Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới quá trình lên men vang táo mèo

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN

ĐỖ THỊ THANH HƢƠNG

NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA MÔI TRƢỜNG
DINH DƢỠNG TỚI QUÁ TRÌNH LÊN MEN
VANG TÁO MÈO

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
ThS. Nguyễn Khắc Thanh

Năm - 2012

1


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình hoàn thành khóa luận tốt nghiệp, tôi đã nhận được
nhiều sự giúp đỡ quý báu của các đơn vị và cá nhân. Nhân dịp này tôi xin bày
tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới:
Ban lãnh đạo, các thầy cô trong tổ vi sinh vật học Khoa Sinh – KTNN
trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 – nơi tôi học tập đã tạo điều kiện thuận lợi
để tôi học tập và hoàn thành việc nghiên cứu khóa luận tốt nghiệp của mình.
Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Đinh Thị Kim
Nhung, ThS. Nguyễn Khắc Thanh. Thầy, cô đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và
tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả người thân, bạn bè đã hỗ

trợ động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 05 năm 2012
Sinh viên
Đỗ Thị Thanh Hƣơng

2


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan kết quả nghiên cứu trong đề tài này là của bản thân
tôi, không trùng với kết quả của các tác giả khác. Nếu có gì không trung thực
tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.
Hà Nội, tháng 05 năm 2012
Tác giả
Đỗ Thị Thanh Hƣơng

3


MỤC LỤC
Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ……………………………………………………………...1
1. Lý do chọn đề tài.........................................................................................1
2. Mục tiêu của đề tài……………………………………………………….2
3. Nội dung của đề tài………………………………………………………2
4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của đề tài…………………………………...3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………………….4
1.1. Khái quát chung về rượu vang…………………………………………4
1.2. Một số đặc tính của tế bào nấm men S. cerevisiae……………………..5

1.3. Vai trò của chủng nấm men S. cerevisiae tới quá trình lên men rượu…...8
1.4. Vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men vang, bệnh vang…………...9
1.5. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng của nấm men……….11
1.6. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men vang……………………12
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU….15
2.1. Đối tượng nghiên cứu…………………………………………………15
2.2. Hóa chất, thiết bị……………………………………………………...15
2.3. Các loại môi trường…………………………………………………...15
2.4. Phương pháp nghiên cứu……………………………………………...16
2.5. Phạm vi nghiên cứu…………………………………………………...21
2.6. Địa diểm thực hiện đề tài……………………………………..............21
2.7. Thời gian thực hiện đề tài……………………………………………..21
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN………….22
3.1. Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men lên men vang táo mèo…………..22
3.2. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới quá trình lên men vang táo
mèo………………………………………………………………………...29
3.3. Ứng dụng lên men vang táo mèo với quy mô phòng thí nghiệm…….....37
3.4. Quy trình công nghệ sản xuất vang táo mèo………………………….38
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ…………………………………………........41
1. Kết luận
2. Kiến nghị
TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………….42

4


DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH
Trang
1. Danh mục bảng
Bảng 2.1. Chỉ tiêu đánh giá cảm quan…………………………………….....20

Bảng 3.1. Hoạt lực lên men của ba mẫu nấm men M1, M2, M3 sau 120h....23
Bảng 3.2. Khả năng lên men của ba mẫu nấm men M1, M2, M3 trên môi
trường lên men..............................................................................24
Bảng 3.3. Khả năng lên men ở các độ pH khác nhau của ba mẫu nấm men
M1, M2, M3..................................................................................25
Bảng 3.4. Khả năng kết lắng của ba mẫu nấm men M1, M2, M3...............25
Bảng 3.5. Khả năng tạo hương thơm và độ trong của ba mẫu nấm men
M1, M2, M3................................................................................... 26
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến quá trình lên men của chủng
S. cerevisiae M1....................................................................29
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của các nồng độ (NH4)2SO4 tới quá trình lên men của
chủng S. cerevisiae M1...................................................................32
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của các nồng độ KH2PO4 tới quá trình lên men của
chủng S.cerevisiae M 1 ...................................................35
Bảng 3.9. Kết quả phân tích rượu thành phẩm...............................................37
2. Danh mục hình
Hình 3.1. Ảnh chụp khuẩn lạc của mẫu nấm men M1...................................27
Hình 3.2. Ảnh chụp tế bào mẫu nấm men M1................................................28
Hình 3.3. Cấy chuyền mẫu nấm men M1 trên thạch nghiêng.......................28
Hình 3.4. Biểu đồ biểu diễn hàm lượng đường sót trong dịch lên men ở
các hàm lượng đường khác nhau..................................................30
Hình 3.5. Biểu đồ biểu diễn hàm lượng cồn trong dịch lên men ở các hàm
lượng đường khác nhau......................................................30
Hình 3.6. Biểu đồ biểu diễn độ pH trong dịch lên men ở các hàm lượng đường
khác nhau...................................................................................31
Hình 3.7. Biểu đồ biểu diễn hàm lượng đường sót trong dịch lên men ở các
nồng độ (NH4)2SO4 khác nhau…..........................................33
Hình 3.8. Biểu đồ biểu diễn hàm lượng cồn trong dịch lên men ở các nồng độ
(NH4)2SO4 khác nhau……………..............………………………33
Hình 3.9. Biểu đồ biểu diễn độ pH trong dịch lên men ở các nồng độ

