Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon tới quá trình lên men vang táo mèo

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

NGUYỄN THỊ THUÝ

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA
NGUỒN CACBON TỚI QUÁ TRÌNH
LÊN MEN VANG TÁO MÈO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học

TS. DƢƠNG MINH LAM
PGS.TS. ĐINH THỊ KIM NHUNG

Hà Nội, 2012

1


2


LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện đề tài này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận
tình của các thầy cô giáo, gia đình và bạn bè. Vì vậy, khi hoàn thành khóa
luận này tôi muốn được gửi lời cảm ơn chân thành tới tất cả mọi người.
Trước tiên tôi xin được bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới thầy giáo

Dương Minh Lam và cô giáo Đinh Thị Kim Nhung đã hướng dẫn tôi trong
suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn tới Ban chủ nhiệm khoa cùng các thầy cô
giáo trong tổ bộ môn Vi sinh vật khoa Sinh- KTNN, Trường Đại học sư phạm
Hà Nội 2 đã hướng dẫn và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình và bạn bè đã giúp
đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận.

Hà Nội, tháng 5/2012
Sinh viên

Nguyễn Thị Thuý

3


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài “ Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon tới
quá trình lên men vang táo mèo” là do tôi thực hiện, không trùng với đề tài
nào khác và không sao chép lại của ai.
Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.

Hà Nội, tháng 5/2012
Sinh viên

Nguyễn Thị Thuý

4

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT, HÌNH VÀ BẢNG

1. Danh mục chữ viết tắt
SLTB

: Số lượng tế bào

TB

: Tế bào

S.cerevisiae : Saccharomyces cerevisiae
HL

: Hàm lượng

TG

: Thời gian

Nxb

: Nhà xuất bản

ĐHSP

: Đại học sư phạm

STT

: Số thứ tự

V

: Thể tích

2. Danh mục hình
Hình 3.1. Mẫu nấm men phân lập trên môi trường thạch đĩa (kí hiệu :
T1,T2,T3)
Hình 3.2. Mẫu nấm men T1, T2, T3 trên môi trường thạch nghiêng
Hình 3.3. Mẫu hình dạng tế bào nấm men T2 quan sát dưới kính hiển vi
quang học với độ phóng đại 1000 lần

5


Hình 3.4. Khả năng lên men các loại đường của mẫu T2
Hình 3.5. Động thái phát triển của chủng nấm men S.cerevisiae T2 trong
môi trường nhân giống
Hình 3.6. Biểu diễn sự biến đổi h àm lượng đường và c ồn sau 14 ngày lên
men
Hình 3.7. Động thái lên men vang táo mèo của chủng S.cerevisiae T2
Hình 3.8. Khả năng lên men của chủng S.cerevisiae T2 trên môi trường có
hàm lượng đường ở các mức khác nhau

3. Danh mục bảng
Bảng 1.1. Thành phần hóa học 1 số loại quả
Bảng 3.2. Hoạt lực lên men của các mẫu nấm men T1, T2, T3 sau 48h
Bảng 3.3. Khả năng lên men các loại đường của mẫu T2

Bảng 3.4. Khả năng sinh trưởng, phát triển của chủng S.cerevisiae T2
trong môi trường nhân giống
Bảng 3.5. Sự biến đổi hàm lượng đường và cồn trong quá trì nh lên men
vang táo mèo
Bảng 3.6. Khả năng lên men của chủng S.cerevisiae T2 trên môi trường có
hàm lượng đường ở các mức khác nhau
Bảng 3.7. Kết quả phân tích rượu thành phẩm

6


MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài .......................................................................................... 1
2. Mục tiêu của đề tài ...................................................................................... 3
3. Nội dung của đề tài ..................................................................................... 3
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .................................................... 3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................... 4
1.1. Tìm hiểu chung về rượu vang .................................................................. 4
1.1.1. Khái niệm về rượu vang.. ...................................................................... 4
1.1.2. Nguyên liệu sản xuất rượu vang. .......................................................... 4
1.1.3. Tàng trữ rượu vang................................................................................ 5
1.1.4. Thành phần của rượu vang............................................................ ....... 6
1.2. Hệ vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men vang và bệnh vang ......... 6
1.2.1. Nấm men ............................................................................................... 6
1.2.2. Vi khuẩn ................................................................................................ 8
1.2.3. Nấm mốc. .............................................................................................. 8
1.2.4. Bệnh vang.............................................................................................. 8
1.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng và phát triển

