Nghiên cứu phân lập các hoạt chất tritecpen glycoside từ lá cây mâm sôi (rubus alceafolius poir)

Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghệp
Mở đầu

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm mưa
nhiều, độ ẩm cao khoảng trên 80%, thích hợp cho sự phát triển của thực vật.
Thêm vào đó, 3/4 diện tích nước ta là đồi núi nên thảm thực vật ở Việt Nam vô
cùng phong phú và đa dạng với khoảng 12000 loài thực vật[1]. Nguồn thực vật
phong phú này không những đáp ứng nhu cầu về lương thực, thực phẩm cho
con người, mà nhiều loài trong số đó còn được sử dụng trong y học cổ truyền.
Các phương thuốc y học cổ truyền đã thể hiện những mặt mạnh là ít độc tính
và ít tác dụng phụ nên được người dân sử dụng tương đối rộng rãi.
Cùng với sự phát triển của xã hội thì nhu cầu của con người ngày càng
cao. Con người ngày càng quan tâm đn nhiều lĩnh vực của cuộc sống đặc biệt
là chăm sóc sức khỏe, làm đẹp. Vì vậy việc nghiên cứu, tìm kiếm các chất
có hoạt tính sinh học có vai trò rất quan trọng. Nó thúc đẩy sự phát triển của
ngành y dược và nhiều lĩnh vực hoá học khác, góp phần nâng cao chất lượng
cuộc sống của con người.
Cõy Mõm xụi phõn b tng i rng rói khp cỏc tnh vựng nỳi thp,
trung du v ng bng. Cõy Mõm xụi cú nhiu b phn (r, lỏ, qu, cnh)
c s dng trong nhiu bi thuc cha bnh. Cõy cú hot tớnh sinh hc cao,
cha nhiu thnh phn húa hc v cú nhiu tỏc dng dc lý, trong dõn gian
c dựng lm thuc thanh nhit, kớch thớch tiờu húa , tiêu viêm.. Vic
nghiờn cu kho sỏt v thnh phn húa hc v tỏc dng dc lý ca cây Mâm
xôi ở Việt Nam t c s khoa hc cho vic s dng chỳng một cỏch hp lý
v cú hiu qu. Vì vậy, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài Nghiên cứu phân lập
các hợp chất tritecpen glycoside từ lá cây Mâm xôi.
Nhim v ca khúa lun:
- Phõn lp mt s hp cht tritecpen glycoside t cõy Mõn xụi .
- Xỏc nh cu trỳc húa hc ca cỏc hp cht ó phõn lp.

Đỗ Thị Tươi

1

K32C Khoa Hóa học


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghệp

Chương 1. Tổng Quan
1.1. Tổng quan về cây Mâm xôi
1.1.1. Thực vật học
Cây Mâm xôi hay còn được gọi là đùm đũm có tên khoa học là Rubus
alceaefolius Poir., thuộc họ Hoa hồng - Rosaceae. Đây là loài cây bụi nhỏ,
thân leo có gai to và dẹt. Cành mọc vươn dài, có nhiều lông. Lá đơn, mọc so
le, hình bầu dục, hình trứng hoặc gần tròn, chia thùy nông, không đều, gân
chân vịt, mép khía răng, mặt trên màu lục sẫm phủ lông lởm chởm, mặt dưới
có nhiều lông mềm, mịn màu trắng xỉn; cuống lá dài cũng có gai; lá kèm sớm
rụng. Cụm hoa mọc ở kẽ lá hoặc đầu cành thành chùm ngắn; lá bắc giống lá
kèm, hoa màu trắng; cánh hoa 5, mỏng hình tròn, nhị rất nhiều thường dài
bằng cánh hoa, chỉ nhị dẹt, lá noãn nhiều. Quả hình cầu, gồm nhiều quả hạch
tụ họp lại như dáng mâm xôi, khi chín màu đỏ tươi, ăn được. Cây ra hoa tháng
2-3, quả tháng 5-7 [1, 2].

Hỡnh 1.1 : Cây Mâm xôi Rubus alceaefolius Poir.

