Ảnh hưởng của hạn tới một số chỉ tiêu sinh lý và hàm lượng proline ở cà chua

Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Sinh lý thực vật

MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Cà chua có tên khoa học Lycopersicum esculentum Miller, thuộc họ Cà
Solanaceae là loại rau ăn quả có giá trị kinh tế cao. Quả cà chua là nguồn thực
phẩm tuyệt vời chứa nhiều vitamin như A, B, C, K… Đặc biệt trong quả cà
chua còn chứa bốn loại caroten là α-carotence, β-carotence, γ -carotence và
lycopene. Sắc tố lycopene là phân tử làm cho quả cà chua có màu đỏ hấp dẫn,
theo các nghiên cứu thì phân tử lycopene trong trái cà chua có tính chống oxy
hoá cao, đây là phân tử có nhiều lợi ích cho sức khỏe của con người như làm
giảm nguy cơ phát triển tế bào ung thư, nhiều bệnh về tim mạch và sự lão
hoá…
Ở nước ta, cây cà chua cũng đã được trồng ở nhiều vùng khác nhau, tuy
nhiên năng suất chưa cao chủ yếu do kĩ thuật canh tác còn lạc hậu hơn nữa cà
chua dễ mắc phải nhiều loại bệnh như xoăn vàng ngọn, đốm vòng, mốc sương
mai… Hơn nữa, cây trồng còn chịu ảnh hưởng lớn của điều kiện thời tiết khí
hậu, và hạn là yếu tố thường xuyên tác động gây ảnh hưởng đến sinh trưởng,
phát triển của cây trồng nói chung cũng như cây cà chua nói riêng từ đó ảnh
hưởng lớn đến năng suất và phẩm chất của chúng. Chính vì vậy mà việc
nghiên cứu khả năng chịu hạn để có các giải pháp nhằm nâng cao tính chịu
hạn là một vấn đề cần thiết đối với nhiều loại cây trồng.
Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về khả năng chịu hạn ở nhiều
loại cây khác nhau như lúa, đậu tương… đều cho thấy kết quả của stress hạn
là dẫn đến sự thay đổi các phản ứng sinh lí, sinh hóa trong cơ thể thực vật như
sự đóng của khí khổng, giảm tỷ lệ thoát hơi nước của mô, giảm quang hợp và
làm tăng tích lũy axit abcisic (ABA), proline, manitol, sorbitol, sự cấu thành
nhóm ascobat, gluthion, α-tocopherol… và sự tổng hợp protein mới [30].

Trần Thị Hà

1

Lớp: K33A - Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Sinh lý thực vật

Chịu hạn ở thực vật thường là kết quả của nhiều cơ chế đáp ứng stress hoạt
động ngang nhau. Các nghiên cứu gần đây đưa ra một số cơ chế chịu hạn
chính bao gồm: vận chuyển ion, bảo vệ thẩm thấu, axit abscisic (ABA), môi
giới phân tử, LEA (late embryogenesis abundant) và vai trò của proline, vai
trò của bộ rễ và khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu [21], [26], [30]. Trên
thế giới đã có khá nhiều nghiên cứu tập trung tìm hiểu cơ chế của tính chịu
hạn (Jones, 1980; Rao và cs, 1994; Farshadfar và cs, 1995), trong đó có không
ít những nghiên cứu đề cập đến vai trò của proline đối với khả năng chịu hạn
của thực vật nói chung và cây trồng nói riêng (Pandey và cs, 1985; Verma,
1990; Xin và cs, 1993). Ở Việt Nam, cũng có những công trình nghiên cứu
của các tác giả: Lê Trần Bình và cs, 1998; Nguyễn Đạt Kiên và cs, 2005.
Chính vì vậy để làm sáng tỏ thêm khả năng chịu hạn của một số giống
cà chua, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Ảnh hưởng của hạn tới một
số chỉ tiêu sinh lý và hàm lượng proline ở cà chua”.
2. Mục đích và nhiệm vụ nghiên cứu
2.1. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu sự biến đổi của một số chỉ tiêu sinh lí, proline ở cà chua
dưới điều kiện hạn, qua đó đánh giá khả năng chịu hạn của giống cà chua VL
3000 và giống Gandeera đang được gieo trồng tại Vĩnh Phúc.

2.2. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Xác định chỉ số chịu hạn tương đối ở giai đoạn cây non.
- Xác định hàm lượng diệp lục, huỳnh quang diệp lục, hàm lượng
proline ở giai đoạn cây ra hoa.
- Xác định hàm lượng diệp lục, huỳnh quang diệp lục, hàm lượng
proline ở giai đoạn quả non.

Trần Thị Hà

2

Lớp: K33A - Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Sinh lý thực vật

3. Ý nghĩa lí luận và ý nghĩa thực tiễn
- Cung cấp tư liệu khoa học cho nghiên cứu ảnh hưởng của hạn tới một
số chỉ tiêu sinh lí (chỉ số chịu hạn, hàm lượng diệp lục, huỳnh quang diệp lục)
và hàm lượng proline ở cà chua.
- Khuyến khích người dân sử dụng giống cà chua có khả năng chịu hạn
tốt hơn.