(NH4)2SO4 khác nhau ................................................................... 34
Hình 3.10. Biểu đồ biểu diễn hàm lượng đường sót trong dịch lên men ở các
nồng độ KH2PO4 khác nhau……………………………………35
Hình 3.11. Biểu đồ biểu diễn hàm lượng cồn trong dịch lên men ở các nồng
5


độ KH2PO4 khác nhau .................................................................. 36

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Nxb
ĐHSP
HL
TB
S. cerevisiae

: Nhà xuất bản
: Đại học Sư Phạm
: hàm lượng
: tế bào
: Saccharomyces cerevisiae

6


ĐẶT VẤN ĐỀ
1. Lý do chọn đề tài
Rượu vang là loại đồ uống có độ cồn nhẹ, có giá trị dinh dưỡng cao,
được lên men từ trái cây mà không phải trải qua quá trình chưng cất và được
tàng trữ hàng chục thậm chí hàng trăm năm nên vang có hương vị rất đặc

trưng hấp dẫn người tiêu dùng.
Việc sản xuất vang đã được con người biết đến từ thời Ai Cập cổ đại,
ban đầu bằng cách ép lấy dịch quả nho, sau đó lên men hoàn toàn tự nhiên
trong các hang đá. Sau một thời gian thu được loại đồ uống có độ cồn thấp, có
hương vị thơm ngon rất quyến rũ.
Louis Pasteur (1857) là người đầu tiên khám phá ra vai trò quan trọng
của nấm men trong quá trình lên men rượu cũng như sự biến đổi hoá sinh
trong quá trình lên men. Bước “đột phá” này đã làm thay đổi về nhận thức, kỹ
thuật với những cải tiến về công nghệ đã tạo ra các loại rượu vang có chất
lượng cao hơn, được sản xuất với quy mô lớn hơn. Tuy nhiên phải tới những
năm 60 của thế kỷ XX ngành sản xuất vang mới thực sự phát triển cả về số
lượng và chất lượng. Gắn liền với tên tuổi của các loại vang nổi tiếng thế giới
như vang Pháp, Italia, Tây Ban Nha …cùng với các sản phẩm như Brandy,
Champgne, Sherry…Ở Việt Nam ngành sản xuất vang mới thực sự bắt đầu từ
những năm 80 của thế kỷ XX với sự xuất hiện của nhà máy vang Thăng Long,
vang Đà Lạt …
Đa số rượu vang trên thế giới được sản xuất từ nho. Tuy nhiên, hiện
nay với những hiểu biết về quá trình lên men rượu và những hiểu biết về nấm
men thì rượu vang không chỉ được lên men từ quả nho mà còn được lên men
từ nhiều loại quả khác như: mận, mơ, dâu, dứa… tạo nên các loại vang hoa
quả khác nhau. Nhưng để có vang tốt thì không phải loại quả nào cũng làm
được. Do đó việc lựa chọn nguyên liệu phù hợp với yêu cầu của công nghệ và
7


chất lượng của sản phẩm cho đến nay vẫn là vấn đề cần thiết đối với ngành
sản xuất vang ở nước ta.
Trong quá trình tìm kiếm, chúng tôi nhận thấy ở miền núi phía Tây Bắc
nước ta có cây táo mèo cho quả có hương vị rất thơm ngon và đặc trưng.
Tổng diện tích cây táo mèo vẫn tiếp tục tăng trong những năm gần đây tuy

nhiên nhu cầu tiêu dùng quả táo mèo chủ yếu là ăn trực tiếp, ngâm rượu,
ngâm dịch siro chỉ chiếm khoảng 35-40% tổng sản lượng quả thu hoạch, số
còn lại thường chưa sử dụng hết do nhiều nguyên nhân. Thông qua việc phân
tích sơ bộ một số chỉ tiêu chúng tôi nhận thấy quả táo mèo rất có triển vọng
trong việc sử dụng làm nguồn nguyên liệu để sản xuất vang. Với những lý do
trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của môi
trường dinh dưỡng tới quá trình lên men vang táo mèo”.
2. Mục tiêu của đề tài
Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới quá trình lên
men vang táo mèo.
3. Nội dung của đề tài
3.1. Phân lập, tuyển chọn được chủng nấm men có khả năng lên men vang táo
mèo.
3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới quá trình lên men
vang táo mèo.
3.3. Lên men rượu vang táo mèo trên quy mô phòng thí nghiệm.
3.4. Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vang táo mèo.

8


4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của đề tài
4.1. Ý nghĩa lý luận của đề tài
Đề tài nghiên cứu nhằm đi sâu tìm hiểu đặc tính sinh lý, sinh hoá của
chủng nấm men có khả năng lên men vang táo mèo. Nghiên cứu này chính là
dẫn liệu bổ sung cho các nghiên cứu về nấm men và ứng dụng của nấm men
trong đời sống.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Tận dụng nguồn nguyên liệu sẵn có trong địa phương, nâng cao thu
nhập cho bà con nông dân trồng táo mèo. Đồng thời xây dựng được quy trình

công nghệ sản xuất vang từ quả táo mèo, góp phần làm phong phú thêm thị
trường vang trong nước.