7


của nấm men.................................................................................................... 9
1.3.1. Nguồn cacbon........................................................................................ 9
1.3.2. Nguồn nitơ và khoáng chất ................................................................... 9
1.3.3. Ảnh hưởng của oxy.. ............................................................................. 9
1.4. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men vang ................................... 10
1.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ cồn và pH ..................................................... 10
1.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ ........................................................................ 10
1.4.3. Ảnh hưởng của hàm lượng đường và hàm lượng men giống. .............. 10
CHƢƠNG 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................ 12
2.1. Nguyên liệu, thiết bị và hoá chất.............................................................. 12
2.1.1. Nguyên liệu chính ................................................................................. 12
2.1.2. Hóa chất và thiết bị.................................................................... ........... 12
2.1.2.1. Hóa chất..................................................................................... ........ 12
2.1.2.2. Dụng cụ và thiết bị ............................................................................. 12
2.1.3. Các loại môi trường............................................................................... 12
2.1.3.1. Môi trường Hansen................................................................... ......... 12
2.1.3.2. Môi trường nhân giống ...................................................................... 13
2.1.3.3. Môi trường lên men............................................................................ 13
2.2. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 13

8


2.2.1. Phương pháp vi sinh... ........................................................................... 13
2.2.2. Phương pháp vật lí, hóa học. ................................................................. 13
2.2.3 Phương pháp toán học ............................................................................ 14

2.3. Phạm vi nghiên cứu… .............................................................................. 14
2.4. Địa điểm thực hiện đề tài ......................................................................... 14
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................... 15
3.1. Phân lập, tuyển chọn và xác định tên khoa học của chủng nấm men
có khả năng lên men vang táo mèo ................................................................. 15
3.1.1. Phân lập chủng nấm men từ dịch táo mèo.. .......................................... 15
3.1.2. Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang táo mèo. ....... 16
3.1.2.1. Quan sát hình dạng tế bào trên kính hiển vi quang học.. ................... 16
3.1.2.2. Xác đị nh hoạt lực lên men của các mẫu nấm men T1, T2, T3
bằng phương pháp cân trọng lượng bì nh ........................................................ 17
3.1.2.3. Khả năng lên men đường của mẫu T2 ............................................... 18
3.1.2.4. Xác định tên khoa học của mẫu T2 .................................................... 19
3.2. Nghiên cứu động thái phát triển của chủng S.cerevisiae T2 trong
quá trình nhân giống........................................................................................ 20
3.3. Nghiên cứu động thái quá trình lên men vang táo mèo của chủng
S.cerevisiae T2 ................................................................................................ 22

9


3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường tới quá trì nh lên men vang
táo mèo ............................................................................................................ 24
3.5. Ứng dụng lên men vang táo mèo với quy mô phòng thí nghiệm ............ 25
3.6. Quy trình công nghệ lên men vang táo mèo ............................................ 26
3.6.1. Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất vang táo mèo ............................... 26
3.6.2. Thuyết minh công nghệ......................................................................... 27
3.6.2.1. Giai đoạn 1: Chế biến dịch lên men ................................................... 27
3.6.2.2. Giai đoạn 2: Lên men chính ............................................................... 27
3.6.2.3. Giai đoạn 3: Lên men phụ (ủ chín vang) ........................................... 27
3.6.2.4. Giai đoạn 4: Hoàn thiện và tiêu thụ sản phẩm ................................... 28

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 29
1. Kết luận.. ..................................................................................................... 29
2. Kiến nghị.. ................................................................................................... 29
TÀI LIỆU THAM KHẢO