Trần Thị Hà

3

Lớp: K33A - Sinh

Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Sinh lý thực vật

NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Đặc điểm thực vật học và sinh trưởng của cây cà chua
Cây cà chua (Lycopersicum esculentum Miller) là một loại rau phổ
biến được trồng rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới. Ở nước ta, cây cà
chua đã được trồng từ rất lâu, cho đến nay cà chua vẫn là loại rau quả
chủ lực được nhà nước ưu tiên phát triển.
Cà chua trồng là cây hàng năm, thân bụi, phân nhánh mạnh, có lớp lông
dày bao phủ, trên thân có nhiều đốt và có khả năng ra rễ bất định. Chiều cao
và số nhánh rất khác nhau phụ thuộc vào giống và điều kiện trồng trọt.
Rễ cà chua thuộc hệ rễ chùm, trong điều kiện đồng ruộng rễ cà chua có
thể phát triển rộng tới 1,3m và sâu tới 1m. Với khối lượng rễ lớn như vậy cà
chua được xếp vào nhóm cây chịu hạn.
Lá cà chua đa số thuộc dạng lá kép, các lá chét có răng cưa, có nhiều
dạng khác nhau: dạng chân chim, dạng lá khoai tây, dạng lá ớt… tùy thuộc
vào giống mà lá cà chua có màu sắc và kích thước khác nhau.
Hoa cà chua được mọc thành chùm. Có ba dạng chùm hoa: dạng đơn
giản, dạng trung gian và dạng phức tạp. Số lượng hoa / chùm, số chùm hoa /
cây rất khác nhau ở các giống.
Quả cà chua thuộc loại quả mọng, có 2 - 3 hoặc nhiều ngăn hạt. Hình
dạng và màu sắc quả phụ thuộc vào từng giống. Ngoài ra màu sắc quả chín
còn phụ thuộc vào điều kiện nhiệt độ, phụ thuộc vào hàm lượng caroten và
lycopen.
Cà chua sinh trưởng và phát triển thuận lợi ở nhiệt độ 200C đến 270C.

Nhiệt độ lớn hơn 300C kéo dài, kết hợp với hạn đất, hạn không khí sẽ dẫn đến
rối loạn quá trình đồng hóa, giảm hàm lượng chất khô trong quả và làm năng

Trần Thị Hà

4

Lớp: K33A - Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Sinh lý thực vật

suất giảm sút nghiêm trọng. Cà chua là cây tương đối chịu hạn, nhưng yêu
cầu về nước nhiều vì khối lượng thân lá trên mặt đất tương đối lớn, đồng thời
hình thành nhiều quả trong thời gian ngắn. Theo tính toán để đạt năng suất 50
tấn/ha cần tới 6000m3 nước. Yêu cầu nước của cà chua nhiều nhất là ở thời kỳ
ra quả, nếu thiếu nước lá cà chua sẽ bị xoăn lại, do vậy quang hợp sẽ bị yếu
đi. Khi độ ẩm thấp, việc sử dụng phân bón sẽ gặp khó khăn, đồng thời cây dễ
bị ngộ độc vì nồng độ muối trong đất cao, quả sẽ chín nhanh hơn, hàm lượng
chất khô và hàm lượng đường cao nhưng sản lượng lại giảm [6].
Vĩnh phúc là một tỉnh ở đồng bằng trung du Bắc Bộ có đầy đủ ba vùng
sinh thái: đồng bằng, trung du và miền núi. Cũng như các tỉnh khác thuộc khu
vực Bắc Bộ, Vĩnh Phúc nằm trong vành đai khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng
ẩm, mưa nhiều. Lượng mưa trung bình từ 1500 – 2000mm, tập trung chủ yếu
vào tháng 6, tháng7, tháng 8. Nhiệt độ trung bình hàng năm là từ 23-240C, độ
ẩm trung bình là 84-89%. Chế độ gió mùa và sự thay đổi khí hậu trong năm
đã gây nhiều khó khăn cho hoạt động sản xuất nông nghiệp do vùng nằm
trong khu vực thường bị khô hạn, sương muối. Hạn là yếu tố thường xuyên

tác động gây ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển của cây trồng nói chung
cũng như cây cà chua nói riêng từ đó ảnh hưởng lớn đến năng suất và phẩm
chất của chúng.
1.2. Những tác động bất lợi của hạn hán đến thực vật
Hạn là một trong những nguyên nhân chính gây mất mùa vụ trên diện
rộng, làm giảm 50% năng suất trung bình và có thể là hơn. Hạn là phức hệ các
điều kiện khí tượng bất lợi gây ra sự thiếu nước, mất nước ở thực vật, bao
gồm: hạn trong đất và hạn trong không khí. Hạn trong đất có thể do nhiệt độ
thấp hoặc nồng độ dịch đất cao. Hạn trong không khí có thể do độ ẩm quá
thấp hoặc do nhiệt độ cao, gió mạnh. Từ đó gây tác động xấu đến sự sinh

