nghiên cứu thành phần hóa học trong cao petroleum ether từ lá cây bần chua (sonneratia caseolaris (l.) engl.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
------------

ĐINH THỊ THÚY DUY

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
TRONG CAO PETROLEUM ETHER
TỪ LÁ CÂY BẦN CHUA
(Sonneratia caseolaris (L.) Engl.)
LUẬN VĂN ĐẠI HỌC

Chuyên Ngành: CÔNG NGHỆ HÓA HỌC
Mã số: CN 262

CẦN THƠ − 2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
-----------

ĐINH THỊ THÚY DUY

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
TRONG CAO PETROLEUM ETHER
TỪ LÁ CÂY BẦN CHUA
(Sonneratia caseolaris (L.) Engl.)
LUẬN VĂN ĐẠI HỌC
Chuyên Ngành: CÔNG NGHỆ HÓA HỌC
Mã số: CN 262

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS. LÊ THANH PHƯỚC
CẦN THƠ − 2012


Trường Đại Học Cần Thơ

Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam

Khoa Công Nghệ

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

Bộ môn Công Nghệ Hóa Học

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

1. Cán bộ hướng dẫn: TS. Lê Thanh Phước
2. Đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học trong cao petroleum ether từ lá cây
Bần chua (Sonneratia caseolaris (L.) Engl).
3. Họ và tên sinh viên thực hiện: Đinh Thị Thúy Duy (MSSV: 2082212)
4. Lớp: Công nghệ hóa học. Khóa 34
5. Nội dung nhận xét:
a. Nhận xét về hình thức của LVTN:
................................................................................................................................
................................................................................................................................
b. Nhận xét về nội dung của LVTN:
................................................................................................................................
................................................................................................................................

................................................................................................................................
................................................................................................................................
................................................................................................................................
c. Nhận xét đối với sinh viên tham gia đề tài:
................................................................................................................................
................................................................................................................................
d. Kết luận,đề nghị và điểm:
................................................................................................................................
................................................................................................................................
Cần Thơ, ngày

tháng

Cán bộ hướng dẫn

năm 2012


Trường Đại Học Cần Thơ

Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam

Khoa Công Nghệ

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

Bộ môn Công Nghệ Hóa Học

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ CHẤM PHẢN BIỆN

1. Cán bộ chấm phản biện:
2. Đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học trong cao petroleum ether từ lá cây
Bần chua (Sonneratia caseolaris (L.) Engl).
3. Họ và tên sinh viên thực hiện: Đinh Thị Thúy Duy (MSSV: 2082212)
4. Lớp: Công nghệ hóa học. Khóa 34
5. Nội dung nhận xét:
a. Nhận xét về hình thức của LVTN:
................................................................................................................................
................................................................................................................................
b. Nhận xét về nội dung của LVTN:
................................................................................................................................
................................................................................................................................
................................................................................................................................
................................................................................................................................
................................................................................................................................
c. Nhận xét đối với sinh viên tham gia đề tài:
................................................................................................................................
................................................................................................................................
d. Kết luận,đề nghị và điểm:
................................................................................................................................
................................................................................................................................
................................................................................................................................
Cần Thơ, ngày

tháng

năm 2012

Cán bộ chấm phản biện

LỜI CẢM ƠN

Luận văn này được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Hóa Sinh 3, Bộ môn Hóa,
Khoa Khoa Học Tự Nhiên, trường Đại Học Cần Thơ , khu II, đường 3/2, quận Ninh
Kiều, thành phố Cần Thơ. Tôi xin chân thành biết ơn sâu sắc đến:
Thầy Lê Thanh Phước, người thầy đã hướng dẫn, hết lòng giảng dạy,giúp đỡ, tạo
mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi hoàn thành luận văn này.
Quý thầy cô của Bộ môn Hóa, Khoa Công nghệ đã truyền đạt nhiều kiến thức và
nhiều kinh nghiệm quý báo trong suốt quá trình học tại trường. Đó là hành trang quý
giúp tôi vững bước trong sự nghiệp cũng như trong cuộc sống.
Cô Bùi Bửu Huê và các thầy cô trong Bộ môn Hóa học, Khoa Khoa học tự nhiên
đã tạo điều kiện cho tôi làm việc tốt nhất.
Anh Từ Minh Tỏ, chị Lê Hương Nhi, chị Lâm Thúy Phương học viên cao học
khóa 17 đã giúp đỡ tận tình trong suốt quá trình làm luận văn.
Xin chân thành cảm ơn!!!