Đỗ Thị Tươi

2

K32C Khoa Hóa học


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghệp

1.1.2. Phân bố, sinh thái
Theo Đỗ Huy Bích và cộng sự [1], trên thế giới chi Rubus có khoảng
hơn 400 loài, hầu hết là cây bụi, mọc thẳng hay bụi trườn, phân bố chủ yếu ở
vùng ôn đới, cận nhiệt đới và cả ở vùng nhiệt đới Bắc bán cầu. Một vài loài
được trồng lấy quả. ở Việt Nam, chi này có 51 loài, 7 thứ, trong đó Mâm xôi
là loài phân bố tương đối rộng rãi ở khắp các tỉnh vùng núi thấp, trung du và
đồng bằng. Cây ưa sáng và ẩm, thường mọc trùm lên các cây bụi và cây leo
khác ở ven rừng ẩm, rừng núi đá vôi, đồi, nhất là trong các trảng cây bụi ưa
sáng trên đất sau nương rẫy. ở vùng đồng bằng, Mâm xôi mọc lẫn trong các
lùm bụi quanh làng, hai bên đường đi. Cây này sinh trưởng, phát triển nhanh.
Những cây ít bị chặt phá ra hoa quả nhiều hàng năm. Cây có khả năng tái sinh
mạnh sau khi bị chặt phá.
1.1.3. Công dụng
Lá, cành và rễ cây Mâm xôi có vị ngọt nhạt, tính bình, có tác dụng
thanh nhiệt, tán ứ, tiêu viêm, chỉ huyết, kích thích tiêu hóa, giúp ăn ngon
miệng. Cành lá phơi khô, nấu nước uống thay chè, dùng cho phụ nữ sau khi đẻ
mất sức và những người ăn không tiêu, đầy bụng. Ngoài ra cành và lá Mâm
xôi còn được dùng phối hợp với Mộc thông, Ô rô để chữa viêm tuyến vú, viêm
gan cấp và mạn tính. Quả có vị ngọt, tính bình, được dùng thay vị Phúc bồn tử
trong y học cổ truyền, có tác dụng bổ gan thận, giữ tinh khí, làm tráng dương,

mạnh sức. Quả được dùng chữa thận hư, liệt dương, di tinh, đái són, đái buốt
[1, 2].
ở ấn Độ người ta dùng quả Mâm xôi làm thuốc chữa bệnh đái dầm của
trẻ em. Nước sắc lá và vỏ thân được dùng làm thuốc điều kinh, chữa tiêu chảy.
ở Trung Quốc, Mâm xôi được sử dụng trong y học cổ truyền để chữa
albumin niệu, viêm tuyến vú và viêm gan mạn tính... ở một số vùng của
Trung Quốc, nó còn được sử dụng để chữa một số bệnh ung thư nhất định.

Đỗ Thị Tươi

3

K32C Khoa Hóa học


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghệp

Theo kết quả nghiên cứu của Cui C. -B. và cộng sự, rễ Mâm xôi thể hiện hoạt
tính ức chế mạnh chu kỳ tế bào ở pha G0/G1 của dòng tế bào tsFT210 (Chu kỳ
tế bào, con đường duy nhất để tế bào sinh sôi, là một quá trình sinh học được
kiểm soát chặt chẽ và thực tế ung thư là sự tăng sinh vô hạn độ không mong
muốn của các tế bào ung thư với sự thoái hóa của chu kỳ tế bào. Do đó, các
chất ức chế chu kỳ tế bào có khả tiềm tàng trong điều trị ung thư) [7].
1.1.4. Thành phần hoá học
Theo các sách về cây thuốc Việt Nam [1, 2], quả Mâm xôi chứa các axit
hữu cơ (chủ yếu là axit citric, malic, salycilic), đường, pectin. Lá chứa tanin.
Tuy nhiên, hiện nay còn rất ít công trình nghiên cứu được công bố về loài R.
alceaefolius.

Từ cây R. alceaefolius mọc ở Trung Quốc, năm 1998 Gan L. và các
đồng nghiệp đã phân lập được: axit corosolic (1), axit tormentic (2), nigainchigoside F1 (3), trachelosperoside E-1 (4) và suavissimoside R1 (5) [8].
Năm 2000, Gan L. và các đồng nghiệp lại công bố phân lập của alcesefoliside
(6), hyperoside (7), vomifoliol (8), -sitosterol (9), daucosterol (10) và
dotriacontyl alcohol (11) [9]. Năm 2002, nhóm nghiên cứu của Cui C. -B. đã
công bố sự phân lập của rubuphenol (12), sanguiin H-2 ethyl ester (13), axit
ellagic (14), ethyl gallate (15), 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl--D-glucopyranose
(16) và 1,2,3,6-tetra-O-galloyl--D-glucopyranose (17) [7].
Cấu trúc của một số hợp chất đã được phân lập từ loài R.
alceaefolius.được dẫn ra sau đây:

Đỗ Thị Tươi

4

K32C Khoa Hóa học


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghệp

Các hợp chất đã được phân lập từ cây Rubus alceaefolius
OH

O

O
HO

HO

OH

OH

HO

HO

Hình 1.1.4.2. Axit tormentic

Hình 1.1.4.1. Axit corosolic
OH

HO

O

O

H

H
HO

HO

O

O
H

H

OH

OH
HO

HO

O

H

O
H

HO

H
OH

HO

OH
OH

OH

OH

OH

OH

Hình 1.1.4.4. Trachelosperoside E-1

Hình 1.1.4.3. Niga-inchigoside F1

OH

OH

HO

O
OH

O
HO

O
O

OH

OH
HO

O

OH
O

O

HOOC

OH

OH
OH

OH

OH

Hình 1.1.4.5. Suavissimoside R1

OH

Hình 1.1.4.7. Hyperoside
OH
HO

OH

O

O

OH

O

O

OH

OH
HO

O

O

OH

Hình 1.1.4.12. Rubuphenol

Hình 1.1.4.8. Vomifoliol

Đỗ Thị Tươi

5

K32C Khoa Hóa học

Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghệp

OH
HO
O
HO
O

HO

OH

O
O

HO
O

OH

H

O

OH

C

O

O

OH

OH

O

O
CH3CH2

OH

O

O

O

O
OH

O
O
OH
HO

OH

HO

HO

OH

OH HO

O

O

OH

Hình 1.1.4.14. Axit ellagic

Hình 1.1.4.13. Sanguiin H-2 ethyl

ester
OH
O
O

O

G=
CH2CH3

OH

C

GO
OH
O
RO

HO

OG

GO

OH

OG
OH

Hình 1.1.4.15. Ethyl gallate

Hình 1.1.4.16. R=G; 1,2,3,4,6-penta-O-

galloyl--D-glucopyranose
Hình 1.1.4.17. (R= H) 1,2,3,6-tetra-O-

galloyl--D-glucopyranose

1.2. Giới thiệu về lớp chất Tritecpen [3, 4, 5].
1.2.1. Giới thiệu chung

Tecpen thường gặp trong giới thực vật, nhất là trong tinh dầu thảo mộc
(các tinh dầu thông, sả, cam, hoa hồng)
Tecpen là các hidrocacbon đa số không no mạch hở hay mạch vòng, có
công thức chung là (C5H8)n (n2)
Tecpen được tạo thành do isopren kết hợp với nhau theo kiểu đầu nối với
đuôi

Đỗ Thị Tươi

6

K32C Khoa Hóa học


Trường ĐHSP Hà Nội 2

C5H8, Isopren

Khóa luận tốt nghệp

C10H16, Oximen

C10H16, Silvestren

Các dẫn xuất chứa oxi của tecpen (ancol, andehit, xeton, este) được gọi là
tecpenoit. Tecpenoit cũng rất phổ biến trong các loại tinh dầu thảo mộc.

O
CHO
OH

Mentol
(Tinh dầu bạc hà)

Xitronelal

Tuion

(Tinh dầu sả)

(Từ dầu Thiya occidentalis)

Căn cứ vào số đơn vị isopren hợp thành mà người ta phân loại tecpen thành
các monotecpen C10, sesquitecpen C15, ditecpen C20, sestertecpen C25, tritecpen
C30, tetratecpen C40 và polytecpen.
Dựa vào số vòng của cấu trúc, người ta chia monotecpen thành ba nhóm:
monotecpen không vòng (Axiclic monotecpen), monotecpen

một vòng

(Monoxiclic monotecpen), monotecpen hai vòng (Bixiclic monotecpen).
Trong mỗi nhóm, các monotecpen có thể là các hidrocacbon không no hoặc
có thêm các nhóm chức ancol, andehit, xeton.

Đỗ Thị Tươi

7

K32C Khoa Hóa học

Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghệp

-Tecpinen

Camphen
(Trong tinh dầu long não)

(Từ dầu thông)

Đitecpen có mạch hở và mạch vòng, quan trọng nhất là hai ancol
đitecpen: phitol (C20H39OH) và retinol (C20H29OH). Phitol ở dạng este tạo
thành một nhánh của clorophin có trong chất diệp lục của cây xanh. Retinol
hay là vitamin A có trong lòng đỏ trứng, dầu gan cá

CH2OH
CH2OH

Phitol

Retinol (vitamin A)

Các tritecpen phân bố rộng rãi trong giới thực vật, cho đến những năm
bảy mươi có khoảng 500 hợp chất tritecpen được xác định cấu trúc. Một số
tritecpen có tác dụng sinh lý, dược lý như: kháng khuẩn, kháng nấm, kháng
viêm và kháng một số dạng ung thư, ngoài ra còn có tác dụng lên hệ thần kinh
trung ương, điều hoà nội tiết, hạ cholesterol máu và chống xơ vữa động mạch.
Hợp chất squalen với cấu hình trans là chất tiền thân sinh học của tất cả

các tritecpen.

Đỗ Thị Tươi

8

K32C Khoa Hóa học


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghệp

squalen

Sự đóng vòng của squalen theo các cách khác nhau tạo nên sự đa dạng
của các hợp chất tritecpen.
1.2.2. Các nhóm Tritecpen
1.2.2.1. Sự đóng vòng của squalenoxit trong chuỗi thuyền - ghế - thuyền ghế.
Sự đóng vòng của squalenoxit trong chuỗi thuyền - ghế - thuyền - ghế
dẫn đến sự hình thành cation cầu nối
Cation này biến đổi tiếp tạo thành các hợp chất khác nhau, sau đây là
một số hợp chất tiêu biểu:
H

H
HO

HO

Protosterol

Lanosterol

CO2H

H
H

OAc

H
H
O

O

HO

AcO

Cycloartenol

axit helvolic

1.2.2.2. Sự đóng vòng của squalen epoxit trong chuỗi ghế - ghế - ghế thuyền
Đóng vòng của squalen epoxit trong chuỗi ghế - ghế - ghế - thuyền tạo
ra cation.

