Nghiên cứu phân lập các hợp chất tritecpen từ cây bục bạc (mallotus paniculatus)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA HÓA HỌC
-------o0o-------

ĐẶNG NGỌC BÁCH

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CÁC HỢP
CHẤT TRITECPEN TỪ
CÂY BỤC BẠC
(MALLOTUS PANICULATUS)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên nghành: Hóa hữu cơ
Người hướng dẫn khoa học
TS. NguyÔn Hoµi Nam

HÀ NỘI - 2011


LỜI CẢM ƠN
Khóa luận tốt nghiệp này được hoàn thành tại phòng Dược liệu Biển,
Viện Hóa sinh biển-Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Trước tiên, em xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Hoài Nam và các
anh chị trong Viện Hóa sinh biển - Viện khoa học và Công nghệ Việt Nam đã
nhiệt tình hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Với tất cả lòng kính trọng và lòng biết ơn chân thành em xin cảm ơn
thấy giáo TS. Nguyễn Văn Bằng người đã tận tình, chu đáo dạy bảo em trong
suốt những năm học ở trường và hoàn thiện khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Hóa hoc - Trường
ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo điều kiện và giúp đỡ, dạy dỗ em trong quá trình học

tập tại trường. Xin cảm ơn tất cả các bạn bè đã động viên giúp đỡ em trong
quá trình học tập và làm khóa luận.
Trong quá trình làm khóa luận tốt nghiệp này mặc dù đã hết sức cố
gắng nhưng chắc chắn không thể tránh được những thiếu sót. Vì vậy em kính
mong nhận được ý kiến đóng góp, chỉ bảo của các quý thầy cô.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 05 năm 2011.
Sinh viên
Đặng Ngọc Bách


LỜI CAM ĐOAN

Khóa luận “ Nghiên cứu và phân lập các hợp chất tritecpen từ cây
Bục bạc ” là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn trực tiếp
của TS. Nguyễn Hoài Nam.
Tôi xin cam đoan Các số liệu, kết quả trong khóa luận này là trung
thực, không trùng lặp với các khoa luận trước đây.

Sinh viên

Đặng Ngọc Bách


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU

1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

3

1.1. Những nghiên cứu tổng quan về cây Bục bạc

3

1.1.1. Thực vật học

3

1.1.2. Phân bố sinh thái

4

1.1.3. Công dụng

4

1.1.4. Thành phần hóa học

4

1.2. Giới thiệu sơ lược về tecpen

5

1.3. Tổng quan về các phương pháp chiết mẫu thưc vật

7

1.3.1. Chọn dung môi chiết

7

1.3.2. Quá trình chiết

10

I.4. Tổng quan về phương pháp sắc kí

11

1.4.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc kí

11

1.4.2. Cơ sở của phương pháp sắc kí

11

1.4.3. Phân loại các phương pháp sắc kí

12

1.4.3.1. Sắc kí cột

12

1.4.3.2. Sắc kí lớp mỏng

13

1.5. Môt số phương pháp hóa lí ứng dụng trong xác định cấu trúc
của các hợp chất hữu cơ

14

- Phổ hồng ngoại (Infraed Spectroscopy-IR)

14

- Phổ khối lượng(Mass spectroscopy - MS)

14

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance
Spectroscopy-NMR)

15


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU

18

2.1. Mẫu thực vật

18

2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất

18

2.2.1. Sắc kí lớp mỏng (TLC)

18

2.2.2. Sắc kí lớp mỏng điều chế

18

2.2.3. Sắc kí cột (CC)

18

2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất

19

2.3.1. Điểm nóng chảy (Mp)