10


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Rượu là một trong những sản phẩm lên men đã được sử dụng rất sớm ở
nhiều nơi trên thế giới. Con người đã biết nấu rượu trước khi Louis Pasteur
khám phá ra bản chất của quá trình lên men(1854- 1864), và trước khi biết
được chính vi sinh vật là tác nhân thực hiện quá trình biến đổi đường thành
rượu.
Khác với rượu trắng và các loại rượu pha chế, rượu vang là loại đồ
uống lên men trực tiếp từ hoa quả. Khi quá trình lên men kết thúc, người ta
không chưng cất mà để lắng tự nhiên, gạn lọc và hoàn thành sản phẩm. Rượu
vang vốn có nguồn gốc từ nho, nên có tên gọi là “Vin” hoặc “Wine”, ngày
nay người ta mở rộng ý nghĩa của rượu vang là rượu không qua chưng cất từ
các loại nước quả. Mặc dù nho là nguyên liệu chính nhưng một số nguyên liệu
khác như táo, đào, dâu… đôi khi cũng được sử dụng. Thông thường rượu
vang chứa 85- 89% nước, khoảng 10- 14% ethanol, dưới 1% acid (nguồn gốc
hoa quả) và hàng trăm loại chất tạo hương khác nhau ở nồng độ thấp. Khác
với đa số các loại đồ uống khác, rượu vang rất khó hỏng và hầu như không
bao giờ là tác nhân truyền nhiễm bệnh tật. Nồng độ cồn có trong rượu vang ở
mức có thể diệt đa số các loại vi sinh vật gây bệnh và nhìn chung uống rượu
vang an toàn hơn nước hoặc sữa (tất nhiên nếu không uống quá mức cần
thiết). Chính vì lí do này, nhiều nên văn minh đã coi rượu vang là quà của
Thượng đế ban tặng nhằm chống lại bênh tật.

Mỗi nước đều có sản phẩm vang nổi tiếng và đã trở thành thương hiệu
cả thế giới biết đến như rượu vang của Pháp, Bồ Đào Nha, Mỹ, Hà Lan… với
các loại rượu nổi tiếng như Brandy, Port, Champagne, Venmouth. Ở Việt
Nam, ngành rượu vang mới thực sự bắt đầu từ những năm 80 của thế kỉ XX

11


và được đánh dấu bằng sự xuất hiện của nhà máy vang Thăng Long, sau đó là
vang Đà Lạt, vang Gia Lâm…
Đa số rượu vang trên thế giới được sản xuất từ nho. Tuy nhiên, Việt
Nam nằm trong khu vực nhiệt đới, không thích hợp cho cây nho phát triển,
diện tích nho ít, sản lượng thấp, vì vậy giá thành cao. Nhưng Việt Nam lại có
rất nhiều các loại quả khác, nhiều về số lượng, phong phú về chủng loại mà
giá thành lại rẻ nên việc sản xuất rượu vang từ các loại quả này là rất cần
thiết.
Để tạo ra một loại rượu vang đặc trưng của Việt Nam, chúng tôi đã tiến
hành tìm kiếm nguồn nguyên liệu để lên men vang. Trong quá trình tìm kiếm
chúng tôi nhận thấy, ở miền núi phía Tây Bắc nước ta có cây táo mèo cho quả
có hương vị thơm ngon và đặc trưng. Tổng diện tích trồng cây táo mèo
khoảng 40.000 ha [9]. Nơi có diện tích trồng cây táo mèo nhiều nhất là các
tỉnh Yên Bái, Sơn La, Điện Biên, Lai Châu. Tuy nhiên, số lượng mang đi tiêu
thụ hàng năm không đáng kể(khoảng 35%), số còn lại thường bị bỏ phí do
không có nguồn tiêu thụ tại chỗ, vận chuyển khó khăn, hoặc giá thành rẻ. Do
vậy người dân trồng cây táo mèo có thu nhập thấp, đời sống gặp nhiều khó
khăn. Thông qua việc phân tích sơ bộ một số chỉ tiêu, chúng tôi nhận thấy quả
táo mèo rất có triển vọng trong việc sử dụng nguồn nhiên liệu để sản xuất
rượu vang.
Hiện nay rượu vang táo mèo chưa được sản xuất rộng rãi do một số yêu
cầu kĩ thuật cũng như chất lượng của sản phẩm lên men. Nghiên cứu bản chất

sinh lí, sinh hóa của quá trình lên men vang táo mèo nhằm tuyển chọn được
chủng có khả năng lên men vang tốt, khảo sát các nhân tố ảnh hưởng tới quá
trình lên men vang táo mèo nhằm nâng cao hiệu suất lên men và chất lượng
sản phẩm phù hợp với tình hình sản xuất ở nước ta là một vấn đề rất cần thiết.