Cần Thơ, tháng 04 năm 2012
Đinh Thị Thúy Duy

i


TÓM TẮT LUẬN VĂN
----o0o---Cây Bần hay còn gọi là Thủy liễu (liễu nước), hải đồng, Bần chua,…Tên khoa
học Sonneratia caseolaris (L.) Engl.., thuộc họ Trân châu (Lythraceae). Cây Bần được
phân bố phổ biến và tìm thấy ở Bangladesh, Brunei Darussalam, Cambodia, China
(Hainan Island), India,… Ở Việt Nam, cây Bần mọc phổ biến ở ven sông, ven biển, bãi
bồi,… Theo dân gian Bần được sử dụng như chất làm se da, chất khử trùng, thuốc đắp
trị bông gân,… Ngoài ra, quả Bần còn có thể dùng để nấu canh chua, có thể chữa bệnh

bong gân, cầm máu,… Trong đề tài này, tôi xác định thành phần hóa học của các hợp
chất ít phân cực từ lá cây Bần.
Bằng phương pháp sắc ký cột KG 60 F254 (silica gel) kết hợp với sắc ký lớp
mỏng, chúng tôi phân lập ra một chất sạch từ cao petroleum ether. Sử dụng các dữ liệu
phổ 1H-NMR đã xác định được chất vừa phân lập là:  -sitosterol.

ii


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN…………………………………………………………………………..i
TÓM TẮT LUẬN VĂN……………………………………………………………….ii
MỤC LỤC……………………………………………………………………………..iii
DANH MỤC HÌNH…………………………………………………………………...vi
DANH MỤC BẢNG………………………………………………………………….vii
DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT……………………………………………...viii
Chương 1:

TỔNG QUAN VỀ CÂY BẦN................................................................1

1.1.

Đặc điểm cây Bần chua .................................................................................1

1.2.

Phân bố sinh thái ...........................................................................................3

1.3.

Công dụng của cây bần chua .........................................................................3

1.3.1.

Y học dân gian .......................................................................................3

1.3.2.

Y học hiện đại ........................................................................................4

1.4.

Một số công trình nghiên cứu về cây bần chua ..............................................4

1.4.1.

Các công trình nghiên cứu ở Việt Nam...................................................4

1.4.2.

Các công trình nghiên cứu trên thế giới ..................................................4

1.4.3.

Thành phần hóa học của cây Bần chua ...................................................5

1.4.4.

Một số hợp chất được phân lập trong cây Bần chua................................5

Chương 2:

CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA QUÁ TRÌNH THỰC NGHIỆM..................8

2.1.

Các kỹ thuật chiết tách thông dụng ................................................................8

iii


2.1.1.

Dung môi để tách chiết các hợp chất hữu cơ ra khỏi mẫu cây.................8

2.1.2.

Lựa chọn dung môi chiết tách.................................................................8

2.1.3.

Một số điều cần biết khi sử dụng dung môi chiết tách ............................9

2.1.4.

Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng.......................................................................9

2.1.5.

Kỹ thuật chiết rắn - lỏng.......................................................................10

2.2.

Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) ..........................................................11

2.2.1.

giới thiệu chung về phương pháp sắc ký lớp mỏng ...............................11

2.2.2.

So sánh sắc ký lớp mỏng với các kỹ thuật sắc ký khác .........................12

2.2.3.

Chất hấp thu silica gel ..........................................................................13

2.2.4.

Dung môi giải ly ..................................................................................13

2.3.

Phương pháp sắc ký cột...............................................................................14

2.3.1.

Giới thiệu về phương pháp sắc ký cột hở..............................................14

2.3.2.

Lựa chon dung môi bắt đầu cho quá trình sắc ký cột ............................14

2.3.3.

Tỉ lệ giữa lượng mẫu chất cần tách đối với kích thước cột ....................15

2.3.4.

Nạp chất hấp thu dạng sệt vào cột.........................................................16

2.3.5.

Đặt mẫu chất cần tách lên đầu cột sắc ký..............................................17

2.3.6.

Theo dõi quá trình giải ly cột................................................................18

2.3.7.

Khi nào thay đổi dung môi giải ly cột...................................................19

Chương 3:

THỰC NGHIỆM..................................................................................20

3.1.

Thiết bị hóa chất ..........................................................................................20

3.1.1.

Dụng cụ thiết bị....................................................................................20

3.1.2.

Hóa chất ...............................................................................................20

3.2.