19

2.3.2. Phổ khối lượng (ESI-MS)

19

2.3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

19

2.3.4. Độ quay cực []D

19

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM

20

3.1. Xử lý mẫu thực vật

20

3.2. Phân lập các hợp chất

20

3.3. Hằng số vật lý và số liệu phổ của các hợp chất phân lập

22

3.3.1. Hợp chất MP2

22

3.3.2. Hợp chất MP3

22

CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

24

4.1. Xác định cấu trúc của hợp chất MP2

24

4.2. Xác định cấu trúc của hợp chất MP3

27

KẾT LUẬN

31

TÀI LIỆU THAM KHẢO

32


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
WHO

World Health Organization

Tổ chức Y tê thế gới

International Union for

Liên minh Quốc tế bảo

Conservation of Nature and

tồn thiên nhiên và tài

Natural Resources

nguyên thiên nhiên

[]D

Specific Optical Botation

Độ quay cực

TLC

Thin Layer Chromatography

Sắc kí lớp mỏng

IUCN

SKLM
CC

Sắc kí lớp mỏng

Clolumm chromatography

Sắc kí cột

M. paniculatus Mallotus paniculatus
IR

In Frared Spectroscopy

Phổ hồng ngoại

MS

Mass Spectroscopy

Phổ khối lượng

EI – MS

Electron Impact Mass

Phổ khối lượng va chạm

Spectrometry

electron

Electron Spray Ionization

Phổ khối lượng phu mù

Mass Spectranetry

điện tử

Fast Atom Bombing Mass

phổ bắn phá nguyên tử

Spectroscopy

nhanh ở mức năng lượng

ESI – MS

FAB

thấp
FAB – MS

NMR
13

C-NMR

Fast Atom Bomb bradment

Phổ khối lượng bắn phá

Mass Spectronmetry

nguyên tử nhanh

Nuclear Magnetic Resonance

Phổ cộng hưởng từ hạt

Spectroscopy

nhân

cacbon-13-Nuclear Magnetic

Phổ cộng hưởng từ hạt

Resonance Spectroscopy

nhân cacbon 13


1

H-NMR

DEPT

proton Magnetic Resonance

Phổ cộng hưởng từ hạt

Spectroscopy

nhân proton

Distortion less Enhacemant
By Polarisation Trafer

2D - NMR

TWO-Dimensional Nuclear

Phổ cộng hưởng từ hạt

Magnetic Resonance

nhân hai chiều

Spectroscopy
HMBC

Heteronuclear Multiple Bond
Connectivily

HMQC

Heteronuclear Multiple
Quantum Coherence

1

H - 1H COSY

1

H - 1H Chemical Shiff

Correlation Spectroscopy
NOESY

Nucler Over hauser Effect
Spectroscopy


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ BẢNG BIỂU
Hình I.1.1. Cây Bục bạc - Mallotus paniculatus

3

Hình III.2a. Sơ đồ chiết phân đoạn

21

Hình III.2b. Sơ đồ phân lập 2 hợp chất ký hiệu MP2 và MP3

21

Hình IV.2.a. Phổ 1H-NMR của MP2

24

Hình IV.2.b. Cấu trúc của MP2

24

Hình IV.2.c. Phổ 13C-NMR của MP2

25

Hình IV.2.d. Phổ DEPT của MP2

26

Hình IV.2.e. Phổ ESI-MS của MP2

27

Hình IV.3.a. Phổ 1H-NMR của MP3

28

Hình IV.3.b. Cấu trúc của MP3

28

Hình IV.3.c. Phổ 13C-NMR của MP3

29

Hình IV.3.d. Phổ DEPT của MP3

30

Bảng IV.2. Số liệu phổ NMR của MP2

25

Bảng IV.3. Số liệu phổ NMR của MP3

29


Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
Theo tổ chức y tế thế giới WHO, có 80% dân số thế giới nằm ở khu vực
các nước đang phát triển và 80% dân số ở các nước đang phát triển sử dụng
thảo dược như một lựa chọn hàng đầu trong điều trị và chăm sóc sức khoẻ.
Theo dự đoán, dân số thế giới sẽ đạt 10 tỷ người vào nửa cuối thế kỷ 21. Với
sự gia tăng dân số khổng lồ, nhu cầu sử dụng hiệu quả các phương pháp chăm
sóc sức khỏe cộng đồng ngày càng là một thách thức lớn đối với toàn nhân
loại. Cùng với sự cạn kiệt của các nhiên liệu tự nhiên như than đá, dầu mỏ,
việc sử dụng các dược phẩm tổng hợp cũng sẽ gặp rất nhiều khó khăn. Bên
cạnh đó, việc phát sinh các loại bệnh mới cũng như sự kháng thuốc của các
nhân tố viêm nhiễm cũng là một thách thức lớn cần giải quyết. Hướng đi phù
hợp giải quyết các vấn đề trên có lẽ là phát triển các dược phẩm mới có nguồn
gốc thực - động vật phục vụ cho việc chăm sóc sức khỏe và kéo dài tuổi thọ
con người.
Việt Nam là quốc gia nằm ở vùng nhiệt đới, có điều kiện thuận lợi cho

các sinh vật phát triển và tạo ra sự phong phú của nhiều loài động thực vật và
nhiều hệ sinh thái khác nhau. Theo thống kê “tiếp cận các nguồn gen và chia
sẻ lợi ích” (của tổ chức bảo tồn thiên nhiên thế giới-IUCN), thì Việt Nam tồn
tại gần 12.000 loài thực vật bậc cao thuộc hơn 2.256 chi, 305 họ chiếm 57%
tổng số họ thực vật trên thế giới. Có 69 loài thực vật hạt trần; 12.000 loài thực
vật hạt kín; 2.200 loài nấm; 2176 loài tảo; 481 loài rêu; 368 loài vi khuẩn lam;
691 loài dương xỉ và hàng 100 loài khác. Đây chính là kho tài nguyên thiên
nhiên vô giá với nguồn dược liệu phong phú và đa dạng vào hạng bậc nhất
trên thế giới.
Cùng với sự đa dạng do thiên nhiên mang lại, Việt Nam còn là một
trong những quốc gia có nhiều kinh nghiệm trong việc sử dụng các thực vật