9


CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Khái quát chung về rƣợu vang
1.1.1. Thành phần của rượu vang
Cồn etanol: do lên men tự nhiên từ dịch trái cây vì vậy không lẫn
andehit, este. Độ cồn của rượu vang từ 10-120 nên nhiều người uống được.
Chất bổ dưỡng: đường là nguyên liệu để tạo nên các loại rượu trong
quá trình lên men vang. Trong dịch quả chín chủ yếu là các loại đường khử:
fructose, glucose, và ít galactose. Ngoài ra còn có cả đường kép: saccharose,...
đường trong vang từ 62-132g/l.
Axit hữu cơ: axit malic, axit tartaric, axit xitric, axit oxalic…Hàm
lượng axit tổng số từ 4-7 g/l (quy ra axit tartaric).
Rượu vang giàu vitamin: vitamin có trong nước quả không bị quá trình
lên men phân hủy mà nó chỉ điều chỉnh lại thành phần.
Các axit amin: có vai trò quan trọng đối với sự sinh sản và phát triển
của nấm men. Ngoài lượng axit amin có sẵn trong dịch quả, quá trình lên men
vang cũng tạo thêm được một số axit amin đã làm cho vang thành phẩm có
hương vị đặc trưng. Các axit amin như: lizin, treonin, valin, acginin, …[11].
1.1.2. Phân loại vang
Có nhiều cách phân loại rượu vang khác nhau dựa vào màu sắc, đặc
điểm chủng trái cây, nhà sản xuất, công nghệ sản xuất,…
Căn cứ theo màu sắc của sản phẩm: vang đỏ, vang trắng, vang hồng.
Căn cứ theo hàm lượng đường, độ rượu, hàm lượng axit: vang khô,
vang dịu, vang ngọt.

10


Xu hướng chung thì vang được phân thành hai nhóm chính: là vang
không có ga tức là trong vang thành phẩm không có CO2 và vang có ga: trong
vang thành phẩm có CO2 [9].
1.1.3. Nguyên liệu sản xuất rượu vang
Nguyên liệu làm rượu vang là các loại quả. Quả chín (có thể chưa thật
chín) sau khi thu hoạch chọn loại quả tươi, chất lượng tốt đem ép lấy nước
hoặc ngâm với đường để thu được dịch nước quả dùng cho lên men.
Tất cả các loại quả đều có đường, nhiều vitamin, nhiều axit hữu cơ,
trong đó có nhiều vitamin C, có đầy đủ chất khoáng và có một lượng protêin
đáng kể. Ngoài ra, nước quả còn chứa tanin, pectin. Trong các loại quả dùng
làm rượu vang trước hết phải kể đến nho.
Nho: thành phần hoá học của nho có (%): 10-30 đường (glucose,
fructose, saccharose); 0,5-0,7 axit hữu cơ (axit tactaric, axit malic); 0,1-0,9
các chất protêin; 0,1-0,3 pectin; 0,1-0,5 chất khoáng; có các vitamin C, B1, B2,
PP cùng các chất thơm.
Ngoài nho các loại quả khác như: dâu, dứa, mơ, mận, táo cũng là
nguyên liêu để sản xuất rượu vang [10].
1.2. Một số đặc tính của tế bào nấm men S. cereciviae
1.2.1. Khái quát về nấm men
Nấm men (yeast) là tên chung chỉ nhóm nấm có cấu tạo tế bào, sinh sản
chủ yếu bằng phương pháp nảy chồi. Chúng phân bố rộng rãi trong thiên
nhiên như trong đất, trong nước, không khí và đặc biệt có nhiều trên bề mặt
các loại quả.
Nấm men có khả năng sinh sản nhanh chóng. Sinh khối của chúng rất
giàu protêin, vitamin và lipit. Nấm men có khả năng lên men các loại đường
để tạo thành rượu trong điều kiện yếm khí, còn trong điều kiện hiếu khí thì

chúng lại có khả năng tạo sinh khối tế bào. Vì thế nấm men được sử dụng
11


rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm để sản xuất rượu, bia, nước giải khát
lên men, sản xuất men bánh mì…Tuy nhiên một số nấm men dại có hại cho
sản xuất, làm nhiễm các quy trình công nghệ và gây hư hỏng sản phẩm [1].
1.2.2. Hình thái và cấu trúc của tế bào nấm men S. cereciviae
Hình thái: có dạng hình ovan hoặc hình trứng. Hình dạng này có thể
thay đổi tuỳ thuộc vào điều kiện môi trường, điều kiện nuôi cấy và tuổi tế bào.
Kích thước: 2-8 μm x 4-10 μm.
Nấm men có màu trắng đục, vàng hoặc hồng nhạt, bề mặt tế bào
thường khô và căng, có thể đứng riêng lẻ hoặc dính nhau thành chuỗi.
1.2.3. Cấu tạo của tế bào nấm men
Mặc dù có cấu tạo đơn bào nhưng nấm men cũng mang đầy đủ tính
chất của một cơ thể sống. Chúng có cấu tạo gồm màng, chất nguyên sinh và
nhân.
1.2.3.1. Màng
Có cấu tạo 2 lớp với tỷ lệ glucan và mannan tương đương nhau. Màng
tế bào có cấu tạo chủ yếu là hemixenlulozo chiếm khoảng 70% trọng lượng
khô của tế bào (31% mannan + 29% glucan), 6-7% protêin và thường protêin
của nó có liên kết vững chắc với các hidratcacbon, tạo thành một phức chất
giàu lưu huỳnh, tồn tại dưới dạng disunfit (-S-S-) hoặc sulfidrin (-SH-). Ngoài
ra màng tế bào còn chứa lipit, đường khử, nitơ, các axit amin và các chất
khoáng. Trên thành tế bào nấm men có các lỗ nhỏ, qua các lỗ này chất dinh
dưỡng được đưa vào trong các tế bào và các sản phẩm trao đổi chất được thải
ra ngoài môi trường xung quanh.
Chức năng của màng tế bào: bảo vệ hình thái tế bào, duy trì áp suất
thẩm thấu bên trong tế bào và điều hoà các quá trình trao đổi chất.