Quá trình xử lý nguyên liệu và điều chế cao ................................................21
iv


3.2.1.

Quá trình thu hái và xử lý nguyên liệu..................................................21

3.2.2.

Quá trình điều chế thu cao ethanol (cao tổng).......................................22

3.2.3.

Quá trình điều chế cao petroleum ether (PE) và các cao khác ...............23

3.3.

Cách phân lập các chất ít phân cực trong lá Bần chua..................................25

3.4.

Các bước tiến hành ......................................................................................25

3.5.

Quá trình phân lập và tinh chế các chất trên cao PE.....................................26

3.6.

Xác định cấu trúc của hợp chất vừa phân lập (PHUOC-DUY01).................30

3.6.1.

Tính chất vật lý của hợp chất PHUOC-DUY01 ....................................30

3.6.2.

Xác định cấu trúc của hợp chất PHUOC-DUY01 .................................30

Chương 4:

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................32

4.1.

Kết luận.......................................................................................................32

4.2.

Đề nghị........................................................................................................32

v


DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Các bộ phận cây Bần chua ..............................................................................1
Hình 2: Thân và Rễ cây Bần chua ................................................................................2
Hình 3: Lá cây Bần Chua.............................................................................................2
Hình 4: Hoa và Quả cây Bần chua ...............................................................................3
Hình 5: Bột lá Bần ngâm trong cồn 95 .....................................................................21
Hình 6: Cao PE..........................................................................................................23
Hình 7: Sơ đồ điều chế cao ........................................................................................24
Hình 8: TLC cao PE và sắc ký cột thường PE............................................................26
Hình 9: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao PE..........................................................26
Hình 10: Sắc ký cột thường phân đoạn Pđ 2.2............................................................28
Hình 11: TlC phân đoạn Pđ 2.2..................................................................................29
Hình 12: TLC phân đoạn Pđ 2.2 với 3 hệ dung môi giải ly.........................................29
Hình 13: Cấu trúc của hợp chất -sitosterol ...............................................................31

vi


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: So sánh sắc ký lớp mỏng với các loại sắc ký khác........................................12
Bảng 2: Các hóa chất sử dụng thực hiện đề tài ..........................................................20
Bảng 3: Kết quả sắc ký cột........................................................................................27

Bảng 4: Kết quả sắc ký cột Pđ 2................................................................................28
Bảng 5: So sánh hợp chất vừa cô lập với chất chuẩn -sitosterol...............................31

vii


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT

NMR

Nuclear Magnetic Resonance

1

Proton Nuclear Magnetic Resonance

H-NMR



Chemical shift

d

Doublet (NMR)

t

Triplet (NMR)

s

Singlet (NMR)

m

Multiplet

TLC

Thin Layer Chromatography

EtOH

Ethanol

PE

Petroleum ether (60-90)

EtOAc, EA

Ethyl acetate

Di

Dichloromethane

ppm

Parts per milion

Rf

Retention factor

HPLC

High-performance liquid chromatography

viii


Chương 1:

TỔNG QUAN VỀ CÂY BẦN

1.1. Đặc điểm cây Bần chua[4,6,7]
Tên Khoa Học: Sonneratia caseolaris (L.) Engl.
Tên đồng nghĩa : Sonneratia acida L, Rhizophora caseolaris
Tên Việt Nam: Bần Chua
Tên khác: Hải đồng, Thủy Liễu
Giới: Plantae
Ngành: Magnoliophyta
Lớp: Magnoliosida
Bộ: Myrtales
Họ: Lythraceae
Chi: Sonneratia
Loài : Sonneratia caseolaris (L.)

Hình 1: Các bộ phận cây Bần chua
Bần là cây thân gỗ, cao từ 5-15 m. Rễ phụ mọc nhô lên khỏi mặt bùn và tập trung
thành khóm ở quanh gốc thân. Lá mọc đối, phiến lá dai, dòn, không lông, không lá bẹ,
1


gần như không cuốn, hình bầu dục, hay hình trứng, dài 5-13 cm, rộng 2-5 cm, với phần
dưới rộng thon nhọn hay tròn, phiến lá nguyên, 8-12 gân mở rộng ra mỗi bên.