12


Với những lí do trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài “ Nghiên cứu ảnh
hưởng của nguồn cacbon tới khả năng lên men vang táo mèo”.
2. Mục tiêu của đề tài
Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon tới khả năng lên men vang táo
mèo.
3. Nội dung của đề tài
3.1. Phân lập, tuyển chọn, xác định tên khoa học của chủng nấm men có khả
năng lên men vang táo mèo.
3.2. Nghiên cứu động thái phát triển của chủng S.cerevisiaeT2 trong môi
trường nhân giống.
3.3. Nghiên cứu động thái quá trình lên men vang táo mèo của chủng
S.cerevisiaeT2.
3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường tới quá trình lên men vang
táo mèo.
3.5. Ứng dụng lên men vang táo mèo với quy mô phòng thí nghiệm.
3.6. Quy trình công nghệ lên men vang táo mèo.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Ý nghĩa khoa học: Đề tài nghiên cứu nhằm đi sâu tìm hiểu các đặc điểm
hình thái, sinh lý, sinh hóa của chủng nấm men có khả năng lên men vang táo
mèo. Đây là dẫn liệu góp phần bổ sung cho các nghiên cứu về nấm men và
ứng dụng của nấm men trong đời sống.
Ý nghĩa thực tiễn: Tận dụng nguồn nguyên liệu sẵn có của địa phương

nhằm nâng cao thu nhập cho các bà con dân tộc vùng cao, sản xuất một loại
vang phù hợp với thị hiếu của người tiêu dùng, góp phần làm phong phú thị
trường vang trong nước.

13


CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tìm hiểu chung về rƣợu vang
1.1.1. Khái niệm về rượu vang
Rượu vang là một loại sản phẩm lên men không qua chưng cất từ nước
ép các loại hoa quả như nho, dứa, mơ, dâu…
Phân loại rượu vang: Có nhiều cách để phân loại rượu vang
Căn cứ vào màu sắc, có thể chia rượu vang thành:
Vang trắng: Lên men từ nước ép nho trắng hoặc nho đỏ
Vang đỏ: Lên men từ nho đỏ có xác quả
Vang hồng: Lên men từ nho đỏ có xác quả nhưng thời gian tiếp
xúc giữa các quả và dịch ép ngắn
Căn cứ vào lượng đường có trong rượu ta có:
Vang chát và vang khô ( hết đường): Thường uống giữa bữa ăn,
vừa ăn vừa uống.
Vang ngọt ( còn đường): Dùng sau bữa ăn.
Xu hướng chung thì vang được phân thành 2 nhóm chính là: Vang
không có gas (trong vang thành phẩm không có CO2) và vang có gas (trong
vang thành phẩm có CO2) [13].
1.1.2. Nguyên liệu sản xuất rượu vang
Nước ta là nước nhiệt đới gió mùa không thích hợp cho cây nho phát
triển tốt. Tuy nhiên nước ta lại có nhiều loại hoa quả rất phong phú, đây là
nguồn nguyên liệu phục vụ cho ngành công nghiệp chế biến rượu vang ( mơ,

táo, dứa, vải…). Thành phần hóa học của quả, điều kiện chăm sóc, khí
hậu…có ảnh hưởng lớn đến chất lượng rượu vang.
Thành phần hóa học của một số loại quả được dẫn ra ở bảng 1.1 [11].

14


Bảng 1.1. Thành phần hóa học 1 số loại quả
Tên quả

Thành phần hóa học cơ bản ( %)
Nước

Đường

Acid

Pectin

Tanin

Nho

73,1

9,88

0,56

0,092

0,07

Vải

84,28

16,1

5,16

0,249

0,83

Dứa

54,3

3,9

0,6

0,249

0,83

Mơ

73,8

9,0

1,1

0,249

0,83

Dâu

84,74

9,19

0,49

0,31

0,035

Táo mèo

84

4,8

1,45

0,249

0,83

1.1.3. Tàng trữ rượu vang
Nếu bảo quản đúng cách rượu vang có thể tàng trữ trong nhiều năm mà
không bị hỏng và mất phẩm chất. Yếu tố quan trọng nhất là hạn chế tiếp xúc
với không khí. Sự có mặt của oxy trong không khí có thể khiến vi sinh vật
phát triển trên bề mặt và tạo những hương vị không mong muốn, như tạo vị
chua của dấm. Oxy cũng khiến rượu vang mất màu và mùi.
Nhằm tránh những biến đổi không mong muốn kể trên, khả năng tiếp
xúc của vang với không khí cần được hạn chế tối đa. Thông thường vang
được chứa đầy kín trong các thùng chứa nhằm hạn chế khoảng trống trong
thùng. Trong quá trình tàng trữ người ta thường bổ sung rượu vang vào những
thùng chứa nhằm bù lấp khoảng trống xuất hiện khi rượu vang bị bay hơi.
Chai rượu vang được bảo quản ở trạng thái nằm ngang nhằm đảm bảo tiếp
xúc trực tiếp giữa rượu vang và nút. Điều này sẽ hạn chế việc nút bị khô và
khả năng thẩm thấu của không khí qua các khe hở tạo ra trên nút khô nứt.
Vang đóng chai có thể bảo quản hàng chục năm trong hầm chứa ở nhiệt độ
thấp ( khoảng 160C) [10].