12


1.2.3.2. Chất nguyên sinh
Màng nguyên sinh chất: nằm ngay dưới lớp thành tế bào. Chức năng
chủ yếu là điều hoà hấp thụ chất dinh dưỡng vào tế bào, và nhờ có hệ enzyme
pecmeaza mà chất dinh dưỡng được hấp thụ và tích luỹ lại trong tế bào.
Chất nguyên sinh của tế bào nấm men:
Riboxom: gồm 2 loại là riboxom 80S (tồn tại trong tế bào chất) và
riboxom 70S (có trong ty thể).
Ty thể: có hình bầu dục dài, kích thước 0,2-0,5nm x 0,4-1,0nm. Kích
thước và hình dáng có thể thay đổi tuỳ thuộc vào điều kiện môi trường nuôi
cấy và trạng thái sinh lý của tế bào. DNA của nấm men là một phân tử dạng
vòng có khối lượng phân tử là 50x106 Da ( gấp 5 lần so với DNA ty thể động
vật bậc cao) DNA nấm men chiếm 15-23% tổng lượng DNA của toàn thể tế
bào nấm men.
Phức hệ gôlgi: nơi giải phóng sản phẩm của quá trình dị hoá, đồng thời
tổng hợp oligosacarit từ monosacarit cho màng tế bào.
Lizoxom: chứa nhiều loại enzyme có khả năng phân giải protein, lipit,
polysacarit.
Các tế bào nấm men khi già sẽ xuất hiện không bào. Trong không bào
có chứa các enzyme thuỷ phân, polyphotphat, lipit, ion kim loại, các sản
phẩm trao đổi chất trung gian. Ngoài tác dụng là một kho dự trữ, không bào
còn có chức năng điều hoà áp suất thẩm thấu của tế bào.
1.2.3.3. Nhân
Tế bào nấm men có nhân thật hình tròn hoặc hình ovan, được bao bọc
bởi lớp màng nhân. Nhân có kích thước khá lớn 1-2,4 μm x 2-8 μm cấu tạo
bởi protein, DNA, RNA và nhiều enzyme. Nhân quyết định đặc tính di truyền
và tham gia điều khiển tất cả các hoạt động sống của tế bào nấm men.

13


1.2.4. Sinh sản của tế bào nấm men
Nấm men sinh sản dưới hai hình thức: vô tính và hữu tính.
Sinh sản vô tính bao gồm: sinh sản bằng hình thức nảy chồi và sinh sản
bằng hình thức phân chia.
Trong đó sinh sản bằng hình thức nảy chồi là hình thức phổ biến nhất.
Khi tế bào phát triển đến một mức nhất định thì cơ thể của nó đâm ra một
chồi nhỏ gọi là mầm (hay chồi). Mầm sinh ra ở vị trí lệch tâm ở trên đầu tế
bào mẹ. Cùng một lúc tế bào có thể đâm ra nhiều chồi, ở mỗi chồi sẽ nhận
được một phần chất nhân và chất nguyên sinh của tế bào mẹ, sau đó nó tách
ra khỏi tế bào mẹ sống độc lập hoặc không tách khỏi mà tạo thành những chồi
nhỏ liên kết với nhau tạo thành chuỗi khuẩn ty giả.
Sinh sản hữu tính bằng bào tử túi.
Bào tử túi của nấm men là những bào tử được sinh ra trong những túi
nhỏ gọi là túi hay mang. Mỗi túi chứa từ 4-8 bào tử túi. Nấm men được tạo
thành theo phương thức sinh sản đơn tính, là quá trình tạo thành bào tử trực
tiếp từ một tế bào riêng rẽ, không qua tiếp hợp. Bào tử túi sau khi ra khỏi túi
gặp điều kiện thích hợp sẽ phát triển thành một tế bào nấm men. Sự hình thành
bào tử túi có 2 ý nghĩa: vừa sinh sản vừa tạo dạng bền vững vì bào tử túi có vỏ
dày, chịu được điều kiện không thuận lợi của môi trường, chịu được nhiệt độ
cao và khô hạn [1], [2].
1.3. Vai trò của chủng nấm men S.cereciviae tới quá trình lên men rƣợu
Nấm men có thể sử dụng đường glucose và fructose trong dịch quả
và chuyển hoá chúng theo con đường đường phân thành pyruvat. Quá
trình này cung cấp năng lượng và chất khử phục vụ sinh tổng hợp cho tế
bào. Trong điều kiện kỵ khí, nấm men loại CO2 khỏi pyruvat trong phản
ứng xúc tác bởi enzyme pyruvat decarboxylase tạo ra acetalđehyt và CO2.