Hình 2: Thân và Rễ cây Bần chua

Hình 3: Lá cây Bần Chua
Hoa lưỡng tính, nụ hoa tròn, đế hoa với 6-8 thùy của lá đài, cánh hoa màu đỏ
đậm, rộng 1.5-3.5 cm, nhụy hoa với 16-21 buồng với nhiều noản, vòi nhụy dài, tiểu
nhụy nhiều, đáy chỉ có màu đỏ tím. Hoa thường nở vào tháng 3-5.
Quả mọng, hình cầu dẹt, đường kính 3-4 cm, xanh, phần cuốn có hình ngôi sao,
nạc có vị chua. Thường có quả vào tháng 8-10.

2


Hình 4: Hoa và Quả cây Bần chua
Các bộ phận thường sử dụng: Quả, vỏ, thân và cành.

1.2. Phân bố sinh thái[4,6]
Bần chua là cây thân gỗ mọc ở các vùng đất ngập mặn ở ven biển và được tìm
thấy ở Bangladesh, Brunei Darussalam, Cambodia, China (Hainan Island), India,
Indonesia, Malaysia, Myanmar, Philippines, Singapore, Sri Lanka, Thailand, Northeast
Australia, Papua New Guinea, Solomon Islands, Vanuatu, New Caledonia, and the
Maldives.

Ở Việt Nam Bần mọc phổ biến ở các vùng ven biển, nước lợ. Cây cũng thường
mọc chung với các loài cây khác như: Trang, Sú, Mắm, Cóc,… Cũng có khi mọc
thành rừng như ở Hải Phòng, Nghệ An, Hà Tĩnh. Cây còn được trồng thêm nhằm chắn
sóng và bảo vệ vùng đất ngập nước ở ven biển.

1.3. Công dụng của cây bần chua[6,3]
1.3.1. Y học dân gian
Lá có vị chát, giã nát với ít muối, đấp lên vết thương có tác dụng cầm máu. Ở
Malaixia, người ta giã lá lẫn với cơm làm thuốc đắp chữa bí tiểu tiện. Ta dùng lá giã
ra, thêm tí muối, làm thuốc đắp tốt các vết thương đụng giập và vết thương nhẹ.

3


Quả có vị chua, tính mát có tác dụng tiêu viêm giảm đau. Người ta lấy quả chua
ăn sống hay nấu canh cá, và cũng được sử dụng làm thuốc đắp chữa bông gân hay bị
sưng tấy. Ở Ấn Độ, người ta dùng dịch ép lên men của quả để cầm máu.
Dịch ép của hoa Bần là một thành phần trong bài thuốc chữa đái ra máu ở Ấn Độ.

1.3.2. Y học hiện đại
Hiện nay cây Bần chỉ mới được sử dụng làm thuốc theo dân gian, chưa có nghiên
cứu khoa học cụ thể nào phục vụ trong y học hiện đại.

1.4. Một số công trình nghiên cứu về cây bần chua[3,5,8]
1.4.1. Các công trình nghiên cứu ở Việt Nam
Hiện nay ở Việt nam có rất ít công trình hay đề tài khoa học nghiên cứu về cây
Bần chua Sonneratia caseolaris (L.).
Ngày 12 tháng 04 năm 2010 có bài nghiên cứu về rễ cây Bần chua, do hai tác giả
La Vũ Thùy Linh và Trương Ngọc Đức (Trường Đại Học Tôn Đức Thắng). Nguyên
liệu có sẵn ở Đồng bằng Nam Bộ, họ đã nghiên cứu sản xuất thành công than hoạt

tính. Công trình đã xác định được đặc trưng của rễ Bần và sản xuất thành công than
hoạt tính với điều kiện than hóa ở 450C trong 3 giờ và hoạt hóa bằng cách tẩm muối
cacbonat và nung trong môi trường CO2 ở nhiệt độ 800C trong khoảng 1 giờ…Kết
quả cho thấy than hoạt tính từ rễ bần có thể thay thế các loại than hoạt tính trên thị
trường trong xử lý nước, xử lý môi trường…
Năm 2010 tác giả Từ minh Tỏ đã xác định thành phần hóa học của các hợp chất
ít phân cực từ rễ cây Bần chua (Sonneratia caseolaris (L.)). Bằng phương pháp sắc ký
cột KG 60 F254 (silica gel) kết hợp với sắc ký lớp mỏng, tác giả đã phân lập được
betulinaldehyde từ cao petroleum ether.