15


1.1.4. Thành phần của rượu vang
Thành phần chủ yếu của rượu vang gồm:
Cồn ethanol: Do lên men tự nhiên từ dịch trái cây vì vậy không lẫn với
alđehyt, este. Độ cồn của rượu 100- 120.
Chất bổ sung: Đường trong rượu vang từ 6,2% - 13,2% chủ yếu là
fructose, glucose, một ít galactose.
Acid vô cơ và acid hữu cơ: Acid Oxalic, acid malic, acid citric…

Rượu vang giàu vitamin: Vitamin có trong nước quả không bị quá
trình lên men phân hủy mà nó chỉ điều chỉnh lại thành phần [3].
Các acid amin: Các acid amin có vai trò quan trọng đối với sự sinh sản
và phát triển của nấm men. Ngoài lượng acid amin có sẵn trong dịch quả, quá
trình lên men vang cũng tạo ra được một số acid amin đã làm cho vang thành
phẩm có hương vị rất đặc trưng. Các acid amin như: Lizin, valin … [12].
1.2. Hệ vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men vang và bệnh vang
1.2.1. Nấm men
1.2.1.1. Sơ lược, cấu tạo, hình thái tế bào nấm men
Sơ lược về nấm men: Nấm men (yeast) là tên chung để chỉ nhóm nấm
có cấu tạo đơn bào, sinh sản bằng lối nảy chồi. Nấm men phân bố khá rộng rãi
trong
tự nhiên (trong đất, nước, không khí, thực phẩm, hoa quả) nhiều loại nấm men
có khả năng lên men rượu. Chính vì vậy, từ lâu con người đã biết sử dụng
nấm men để sản xuất rượu bia.
Tuy nhiên có một số nấm men độc hại, làm nhiễm các quy trình công
nghệ và gây hư hỏng sản phẩm.
Cấu tạo: Chủ yếu của tế bào nấm men là hemicellulose chiếm 70%
trọng lượng khô ( trong đó 31% manman, 29% glucan). Ngoài ra còn chứa 13% kitin, 6- 10% protein, 8- 8,5% lipid, 7% khoáng. Thành phần nội bào quan

16


trọng của nấm men là ty thể, không bào và nhân. Số lượng ty thể khoảng 1020/ tế bào. Chúng có vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng, sinh sản
của nấm men. Không bào được hình thành từ thể golgi hay mạng lưới nội
chất. Không bào chứa hệ thống keo bao gồm: Enzyme, protein, hydrocacbon,
muối canxi, kali, acid nucleic và các chất dự trữ khác. Nhân hình ovan, tròn
nằm gần không bào trung tâm với khích thước khoảng 2,4μm. Nhân chứa toàn
bộ hệ men tham gia điều khiển quá trình sinh tổng hợp của tế bào nấm men.
Hình thái tế bào: Đa số có hình trứng, cầu hay ovan. Kích thước từ (310) × (5- 12)μm. Hình dạng kích thước tế bào điển hình chỉ được tạo ra trong

môi trường phù hợp. Khi điều kiện bất lợi thì hình dạng, kích thước tế bào sẽ
bị biến dạng ( khi môi trường nghèo dinh dưỡng nấm men có hình đế giày).
1.2.1.2. Sinh sản của tế bào nấm men
Trong điều kiện bình thường tế bào nấm men sinh sản theo lối nảy
chồi. Trong điều kiện không thuận lợi 1 số có thể chuyển sang sinh sản bằng
bào tử, sinh sản nảy chồi ở nấm men là hình thức phổ biến nhất. Khi tế bào
phát triển đến một mức độ nhất định thì trên cơ thể của nó đâm ra một chồi
nhỏ gọi là mầm (chồi). Mầm (tế bào con) đâm ra ở vị trí lệch tâm trên một
đầu của tế bào mẹ. Sau khi nảy mầm, tế bào con phát triển trên cơ thể mẹ
hoặc tách khỏi cơ thể mẹ để phát triển độc lập.
Nấm men Saccharomyces có khả năng hình thành bào tử, bào tử túi
được sinh ra trong các túi nhỏ gọi là túi nang, mỗi túi chứa 1-8 bào tử. Nấm
men Saccharomyces được hình thành theo lối sinh sản vô tính. Đó là quá trình
hình thành bào tử từ một tế bào riêng rẽ không tiếp hợp. Bào tử túi sau khi ra
khỏi túi gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành một tế bào nấm men. Tiếp
theo tế bào nấm men lại sinh sản theo lối nảy chồi.
Nấm men được dùng trong lên men rượu vang là Saccharomyces
cerevisiae chứa trung bình 75% nước, 25% chất khô [3], [11].