14


Bước tiếp theo, acetalđehyt khử thành ethanol dưới tác động của enzyme
alcohol đehydrogenase và NADH.
Quá trình chuyển hoá glucose thành ethanol bởi S. cereciviae có thể
được diễn giải trong phương trình sau:
C6H12O6 + 2Pi + 2ADP + 2H+

2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP

Ngoài ethanol và CO2, còn một sản phẩm quan trọng nữa của quá trình
lên men là glycerol. Nồng độ glycerol trong rượu vang có thể thay đổi trong
khoảng từ 2-10g/l tuỳ thuộc vào chủng loại nấm men và điều kiện lên men.
Glycerol được tạo ra trong các phản ứng sau:
NADH – H+
Dihydroxyacetone phosphat
(DHAP)

NAD+
Glycerol 3 - phosphat

DHAP
reductase
glycerol
phosphatase

Pi

Glycerol [13].

1.4. Vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men vang, bệnh vang
1.4.1. Nấm men
Nấm men: căn cứ vào cấu tạo, đặc điểm sinh lý, khả năng lên men tạo
cồn và hương vị đặc trưng của nấm men khi lên men vang, người ta thường
phân loại nấm men trong quá trình sản xuất rượu vang thành một số loài sau:
Saccharomyces vini, S. cerevisiae, Saccharomyces oviormis…
Trong đó, chủng nấm men S. cerevisiae là chủng được sử dụng rộng rãi nhất
trong sản xuất.
S. cerevisiae: có khả năng lên men dịch có hàm lượng đường cao và tạo
được 18-20%V cồn, khả năng kết lắng tạo hương, vị đặc trưng cho vang tốt.
15


Vì vậy, trong sản xuất vang có độ cồn cao người ta thường sử dụng chủng này
để lên men [9].
1.4.2. Nấm mốc
Phát triển ở quả, chất bã của quá trình sản xuất rượu vang, thùng chứa
thiết bị hoặc không khí đưa đến. Đại diện: chi Rhizopus, Aspergillus.
1.4.3. Vi khuẩn lactic
Trong dịch quả cũng như trong vang thường gặp khá nhiều loài vi khuẩn
lactic, trong đó có rất nhiều loài rất cần thiết cho quá trình sản xuất vang từ
các loại quả giàu axit malic, ví dụ các chủng vi khuẩn lên men lactic thuộc
các giống Pediococus và Leuconostoc. Ngày nay, người ta đã xác định cả vi
khuẩn lactic lên men đồng hình như: Lactobacillus plantarum, Lactobacilus
casie và vi khuẩn lactic lên men dị hình như: Lactobacillus buchneri,
Lactobacillus brevis, Leuconostoc vini đều có thể lên men malolactic. Trong
số các vi khuẩn lactic thì chủng Leuconostoc oenos được đánh giá là phát
triển tốt trong môi trường rượu vang có độ cồn cao, pH thấp ≤ 3,5 và có khả
năng lên men axit malic thành axit lactic có thể đạt từ 75-96% [9].
1.4.4. Vi sinh vật làm hỏng vang

Có không ít các loại vi khuẩn làm cho vang bị đục, có vị chua gắt, mùi
khó chịu, làm cho vang bị hỏng như:
Vi khuẩn yếm khí: các vi khuẩn lactic như: L.brevis, L. pastorianus,
L.buchneri... làm cho vang bị vẩn đục, có mùi dưa muối, hương và vị của
vang bị thay đổi đáng kể, khó chấp nhận.
Các vi khuẩn hiếu khí: một số loại nấm men tạo màng trên bề mặt vang
như Pichia, Candida, Zygopichia...phân giải đường thành những axit hữu cơ:
xitric, axetic... làm cho vang bị đục, độ chua tăng cao, vị không ngon.
Một số nấm men giống Torulopsis, Brettanomyces... lên men đường thành
rượu và nhiều loại axit bay hơi, làm hỏng vang hoặc vang bị hoá nhầy;
16


Hansenula oxy hoá etylic, glycerine, axit hữu cơ... làm cho vang bị đục, có vị
đắng.
Các vi khuẩn thuộc Acetobacter oxy hoá etylic thành axit axetic và
CO2, thậm chí sản phẩm cuối cùng là CO2 và nước đã làm cho vang có vị
chua gắt của giấm, vang bị nhớt không sử dụng được [9].
1.4.5. Bệnh vang
Là hiện tượng rượu vang bị chua chất lượng rượu vang bị giảm rất
nhanh. Nguyên nhân do rượu vang bị tiếp xúc với không khí và do dưới tác
dụng của vi khuẩn axetic đã biến cồn thành axit axetic. Hoặc có thể do vi sinh
vật lên men trong điều kiện kỵ khí gây ra [5].
1.5. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh trƣởng của nấm men
1.5.1. Nguồn cacbon
Cacbon là nguồn nguyên liệu cơ bản kiến tạo nên bộ khung tế bào nấm
men. Là thành phần quan trọng của quá trình trao đổi chất và là nguồn dinh
dưỡng hàng đầu cho vi sinh vật.
Nguồn nấm men chủ yếu của cacbon là hydrat cacbon, nó đáp ứng 3
nhu cầu của nấm men là:

Sản sinh năng lượng thông qua quá trình oxi hoá khử.
Tạo thành những tiền chất.
Tham gia vào các quá trình oxi hoá khử.
1.5.2. Nguồn nitơ
Nitơ là thành phần quan trọng cấu tạo nên tế bào. Nguồn nitơ được nấm
men lấy từ các hợp chất vô cơ và hợp chất hữu cơ. Do vậy, khi nhân giống
nấm men người ta thường bổ sung thêm lyzin, arginin hoặc (NH4)SO4 để tăng
cường khả năng sinh sản cho nấm men [9].