Trần Thị Hà

5

Lớp: K33A - Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Sinh lý thực vật

trưởng, phát triển của cây trồng và cuối cùng là ảnh hưởng đến năng suất,
phẩm chất của chúng.
Hạn là hiện tượng thường xuyên xảy ra trong thiên nhiên và liên quan
trực tiếp đến vấn đề nước trong cơ thể thực vật. Nước là yếu tố giới hạn đối
với cây trồng, là sản phẩm quan trọng khởi đầu, trung gian và cuối cùng của
các quá trình chuyển hóa sinh hóa, là môi trường để các phản ứng trao đổi
chất xảy ra. Mỗi cây trồng có một giới hạn nhất định đối với các nhân tố sinh
thái của môi trường như hạn, nóng, lạnh... Nếu ở ngoài giới hạn đó có thể gây

hại cho sự sinh trưởng và phát triển của cây, giảm năng suất sinh học. Thực
vật có khả năng ngăn ngừa thương tổn khi bị tổn thương gọi là tính chống
chịu. Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về khả năng chịu hạn ở cây đậu
tương, ngô, lúa, đậu xanh...
Nguyên nhân chính của sự mất mùa và làm giảm năng suất gieo trồng
là do hạn [24]. Trên thế giới có khoảng 40-60% diện tích đất trồng bị hạn
[30]. Nước ta có địa hình phức tạp nên khí hậu cũng rất phức tạp, lượng mưa
phân bố không đều giữa các vùng trong năm, nên hạn có thể xảy ra ở bất cứ
nơi nào. Hơn nữa, sự bùng nổ dân số kết hợp với ô nhiễm môi trường cho nên
hạn hán, lũ lụt thường xuyên xảy ra. Hạn là nguyên nhân chính của stress
thẩm thấu [31]. Thiếu nước cây sẽ chết non hoặc làm giảm sức sống, giảm
năng suất. Để giữ nước cho cơ thể cây cần có sự biến đổi hình thái hoặc duy
trì áp suất thẩm thấu của tế bào… đó là khả năng chịu hạn của cây trồng.
Kết quả của stress hạn là sự thay đổi các phản ứng sinh lí, sinh hóa
trong cơ thể thực vật như sự đóng của khí khổng, giảm tỷ lệ thoát hơi nước
của mô, giảm quang hợp và làm tăng tích lũy axit abcisic (ABA), proline,
manitol, sorbitol, sự cấu thành nhóm ascobat, α-tocopherol… và sự tổng hợp
protein mới [30]. Hạn còn dẫn tới một số biến đổi trong mô và tế bào như làm
kết tủa và biến tính protein, làm tăng độ lỏng của lipid màng, sự mở xoắn của

Trần Thị Hà

6

Lớp: K33A - Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Sinh lý thực vật

axit nucleic. Hạn cũng phá hoại hệ thống quang hóa II trên màng thylacoid
[31].
Dưới ảnh hưởng của sự thiếu nước, sinh trưởng của cây trồng bị ảnh
hưởng và hậu quả là năng suất của cây trồng bị suy giảm. Những thay đổi
diễn ra trong cây trồng dưới điều kiện hạn chủ yếu liên quan tới việc thay đổi
chức năng trao đổi chất và một trong những chức năng đó là sự suy giảm các
sắc tố quang hợp. Sự suy giảm sắc tố quang hợp dẫn tới giảm hấp thu ánh
sáng và không hình thành được năng lượng khử, mà đây là nguồn năng lượng
cho các phản ứng của pha tối trong quang hợp. Những thay đổi các sắc tố
quang hợp gần như liên quan tới hiệu suất sinh khối của quang hợp. Có thể
nói rằng, hạn làm thay đổi về mặt hình thái, lý sinh và thành phần các sắc tố
trong thực vật bậc cao [13], cụ thể là làm thay đổi tỷ lệ của diệp lục a/b và
carotenoid [7], [10]. Sự suy giảm hàm lượng diệp lục đã được thông báo trên
đối tượng cây bông [17] và cây dừa cạn (Catharanthus roseus) [12]. Hàm
lượng diệp lục giảm xuống mức đáng kể khi độ thiếu hụt nước càng cao ở cây
hướng dương [28] và ở cây Việt quất quả đen hay ỏng ảnh (Vaccinium
myrtillus) [29]. Tỷ lệ quang hợp ở lá của thực vật bậc cao như đã biết là giảm
cùng với hàm lượng nước tương đối và thế năng nước của lá [16], [30]. Tuy
nhiên vẫn còn tranh luận về hạn hán chủ yếu hạn chế quang hợp thông qua sự
đóng mở lỗ khí hoặc thông qua làm suy giảm trao đổi chất. Cả hạn chế do lỗ
khí hay không do lỗ khí nhìn chung chủ yếu làm giảm quang hợp dưới điều
kiện thiếu nước. Quá trình quang hợp bị hạn chế dưới điều kiện thiếu nước
thông qua hoạt động trao đổi chất giảm là một vấn đề rất phức tạp hơn rất
nhiều so với sự giới hạn của khí khổng và chủ yếu là giảm hàm lượng sắc tố
quang hợp ở cây hướng dương [31].
Sơ đồ một số nguyên nhân chính làm giảm sinh trưởng của cây dưới
điều kiện thiếu nước:

Trần Thị Hà

7

Lớp: K33A - Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Sinh lý thực vật

Stress hạn

Mất sức
trương

Tế bào giảm kéo dài và
mở rộng

Giảm nguyên
phân

Giảm sinh trưởng

Carotenoid là các phân tử isoprenoid kích thước lớn, chúng được tổng
hợp đầu tiên (de novo) ở tất cả các sinh vật quang hợp và nhiều sinh vật
không quang hợp. Chúng là dẫn xuất của hydrocarbon caroten chẳng hạn như
lycopene và β-carotene hoặc xanthophyll, một kiểu lutein. Thiệt hại oxy hóa
tạo ra bởi stress hạn trong thực vật mô được giảm bớt bởi hoạt động phối hợp
của cả hai hệ thống liên quan enzyme (enzymatic) và không liên quan enzym
(non-enzymatic) chống oxy hóa. Các yếu tố trong hai hệ thống đó gồm βcarotene, ascorbate (AA), α-tocopherol (α-toc), giảm glutathione (GSH) và

giảm hoạt động enzim superoxide dismutase (SOD), peroxidase

(POD),

ascorbate peroxidase (APX), catalase (CAT), polyphenol oxidase (PPO) và
glutathione reductase (GR). Caroten là một thành phần quan trọng trong hệ
thống bảo vệ cây trồng chống oxy hóa, nhưng chúng rất dễ bị oxy hóa phân
hủy β-carotene có mặt trong lạp lục của tất cả thực vật và chỉ liên kết với các
lõi của phức hệ PS I và PS II.
Stress nước là thay đổi nhiều quá trình trong đó có sự suy giảm hàm
lượng diệp lục và carotenoid [14]. Tuy nhiên, còn rất ít những công trình
nghiên cứu nhằm cải thiện hàm lượng sắc tố dưới điều kiện stress nước. Bên
cạnh đó, có những công trình nghiên cứu ứng dụng chất xử lý ngoại sinh như
brassionlide, uniconazole và methyl jasmonate nhằm cải thiện khả năng chịu

Trần Thị Hà

8

Lớp: K33A - Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Sinh lý thực vật

hạn với việc tăng hoạt động của superoxide dismutase (SOD), ascorbate
peroxidase (APX), catalase (CAT), ABA và cải thiện carotenoid tổng số ở
ngô. Tương tự như vậy, các chất có vai trò quan trọng là: tocopherol, lipid tan
trong chống oxy hóa trong lục lạp, có thể được hiểu như việc cải thiện hàm

lượng sắc tố dưới điều kiện bị stress trong các sinh vật quang hợp bao gồm
thuốc lá và cây Arabidopsis thaliana và Synechocystis sp. PCC6803.
Như vậy, có thể thấy những nỗ lực của con người đó là hoặc làm tăng
sinh tổng hợp sắc tố hoặc thay đổi phương thức tổng hợp sắc tố nhằm tăng
cường khả năng chịu hạn của thực vật.
1.3. Kỹ thuật huỳnh quang diệp lục để đánh giá khả năng chịu hạn của
cây trồng
Hiện nay, một kĩ thuật để đánh giá một cách nhanh chóng và chính xác
khả năng chịu hạn của thực vật được các nhà sinh lí thực vật cũng như sinh lí
sinh thái học sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu của mình đó là kĩ thuật
phân tích huỳnh quang diệp lục [18]. Bằng cách sử dụng kĩ thuật này, cho
phép đánh giá nhanh khả năng chống chịu của cây trồng với hạn hán, nhiệt,
lạnh, ánh sáng, và stress muối [19], [27].
Kỹ thuật này có thể được áp dụng cho việc nghiên cứu quang hợp và
cho các nghiên cứu về bộ máy quang hợp. Huỳnh quang diệp lục in vivo bị
ảnh hưởng bởi một số hiện tượng, mà từ đó ảnh hưởng đến quang hợp,
phương pháp huỳnh quang diệp lục có thể được đo bằng thiết bị hiện đại,
không có sự xâm lấn và phá hủy tế bào sống, và cũng dễ sử dụng trong lĩnh
vực thí nghiệm.
Các yếu tố ảnh hưởng đến quang hợp đều có thể được nghiên cứu
riêng, việc sử dụng kĩ thuật này cho phép đánh giá trạng thái hoạt động của bộ
máy quang hợp dưới tác động của các điều kiện gây stress. Sau đây là các yếu
tố stress và hiện tượng đặc biệt đã được nghiên cứu bằng cách sử dụng các kỹ

Trần Thị Hà

9

Lớp: K33A - Sinh

Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Sinh lý thực vật

thuật huỳnh quang diệp lục: ô nhiễm môi trường, stress nước, quang ức chế photoinhibition, và nhiệt độ thấp.
Đã có nhiều công trình nghiên cứu viết về kỹ thuật này và các ứng
dụng có thể có của nó. Mối quan hệ được tìm thấy giữa các hoạt động của hệ
ánh sáng II và sự cố định CO2 của bộ lá, đây có thể là một tham số mạnh mẽ
để ước tính hiệu quả của bộ máy quang hợp. Ngày nay, huỳnh quang diệp lục
trở thành một công cụ tiềm năng cho một số nghiên cứu cơ bản và ứng dụng
thực tế [27]. Các tác giả đã chia các nhóm ứng dụng kỹ thuật này gồm:
• Đánh giá các thay đổi hóa học trong môi trường (stress hóa học); các
chất ức chế - Inhibitors, phân bón, các khí hoặc các stress của các yếu tố hóa
học nào khác có thể được kiểm tra.
• Nghiên cứu về các tham số vật lý của môi trường (stress vật lý), giống
như chất lượng và cường độ ánh sáng, quang ức chế-photoinhibition và nhiệt
độ.
• Cảm ứng sinh học: phân tích một hệ thống về sức sống, năng suất, sức
đề kháng với stress, nghiên cứu sinh thái động (eco-dynamics) của một hệ
thống phức tạp, ví dụ một cây trong vườn, hay trong khu rừng.
Trong một nghiên cứu với lúa mạch, về sức chống chịu của cây trồng
với hạn hán, nhiệt, lạnh, ánh sáng, và stress muối đã được kiểm nghiệm bằng
kỹ thuật này [9], [27]. Ví dụ khác của tác giả Prange (1986) đã thấy huỳnh
quang diệp lục có ý nghĩa là phát hiện nhanh chóng và nhạy cảm với sự mất
nước (làm khô) trong bộ lá khoai tây [19].
Khi một lá cây hấp thụ ánh sáng, một chuỗi phản ứng bắt đầu làm việc.
Quá trình này được gọi là quang hợp. Trong quá trình quang hợp, năng lượng
bức xạ được chuyển thành năng lượng hóa học nhờ một số cơ chế vật lý và
hóa học. Quá trình này bắt đầu với chất diệp lục hấp thụ ánh sáng bởi các