1.4.2. Các công trình nghiên cứu trên thế giới
Một số công trình nghiên cứu về cây Bần chua (Sonneratia caseolaris (L.)) trên
thế giới.
Năm 1995 nghiên cứu về thành phần hóa học trên hoa của cây Bần chua
(Sonneratia caseolaris (L.)). Hoa của cây Sonneratia caseolaris (L.) được làm khô.
4


Được chiết với hexane, dichloromethane, ethyl acetate và methanol. Các phân đoạn
chiết từ dầu thô bằng sắc ký cột đã phân lập được mười chất. Tám chất đã biết được
tính chất vật lý, TLC với mẫu xác thực, các phản ứng hóa học và dữ liệu phổ. Tám
chất này là một hỗn hợp của một chuỗi dài sắp xếp theo thứ tự các hydrocarbon
(C23-C33), một hỗn hợp các chuỗi dài các ester, một hỗn hợp các chuỗi dài của alcohol
(C26, C30, C33), một hỗn hợp các steroids (-sitosterol và stigmasterol), kaempferol,
qrercetin, gallic acid và -sitosterol-3-O--D-glucopyranoside. Hai chất còn lại đang
quá trình nghiên cứu.
Năm 2009, nhóm nghiên cứu gồm: Tian Minqing, Dai Haofu, LI Xiaoming,
Wang Bingui. Họ đã khảo sát thành công thành phần hóa học trong cây Sonneratia
caseolaris (L.), và đang trên tạp chí khoa học Oceanology Trung Quốc. Họ đã phân
lập được hai mươi bốn chất trong đó có tám steroid, chín triterpenoids, ba flavonoid,

và các dẫn xuất benzenecarboxylic được phân lập từ thân và cành của cây Sonneratia
caseolaris (L.).

1.4.3. Thành phần hóa học của cây Bần chua


Trên thân và cành: Oleanolic acid, 3,3'-di-O-methyl ether ellagic acid,

3',4-O-tri-O-methyl ether ellagic acid,…


Trên hoa: (-sitosterol và stigmasterol), kaempferol, qrercetin, gallic

acid và -sitosterol-3-O--D-glucopyranoside,…


Trên Quả: (-)-(R)-nyasol, (-)-(R)-4′-O-methylnyasol, maslinic acid,

4-((R,Z)-3-(4-hydrophenyl)pent-1-enyl)phenol,5,7-dihydroxy-2-(3,4-dihydrophenyl)4H-chromen-4-one (luteolin), luteolin 7-O-β-glucoside, tetrahydro-2-(hydroxymethyl)6-phenethyl-2H-pyran-3,4,5-triol,(4αS,6αR,6αS,6R,8αR,10S,12αR,14bS)-10-hydroxy2,2,6α,6,9,9,12α-heptamethyl-1,3,4,5,6,6α,7,8,8α,10,11,12,13,14tetradecahydropicene-4α-carboxylic acid (Oleanic acid),…

1.4.4. Một số hợp chất được phân lập trong cây Bần chua
 Luteolin
Tên khác: Digitoflavone, flacitran, luteolol…
Công thức phân tử: C15H10O6
5


Công thức cấu tao:
OH
OH

HO

O

OH

O

Khối lượng phân tử: 286.24 g/mol
 Luteolin 7-O-β-glucoside
Tên IUPAC:
7-((2S,3R,4S,5S,6R)-Tetrahydro-3,4,5-trihydroxy-6-(hdroxymethyl)-2H-pyran2-yloxy)-5-hydroxy-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-4H-chromen-4-one
Công thức cấu tạo:
OH
OH
O

HO
HO

O

O

OH
OH

OH

O

 Oleanolic acid
Tên IUPAC:
(4αS,6αR,6αS,6R,8αR,10S,12αR,14S)-10-hydroxy-2,2,6α,6b,9,9,12α-heptamet
hyl-1,3,4,5,6,6α,7,8,8α,10,11,12,13,14-tetradecahydropicene-4α-carboxylic acid
Công thức phân tử: C30H48O3
Công thức cấu tạo:

H
OH

H
HO

O

H

khối lượng phân tử: 456.7 g/mol

6


 Quercetin
Tên IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-4H- chromen-4-one
Phân tử khối 302.236 g/mol
Công thức phân tử: C15H10O7
Công thức cấu tạo:
OH
OH

HO

O

OH
OH

O

7


Chương 2:

CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA QUÁ TRÌNH
THỰC NGHIỆM

2.1. Các kỹ thuật chiết tách thông dụng[2]
2.1.1. Dung môi để tách chiết các hợp chất hữu cơ ra khỏi mẫu cây
Do cấu tạo hóa học của cây cỏ hoặc sinh khối thường là những chất liệu đại phân
tử tương đối trơ, không hòa tan trong dung môi hữu cơ. Do đó việc khảo sát hợp chất
tự nhiên nghĩa là chiết lấy và khảo sát các biến dưỡng thứ cấp có trọng lượng phân tử
nhỏ.
Thông thường, người ta muốn nghiên cứu các hợp chất tự nhiên có tính ái dầu
với mức độ phân cực khác nhau. Tuy nhiên đôi khi cũng nghiên cứu các hợp chất có
tính ái nước. Vì vậy, việc chiết tách hợp chất thiên nhiên được thực hiện lần lượt với
từng loại dung môi có tính phân cực tăng dần hoặc chiết một lần lấy tất cả các loại hợp
chất ra bằng cách sử dụng dung môi vạn năng methanol, ethanol.
Nguyên tắc tổng quát là tùy vào đặc tính các chất biến dưỡng thứ cấp có trong
từng loại cây mà sự lựa chọn dung môi và qui trình phù hợp để tách hợp chất ra khỏi

cây. Do đó, trước khi làm thực nghiệm cần phải thu thập đầy đủ các tài liệu tham khảo
có liên quan trực tiếp đến loại cây cần khảo sát để chọn ra qui trình tách chiết phù hợp.
Muốn tách chiết hợp chất ra khỏi cây cần chọn dung môi phù hợp, sử dụng kỹ
thuật chiết ngâm dầm, chiết Soxhlet,... Sau khi chiết, phần bã cây hoặc sinh khối còn
lại được lọc bỏ, dung môi qua lọc được thu hồi bằng máy cô quay chân không ở nhiệt
độ thấp khoảng 30-40°C do nhiệt độ cao có thể làm hư hại một số hợp chất kém bền
nhiệt.

2.1.2. Lựa chọn dung môi chiết tách
Dung môi tách chiết phải trung tính, không độc, không quá dễ cháy, hòa tan được
hợp chất cần khảo sát, sau khi tách chiết xong, dung môi có thể được loại bỏ dễ dàng.
Hạn chế sử dụng dung môi độc như benzene hoặc diethyl ether, carbon tetrachloride,...

8


2.1.3. Một số điều cần biết khi sử dụng dung môi chiết tách
Các dung môi cần được chưng cất lại và tồn trữ trong những chai lọ bằng thủy
tinh do trong môi trường chứa một số tạp bẩn, nhất là chất làm dẻo vì dung môi
thường được chứa trong các thùng làm bằng nhựa dẻo.
Methanol, chloroform thường chứa tạp chất di(2-ethylexyl) thường bị nhầm lẫn
là hợp chất tự nhiên có trong cây cỏ khảo sát.
Acetone có thể tạo ra dẫn xuất acetonid nếu hợp chất chiết có chứa nhóm cis1,2-diol hiện diện trong môi trường acid.
Choloroform, dichloromethane có thể tạo phản ứng với một vài loại alkaloid tạo
thành alkaloid dạng muối tứ cấp và một vài hợp chất giả tạo khác.
Diethyl ether ít được sử dụng để chiết tách hợp chất vì có nhiệt độ sôi thấp dễ
cháy, độc, có thể gây mê cho người sử dụng và có khuynh hướng tạo thành peroxide
dễ gây nổ.
Chiết bằng môi trường acid hay kiềm có thể thủy giải các hợp chất glycoside
(môi trường acid sẽ cắt đứt glycoside tại nối acetal làm mất đi phần đường) hoặc cắt

đứt nối ester (môi trường kiềm) hoặc tạo ra sự chuyển vị.
Sau khi chiết, dung môi có thể thu hồi bằng máy cô quay chân không ở nhiệt độ
30-40°C để không làm hư hại một số hợp chất kém bền nhiệt.

2.1.4. Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng
Kỹ thuật này còn được gọi là sự chiết bằng dung môi. Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng
được áp dụng để phân chia cao alcol thô ban đầu hoặc dung dịch ban đầu thành những
phân đoạn có tính phân cực khác nhau.
Nguyên tắc của sự chiết là dung môi không phân cực (thí dụ petroleum ether,…)
sẽ hoà tan tốt các hợp chất không phân cực (thí dụ các alcol béo, ester béo,…), dung
môi phân cực trung bình (thí dụ diethyl ether, dichloromethane,…) hoà tan tốt các hợp
chất có tính phân cực trung bình (các hợp chất có chứa nhóm chức ether -O-, aldehyde
-CHO, cetone -CO-, ester -COO-,…) và dung môi phân cực mạnh (các hợp chất có
chứa nhóm chức -OH, -COOH,…) sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực mạnh.