Đặng Ngọc Bách

1

K33A - Khoa Hóa học


Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

và sinh vật trong các bài thuốc y học cổ truyền. So với Tây dược, các bài
thuốc y học cổ truyền có rất nhiều ưu điểm trong chữa bệnh như ít độc tính, ít
có tác dụng phụ, dễ tìm nguyên liệu. Chính vì vậy nhiều công ty dược phẩm
trong và ngoài nước đã và đang tập trung hướng nghiên cứu và kinh doanh
vào các sản phẩm thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên. Việc nghiên cứu tập
trung đã thúc đẩy các hướng nghiên cứu tìm kiếm dược liệu từ thiên nhiên,
qua nghiên cứu các nhà khoa học đã tìm ra nhiều loài thực vật có ứng dụng

cao trong y dược như nhân sâm - Panax ginseng, thanh hao hoa vàng Artemisia annua, đan sâm - Salvia miltiorrhiza… Những kết quả nghiên cứu
này đã giúp cho việc cung cấp các hoạt chất quý cho nghiên cứu tạo các sản
phẩm phục vụ chăm sóc sức khỏe cộng đồng.
Trong số các loài thực vật của Việt Nam, các loài thực vật thuộc họ
Thầu dầu hiện đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới
và Việt Nam. Các nghiên cứu về họ thầu dầu đã góp phần tìm ra nhiều loài
thực vật tiềm năng như loài Khổ sâm, loài Diệp hạ châu và loài Mallotus…
Khóa luận tốt nghiệp này tập trung vào “Nghiên cứu phân lập các hợp
chất tritecpen từ cây Bục Bạc-Mallotus paniculatus” với mục tiêu:
1. Phân lập được một số hợp chất tritecpen từ cây Bục Bạc;
2. Xác định được cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập.

Đặng Ngọc Bách

2

K33A - Khoa Hóa học


Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1 Những nghiên cứu tổng quát về cây Bục bạc
1.1.1 Thực vật học:
Cây Bục bạc hay còn được gọi là Bùm bụp nâu, Bùng bục nâu, Bai
bái, Bạch thu, Bông bét nam, Bông bệt tùy thuộc vào địa phương mà có các
tên gọi khác nhau. Cây có tên khoa học là Mallotus paniculatus thuộc họ thầu
dầu-Euphorbiaceae. Đây là loài cây tiểu mộc hay đại mộc đến 20cm, lá có

phiến xoắn tam giác hay hình thoi, có ba thùy hay không, có hai tuyến ở gốc
đáy phiến, mặt dưới có lông hình sao; có cuống lá dài từ 15-20cm; Hoa cụm,
có lông nâu, dài 7-35cm, hoa đực có 50-60 tiểu nhụy, hoa cái có noãn sào 2-3
buồng. Quả nang to 7-8 mm, có gai nạc thưa dài; hạt tròn. Cây có hoa vào
tháng 5-6, quả vào tháng 11-12 hàng năm. Hoa thường có màu vàng nhạt, gỗ
màu vàng lợt, vỏ cây dễ được tách ra khỏi thân cây và vỏ cây thường rất dai
kéo thường khó đứt.

Hình 1.1.1. Cây Bục bạc Mallotus paniculatus

Đặng Ngọc Bách

3

K33A - Khoa Hóa học


Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

1.1.2 Phân bố sinh thái:
Mallotus là chi khá lớn có khoảng hơn 150 loài khác nhau với đặc điểm
có biên độ sinh thái tương đối rộng, dó đó được phân bố ở rất nhiều nơi.
Ở nước ta, cây mọc nhanh trên các nương rẫy bị bỏ hoang hay rừng bị tàn
phá kiệt quệ hay các thảm cây bụi và thường mọc lẫn với Ba soi, Lành
ngạnh, Hu đay, Cỏ lào….Ở nhiều nơi dưới độ cao 500-600m, từ Hà Giang,
Lào Cai, cho tới Lâm Đồng, Kiên Giang (Phú Quốc). Cây thường mọc ở hàng
rào, bờ nương và thuộc loài ưa bóng và đất ẩm.
Trên thế giới, loài cũng được phân bố ở rất nhiều quốc gia, có thể kể đến

như là: Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản, Australia, Ấn Độ, Thái Lan, Lào,
Campuchia, Malaysia.v.v...
1.1.3 Công dụng:
Hạt có chất mỡ đặc có thể dùng thắp sáng. Rễ và quả dùng để chữa vết
thương đụng giập, sưng tấy.v.v…. Có thể thu hái rễ quanh năm và thường
được dùng tươi, quả thu hái tháng 10-11 hàng năm. Đặc biệt là vỏ cây có
nhiều sợi rất dai dùng để bện thừng.
1.1.4 Thành phần hóa học:
Cho đến này chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của loài
Mallotus paniculatus, các nghiên cứu bước đầu phát hiện được b¶y hîp chÊt
cardenolides lµ: 11-oxouzarigenin (1), mallogenin (2), malloside (3),
panoside (4), glucopanoside (5), uzarigenin (6) vµ coroglaucigenin (7).
O