17


Theo quan điểm kinh tế người ta chia nấm men thành các chủng:
Chủng lên men với hiệu suất cao, ở thời điểm tối ưu tạo 20%V cồn.
Chủng lên men với thời gian ngắn, lên men tạo 8- 10%V cồn.
Chủng chịu được nồng độ cồn cao, lên men dưới 30% đường
tạo 10- 13%V cồn.
1.2.2. Vi khuẩn
Trong nước quả và rượu vang có thể phát triển những dạng vi khuẩn là
nguyên nhân gây nên những biến đổi sâu sắc trong rượu vang như vị chua,

mùi, có loài còn gây đục vang. Đó thường là các loài vi khuẩn Acetobacter
xylnium, Acetobacter aceti. Pasteur đã tìm ra cơ chế làm hỏng vang khi rượu
vang tiếp xúc với không khí nhiễm vi khuẩn Bacillus [10].
Do vậy để bảo quản rượu vang người ta có thể dùng thanh trùng
Pasteur nhưng nó lại làm giảm chất lượng rượu vang. Ngoài ra, người ta còn
dùng phương pháp vi lọc hoặc dùng một số chất bảo quản phổ biến như
SO2(75-120 mg/l).
1.2.3. Nấm mốc
Nấm mốc phát triển ở quả, chất bã của sản xuất rượu vang, thùng chứa
thiết bị hoặc do bụi không khí đưa đến như nấm mốc thuộc chi Rhizopus,
Aspergillus [6], [10].
1.2.4. Bệnh vang
Bệnh vang luôn là vấn đề phải quan tâm của các nhà sản xuất rượu
vang. Vấn đề bệnh vang được khám phá đầu tiên bởi Pasteur. Bệnh vang làm
cho rượu bị chua, có mùi khó chịu và phẩm chất rượu giảm rất nhanh [9].
Các vi sinh vật kị khí: Vi khuẩn Lb. brevia, Lb. Pasteurianus, Lb.
plantarum đã làm cho vang bị vẩn đục, làm chuyển hóa acid citric, tạo ra
lượng lớn acid lactic, acid acetic và 2,3- butanediol.

18


Các vi khuẩn hiếu khí: Một số loại nấm men tạo màng trên bề mặt vang
như: Candida, Zygopichia, Pichia… phân giải đường thành các acid hữu cơ:
citric, acetic…[2].
1.3. Các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình sinh trƣởng, phát triển của nấm
men
1.3.1. Nguồn cacbon
Cacbon là nguồn nguyên liệu cơ bản kiến tạo nên bộ khung tế bào nấm
men. Là thành phần quan trọng của tất cả các chất trao đổi và là nguồn dinh

dưỡng hàng đầu của vi sinh vật.
Nguồn cacbon cung cấp cho nấm men Saccharomyces cerevisiae được
lấy chủ yếu từ các nguồn đường: Glucose, saccharose, fructose.
Nguồn cacbon đáp ứng được 3 nhu cầu cơ bản của nấm men.
Sản sinh ra năng lượng thông qua quá trình oxi hóa khử.
Tạo thành những tiền chất.
Tham gia vào các quá trình oxi hóa khử.
1.3.2. Nguồn nitơ và khoáng chất
Nitơ là thành phần quan trọng cấu tạo nên tế bào, nó là một trong
những nguyên tố cấu tạo nên acid nucleic. Nitơ cung cấp cho vi sinh vật chủ
yếu từ 2 nguồn: nguồn vô cơ và nguồn hữu cơ. Các nguyên tố khoáng như P,
S đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất của nấm men. Các ion
Ca2+, Mg2+, Fe2+... nằm trong tế bào của các enzyme hoạt động.
1.3.3. Ảnh hưởng của oxy
Quá trình tăng sinh khối của nấm men là quá trình hiếu khí vì vậy oxy
là nguồn quan trọng để nấm men tăng sinh khối trong quá trình nhân giống.