9


2.1.5. Kỹ thuật chiết rắn - lỏng
Kỹ thuật chiết ngấm kiệt
Dụng cụ: gồm một bình ngấm kiệt bằng thủy tinh, hình trụ đứng, đáy bình có van
khóa, một bình chứa đặt bên dưới để hứng dịch chiết. Phía trên bình ngấm kiệt là bình
lóng để chứa dung môi tinh khiết.
Thực hành: bột cây được xay khô, lọt được qua lỗ rây 3 mm. Đáy của bình ngấm
kiệt được lót bằng bông thủy tinh và một tờ giấy lọc. Bột cây được đặt lên trên lớp
bông thủy tinh, đến gần đầy bình. Đậy bề mặt lớp bột bằng một tờ giấy lọc và chặn lên
trên bằng những viên bi thủy tinh để dung môi không làm xáo trộn bề mặt lớp bột. Từ
từ rót dung môi vào bình đến khi dung môi phủ xấp xấp phía trên lớp mặt.
Để yên một thời gian thường là 12-24 giờ. Mở khóa bình ngấm kiệt cho dịch
chiết chảy ra, đồng thời mở khóa bình lóng để dung môi chảy xuống bình ngấm kiệt.

Điều chỉnh sao cho vận tốc dung môi chảy vào bằng với vận tốc dịch chiết chảy ra
khỏi bình ngấm.
Phương pháp này đòi hỏi thiết bị phức tạp hơn nhưng hiệu quả lại cao hơn và ít
mất công hơn phương pháp ngâm dầm, vì đây là quá trình chiết liên tục, dung môi
trong bình ngấm kiệt đã bão hòa mẫu chất sẽ liên tục được thay thế bằng dung môi
tinh khiết.
Kỹ thuật chiết ngâm dầm
Ngâm bột cây trong một bình chứa bằng thủy tinh hoặc bằng thép không gỉ, bình
có nắp đậy. Tránh sử dụng bình bằng nhựa vì dung môi hữu cơ có thể hòa tan một ít
nhựa, gây nhầm lẫn là hợp chất có chứa trong cây.
Rót dung môi tinh khiết vào bình cho đều xấp bề mặt của lớp bột cây. Giữ yên ở
nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi xuyên thấm vào cấu
trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên. Sau đó, dung dịch chiết được lọc
ngang qua một tờ giấy lọc, thu hồi dung môi sẽ có được cao chiết. Tiếp theo, rót dung
môi mới vào bình chứa mẫu cây và tiếp tục quá trình chiết thêm một số lần nữa cho
đến khi chiết kiệt mẫu cây.

10


2.2. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)[1]
2.2.1. giới thiệu chung về phương pháp sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography), dựa chủ yếu
vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung
môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất hấp thu trơ, thí dụ như silica gel,
hoặc nhôm oxyt. Pha tĩnh này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền
phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic. Do chất hấp thu được tráng thành
một lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng.


Bình sắc ký: Một chậu, hũ, lọ,… bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng, có nắp



Pha tĩnh: Một lớp mỏng khoảng 0.25 mm của một loại chất hấp thu, thí dụ

đậy.

như silica gel, alumin,… được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng
như tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic. Chất hấp thu trên tấm lá đỡ nhờ sulfat calci
khan, hoặc tinh bột, hặc một loại polymer hữu cơ.


Mẫu cần phân tích: Mẫu chất cần phân tích thường là hỗn hợp gồm nhiều

chất với độ phân cực khác nhau. Sử dụng khoảng 1 microlit (1 μL) dung dịch mẫu với
nồng độ loãng 2-5%, nhờ một vi quản để chấm mẫu thành một điểm gọn trên pha tĩnh,
ở vị trí phía trên cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng đang chứa trong
bình.


Pha động: Dung môi hay hỗn hợp hai dung môi, di chuyển chầm chậm dọc

theo tấm lớp mỏng và lôi kéo mẫu chất đi theo nó. Dung môi sẽ di chuyển lên cao nhờ
vào tính mao quản. Mỗi thành phần của chất mẫu sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau,
đi phía sau mực của dung môi. Vận tốc di chuyển này tùy thuộc vào các lực tương tác
tĩnh điện mà pha tĩnh muốn níu giữ các mẫu chất ở lại pha tĩnh (hiện tượng hấp thu của
pha tĩnh) và tùy vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi.
Với chất hấp thu là silica gel hoặc alumin, các hợp chất kém phân cực sẽ di
chuyển nhanh và các hợp chất rất phân cực di chuyển chậm.