phân tử ăng-ten. Trong bước tiếp theo năng lượng bức xạ được chuyển giao

Trần Thị Hà

10

Lớp: K33A - Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Sinh lý thực vật

như năng lượng và kích thích được sử dụng trong một trung tâm phản ứng
hữu ích cho quá trình hóa học, hoặc bị tiêu tan, chủ yếu là nhiệt, và ít hơn là
bức xạ phát ra, hay nói cách khác, như trong huỳnh quang diệp lục in vivo
[27]. Vì vậy, “bẫy” năng lượng photon, năng lượng oxy hóa khử (như vậy,
gây ra dòng điện tử và quá trình quang hóa), bức xạ hồng ngoại và huỳnh
quang (hình 1.1).
Bức xạ kích thích quang hợp

Hệ thống ánh sáng
diệp lục a

Năng lượng
oxy hoá khử

Huỳnh quang

Nhiệt

Hình 1.1: Nguồn gốc huỳnh quang diệp lục
Màu xanh lá cây thực vật có chứa hai loại chất diệp lục. Chúng được
gọi là diệp lục a và diệp lục b. Trong ánh sáng trắng, chúng xuất hiện màu
xanh lá cây (green) vì chúng hấp thụ bước sóng của ánh sáng màu xanh và đỏ
của quang phổ (hình 1.2).

Hình 1.2: Phổ hấp thụ của chlorophyll a (đường liền) và chlorophyll b
(đường nét đứt)

Trần Thị Hà

11

Lớp: K33A - Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Sinh lý thực vật

Vì vậy, khi ánh sáng chiếu sáng trên lá thực vật, chỉ có năng lượng của
ánh sáng màu xanh lục (blue) và đỏ sẽ được hấp thụ bởi các diệp lục này. Một
phần năng lượng sẽ được sử dụng cho các phản ứng hóa học trong quang hợp.
Và tất cả các năng lượng không được sử dụng, sẽ được “tiêu phí”. Năng
lượng bị mất đi là ánh sáng chứa năng lượng thấp hơn so với ánh sáng hấp
thụ, có bước sóng dài hơn (theo định luật Planck). Vì vậy, việc phát xạ huỳnh
quang luôn luôn là một bước sóng dài hơn ánh sáng hấp thụ bởi bộ lá thực
vật.
Ở nhiệt độ sinh lý, trong thực vật bậc cao, gần như huỳnh quang đến từ

phân tử diệp lục a, có liên quan đến hệ thống ánh sáng II, một phát xạ huỳnh
quang cao cho một bước sóng 710 nm và có thể là liên quan đến hệ thống ánh
sáng I (PS I). Trong ý nghĩa này, hoạt động của cả hai hệ thống ánh sáng có
thể được so sánh bởi ý nghĩa của tỷ lệ huỳnh quang. Tuy nhiên, câu trả lời
huỳnh quang về cơ bản là giới hạn trong photosystem II ở nhiệt độ khí quyển
thông thường.
Huỳnh quang của PS II có thể được đo với quang tử hoặc với một
photodiode (đi-ốt quang) nhạy cảm với ánh sáng ở vùng 690 nm. Thông số
huỳnh quang diệp lục và stress thực vật:
 F0: bị ảnh hưởng bởi các stress của môi trường, gây biến đổi ở mức độ
sắc tố của PS II. Ví dụ, nhiệt làm hư hại của PS II được đặc trưng bởi
sự gia tăng mạnh mẽ F0 nhưng nhiệt độ thấp (băng giá) gây hư hại
thylakoid lại không ảnh hưởng đến F0.
 Fv: sự khác biệt Fm-F0 là gọi là huỳnh quang biến đổi. Thông thường
giá trị này được hạ xuống bằng stress môi trường, mà nguyên nhân là
gây hư hại trên thylakoid. Ví dụ các loại stress này như: nóng, lạnh và
quang ức chế (photoinhibition).