19


1.4. Các yếu tố hƣởng tới quá trình lên men vang
1.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ cồn và pH
Nấm men lên men luôn sản sinh ra một lượng cồn. Nồng độ cồn thích
hợp cho nấm men tốt nhất là 9- 14%V. Khả năng chịu cồn và lên men tốt
trong môi trường có nồng độ cồn thích hợp là một tiêu chí để tuyển chọn
chủng nấm men cho quá trình sản xuất rượu.
Trong quá trình lên men pH môi trường luôn biến đổi. Ở giai đoạn
cuối pH hơi tăng do nấm men tự phân hủy giải phóng ra NH3.
Với pH: 2- 3 quá trình lên men yếu.
pH > 6,5- 7,5 khả năng lên men không còn.

pH thích hợp là 4-5 [10].
1.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng khá lớn đến quá trình lên men. Mỗi loại nấm
men có khoảng nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển:
Nhiệt độ < 200C: Sự lên men chậm chạp, độ rượu tạo thành thấp.
Nhiệt độ < 100C: Không diễn ra quá trình lên men.
Nhiệt độ: 350C: Nguy hiểm cho quá trình lên men, nấm men không
chết nhưng mất tác dụng.
Nhiệt độ thích hợp cho nấm men phát triển là 26- 280C [8].
Nhiệt độ > 350C: Quá trình lên men dừng lại, lượng đường sót cao,
vi khuẩn hoạt động đặc biệt nhiều vi khuẩn chuyển hóa đường thành
acid acetic gây chua, giảm chất lượng vang.
1.4.3. Ảnh hưởng của hàm lượng đường và hàm lượng men giống
Đường và các chất hòa tan tạo nên áp suất thẩm thấu ảnh hưởng tới quá
trình vận chuyển các chất ra hoặc vào tế bào. Hàm lượng đường thích hợp cho
quá trình lên men là 12- 25%. Hàm lượng đường 30%V sẽ ức chế quá trình
lên men. Các kết quả nghiên cứu cho thấy khi hàm lượng đường trong dịch

20


lên men tăng thì hàm lượng acid acetic trong vang tăng. Mặt khác tỉ lệ các
loại đường trong dịch lên men cũng ảnh hưởng không nhỏ đến tốc độ và hiệu
suất lên men. Kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả cho thấy: Glucose là một
loại đường phù hợp nhất cho sự sinh sản và phát triển chủng nấm men cũng
như quá trình tạo rượu, tiếp đó là đường fructose và saccharose….Vì vậy quả
có chứa hàm lượng đường khử càng cao thì càng có lợi cho quá trình lên men
và chất lượng vang thành phẩm [10].
Hàm lượng men giống cũng ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình sinh
trưởng cũng như quá trình lên men của nấm men. Hàm lượng tế bào nấm men

có trong dịch lên men càng thấp thì thời gian lên men càng kéo dài hơn, dễ bị
nhiễm khuẩn, ngược lại hàm lượng men giống trong dịch lên men càng cao thì
thời gian lên men ngắn hơn, hạn chế được khả năng nhiễm khuẩn do sự áp
đảo của tế bào nấm men. Nhưng hàm lượng men giống quá cao sẽ làm thay
đổi thành phần môi trường lên men và sẽ không có lợi cho quá trình lên men
và chất lượng
rượu vang. Nhìn chung hàm lượng men giống thích hợp cho quá trình lên men
khoảng 10%.

21


CHƢƠNG 2
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu, thiết bị và hóa chất
2.1.1. Nguyên liệu chính
Quả táo mèo thu nhận từ hai tỉnh Sơn La và Yên Bái.
Chủng nấm men nghiên cứu được phân lập từ dịch siro quả táo mèo có
vị trí phân loại theo Yelinov N.P (1996) sau đây:
Lớp

: Hemiascomycetes

Bộ

: Endomycetales

Họ

: Saccharomycetaceae

Giống : Saccharomyces
Loài

: cerevisiae

2.1.2. Hóa chất và thiết bị
2.1.2.1. Hóa chất
Một số loại hóa chất được sử dụng: MgSO4, KH2PO4, ( NH4)2SO4,
agar, pepton, các loại muối, các loại đường…
2.1.2.2. Dụng cụ và thiết bị
Dụng cụ: Hộp lồng, ống nghiệm, phiễu thủy tinh, que cấy, đèn cồn,
bình tam giác, bình lên men…
Thiết bị: Nồi hấp, tủ sấy, buồng cấy vô trùng, cân phân tích, kính hiển
vi…
2.1.3. Các loại môi trường
2.1.3.1. Môi trường Hansen ( MT1) g/l: Môi trường phân lập và sơ tuyển
chủng nấm men
1. Đường Glucose: 50,0g
2. Pepton: 5,0g