11


2.2.2. So sánh sắc ký lớp mỏng với các kỹ thuật sắc ký khác
Bảng 1: So sánh sắc ký lớp mỏng với các loại sắc ký khác
Sắc ký lớp

Sắc ký cột

Sắc ký cột

mỏng

cổ điển

chớp

Sắc ký khí

Sắc ký
HPLC

nhoáng
Cơ chế sắc

Hấp

ký

thu/phân

Hấp thu

Hấp thu

Phân chia

Phân chia

chia
Tính chất

Dung dịch

Dung dịch

Dung dịch

Khí hoặc

Mẫu có tính

hợp chất

mẫu có tính

mẫu có tính

mẫu có tính

hơi của các

bay hơi

đem phân

kém bay hơi kém bay hơi kém bay hơi

hợp chất có

nhiều hay ít

tích
Khả năng

tính bay hơi đều phù hợp
Đạt

Trung bình

Tốt

Rất tốt

Rất tốt

Thời gian

Vài phút

Nhiều giờ

Vài mươi

Vài phút

Vài phút

tách chất

đến vài giờ

Hiệu quả

Rất tốt

Rất tốt

Rất tốt

Rất tốt

Rất tốt

Có thể

Rất tốt

tách chất

tách chất

phút
Cần sắc ký

Cần sắc ký

vài lần

vài lần

Cần sắc ký

Cần sắc ký

vài lần

vài lần

Rất tốt

Rất tốt

định tính
Hiệu quả

Có thể

tách chất

định lượng
Khả năng
tách lượng

Có thể

nhưng khó

lớn mẫu

12


Sắc ký lớp mỏng có một số ưu điểm như sau:


Chỉ cần một lượng mẫu rất ít để phân tích.



Có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng, trong cùng điều

kiện phân tích.


Tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích có thể được định vị trên tấm sắc ký

lớp mỏng, trong khi so với HPLC: những hợp chất có tính phân cực mạnh sẽ có sắc ký
đồ ở dạng một mũi hấp thụ rộng và dài, nên quan sát viên khó phân biệt được đó là
một mũi (để chỉ sự hiện diện của một chất) hay chỉ là tạp bẩn.

2.2.3. Chất hấp thu silica gel
Silica gel là chất hấp thu được sử dụng thông dụng nhất. Silica gel được sử
dụng làm pha tĩnh trong sắc ký được chế tạo bằng cách thủy giải silicat natri (cho tác
dụng với acid sulfuric) để thành acid polysilisic, tiếp theo là sự ngưng tụ và polymer
hóa để đạt các chỉ tiêu vật lý cần thiết như có các hạt với kích cỡ hạt, thể tích lỗ rỗng
trên bề mặt…như yêu cầu. Ngoài ra người ta còn thêm các hợp chất khác để tăng khả
năng tách theo mong muốn.

2.2.4. Dung môi giải ly
Nguyên tắc chọn dung môi: Nên chọn loại dung môi rẻ tiền, vì phải cần một
lượng lớn, có độ tinh khiết cao, tránh có các vết kim loại. Dung môi không được quá
dễ bay hơi, ví dụ như ethyl ether, nhiệt độ sôi xấp xỉ 35C, gần bằng nhiệt độ của
phòng thí nghiệm vào mùa nóng (miền nam Việt Nam). Dung môi dễ bay hơi sẽ dễ
dàng bay đi khỏi tấm lớp mỏng sau khi giải ly.
Một mẫu chất cần phân tích có chứa nhiều cấu tử khác nhau. Khả năng tách riêng
các hợp chất này bằng sắc ký lớp mỏng tùy thuộc vào tỷ lệ phân phối của các hợp chất
này giữa chất hấp thu và dung môi giải ly. Muốn thay đổi khả năng tách, người ta thay
đổi thành phần các dung môi sử dụng để giải ly. Thường thì người ta sử dụng với hệ
hai dung môi.
Về nguyên tắc tổng quát, nếu có thể, nên tránh sử dụng hỗn hợp dung môi có
nhiều hơn hai cấu tử, vì hỗn hợp phức tạp như thế dễ dàng dẫn đến việc thay đổi pha
khi có sự thay đổi nhiệt độ.
13