Đỗ Thị Tươi

9

K32C Khoa Hóa học


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghệp
OH

Từ cation này có thể tạo ra các
H

20

tritecpen 4 vòng xuất hiện trong nhựa
dammar là các chất dammarendiol I
HO

hay dammarendiol II (đồng phân

dammarendiol

epime ở vị trí C20).
H
20

Sự chuyển vị cation trên tạo ra
14

nhóm hợp chất có tầm quan trọng lớn
là nhóm euphol

8

- tirucallol. Công

HO

thức hợp chất như sau:

Euphol: 20 H; Tirucallol: 20 H

1.2.2.3. Sự đóng vòng của squalen trong các chuỗi ghế - ghế - ghế - ghế ghế, ghế- ghế - ghế - ghế - thuyền, ghế - thuyền - ghế - ghế - thuyền.
Sự đóng vòng của squalen theo cấu dạng ghế - ghế - ghế - ghế - ghế dẫn
tới các cation trung gian từ đó hình thành các diplopten, tetrahymanol và các
tritecpen năm vòng.
H

H

OH
H
H

H

H

Diplopten

Tetrahymanol

Đóng vòng theo cấu dạng ghế- ghế - ghế - ghế - thuyền của squalen dẫn
tới sự hình thành của moretenol và các hợp chất liên quan qua cation trung
gian như hình vẽ sau:

Đỗ Thị Tươi

10

K32C Khoa Hóa học


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghệp
H

H

HO

H

Morotenol

Cation trung gian
Đóng vòng theo cấu dạng ghế- ghế - ghế - ghế - thuyền của squalen kết hợp

chuyển vị tạo ra các hợp chất như neomotinol và fernen.
H

HO

fernen

neomotiol

Một đại diện quan trọng cho nhóm các tritecpen dẫn ra từ cấu dạng ghế thuyền - ghế - ghế - thuyền là Arborinol.
H

HO

HO

Arborinol

1.2.2.4. Sự đóng vòng của squalen một cách đồng thời từ hai đầu
Một nhóm nhỏ tritecpen là sản phẩm của sự oxi hoá đồng thời từ hai đầu
của phân tử squalen. Các hợp chất tiêu biểu của nhóm này là onocerin và
tritecpen 5 vòng thuộc khung serraten với chất đại diện là serratendiol.
OH

H

OH
HO

OH

H

H

H

H
H

HO

H
HO

serratendiol

onocerin

Đỗ Thị Tươi

11

K32C Khoa Hóa học


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghệp

1.3. Các phương pháp chiết mẫu thực vật
1.3.1 Đặc điểm chung của chiết
Khái niệm: Chiết là quá trình tách và phân ly các chất dựa vào quá trình
chuyển một chất hoà tan trong một pha lỏng vào một pha lỏng khác không hoà
tan với nó.
Mục đích của chiết:
+ Chuyển một lượng nhỏ chất nghiên cứu trong một thể tích lớn
dung môi này vào một thể tích nhỏ dung môi khác nhằm nâng cao nồng độ
của chất cần nghiên cứu và được gọi là chiết làm giàu.
+ Ngoài ra còn dựng phương pháp chiết pha rắn để tách hay phân
ly các chất trong một hỗn hợp phức tạp với điều kiện thích hợp.Thường dùng
trong phân tách các hợp chất tự nhiên.
1.3.2. Cơ sở của quá trình chiết.
Dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất trong hai chất lỏng không
hoà tan lẫn với nhau. Sự phân bố khác nhau là do tính tan khác nhau của các
chất trong các pha lỏng.
Quá trình chiết dựa trên định luật Nerst:
KA = CA/CB
KA: hằng số phân bố
CA, CB: nồng độ các chất hoà tan trong chất lỏng A, B
không hoà tan lẫn vào nhau.
1.3.3. Quá trình chiết
1.3.3.1. Chọn dung môi chiết
Thông thường các chất chuyển hoá thứ cấp trong cây có độ phân cực
khác nhau.Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm.
Dung môi dùng trong quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cẩn
thận.

