuật này có hai
kiểu tạo chồi, một kiểu tạo chồi từ một mẫu cấy chỉ có một mắt hoặc nhiều mắt.
Phƣơng pháp hác để gia tăng số chồi ở giai đoạn này là cấy đỉnh sinh trƣởng
10


(meristem culture) hoặc cấy chồi (shoot tip culture). Đỉnh sinh trƣởng hoặc chồi có
thể đƣợc lấy từ chồi đỉnh hay chồi ngang (Nguyễn Bảo Toàn, 2010).
 Giai đoạn III (giai đoạn tạo rễ và phát triển)
Mục đ ch của giai đoạn này là chuẩn bị cho cây con sẵn sàng cho sự ra ngoài.
Nó bao gồm việc ra rễ, phát triển cây con, cũng nhƣ tạo sự cứng cỏi cho chúng đối
với những xáo trộn sau này. Phƣơng pháp nhân giống vô tính trong ống nghiệm có
hiệu quả hi có đƣợc tỉ lệ cây con sống tốt cao sau khi ra khỏi giai đoạn nuôi cấy vô
trùng và chuyển trồng nơi vƣờn ƣơm. Việc cấy chuyền cuối cùng đƣợc tiến hành
nhằm giúp cho sự sinh trƣởng và tạo rễ. Có thể lợi dụng giai đoạn này để huấn
luyện cây và chuẩn bị cho chúng bƣớc vào giai đoạn in vivo (Lâm Ngọc Phƣơng,
2009).
 Giai đoạn IV (giai đoạn thuần hóa)
Theo Nguyễn Bảo Toàn (2010) mục đ ch của giai đoạn này là làm giảm tối
thiểu chết cây con, khi chuyển từ in vitro sang nhà lƣới hoặc điều kiện ngoài đồng.
Trong giai đoạn này các yếu tố cần đƣợc quan tâm là:
- Tình trạng cây con khi chuyển ra môi trƣờng trồng.
- Các yếu tố về môi trƣờng nhƣ nhiệt độ, ẩm độ và ánh sáng của nơi thuần

dƣỡng hoặc tình trạng cây con trong bình cấy.
1.2.5 Phƣơng pháp vi nhân giống
 Phƣơng pháp nhân chồi bên
Chồi nách hay chồi bên có cấu tạo giống chồi ngọn, cành bên cùng lớn lên bởi
phần đỉnh ngọn của nó và mỗi cành bên cũng đƣợc tận cùng bằng một chồi ngọn.
Trong nách lá thƣờng có thể có hai, ba hoặc nhiều hơn các chồi nách sắp xếp theo
hƣớng ngang hoặc thẳng đứng (Hà Thị Lệ Ánh, 2005).
Trong phƣơng pháp nhân chồi bên, chồi ngọn đƣợc cô lập trên môi trƣờng dinh
dƣỡng và các chồi bên từ các nách lá phát triển dƣới ảnh hƣởng của cytokinin ở
nồng độ cao. Vai trò cytokinin lúc này là hạn chế ƣu t nh ngọn để cho các chồi bên
có thể phát triển. Các chồi bên này có thể tiếp tục chuyển sang môi trƣờng mới bổ
sung cytokinin thì các chồi bên mới lại tiếp tục đƣợc tạo ra (Nguyễn Đức Lƣợng và
Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
 Ƣu điểm của phƣơng pháp này:
11


- Phƣơng pháp này đơn giản hơn so với các phƣơng pháp nhân giống khác
- Tốc độ nhân giống cao
- Sản phẩm ổn định về mặt di truyền
- Cây con tăng trƣởng rất tốt, có lẽ là do đã đƣợc trẻ hóa
- Đối với một số loại cây, số lần cấy chuyền càng nhiều thì nhu cầu cytokinin
càng giảm là do cây đã quen với cyto inin và mô đã đƣợc trẻ hóa (Nguyễn Đức
Lƣợng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
 Các yếu tố ảnh hƣởng lên sự hình thành chồi bên
Theo Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị Thủy Tiên (2002) thì nhu cầu về cytikinin
rất khác nhau (loại và nồng độ cytokinin). Ví dụ cây con của Bromeliaceae có thể
tạo chồi bên mà không cần sự hiện diện của cyto inin trong môi trƣờng nuôi cấy.
Đối với một số loại cây, số lần cấy truyền càng nhiều thì nhu cầu về cytokinin càng
giảm do cây đã quen với cyto inin và mô đã đƣợc trẻ hóa. Nhu cầu về nồng độ

cyto inin thay đổi tùy theo từng loài thực vật.
1.3 Một số nghiên cứu về các cây thuộc họ Cúc (Asteraceae)
Ở giống cúc C23 sử dụng môi trƣờng MS kết hợp với NAA 0,5 mg/l trong giai
đoạn tạo rễ là thích hợp nhất (Đặng Minh Tâm, 2002).
Đỗ Bé Thảo (2009), môi trƣờng nuôi cấy MS có sự hiện diện của than hoạt tính 1
g/l kết hợp với chất điều hòa sinh trƣởng NAA 0,5 mg/l cho tỉ lệ tạo rễ cao 100%,
số rễ đƣợc hình thành 4,3 rễ/cây, sự vƣơn dài rễ 5,6 cm và chiều cao chồi 4,6 cm có
hiệu quả cao nhất trong môi trƣờng tạo rễ của chồi cúc “Farm t m”
(Chrysanthemum sp.).
Jaime (2004) sử dụng môi trƣờng MS kết hợp TDZ 2 mg/l để tạo mô sẹo có hiệu
quả trên hoa cúc (Chrysanthemum sp.) và môi trƣờng thích hợp tạo rễ là MS kết
hợp NAA 1 mg/l.
Theo Trần Khắc Hạnh và ctv. (2004), đối với giống cúc CN01 sử dụng môi
trƣờng MS + BA 0,5 mg/l + 15% nƣớc dừa để nuôi cấy, số chồi thu đƣợc sau 4 tuần
nuôi cấy là 5 chồi/mẫu. Sử dụng môi trƣờng MS + 15% nƣớc dừa để tạo cây hoàn
chỉnh sau 2 tuần nuôi cấy.

12