O
O

O

HO
R1

O
H

R1

OH

OH

HO

H

7

R2O

R2
HO
H

H 1. R = R = H
1
2

2. R1 = H, R2 = -L-rha
3. R1 = OH, R2 = -L-rha
4. R1 = OH, R2 = -D-glc(1->4)-L-rha

Đặng Ngọc Bách

O

O

4

5. R1 = H, R2 =OH
6. R1 = OH, R2 =OH

K33A - Khoa Hóa học


Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

1.2 Giới thiệu sơ lược về tecpen
Tecpen là lớp hợp chất thiên nhiên phổ biến nhất và lý thú nhất về
phương diện hóa học. Tecpen có thể tìm thấy trong tinh dầu thảo mộc (như
các tinh dầu chanh, cam, xả, hoa hồng, thông, .v.v…) với bộ khung cacbon là
sự sắp xếp của các tiểu phân isopentan (hay đơn vị isopren) nối với nhau theo
kiểu “đầu nối với đuôi”, chúng có công thức chung là (C5H8)n với điều kiện n
≥ 2. Tecpen có thể là những hiđrocacbon mạch hở hoặc mạch vòng, hoặc là
các dẫn xuất chứa oxi của chúng như: ancol, anđehit, xeton, este,.v.v…Tùy
thuộc theo số lượng n đơn vị isopentan trong bộ khung cacbon người ta phân
loại như sau:
Loại tecpen

Khung
cacbon

Số lượng
cacbon

Thí dụ

Monotecpen

(iso-C5)2

10

C10H16, C10H18O,C10H 16O

Secquitecpen

(iso-C5)3

15

C15H24, C15H24O, C15H22O

Đitecpen

(iso-C5)4

20

C20H32, C20H32O, C20H30O

Tritecpen

(iso-C5)6

30

C30H50, C30H50O

Tetratecpen

(iso-C5)8

40

C40H56

Các đơn vị isopren nối với nhau theo kiểu đầu đuôi hoặc đầu đầu, đuôiđuôi để hình thành nhiều dạng chất, trong đó có cấu trúc bao gồm hàng chục
nghìn mắt xích isopentan. Đó chính là politecpen, quen thuộc nhất là cao su
thiên nhiên mà ở đó một mắt xích isopentan đều có một liên kết đôi và có cấu
hình cis:

Poli – cis – isopren
Đặng Ngọc Bách

5

K33A - Khoa Hóa học


Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Cũng có các tecpen hình thành từ các đơn vị ispren với kiếu kết nối
đầu-đuổi hoặc đuôi đuôi nhưng số mắt xích kết hợp nhỏ để hình thành các
tecpec rất phổ biến trong các loài thực vật thông dụ như Miaxen (C10H16)
có trong tinh dầu cây nguyệt quế, Oximen có trong lá cây Ocimum basilicum
một loài húng quế.

Oximen
Miaxen
Một số tecpec có trong các loài hoa hồng và tinh dầu xả (Geranial và
Xitronelal), tinh dầu bạc hà (Menton), Limonen được tách từ vỏ cam chanh,
Silvestren được tách từ tinh dầu cây pinuc Silvestris, Sabinen được tách từ cây
Juniperus sabina, Cedren được tách từ cây Hoàng đàn, còn camphen có nhiều
trong tinh dầu như Long não.
Bên cạnh đó còn tồn tại các dẫn xuất chứa oxi của tritecpen với cấu trúc
là vòng sáu cạnh ví dụ như: Fiđelin và Fiđelanol.

Friđenlin (C30H50O)
Friđelanol (C30H50O)
Hợp chất squalen với cấu hình trans là chất tiền thân sinh học của tất cả
các tritecpen.

Squalen
Đặng Ngọc Bách

6

K33A - Khoa Hóa học


Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Sự đóng vòng của Squalen theo các kiểu khác nhau tạo lên sự đa dạng
của các hợp chất tritecpen.

Nhìn chung các tritecpen thường phân bố rộng rãi trong giới thực vật,
các nghiên cứu về hoạt tính sinh học cũng chỉ ra rằng các tritecpen có khả
năng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng viêm và kháng một số dạng ung thư.
Ngoài ra, một số nghiên cứu khác còn chỉ ra rằng các tritecpen có tác
dụng lên hệ thần kinh trung ương, điều hòa nội tiết, hạ cholesterol trong máu
và chống xơ vữa động mạch.
1.3 Tổng quan về các phương pháp chiết mẫu thực vật
Sau khi tiến hành thu hái và sẫy mẫu thực vật, tùy vào đối tượng chất
có trong mẫu khác nhau như các chất phân cực, các chất có độ phân cực vừa
phải.v.v… mà ta chọn dung môi và hệ dung môi phù hợp.
1.3.1 Chọn dung môi chiết
Chiết là phương pháp dùng một dung môi thích hợp hòa tan chất cần
tách thành một pha lỏng (gọi là dịch chiết) phân chia khỏi pha lỏng (hoặc pha
rắn) chứa hỗn hợp các chất còn lại. Tách lấy dịch chiết, giải phóng dung môi
sẽ thu được chất cần tách. Người ta thường dùng phương pháp chiết để tách
lấy chất hữu cơ khi nó ở dạng nhũ tương hoặc huyền phù trong nước, hay để
tách lấy chất hữu cơ ra khỏi một hỗn hợp ở thể rắn. Dung môi thường dùng là
Hexan, Etylacetate, clorofom, …
Thường thì các chất chuyển hóa thứ cấp trong cây có độ phân cực khác
nhau. Đôi khi để tạo ra độ phân cực của dung môi thích hợp người ta không
chỉ dùng đơn thuần một loại dung môi mà phải kết hợp một tỷ lệ nhất định
các loại dung môi khác nhau để tạo ra hệ dung môi mới. Tuy nhiên những
thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm. Dung môi sử dụng cho quá
trình chiết cần phải được lựa chọn hết sức cẩn thận. Điều kiện để chọn dung