17


1.5.3. Các nguyên tố khoáng
Nguồn muối khoáng cần thiết cho quá trình trao đổi chất của nấm men
gồm: Mg, Ca, K, Co, S, P, Fe, Cu...
Các nguyên tố N, P, S đóng vai trò quan trọng đối với sự hình thành
màng và nhân tế bào; Cu, Ca, Mg là trung tâm chuyển hoá của nhiều loại
enzyme tham gia vào quá trình chuyển hoá đường thành rượu. Ngoài ra,
muối P, K còn có tác dụng như một dung dịch đệm giữ pH của môi trường
luôn ổn định. Như vậy, có thể nói rằng muối khoáng có vai trò quan trọng
trong quá trình trao đổi chất của nấm men [9].
1.5.4. Các vitamin
Một số vitamin như B1, biotin, vitamin E... có tác dụng rất tốt đến sự
sinh trưởng và phát triển của nấm men. Nhiều loại vitamin còn có tác dụng
tăng cường sự hoạt hoá của một số enzyme trong quá trình lên men rượu [9].
1.5.5. Nguồn oxi
Trong quá trình lên men giai đoạn đầu yêu cầu oxy cao nhất để nấm
men sinh sản, phát triển tăng sinh khối. Trong điều kiện kỵ khí nấm men sử
dụng lượng oxy hoà tan trong môi trường để sinh trưởng và chủ yếu là lên
men.

1.6. Các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình lên men
1.6.1. Ảnh hưởng của pH
Trong quá trình nuôi cấy, pH môi trường luôn thay đổi dẫn đến sự biến
đổi của nấm men trong quá trình sinh sản.
pH: 2-3: quá trình lên men yếu.
pH: 6,5-7,5: quá trình lên men bị dừng lại.
pH: 4-5: khả năng lên men vang tốt nhất [5].

18


1.6.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn tới quá trình lên men.
Nhiệt độ < 200C: sự lên men chậm chạp, độ rượu tạo thành thấp.
Nhiệt độ < 100C: không diễn ra quá trình lên men.
Nhiệt độ ở 350C: nguy hiểm cho quá trình lên men, nấm men không
chết nhưng mất tác dụng.
Nhiệt độ > 350C: quá trình lên men dừng lại, lượng đường sót cao, vi
khuẩn hoạt động, đặc biệt nhiều vi khuẩn chuyển hoá đường thành axit axetic
gây chua, giảm chất lượng vang.
Nhiệt độ thích hợp nhất cho nấm men phát triển là 26-280C [12].
1.6.3. Ảnh hưởng của nồng độ cồn
Nồng độ cồn thích hợp cho nấm men pháp triển tốt là 9-14%V. Trong
quá trình lên men nồng độ rượu tăng dần sẽ gây ức chế không chỉ cho các
hoạt động sống của nấm men mà còn kìm hãm hoạt động của nhiều loại
enzyme chuyển hoá đường thành rượu. Do vậy, khả năng chịu cồn và lên men
tốt trong môi trường có nồng độ cồn thích hợp là một tiêu chí để tuyển chọn
chủng nấm men cho quá trình sản xuất rượu vang [9].
1.6.4. Ảnh hưởng của hàm lượng đường
Hàm lượng đường phù hợp cho lên men vang là 12-25%V và tới 30%V

sẽ ức chế mạnh mẽ quá trình lên men. Các nghiên cứu của Schanderl còn cho
thấy khi hàm lượng đường trong dịch lên men tăng thì hàm lượng axit axetic
cũng tăng. Tỷ lệ các loại đường có trong dịch lên men cũng ảnh hưởng lớn tới
tốc độ và hiệu suất lên men, glucose là loại đường phù hợp nhất cho sự sinh
sản và phát triển của nấm men cũng như quá trình lên men rượu, tiếp đó là
đường fructose và saccharose... Vì vậy quả có chứa hàm lượng đường khử
càng cao thì càng có lợi cho quá trình lên men cũng như đến chất lượng vang
thành phẩm [9].
19


1.6.5. Ảnh hưởng của hàm lượng men giống
Số lượng tế bào nấm men có trong dịch lên men càng thấp thì thời
gian nhân giống và lên men vang sẽ bị kéo dài hơn, dễ bị nhiễm khuẩn.
Ngược lại, hàm lượng men giống trong dịch lên men càng cao thì thời gian
lên men sẽ ngắn hơn hạn chế được khả năng nhiễm khuẩn do sự áp đảo của
nấm men. Tuy nhiên khi số lượng men giống quá cao có thể sẽ làm thay đổi
thành phần môi trường lên men và sẽ không có lợi cho quá trình lên men
cũng như chất lượng sản phẩm. Nhìn chung, số lượng men giống trong dịch
lên men chỉ nên từ 6-10 triệu TB/ml dịch lên men là phù hợp [9].
1.6.6. Ảnh hưởng của nồng độ oxy hoà tan
Nồng độ oxy hoà tan giữ vai trò quan trọng đối với sự sinh trưởng của
nấm men, hiệu suất lên men và chất lượng của vang. Trong điều kiện lên men
rượu, thời gian đầu khi môi trường có một lượng nhỏ oxy nấm men sẽ chuyển
hoá hiếu khí đường để thu năng lượng và phát triển mạnh mẽ sinh khối, môi
trường cũng dần chuyển sang kỵ khí và nấm men chuyển sang lên men rượu.
Do đó sản phẩm của quá trình sẽ bao gồm: ethanol, CO2, sinh khối, các axit
hữu cơ và các sản phẩm phụ khác. Như vậy, lượng vừa đủ oxy cho quá trình
lên men vang không chỉ đáp ứng yêu cầu sinh sản và phát triển mạnh của nấm
men mà còn làm mất đi một số sản phẩm lên men không cần thiết [9].