Trần Thị Hà

12

Lớp: K33A - Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Sinh lý thực vật

 Fm: huỳnh quang tối đa giảm sau khi tiếp xúc của lá với nhiệt độ cao

nhưng không nguy hiểm. Xử lý nhiệt là nguyên nhân tăng F0 và giảm
Fm, hoạt động của PS II sẽ bị ức chế.
 Fm/F0: tỉ lệ này phụ thuộc vào thế năng nước của lá. Trong điều kiện
khô hạn nó sẽ giảm xuống tới 1. Trong điều kiện hạn hán trầm trọng
Fv không được tạo ra, nhưng sau khi có nước tỷ lệ này được phục hồi
lên đến 3,0.
 Fv/Fm: mối quan hệ này thường trong khoảng 0,832 ± 0,004 và nó tỷ lệ
thuận với hiệu suất lượng tử của phase quang hóa của quang hợp. Sự
giảm tỷ lệ này là một chỉ số tốt cho đánh giá thiệt hại của
photoinhibition gây ra bởi ánh sáng khi thực vật trải qua các loại stress
môi trường như hạn hán, lạnh, băng giá, chiếu sáng quá mức hoặc độ
mặn. Khi các thay đổi trong hệ số tương quan này được kiểm tra, có sự
gia tăng hiệu quả F0 (thường là do sự phá hoại các trung tâm phản ứng
của PS II) có thể được tách ra từ giảm của Fv, mà thường được giải
thích là chỉ số gia tăng của F0 không “dập tắt” quang hóa. Cũng cần lưu
ý rằng photoinhibition, ví dụ, có tác dụng kích thích cả hai.
Như đã đề cập, hiện nay đã có rất nhiều công trình khoa học đánh giá
nhanh chóng khả năng chịu hạn của thực vật thông qua phân tích huỳnh
quang diệp lục, trên đối tượng khoai tây, tác giả Prange (1986) [19] đã thấy
huỳnh quang diệp lục có ý nghĩa là phát hiện nhanh chóng và nhạy cảm với
sự mất nước (làm khô) trong bộ lá. Trong một nghiên cứu với lúa mạch, về
sức chống chịu của cây trồng với hạn hán, nhiệt, lạnh, ánh sáng, và stress
muối đã được kiểm nghiệm bằng kỹ thuật này [27]. Trong nghiên cứu về ảnh
hưởng của hạn đất đến quang hợp và huỳnh quang diệp lục trên 3 giống đậu
xanh, cho thấy giá trị F0 tăng kết hợp với sự suy giảm của Fm [32], giá trị
Fv/Fm cũng bị suy giảm nhanh vào giai đoạn cuối của quá trình gây hạn ở

Trần Thị Hà

13

Lớp: K33A - Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Sinh lý thực vật

Arabidopsis thaliana, thông số này phản ánh các thông số của quá trình quang
hợp, từ đó cho thấy điều kiện hạn ảnh hưởng đến toàn bộ bộ máy quang hợp
đặc biệt vào thời gian gây hạn cuối cùng [29]. Sự suy giảm của giá trị Fv/Fm
cũng gặp trong trường hợp cà chua gặp hạn muối, ngoài ra cà chua còn tăng
hàm lượng axit absisic, tăng 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC)
là tiền chất của ethylene, ACC là hợp chất hormone tăng đồng thời với sự bắt
đầu quá trình oxi hóa và sự suy giảm của huỳnh quang diệp lục [11].
1.4. Proline và vai trò đối với thực vật
Ngoài những thay đổi về chỉ tiêu sinh lý nói trên thì trong điều kiện hạn
cơ thể thực vật còn có những biến đổi đáp ứng về sinh hóa trong đó sự tăng
hàm lượng proline là có ý nghĩa nhất. Proline hay α-pirolidin cacboxylic là
một α-iminoaxit ưa nước có công thức phân tử C5H9NO2, có mạch bên là
hidrocacbua khác với các axit amin khác ở chỗ nhóm amin bậc 1 ở Cα liên kết
với cacbon của mạch bên tạo thành vòng pirolidin.

Cấu trúc không gian

Công thức cấu tạo

Proline là một axit amino có khả năng hòa tan mạnh trong nước, giữ
nước và lấy nước cho tế bào. Proline được tích lũy ở lá cây của nhiều loài
thực vật, mô lá, mô phân sinh chóp rễ của thực vật, tích lũy trong hạt phấn bị

làm khô, tích lũy ở vùng chóp rễ đang sinh trưởng và những tế bào thực vật
nuôi cấy trong môi trường huyền phù đã thích nghi với điều kiện stress nước.
Proline bảo vệ màng tế bào và protein chống lại ảnh hưởng bất lợi của sự tập
trung cao các ion vô cơ và nhiệt độ.

Trần Thị Hà

14

Lớp: K33A - Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Sinh lý thực vật

Quá trình tổng hợp proline nằm ở trung tâm của sự chuyển hóa cacbon
và đồng hóa nitơ. Bất kỳ sự thay đổi về nồng độ proline (có thể là liên quan
stress hoặc không) sẽ đi kèm với những thay đổi trong quá trình chuyển hóa
tổng hợp nitơ, cũng ảnh hưởng đến sự chuyển hóa các phân tử khác, như
protein và polyamine.
Theo Samaras và cs, 1995 [25] con đường tổng hợp proline trong thực
vật như sau:

Hình 1.3: Các con đường biến đổi của sự chuyển hóa proline ở thực
vật

bậc

cao

P5SC, Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase ;

Δ1-pyrroline-5-carboxylate reductase ;

P2CR,

P5CR

Δ1-pyrroline-2-carboxylate reductase ;

2
α CG, α -ketoglutarate; GLU, L-glutamate; (1) N -acetyl-L-ornithine-amindohydrolase ; (2)

N2 -acetyl-L-ornithine:L-glutamate N-acetyltransferase ; OAT, ornithine-σ-aminotransferase;

Trần Thị Hà

15

Lớp: K33A - Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Sinh lý thực vật

(3) ornithine- α -aminotransferase (a) + ATP  ADP; (b) + NADPH+H+  NADP+ + Pi;
(c) + NADPH+ H+  NADP+.