Đặng Ngọc Bách

7

K33A - Khoa Hóa học

Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

môi là phải thoả mãn các yêu cầu như: cần hòa tan những chất chuyển hóa thứ
cấp đang nghiên cứu, dễ dàng loại bỏ, có tính trơ tức là không phản ứng với
chất nghiên cứu, không độc, không dễ bốc cháy. Những dung môi này nên
được chưng cất để thu được dạng sạch trước khi sử dụng, nếu chúng có lẫn
các chất khác có thể ảnh hưởng tới hiệu quả và chất lượng quá trình chiết.
Thường có một số chất dẻo lẫn trong dung môi như các điankylphtalat, tri-nbutylaxetynitat và tributylphotphat. Những chất này có thể lẫn với dung môi
trong quá trình sản xuất dung môi hoặc khâu bảo quản như các thùng chứa
bằng nhựa hoặc các nút nhựa.
Metanol

và

clorofoc

thường

chứa

đioctylphotphtalat[đi-(2-

etylhexyl)phtalat hoặc Bis-2-etylhexylphtalat]. Chất này làm sai lệch kết quả
phân lập trong quá trình nghiên cứu hóa thực vật. Chất này còn thể hiện hoạt
tính trong quá trình thử nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây.
Clorofoc, metylenclorit và metanol là các dung môi thường được lựa chọn

trong quá trình chiết sơ bộ một phần của cây (như lá, rễ, thân, củ).
Những tạp chất của clorofoc như CH2Cl2, CH2ClBr có thể phản ứng với
một vài hợp chất khác như các ankanoit tạo ra muối bậc 4 và các sản phẩm
khác tương tự như vậy, có một lượng nhỏ axit HCl cũng có thể gây ra sự phân
hủy sự khử hay sự đồng phân hóa với các hợp chất khác. Bởi clorofoc có thể
gây tổn thương cho gan và thận cho nên cần được thao tác khéo léo cẩn thận ở
nơi thông thoáng và phải đeo mặt lạ phòng độc. Metylenclorit độc hơn và dễ
bay hơi hơn clorofoc.
Metanol và Etanol 80% là những dung môi phân cực hơn các
hiđrocacbon thế Clo. Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ
thấm tốt hơn qua màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu
được lượng lớn các thành phần trong tế bào. Trái lại clorofoc khả năng phân
Đặng Ngọc Bách

8

K33A - Khoa Hóa học


Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

cực thấp hơn có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào. Các ancol phần lớn là
các chất chuyển hóa phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình và
thấp vì vậy khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng bị hòa tan đồng thời.
Thông thường dung môi cồn trong nước dường như là dung môi tốt nhất cho
quá trình chiết sơ bộ. Tuy nhiên thì cũng có một vài sản phẩm mới được tạo
thành khi dùng Metanol trong suốt quá trình chiết. Ví dụ như Trechlonolide A
thu được từ Trechonaetes laciniata được chuyển hóa thành Trechlonolide B

bằng quá trình metyl hóa khi đun nóng với Metanol chứa một ít axit và quá
trình phân hủy 1-hiđroxyltropacocain cũng xảy ra

khi

Erythoxy

novogranatense được chiết trong Metanol nóng.
Người ta thường ít sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ lá cây
mà thả vào đó là dung dịch nước của Metanol. Đietyl ete hiếm khi được sử
dụng cho quá trình chiết thực vật vì nó rất dễ bay hơi, dễ bốc cháy và cũng rất
độc đồng thời nó có xu hướng tạo ra Peroit dễ nổ, Peroxit của Đietylete dễ
gây ra phản ứng oxi hóa với những hợp chất không có khả năng tạo
Cholesterol như các Carotenoid. Tiếp đến là Axeton cũng có thể tạo thành
Exetonit nếu 1,2-Cis-điol có mặt trong môi trường axit. Quá trình chiết dưới
điều kiện axit hoặc bazơ thường được sử dụng đối với quá trình phân tách đặc
trưng, cũng có khi sử dụng các dịch chiết bằng axit, bazơ có thể tạo ra các sản
phẩm mong muốn.
Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hóa thứ cấp
trong cây được chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợp
cho quá trình chiết tránh được sự phân hủy chất bởi dung môi và quá trình tạo
thành chất mong muốn. Sau khi chiết thành dung môi được cất ra bằng máy
cất quay ở nhiệt độ không quá 300C - 400C, với một vài hóa chất có thể thực
hiện ở nhiệt độ cao hơn.