Đỗ Thị Tươi

12

K32C Khoa Hóa học


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghệp

Điều kiện của dung môi là phải hoà tan được những chất chuyển hoá
thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng
với chất nghiên cứu), không độc, không dễ bốc cháy.
Những dung môi này nên được chưng cất để thu được dạng sạch trước
khi sử dụng. Nếu chúng có lẫn cấc chất khác thì có thể ảnh hưởng đến hiệu
quả và chất lượng của quá trình chiết. Thường có một số chất dẻo lẫn trong
dung môi như các điankyl phtalat, tri-n-butyl-axetylcitrar và tributylphosphat.
Những chất này có thể lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất hoặc trong
khâu bảo quản như trong các thùng chứa hoặc các nút đậy bằng nhựa.
Methanol

và

chloroform

thường

chứa

đioctylphtalat

[đi-(2-

etylhexyl)phtalat hoặc bis-2- etylhexyl-phtalat]. Chất này sẽ làm sai lệch kết
quả phân lập trong các quá trình nghiên cứu hoá thực vật, thể hiện hoạt tính
trong thử nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây. Chlorofrom,
metylen clorit và methanol là những dung môi thường được lựa chọn trong
quá trình chiết sơ bộ một phần của cây như: lá, thân, rễ, củ, quả, hoa
Những tạp chất của chloroform như CH2Cl2, CH2ClBr có thể phản ứng
với một vài hợp chất như các ankaloit tạo muối bậc bốn và những sản phẩm
khác. Tương tự như vậy sự có mặt của lượng nhỏ axit clohidric (HCl) cũng có
thể gây ra sự phân huỷ, sự khử nước hay sự đồng phân hoá với các hợp chất
khác. Vì chloroform có thể gây tổn thương cho gan và thận nên nó cần được
thao tác khéo léo, cẩn thận ở nơi thoáng và phải đeo mặt lạ phòng độc.
Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn chloroform.
Methanol và ethanol 80% là những dung môi phân cực hơn các
hidrocacbon thế clo. Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ
thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu
được lượng lớn các thành phần trong tế bào. Trái lại khả năng phân cực của
Chlorofrom thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào. Các ancol
hoà tan phân lớn các chất chuyển hoá phân cực cùng với các hợp chất phân

Đỗ Thị Tươi

13

K32C Khoa Hóa học


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghệp

cực trung bình và thấp. Vì vậy khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng bị
hoà tan đồng thời. Thông thường dung môi cồn trong nước có những đặc tính
tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ.
Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng
methanol trong sut quá trình chiết. Thí dụ trechlonolide A thu được từ
Trechonaetes aciniata được chuyển thành trechonolide B bằng quá trình phân
huỷ 1-hydroxytropcocain cũng xảy ra khi erythroxylum novogranatense được
chiết trong methanol nóng.
Người ta thường ít sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ cây mà
thay vào đó là dùng dung dịch nước của methanol.
Đietyl ete hiếm khi được dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất
dễ bay hơi, bốc cháy và rất độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit dễ
nổ, peroxit của đietyl ete dễ gây phản ứng oxi hoá với những hợp chất không
có khả năng tạo Cholesterol như các carotenoid. Tiếp đến là axeton cũng có
thể tạo thành axetonit nếu 1,2 cis- diol có mặt trong môi trường axit. Qúa
trình chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình phân
tách đặc trưng, cũng có khi xử lý các dịch chiết bằng axit-bazơ có thể tạo
thành những sản phẩm mong muốn.
Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hoá thứ cấp trong
cây được chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợp cho quá
trình chiết tránh được sự phân huỷ chất bởi dung môi và quá trình tạo thành
chất mong muốn.
Sau khi chiết dung môi được cất ra bằng máy cắt quay ở nhiệt độ không
quá 30-400C, với một hoá chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn.
1.3.3.2. Quá trình chiết
Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau:
- Chiết ngâm.
- Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet.

Đỗ Thị Tươi

14

K32C Khoa Hóa học


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghệp

- Chiết sắc với dung môi nước.
- Chiết lôi cuốn theo hơi nước.
Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi
nhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời
gian. Thiết bị sử dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khoá ở dưới đáy để
điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi. Dung môi
có thể nóng hoặc lạnh nhưng nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn. Trước đây,
máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhưng hiện nay có thể dùng
bằng thuỷ tinh.
Thông thường quá chiết ngâm không được sử dụng như phương pháp
chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng 24 giờ
rồi chất chiết được lấy ra. Thông thường quá trình chiết một mẫu chỉ thực hiện
qua ba lần dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa những chất giá trị
nữa. Sự kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một vài cách khác nhau.
Như vậy tuỳ thuộc vào mục đích cần chiết lấy chất gì để lựa chọn dung môi
cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lý nhằm đạt hiệu quả cao.
Ngoài ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các
hợp chất mà ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết.