1.6.7. Ảnh hưởng của chất kìm hãm chọn lọc
SO2 là chất ức chế chọn lọc vi sinh vật có hại, hiện nay vẫn đang được
sử dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất vang. SO2 có thể được bổ sung
trực tiếp ở dạng khí hoặc ở một số dạng muối như K2S2O5, Na2S2O5, hoặc SO2
lỏng.
SO2 ức chế quá trình lên men nói chung và làm tăng lượng acetaldehyt
và glycerine trong sản phẩm đồng thời SO2 cũng hạn chế sự lên men malolactic.
Vì vậy, việc sử dụng SO2 trong quá trình lên men vang cần phải tính toán phù
hợp với công nghệ và thông thường sử dụng SO2 với hàm lượng 75-100 ppm
làm chất kìm khuẩn cũng như chất chống oxy hoá là phù hợp và có hiệu quả rất
tốt [9].
20


CHƢƠNG 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Quả táo mèo (Docynia indica), họ hoa hồng (Rosaceae).
Chủng nấm men được phân lập từ dịch táo mèo có khả năng lên men
vang táo mèo.
2.2. Hóa chất, thiết bị
2.2.1. Hoá chất
Một số hoá chất được sử dụng: MgSO4, KH2PO4, (NH4)2SO4, axit xitric
(hãng: FENXICHUN-Trung Quốc), K2S2O5 (hãng: BATOL-Pháp), các loại
muối nitrat, các loại đường (hãng: BDH-Anh).
2.2.2. Thiết bị
Hộp petri, ống nghiệm, đường kế Đức, tủ sấy, tủ lạnh sâu, buồng cấy
vô trùng, buồng đếm Goriaev, máy đo pH, máy quang phổ kế, máy ly tâm,
kính hiển vi quang học, nồi khử trùng cao áp, máy lắc ổn nhiệt.
2.3. Các loại môi trƣờng

2.3.1. Môi trường Hansen ( g/l)
Đường glucoza

: 50g

Pepton

: 5g

MgSO4.7H2O

: 0,5g

KH2PO4

: 1g

(NH4)2SO4

: 1g

Thạch aga

: 20g

Nước

: 1000ml

21

2.3.2. Môi trường nhân giống (g/l)
Đường glucoza

: 50g

Pepton

: 5g

MgSO4.7H2O

: 0,5g

KH2PO4

: 1g

(NH4)2SO4

: 1g

Nước

: 1000ml

2.3.3. Môi trường lên men ( g/l)
Dịch hoa quả

: 200ml

MgSO4.7H2O

: 0,5g

KH2PO4

: 1g

(NH4)2SO4

: 1g

Nước

: 1000ml

2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Các phương pháp vi sinh
Nguồn nấm men được chúng tôi sử dụng phân lập và tuyển chọn để
nghiên cứu lên men vang táo mèo là từ thiên nhiên và được tiến hành theo các
bước cơ bản sau:
2.4.1.1. Tạo nguồn giống nấm men để phân lập và tuyển chọn
Nguyên liệu dùng để sản xuất rượu vang ở đây là quả táo mèo (quả sơn
tra). Quả thu hoạch về cần chọn lấy các quả chín, loại bỏ quả dập nát, thối rữa.
Quả đã chọn đem rửa sạch để ráo nước, sau đó cho vào các ang, thùng, ngâm
đường theo tỷ lệ 1:1. Quả táo mèo được khía các đường nhỏ quanh quả.
Khoảng 2 ngày khuấy trộn một lần, sau một tháng thu được thứ sirô nước quả
các nồng độ đường 60%-80% và nhiều dưỡng chất khác được chiết ra từ thịt

quả.