22


3. MgSO4.7H2O: 0,5g
4. KH2PO4: 1,0g
5. ( NH4)2SO4: 1,0g
6. Thạch agar: 20g
7. Nước cất: 1000ml
2.1.3.2. Môi trường nhân giống (MT2) g/l:

1. Đường Glucose: 50,0g
2. Pepton: 5,0g
3. MgSO4.7H2O: 0,5g
4. KH2PO4: 1,0g
5. ( NH4)2SO4: 1,0g
6. Nước cất: 1000ml
2.1.3.3. Môi trường lên men (MT3) g/l:
1. Dịch siro hoa quả: 50,0g
2. MgSO4.7H2O: 0,5g
3. KH2PO4: 1,0g
4. ( NH4)2SO4: 1,0g
5. Nước cất: 1000ml
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp vi sinh
Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men dựa trên việc nghiên cứu hình
thái tế bào nấm men, xác định số lượng tế bào nấm men, hoạt lực lên men.
2.2.2. Phương pháp vật lí, hóa học
Xác định hàm lượng đường bằng đường kế.
Xác định nồng độ pH bằng giấy thử pH và máy đo pH.
Xác định hàm lượng cồn bằng cồn kế.

23


2.2.3. Phương pháp toán học
Giá trị trung bình số học:
n

X

X 

i 1

i

n

Độ lệch chuẩn:

 

S

i





2

( nếu n < 30)

n 1

 

S

i





2

n 1

( nếu n ≥ 30)

Sai số trung bình học

m

S
n

Hệ số biến thiên

Cv 
Trong đó:

S
 100%
X

n : Số lần nhắc lại
Xi: Giá trị của lần thứ i

S: Độ lệch chuẩn
m: Sai số trung bình học

2.3. Phạm vi nghiên cứu
Chủng nấm men Saccharomyces, tuyển chọn trên đối tượng là quả táo
mèo được thu nhận từ hai tỉnh Sơn La và Yên Bái.
2.4. Địa điểm thực hiện đề tài
Phòng thí nghiệm Vi sinh, Khoa Sinh- KTNN Trường Đại học sư phạm
Hà Nội 2.

24


CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Phân lập, tuyển chọn, xác định tên khoa học của chủng nấm men có
khả năng lên men vang táo mèo
Nấm men đóng vai trò quan trọng đối với toàn bộ quy trình sản xuất và
chất lượng của vang. Vì vậy, nấm men sử dụng lên men rượu vang từ dịch táo
mèo phải đạt các yêu cầu sau [16]:
1. Lên men được ở nồng độ đường và nồng độ acid cao.
2. Có hiệu suất lên men cao.
3. Có khả năng kết lắng tốt và làm trong sản phẩm.
4. Tạo hương thơm đặc trưng và không có vị lạ, không sinh độc tố.
5. Ổn định lâu dài trong sản xuất.
3.1.1. Phân lập chủng nấm men từ dịch táo mèo
Môi trường phân lập chủng nấm men là môi trường Hansen. Dùng
phương pháp phân lập trên hộp Petri nhằm tuyển chọn một tập hợp tế bào
nấm men của cùng một nòi có kích thước, hình thái, khả năng lên men như
nhau.

Cách tiến hành: Môi trường phân lập được khử trùng và phân vào các
hộp Petri vô trùng để nguội. Dùng dịch hoa quả đã được pha loãng từ 10-1- 1010

bằng nước cất. Nhỏ 1- 2 giọt dịch huyền phù với độ pha loãng 10-9 lên bề

mặt thạch, dàn đều bằng bàn trang. Gói kín và nuôi trong tủ ấm ở điều kiện
300C trong 2-3 ngày, trên bề mặt thạch thấy xuất hiện các khuẩn lạc với các
đặc điểm: hình tròn, màu trắng, nhẵn bóng đặc trưng cho nấm men.
Kết quả phân lập chọn được 3 mẫu nấm men có đường kính khuẩn lạc
1,2- 1,5 mm. Chúng tôi dùng 3 mẫu này làm đối tượng nghiên cứu tiếp. Kí
hiệu là T1, T2, T3 (hình 3.1).

25