Phân tử proline có cấu trúc vòng (pirolidin), cấu trúc này tạo nên cho
proline một hình dáng vững chắc hơn so với các axit amin khác. Như vậy, vai
trò của proline trong chống chịu stress nước ở thực vật thể hiện: proline tham
gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu của nội bào và tham gia vào cấu trúc bảo vệ
màng và protein , chống oxy hóa, điều hòa pH tế bào chất, lưu trữ cacbon và
nitơ, bảo vệ trao đổi chất chống lại điều kiện stress.
Sự tích lũy proline là một phản ứng chuyển hóa thông thường ở thực vật
trong điều kiện thiếu hụt nước và stress muối, đây là chủ đề được các nhà khoa
học nghiên cứu trong nhiều năm qua [20].
Đã có nhiều công trình ở nước ngoài nghiên cứu trên các đối tượng
thực vật và cây trồng khác nhau, để tìm hiểu về cơ chế tổng hợp, chuyển hoá
proline… liên quan đến vai trò của proline đối với tính chịu hạn của thực vật.
Trong dòng tế bào thuốc lá được nuôi cấy thích nghi với nồng độ 428 mM
NaCl, proline chiếm trên 80% axit amin tự do [23]. Người ta thừa nhận rằng
có sự phân bố đồng đều proline trong toàn bộ thể tích nước của nội bào, kết
quả xác định axit amin tại thời điểm này vượt quá 129 mM. Tuy nhiên, nếu
chỉ hạn chế trong nội bào thì sự tích lũy proline có thể vượt quá nồng độ 200
mM trong các tế bào này vì thế nó góp phần căn bản vào việc điều chỉnh thẩm
thấu nội bào. Cũng trên đối tượng cây thuốc lá, tác giả Kishor và CS (1995)
[15] nghiên cứu cây thuốc lá được chuyển gen (gen liên quan đến sinh tổng
hợp proline – P5CS) trong điều kiện hạn nước, hạn muối, kết quả cho thấy
hàm lượng proline gấp khoảng từ 10-18 lần so với đối chứng.
Ở Việt Nam, đã có một số tác giả nghiên cứu về vai trò của proline đối
với khả năng chịu hạn của nhiều loại cây trồng cũng cho kết quả khả quan.
Tác giả Đinh Thị Phòng (2003) bằng việc xử lí lạnh, mặn, hạn trên các giống

Trần Thị Hà

16

Lớp: K33A - Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Sinh lý thực vật

lúa đã cho thấy có mối tương quan thuận giữa tính chống chịu của cây với
hàm lượng proline gia tăng của các giống lúa nghiên cứu [2]. Trên các đối
tượng cà chua, đậu xanh khi nghiên cứu cũng cho thấy có sự tích lũy proline
trong cây sống trong điều kiện thiếu nước hay stress muối [3], [4].

Trần Thị Hà

17

Lớp: K33A - Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Sinh lý thực vật

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.Vật liệu thực vật
Gồm 2 giống cà chua: VL-3000 và Gandeera đang được gieo trồng tại
Vĩnh Phúc. Nguồn gốc và đặc điểm của 2 giống cà chua được trình bày trong
bảng 2.1.
Bảng 2.1. Đặc điểm của 2 giống cà chua
Tên giống

Xuất xứ

Đặc điểm sinh học
Là giống lai chống được các bệnh xoăn lá,
sương mai...giống sinh trưởng bán hữu hạn.

VL – 3000

Mỹ

Thời gian sinh trưởng từ 100-120 ngày, thời
gian thu hoạch kéo dài từ 30-60 ngày tùy
từng vụ.
Là giống lai chống bệnh xoăn vàng ngọn,
giống sinh trưởng bán hữu hạn, cây cao từ

Gandeera

Ấn Độ

110-130cm. Thời gian sinh trưởng 130-150
ngày, sinh trưởng khỏe, chịu nhiệt và chịu
mưa tốt. Thời gian thu hoạch kéo dài 40-60
ngày tùy vụ và điều kiện thâm canh.

2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm tại Khu nhà lưới, khoa Sinh-KTNN, trường Đại học Sư
phạm Hà Nội 2 vào tháng 9 - tháng 12 năm 2009.