1.4. Các phương pháp sắc ký trong phân lập các hợp chất hữu cơ
Phương pháp sắc ký (chromatography) là một phương pháp phổ biến và
hữu hiệu nhất hiện nay, được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các hợp
chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng.
1.4.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký [3].
Sắc ký là phương pháp tách các chất dựa vào sự khác nhau về bản chất
hấp phụ và sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và tĩnh.
Sắc ký gồm có pha tĩnh và pha động. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu
tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất
của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan). Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác

Đỗ Thị Tươi

15

K32C Khoa Hóa học


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghệp

nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình pha động chuyển động dọc
theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá
trình hấp phụ và phản hấp phụ. Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ
chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn
với pha này. Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá trình
sắc ký.
1.4.2. Cơ sở của phương pháp sắc ký
Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai

pha động và pha tĩnh. ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ
thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch (hoặc
với chất khí là áp sut riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng
nhiệt Langmuir:
n

n .b.C
1 b.C

n- lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng
n -lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào đó

b- hằng số
C nồng độ của chất bị hấp phụ
1.4.3. Phân loại các phương pháp sắc ký
Trong phương pháp sắc ký pha động là các lưu thể (các chất ở trạng thái
khí hay lỏng), còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn. Dựa
vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc ký thành hai nhón lớn:
sắc ký khí và sắc ký lỏng. Dựa vào cách tiến hành sắc ký, người ta chia ra
thành các phương pháp sắc ký chủ yếu sau:
1.4.3.1. Sắc ký cột (CC)
Đây là phương pháp sắc ký phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh gồm
các loại Silica gel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha đảo YMC,
ODS, Dianion Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột có thể bằng thuỷ tinh

Đỗ Thị Tươi

16

K32C Khoa Hóa học

Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghệp

hoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thuỷ tinh). Độ mịn của chất hấp phụ hết
sức quan trọng, nó phản ánh số đĩa lý thuyết hoặc khả năng tách của chất hấp
phụ. Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lý thuyết càng lớn, khả năng
tách càng cao và ngược lại. Tuy nhiên nếu chất hấp phụ có kích thước hạt càng
nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm. Trong một số trường hợp nếu lực trọng trường
không đủ lớn thì gây ra hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy được), khi
đó người ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC), áp suất cao
(HPLC).
Trong sắc ký cột, tỷ lệ đường kính cột (D) so với chiều cao cột (L) rất
quan trọng, nó thể hiện khả năng tách của cột. Tỷ lệ L/D phụ thuộc vào yêu
cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể. Trong sắc ký, tỷ lệ giữa
quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi gọi là
Rf, với mỗi một chất sẽ có Rf khác nhau. Nhờ vào sự khác nhau về Rf này mà
ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp. Tỉ lệ chất so với tỉ lệ chất hấp phụ
cũng rất quan trọng và tuỳ thuộc vào yêu cầu tách. Nếu tách thô thì tỉ lệ này
thấp (từ 1/5 1/10), còn nếu tách tinh thì tỉ lệ này cao hơn và tuỳ vào hệ số
tách (tức phụ thuộc vào sự khác nhau Rf của các chất), mà hệ số này trong
khoảng 1/20 1/30. Trong sắc ký cột, việc đưa chất lên cột hết sức quan
trọng. Tuỳ thuộc vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên
cột bằng các phương pháp khác nhau. Nếu lượng chất nhiều và chạy thô, thì
phổ biến là tẩm chất vào silica gel rồi làm khô, tơi hoàn toàn, đưa lên cột. Nếu
tách tinh, thì đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hoà tan chất bằng dung môi
chạy cột với lượng tối thiểu.
Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột:

- Cách 1: Nhồi cột khô. Theo cách này, chất hấp phụ được đưa trực tiếp
vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để chất
hấp phụ sắp xếp chặt trong cột. Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy cột
đến khi cột trong suốt.

Đỗ Thị Tươi

17

K32C Khoa Hóa học


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghệp

- Cách 2: Nhồi cột ướt, tức là chất hấp phụ được hoà tan trong dung môi
chạy cột trước với lượng dung môi tối thiểu. Sau đó đưa dần vào cột đến khi
đủ lượng cần thiết.
Khi chuẩn bị cột phải lưu ý không được để bọt khí bên trong (nếu có
bọt khí gây nên hiện tượng chạy rối trong cột và giảm hiệu quả tách), và cột
không được nứt, gãy, dò.
Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách. Nếu tốc
độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách. Còn nếu tốc độ dòng chảy
quá thấp thì sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công việc.
1.4.3.2. Sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng (SKLM) thường được sử dụng để kiểm tra và định
hướng cho sắc ký cột. SKLM được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn Silica
gel trên đế nhôm hay đế thuỷ tinh. Ngoài ra, SKLM còn dùng để điều chế thu
chất trực tiếp. Bằng việc sử dụng bản SKLM điều chế (bản được tráng Silica

gel dày hơn) , có thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản, và sau khi chạy sắc ký,
người ta có thể cạo riêng phần Silica gel có chứa chất cần tách rồi giải hấp phụ
bằng dung môi thích hợp để thu được từng chất riêng biệt. Có thể phát hiện
chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc trưng cho từng
lớp chất hoặc sử dụng dung dịch H2SO4 10%.
1.5. Một số phương pháp hoá lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu
cơ [3]
Cấu trúc hoá học các hợp chất hữu cơ được xác định nhờ vào các
phương pháp phổ kết hợp. Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học của từng chất mà
người ta sử dụng phương pháp phổ cụ thể nào. Cấu trúc càng phức tạp thì yêu
cầu phối hợp các phương pháp phổ càng cao. Trong một số trường hợp, để xác
định chính xác cấu trúc hoá học của các hợp chất, người ta phải dựa vào các
phương pháp bổ sung khác như chuyển hoá hoá học, kết hợp với các phương
pháp sắc ký so sánh