22


Theo dõi dịch lên men phân tích nồng độ cồn trong dịch quả lựa chọn
mẫu có độ cồn bằng 10%V làm nguồn cung cấp nấm men để tiến hành phân
lập [5].
2.4.1.2. Phân lập giống nấm men
Pha loãng dịch quả bằng nước đảm bảo vệ sinh cho đến khi đạt nồng độ
đường 20%, dịch pha loãng được sunfit hóa bằng K2S2O5 với liều lượng thích
hợp để không giết chết nấm men thuần chủng. Sau đó để lên men tự nhiên ở
nhiệt độ 26-280C, đến ngày thứ 3-5 lấy khoảng 5-10 ml dịch đang lên men
pha loãng ở các nồng độ khác nhau 10-1, 10-2, 10-3…10-9, 10-10. Từ mỗi ống
nghiêm chứa dịch pha loãng lấy một giọt dùng bàn trang trải đều trên hộp
lồng có chứa môi trường Hansen rồi để trong tủ ấm 26-280C trong thời gian 2
đến 3 ngày. Từ các hộp lồng này lựa chọn lấy các khuẩn lạc to, trơn, nhẵn,
bóng, đem cấy riêng rẽ vào các ống thạch nghiêng [7], [12].
2.4.1.3. Đếm số lượng tế bào nấm men
Phương pháp đếm số lượng tế bào nấm men dùng để xác định mật độ tế
bào trong môi trường nuôi cấy là phương pháp đơn giản, thuận tiện, cho kết
quả nhanh. Dụng cụ để đếm số lượng tế bào là buồng đếm hồng cầu ThomasGoriaev có cấu tạo là một khung đếm bằng phiến kính bao gồm 400 ô vuông
nhỏ với tổng thể tích của buồng đếm là 0,1m3 [3].
Việc đếm số lượng tế bào nấm men có trong môi trường nuôi cấy được
thực hiện đúng theo nguyên tắc đếm số lượng hồng cầu trong máu.
2.4.1.4. Phương pháp hoạt hoá giống
Các khuẩn lạc được chọn sẽ cấy vào ống thạch ngiêng để ở 26-280C
trong vòng 24 giờ được giống cấp 1. Nấm men được lấy từ thạch nghiêng để
đưa vào dịch lên men. Tiến hành hoạt hóa giống bằng cách nuôi trong môi
trường nhân giống ở 26-280C trong 24 giờ trên máy lắc được giống cấp 2.

Dùng giống cấp 2 để lên men [12].
23


2.4.1.5. Xác định hoạt lực lên men
Xác định hoạt lực để lên men của nấm men thông qua việc xác định
hàm lượng CO2 được sinh ra (g/l dịch lên men) khi tiến hành lên men trong
các bình tam giác với 50ml dịch môi trường lên men. Hàm lượng CO2 sinh ra
càng nhiều chứng tỏ hoạt lực lên men càng tốt.
Trong một số trường hợp khi nghiên cứu về nấm men ở giai đoạn nhân
giống hoặc lên men vang chúng tôi kết hợp phân tích hàm lượng cồn và
đường sót để xác định hiệu suất lên men. Nếu hiệu suất lên men càng cao thì
hoạt lực lên men của nấm men được đánh giá càng tốt [5].
Hiệu suất lên men được tính bằng công thức:
N

Vtt
x100%
Vlt

Trong đó: N: Hiệu suất lên men
VTT: Nồng độ cồn thực tế (%m)
VLT: Nồng độ cồn tính theo lý thuyết
2.4.1.6. Quan sát hình dạng tế bào trên kính hiển vi
Tế bào nấm men được nhuộm đơn bằng cách: lấy một lượng nhỏ tế bào
từ ống thạch nghiêng, dàn đều lên lam kính có chứa một giọt nước cất sau đó
cố định vết bôi bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn. Nhỏ 1-2 giọt xanhmetilen
lên vết bôi, để trong 2-3 phút rồi rửa lại bằng nước cất. Cuối cùng hơ trên
ngọn lửa đèn cồn, để khô rồi quan sát hình thái tế bào nấm men trên kính hiển
vi quang học có độ phóng đại 1000 lần [3].

2.4.1.7. Xác định khả năng kết lắng
Hòa sinh khối nấm men vào dung dịch đệm axetat (có pH: 4,5) được
đựng trong các ống nghiệm có hình dạng và kích thước như nhau với thể tích
của dung dịch đệm và số lượng nấm men hoàn toàn bằng nhau. Lắc kỹ trên
máy với tốc độ 200 vòng/phút trong thời gian 3-5 phút, để lắng 15 phút. Lúc
này, toàn bộ khối dịch phân thành hai lớp (phía dưới đáy của ống nghiệm là
24


nấm men đã kết lắng). Tiến hành đo chiều cao lớp kết lắng của chủng nấm
men trong từng ống nghiệm để xác định khả năng kết lắng của chủng nấm
men. Ống nghiệm nào có chiều cao kết lắng cao nhất là chủng nấm men có độ
kết lắng tốt nhất [5].
2.4.1.8. Xác định tên khoa học của chủng nấm men
Chúng tôi sử dụng khoá phân loại của Lodder (1970) để xác định tên
khoa học của chủng nấm men do chúng tôi phân lập và tuyển chọn để lên men
táo mèo thông qua các tiêu chí cơ bản.
Đặc điểm sinh học (cấu tạo, hình thái, sinh lý, điều kiện hình thành túi
bào tử, và số lượng bào tử,…).
Khả năng đồng hoá cacbon.
Khả năng đồng hoá các loại muối nitrat.
Khả năng lên men đường.
2.4.2. Phương pháp hoá học
Xác định hàm lượng đường bằng đường kế.
Xác định độ pH bằng máy đo pH và giấy đo pH.
Xác định hàm lượng axit trong dịch lên men bằng chuẩn độ dung dịch
NaOH 0,1N. Từ số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn ta tính hàm lượng axit dịch
lên men.
Xác định hàm lượng cồn bằng cồn kế hoặc bằng phương pháp hoá học.
2.4.3. Phương pháp toán học

Chúng tôi tiến hành xử lý kết quả thu được bằng phương pháp thống kê
toán học qua các thông số sau:
2.4.3.1. Giá trị trung bình số học
n

M 
i 1

Mi
n

25