Đặng Ngọc Bách

9

K33A - Khoa Hóa học

Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

1.3.2 Quá trình chiết
Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau:
 Chiết ngâm
 Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết xoclet
 Chiết sắc với dung môi nước
 Chiết lôi cuốn với hơi nước
Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất
trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và tốn ít
thời gian. Thiết bị sử dụng là một bình thủy tinh với một khóa ở dưới đáy để
tạo tốc độ chảy cho quá trình rửa tách dung môi, dung môi có thể nóng hoặc
lạnh. Trước kia máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhưng hiện
nay có thể làm bằng thủy tinh.
Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phương
pháp chiết tách liên tục bởi mẫu được ngâm cùng với dung môi trong máy
chiết khoảng 24h và sau đó chất chiết được tách ra. Cần lưu ý sau một quá
trình chiết 3 lần dung môi, cặn thu được không còn chứa những chất có giá trị
nữa. Thông thường thì Sự kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một vài
cách khác nhau ví dụ như:
+ Khi chiết các ankaloit ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của hợp chất này
ra khỏi bình chiết bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như
Dragendorff và tác nhân Mayer.
+ Hay khi chiết các chất béo thì nồng độ trong các phần của dung dịch
chiết ra và sự xuất hiện của các cặn tiếp theo đó sẽ cho ta biết được sự kết
thúc quá trình chiết.

Như vậy, tùy thuộc vào mục đích cần chiết lấy chấy gì để chọn dung môi
thích hợp và lựa chọn quá trình chiết hợp lý nhằm đạt kết quả cao nhất. Ngoài

Đặng Ngọc Bách

10

K33A - Khoa Hóa học


Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

ra còn có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các hợp chất
mà ta có thể thu được một số hợp chất ngay trong quá trình chiết.
1.4 Tổng quan về phương pháp sắc kí
Phương pháp sắc kí là một trong những phương pháp phổ biến và hữu
hiệu nhất hiện nay, được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các hợp chất
hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng.
1.4.1 Đặc điểm chung của phương pháp sắc kí
Sắc kí là phương pháp tách các chất dựa vào sự khác nhau về bản chất hấp
và sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và tĩnh
Sắc kí gồm pha động và pha tĩnh. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của
hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với các tính chất của
chúng ví dụ như: tính bị hấp phụ, tính tan.v.v...
Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau đối với pha động và pha tĩnh.
Trong quá trình, pha động chuyển động dọc theo hệ sắc kí thì hết lớp pha tĩnh
nay tới lớp pha tĩnh khác sẽ lặp đi lặp lai quá trình hấp phụ và phản hấp phụ.
Kết quả là các chất có ái lực lớn đối với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn

qua hệ thống sắc kí so với các chất tương tác yêu hơn. Nhờ đặc điểm này mà
người ta có thể tách các chất thông qua quá trình sắc kí.
1.4.2 Cơ sở của phương pháp sắc kí
Phương pháp sắc kí dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa
hai pha động và tĩnh. Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ
thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch hoặc
với chất khí là áp suất riêng phần gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng
nhiệt Langmuir:
n=

n∞bC
1+bC

Trong đó: n - Lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng;

Đặng Ngọc Bách

11

K33A - Khoa Hóa học


Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

n∞- Lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất
hấp phụ nào đó;
b - Là hằng số;
C - là nồng độ của chất bị hấp phụ

1.4.3 Phân loại các phương pháp sắc kí
Trong phương pháp sắc kí pha động là các lưu thể (các chất ở trạng thái khí
hay lỏng), còn pha tĩnh các chất có thể ở pha lỏng hay rắn.
Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc kí thành hai
nhóm lớn: Sắc kí khí và sắc kí lỏng
Dựa vào cách tiến hành người ta chia ra thành các phương pháp sắc kí
chủ yếu sau:
1.4.3.1 Sắc kí cột
Đây là phương pháp phổ biến nhất thường được sử dụng và cũng là
phương pháp ká đơn giản, chất hấp phụ là pha tĩnh gồm các loại silicagel (có
kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha đảo YMC,ODS, Dianion…
Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột có thể bằng thủy tinh hoặc bằng kim loại
nhưng phổ biến nhất là bằng thủy tinh). Độ mịn của chất hấp phụ hết sức quan
trọng, nó phản ánh số đĩa lý thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ. Độ
hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lý thuyết càng lớn, khả năng tách
càng cao và ngược lại. Tuy nhiên, nếu chất hấp phụ có kích thước hạt càng
nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm. Trong một số trường hợp nếu lực trọng trương
không đủ lớn sẽ gây ra hiện tượng tắc cột, khi đó người ta phải sử dụng áp
suất, với áp suất trung bình (MPC), áp suất cao (HPLC).
Trong sắc kí cột, tỉ lệ đường kính cột (D) so với chiều cao cột (L) rất
quan trọng, nó thể hiện khả năng tách của cột. Tỉ lệ L/D phụ thuộc vào
yêu cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể. Trong sắc kí tỉ lệ giữa
quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi gọi là