Đỗ Thị Tươi

18

K32C Khoa Hóa học


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghệp

1.5.1. Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy, IR)
Phổ hồng ngoại được xác định dựa vào sự khác nhau về dao động của
các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại. Mỗi
kiểu liên kết được đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau. Do đó dựa

vào phổ hồng ngoại, có thể xác định được các nhóm chức đặc trưng trong hợp
chất, ví dụ như dao động hoá trị của nhóm OH tự do trong các nhóm hydroxyl
là 3300 3450 cm-1, của nhóm cácbonyl C=O trong khoảng 1700 1750
cm-1
1.5.2. Phổ khối lượng (Mass spectroscopy, MS).
Nguyên tắc của phương pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion
trong phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài. Phổ MS còn cho
các pic ion mảnh khác mà dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế
phân mảnh và dựng lại được cấu trúc hoá học các hợp chất. Hiện nay có rất
nhiều loại phổ khối lượng, những phương pháp chủ yếu được nêu ra dưới đây:
- Phổ EI-MS (Electron Impact Ionizatoin mass spectroscopy) dựa vào sự
phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lượng khác nhau,
phổ biến là 70 eV.
- Phổ ESI-MS (Electron spray Ionizatoin mass spectroscop) gọi là phổ
phun mù điện tử. Phổ này được thực hiện với năng lượmg bắn phá thấp hơn
nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử và các
pic đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị phá vỡ.
- Phổ FAB (Fast Atom Bombing mass spectroscopy) là phổ bắn phá
nguyên tử nhanh với sự bắn phá nguyên tử nhanh ở năng lượng thấp, do đó
phổ thu được cũng dễ thu được pic ion phân tử.
- Phổ khối lượng phân giải cao ( High resolution mass spectroscopy) cho
phép xác định pic ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao.
- Ngoài ra, hiện nay người ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp sắc
ký kết hợp với khối phổ khác như: GC-MS (sắc ký khí khối phổ), LC-MS (

Đỗ Thị Tươi

19

K32C Khoa Hóa học

Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghệp

sắc ký lỏng khối phổ). Các phương pháp kết hợp này còn đặc biệt hữu hiệu
khi phân tích thành phần của hỗn hợp chất (nhất là phân tích thuốc trong
ngành dược).
1.5.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance
Spectroscopy, NMR)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu
hiệu nhất hiện nay. Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một
chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của
hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử.
Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và
cacbon) là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (1H và 13C) dưới tác
dụng của từ trường ngoài. Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng
độ chuyển dịch hoá học (chemical shift) . Ngoài ra, đặc trưng của phân tử còn
được xác định dựa vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin
coupling).
1.5.3.1. Phổ 1H - NMR:
Trong phổ 1H NMR, độ chuyển dịch hoá học () của các proton được
xác định trong thang ppm từ 0 14 ppm, tuỳ thuộc vào mức độ lai hoá của
nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phần. Dựa vào những đặc trưng
của độ chuyển dịch hoá học và tương tác spin mà ta có thể xác định được cấu
trúc hóa học của hợp chất.
1.5.3.2. Phổ 13C - NMR:
Phổ này cho tín hiệu vạch phổ cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng
hưởng ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo của

phổ 13C NMR là ppm, với dải thang đo rộng 0 230 ppm.
1.5.3.3. Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer):
Phổ này cho ta các tín hiệu phân loại các loại cacbon khác nhau. Trên
phổ DEPT, tín hiệu của các cacbon bậc bốn biến mất. Tín hiệu của CH và CH3

Đỗ Thị Tươi

20

K32C Khoa Hóa học


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghệp

nằm về một phía và của CH2 về một phía trên phổ DEPT 1350. Trên phổ DEPT
900 chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của các CH.
1.5.3.4. Phổ 2D-NMR:
Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định các tương tác của
các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều. Một số kỹ thuật chủ
yếu thường được sử dụng như sau:
- Phổ HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence): Các tương tác
trực tiếp H-C được xác định nhờ vào các tương tác trên phổ này. Trên phổ,
một trục là phổ 1H - NMR còn trục kia là 13C - NMR. Các tương tác HQMC
nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ.
- Phổ 1H - 1H COSY (HOMOCOSY) (1H - 1H Chemical Shift Correlation
Spectroscopy): Phổ này biểu diễn các tương tác xa của H-H, chủ yếu là các
proton đính với cacbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà các phần của phân tử
được ghép nối lại với nhau.

- Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): Đây là phổ biểu
diễn tương tác xa trong không gian phân tử. Nhờ vào các tương tác trên phổ
này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu
trúc.
- Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy): Phổ này biểu diễn
các tương tác xa trong không gian của các proton không kể đến các liên kết
mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian. Dựa vào kết quả phổ
này có thể xác định cấu trúc không gian của phân tử.
Người ta còn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kỹ thuật phổ NOE
Differences để xác định cấu trúc không gian của phân tử. Bằng việc đưa vào
một xung đúng bằng từ trường cộng hưởng của một proton xác định thì các
proton có cùng phía về không gian cũng như gần nhau về không gian sẽ cộng
hưởng mạnh hơn và cho tín hiệu với cường độ mạnh hơn. Ngoài ra, còn sử
dụng phổ X-RAY (Nhiễu xạ Rơngen) để xác định cấu trúc không gian của

Đỗ Thị Tươi

21

K32C Khoa Hóa học


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghệp

toàn bộ phân tử của hợp chất kết tinh ở dạng đơn tinh thể. Nhưng phạm vi sử
dụng của nó hạn chế vì yêu cầu cần tiên quyết của phương pháp này là cần
phải có đơn tinh thể. Đây là một điều kiện không phổ biến đối với các hợp
chất hữu cơ.

Như trên đã đề cập ngoài việc sử dụng các loại phổ người ta còn sử
dụng kết hợp với các chuyển hoá hoá học cũng như các phương pháp phân tích
so sánh kết hợp khác.

Đỗ Thị Tươi

22

K32C Khoa Hóa học


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghệp

Chương 2. đối tượng và phương pháp
nghiên cứu
2.1. Mẫu thực vật
Cây Mâm xôi được thu hái vào tháng 02 năm 2010 tại Tam Đảo, Vĩnh
Phúc. Mẫu cây được TS. Trần Huy Thái, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh
vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam giám định.
Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại Viện Hoá học các Hợp chất Thiên nhiên,
Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất
2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien
60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại
ở hai bước sóng 254 nm và 368 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4
10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ từ đến
khi hiện màu.

2.2.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế
Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Silica gel
60G F254 (Merck, ký hiệu 105875), phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại hai
bước sóng 254 nm và 368 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là
dung dịch H2SO4 10%, hơ nóng để phát hiện vệt chất, ghép lại bản mỏng như
cũ để xác định vùng chất, sau đó cạo lớp Silica gel có chất, giải hấp phụ bằng
dung môi thích hợp.
2.2.3. Sắc ký cột (CC)
Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel pha thường và
pha đảo. Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh).
Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50 m, FuJisilisa Chemical Ltd.).

Đỗ Thị Tươi

23

K32C Khoa Hóa học


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghệp

2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất
2.3. 1. Điểm nóng chảy (Mp)
Điểm nóng chảy được đo trên máy Kofler micro-hotstage của Viện Hóa
học các Hợp chất Thiên nhiên.
2.3. 2. Phổ khối lượng (ESI-MS)
Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization Mass
Spectra) được đo trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap của Viện Hoá học,

Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR): 1H-NMR (500 MHz) và

13

C-NMR

(125 MHz) được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, Viện
Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.4. Phân lập các hợp chất
Mẫu lá của cây Mâm xôi (20 kg tươi), được rửa sạch, phơi khô trong
bóng râm, sau đó sấy khô bằng tủ sấy ở nhiệt độ 50oC, sau cùng đem nghiền
nhỏ thành bột thu được 4 kg bột khô.
Bột khô lá cây Mâm xôi (4 kg) được chiết 3 lần bằng metanol ở nhiệt độ
50oC. Các dịch chiết này được gộp lại và loại dung môi dưới áp suất giảm, thu
được 100g dịch chiết metanol. Bổ sung 4 lít nước cất vào dịch chiết này, sau
đó chiết phân bố lần lượt với các dung môi n-hexan, clorofoc, etylaxetat, nbutanol như sơ đồ 2.4.1.

Đỗ Thị Tươi

24

K32C Khoa Hóa học


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghệp

Bột lá khô R. alceaefolius
(4 kg)
Chiết MeOH

Bổ sung nước

RA1- Cặn MeOH (100g)

n-Hexan: nước 1/1
Lớp nước

Bổ sung CHCl3
RA1A: Cặn n-Hexan (20 g)

CHCl3: nước 1/1

Lớp nước

Bổ sung EtOAc
RA1B: Cặn CHCl3 (40 g)

EtOAc: nước 1/1

lớp nước

Bổ sung n-BuOH

RA1C: Cặn EtOAc (10 g)

n-BuOH: nước 1/1

RA1D: Cặn n-BuOH (5 g)

RA1E: Lớp nước (25 g)

Sơ đồ 2.4.1: Sơ đồ chiết phân đoạn dịch chiết metanol của cây Mâm xôi.

Đỗ Thị Tươi

25

K32C Khoa Hóa học