Đặng Ngọc Bách

12

K33A - Khoa Hóa học

Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Rf, với mỗi một chất cụ thể sẽ có một Rf khác nhau. Nhờ vào sự khác nhau
của Rf mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp.
Tỉ lệ chất so với chất hấp phụ cũng rất quan trọng tùy thuộc vào yêu
cầu tách. Nếu tách thô thì tỉ lệ này thấp từ 1/5 - 1/10, còn nếu tách tinh thì tỉ lệ
này cao hơn và tùy thuộc vào hệ số tách tức là phụ thuộc vào sự khác nhau Rf
của các chất, mà hệ số này trong khoảng 1/20 - 1/30.
Sắc kí cột việc đưa chất lên cột rất quan trọng, tùy thuộc vào lượng chất
và dạng chất mà người ta có thể đưa lên cột bằng các phương pháp khác nhau.
Nếu lượng chất nhiều và chạy thô thì phổ biến nhất là tẩm chất vào silicagel
rồi làm khô, tơi hoàn toàn rồi đua lên cột. Nếu tách tinh thì đưa trực tiếp lên
cột bằng cách hòa tan chất bằng dung môi chạy cột với lượng tối thiểu.
Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột:
- Cách 1: Nhồi cột khô, theo cách này chất hấp phụ được đưa trực tiếp
vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để chất
hập phụ được sắp xếp chặt trong cột sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy
cột đến khi cột trong suốt
- Cách 2: Nhồi cột ướt, tức là chất hấp phụ được hòa tan trong dung
môi chạy cột trước với lượng dung môi tối thiểu. Sau đó đưa dần vào cột đến
khi đủ lượng cần thiết. Khi chuẩn bị cột cần lưu ý, không để bọt khí bên trong
nếu có bọt khí gây lên hiên tượng chạy rối trong cột và giảm hiệu quả tách, và
cột không được nứt, gãy, dò.
Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng tới hiệu quả tách. Nếu tốc
độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách. Nếu tốc độ dòng chảy quá
thấp sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng tới tiến độ công việc.
1.4.3.2 Sắc kí lớp mỏng

Săc kí lớp mỏng (SKLM) thường được sử dụng để kiểm tra và định
hướng cho sắc kí cột. SKLM được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silicagel

Đặng Ngọc Bách

13

K33A - Khoa Hóa học


Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

trên đế nhôm hay đế thủy tinh. Ngoài ra SKLM còn để điều chế thu trực tiếp.
Bằng việc sử dụng bản SKLM điều chế (bản được tráng silicagel dày hơn), có
thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản, và sau khi chạy sắc kí, người ta có thể
cạo riêng phần silicagel có chứa chất cần tách rồi giải hấp phụ bằng dung môi
thích hợp để thu được từng chất riêng biệt. Có thể phát hiện chất ntrên bản
mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc trưng cho từng lớp chất
hoặc sử dung dịch H2SO4 10%.
1.5 Một số phương pháp hóa lí ứng dụng trong xác định cấu trúc của các
hợp chất hữu cơ
Cấu trúc hóa học của hợp chất hữu cơ thường được xác định nhờ vào
ứng dụng của các phương pháp phổ kết hợp. Tùy thuộc vào cấu trúc hóa học
của từng chất mà sử dụng các phương pháp phổ cho phù hợp. Cấu trúc càng
phức tạp thì yêu cầu phối hợp các phương pháp phổ càng cao. Trong một số
trường hợp, để xác định cấu trúc hóa học của hợp chất người ta phải dựa vào
các phương pháp phổ khác như chuyển hóa hóa học, kết hợp với phương pháp
sắc kí so sánh…

- Phổ hồng ngoại (Infraed Spectroscopy-IR)
Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động của
các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại. Mỗi
kiểu liên kết được đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau. Do đó dựa
vào phổ hồng ngoại có thể xác định các nhóm đặc trưng trong hợp chất, ví dụ
như dao động hóa trị của nhóm OH tự do trong các nhóm hyđroxyl là 33003450 cm-1, của nhóm cacbonyl C=O là khoảng 1700-1750 cm-1, của nhóm NH
là khoảng 3100-3500 cm-1.v.v…
- Phổ khối lượng(Mass spectroscopy - MS)
Nguyên tắc của phương pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion của
phân tử chất dươi sự bán phá của chùm ion bên ngoài. Phổ MS còn cho các

Đặng Ngọc Bách

14

K33A - Khoa Hóa học


Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

pic ion mảnh khác mà dựa vào đó ma người ta có thể xác định được cơ chế
phân mảnh, và dựng lại được cấu trúc các hợp chất. Hiện nay có rất nhiều
phương pháp phổ khối lượng, sau đây là một số phương pháp chủ yếu:
+ Phổ EI-MS (Electron Impact Ionization Mass Spectroscopy) dựa vào
sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lượng khác nhau,
phổ biến là 70 eV.
+ Phổ ESI-MS (Electron Spray Ionization Mass Spectroscopy) gọi là
phổ phun mù điện tử. Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp

hơn nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là các pic ion phân
tử và các pic đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp dễ
bị phá vỡ.
+ Phổ FAB (Fast Atom Bombing Mass Spectroscopy) là phổ bắn phá
nguyên tử nhanh với sự bắn phá nguyên tử nhanh ở mức năng lượng thấp, do
đó phổ thu được cũng dễ thu được pic ion phân tử.
+ Phổ khối lượng phân giải cao (High Resolution Mass Spectroscopy),
cho phép xác định pic ion phân tử hoặc ion mảnh với sự chính xác cao.
Ngoài ra, hiện nay người ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp sắc
kí kết hợp với phổ khác như: GC-MS (sắc kí khí - khối phổ), LC - MS (sắc kí
lỏng - khối phổ). Các phương pháp kết hợp này còn đặc biệt hữu hiệu khi
phân tích thành phần của hỗn hợp chất đặc biệt là đối với phân tích thuốc
trong ngành dược.v.v…
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance
Spectroscopy-NMR)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một trong những phương pháp phổ hiện
đại và hữu hiệu nhất hiện nay. Với việc sử dụng kết hợp các kĩ thuật phổ
NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định cấu trúc của
hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử.

Đặng Ngọc Bách

15

K33A - Khoa Hóa học


Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và
cacbon) là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ 1H và 13C) dưới tác
dụng của từ trường ngoài. Sự cộng hưởng khác nhau nay được biểu diễn bằng
độ dịch chuyển hóa học (chemical shift). Ngoài ra đặc trưng của nhân tử còn
được xác định dựa vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin
coupling).
+ Phổ 1H - NMR: Trong phổ 1H - NMR độ dịch chuyển hóa học (δ) của
các proton được xác định trong thang ppm từ 0-14ppm, tùy thuộc vào mức độ
lai hóa của nguyên tử cũng như đặc trưng của độ dịch chuyển hóa học và
tương tác spin mà ta xác định được cấu trúc hóa học của các hợp chất.
+ Phổ 13C - NMR: Phổ này cho tín hiệu phổ vạch cacbon. Mỗi nguyên
tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác
nhau. Thang đo phổ 13C - NMR là ppm, với dải thang độ rộng 0-230ppm.
+ Phổ DEPT Distortionless Enhancement By Polarisation Transfer):
Phổ này cho ta tín hiệu phân loại các loại cacbon khác nhau. Trên phổ DEPT
cacbon bậc 4 không có tín hiệu, tín hiệu CH và CH3 nằm về một phía và của
CH2 nằm về một phía trên phổ DEPT 1350. Trên phổ DEPT 900 chỉ xuất hiện
tín hiệu phổ của các CH.
+ Phổ 2D - NMR: đây là kĩ thuật phổ 2 chiều cho phép xác định tương
tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều. Một số kĩ
thuật chủ yếu thường được sử dụng như sau:
- Phổ HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence)
Các tương tác trực tiếp H-C được xác định nhờ vào các tương tác trên
phổ này. Trên phổ một là trục phổ 1H-NMR, còn trục kia là 13C-NMR. Các
tương tác HMQC nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ.
- Phổ 1H-1H COSY (Homocosy), (1H-1H Chemical Shift Correlation
Spectroscopy)

Đặng Ngọc Bách

16

K33A - Khoa Hóa học


Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Phổ này biểu diễn các tương tác xa của H-H, chủ yếu là các proton đính
với cacbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà các phân tử được ghép nối với
nhau.
- Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity)
Đây là phổ biểu diễn tương tác xa trong không gian phân tử. Nhờ vào
các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân
tử được xác định về cấu trúc.
- Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy)
Phổ này biểu diễn các tương tác xa trong không gian của các proton
không kể đến các liên kết mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không
gian. Dựa vào kết quả phổ này có thể xác định cấu trúc không gian của phân
tử. Người ta còn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kĩ thuật phổ NOE differences
để xác định cấu trúc không gian của phân tử bằng việc đưa vào một xung
đúng bằng từ trường cộng hưởng của một proton xác định thì các proton có
cùng phía vế không gian cũng như gần nhau về không gian sẽ cộng hưởng
mạnh hơn và cho tín hiệu cộng hưởng với cường độ mạnh hơn.
Ngoài ra còn sử dụng phổ X-RAY (nhiễu xạ Rơngen) để xác định cấu
trúc không gian của toàn phân tử của hợp chất kết tinh ở dạng tinh thể.
Như trên đã đề cập, ngoài viếc sử dụng các loại phổ người ta còn sử
dụng kết hợp với các phương pháp chuyển hóa hóa học cũng như các phương

pháp phân tích so sánh kết hợp khác. Đặc biệt với phân tử nhiều mạch chính
dài, tín hiệu phổ NMR bị chồng lấp nhiều, khó xác định được chính xác chiều
dài các mạch. Đối với phân tử có các đơn vị đường thì việc xác định chính
xác các loại đường cũng như cấu hình đường thông thường phải sử dụng
phương pháp thủy phân rồi xác định bằng phương pháp so sánh LC-MS hoặc
GC-MS với các đường chuẩn dự kiến.

Đặng Ngọc Bách

17

K33A - Khoa Hóa học