* Thí nghiệm 1: Xác định chỉ số chịu hạn tương đối
Gieo 2 giống cà chua vào các chậu trồng chứa cát vàng (10cm x 10cm),

Trần Thị Hà

18

Lớp: K33A - Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Sinh lý thực vật

mỗi giống được gieo vào 20 chậu, ngâm các chậu này vào trong dung dịch
dinh dưỡng, 2 ngày thay dung dịch 1 lần.
Sau 7 ngày cây có 3 lá thật, nhấc các chậu ra khỏi dung dịch và ủ vào
trong cát đã phơi khô, giữ nguyên trạng thái để theo dõi mức độ héo của cây
trong 5 - 7 ngày kể từ khi lô thí nghiệm bắt đầu có cây héo. Tính tỷ lệ cây
không héo ra phần trăm (% CKH).
Sau 5 ngày để héo, tiến hành tưới dung dịch dinh dưỡng phục hồi.
Đánh giá tỷ lệ cây phục hồi sau 1 ngày, 3 ngày, 5 ngày (%CPH).
* Thí nghiệm 2: Phân tích diệp lục tổng số, huỳnh quang diệp lục và
proline ở hai giai đoạn ra hoa và quả non
Gieo hạt 2 giống cà chua vào các chậu, kích thước chậu: cao 45cm,
đường kính 35cm, mỗi giống được gieo 20 chậu, đến giai đoạn cây non chỉ để
lại 1 cây trong mỗi chậu, đảm bảo lượng đất, lượng phân bón, chế độ tưới tiêu
nước, chế độ chăm sóc đồng đều giữa các chậu thí nghiệm theo kỹ thuật thông
thường sau đó chia số chậu thành 2 lô:
- Lô 1: dùng để xác định hàm lượng diệp lục tổng số, huỳnh quang diệp

lục, hàm lượng proline trong lá cà chua giữa công thức đối chứng (cung cấp
đủ nước) và công thức thí nghiệm (gây hạn nhân tạo) vào thời kì ra hoa.
- Lô 2: dùng để xác định hàm lượng diệp lục tổng số, huỳnh quang diệp
lục, hàm lượng proline trong lá cà chua giữa công thức đối chứng (cung cấp
đủ nước) và công thức thí nghiệm (gây hạn nhân tạo) vào thời kì quả non.
Thời gian theo dõi sự biến động hàm lượng diệp lục tổng số, huỳnh
quang diệp lục, hàm lượng proline trong quá trình gây hạn cây cà chua, từ khi
bắt đầu ngừng tưới nước đến khi 50% số cây của lô thí nghiệm có triệu chứng
héo.

Trần Thị Hà

19

Lớp: K33A - Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Sinh lý thực vật

2.2.2. Phương pháp xác định chỉ tiêu nghiên cứu
2.2.2.1. Phương pháp xác định chỉ số chịu hạn tương đối
Đánh giá khả năng chịu hạn theo phương pháp của Lê Trần Bình và cs
(1998) [1]
* Chuẩn bị dung dịch dinh dưỡng Knốp
Hóa chất

Knốp, g/l nước cất

Ca(NO3)2

1,00g

KH2PO4

0,25g

MgSO4.7H2O

0,25g

KCl

0,125g

FeCl3

0,0125g

Chú ý: Khi pha dung dịch Knốp, phải pha riêng từng hợp chất với nồng
độ gấp nhiều lần tùy thuộc vào lượng dung dịch cần sử dụng. Đó chính là
dung dịch gốc. Khi pha thành dung dịch Knốp để dùng ta lấy một phần của
dung dịch gốc và pha loãng bằng nước cất một số lần tương ứng. Chẳng hạn
nồng độ của dung dịch gốc vừa nêu là gấp 100 lần, bây giờ ta muốn có 1 lít
dung dịch sử dụng thì lấy 10ml dung dịch gốc và cho thêm 990 ml nước cất.
Chú ý khi pha dung dịch để nuôi trồng cây ta cần phải tuân thủ thứ tự các chất
như bảng trên nghĩa là đầu tiên pha dung dịch Ca(NO3)2, tiếp theo cho dung
dịch KH2PO4 vào với dung dịch Ca(NO3)2 tiếp theo đổ dung dịch
MgSO4.7H2O… làm như vậy để tránh kết tủa.

* Phương pháp
 Hạt nảy mầm gieo vào các chậu trồng chứa cát vàng (10cm x 10cm),
ngâm các chậu này vào trong dung dịch dinh dưỡng, 2 ngày thay dung
dịch 1 lần.
 Sau 7 ngày cây có 3 lá thật, nhấc các chậu ra khỏi dung dịch và ủ vào
trong cát đã phơi khô, giữ nguyên trạng thái để theo dõi mức độ héo
của cây trong 5 - 7 ngày kể từ khi lô thí nghiệm bắt đầu có cây héo.

Trần Thị Hà

20

Lớp: K33A - Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Sinh lý thực vật

Tính tỷ lệ cây không héo ra phần trăm (% CKH).
 Sau 5 ngày để héo, tiến hành tưới dung dịch dinh dưỡng phục hồi.
Đánh giá tỷ lệ cây phục hồi sau 1 ngày, 3 ngày, 5 ngày (%CPH).
 Tỷ lệ cây không héo và cây phục hồi (S).
 Phần trăm cây không héo (CKH), phần trăm cây phục hồi (CPH) được
tính theo công thức sau:

S(%)=

N
x100

Nt

Trong đó:
S = tỷ lệ phần trăm cây không héo (hay cây phục hồi)
N = Số cây không héo (hay số cây phục hồi)
Nt = Tổng số cá thể tham gia thí nghiệm
* Hệ số chịu hạn tương đối (S)
Để so sánh các giống với nhau cần xây dựng một hệ số chịu hạn tương
đối. Hệ số đó của một giống được đánh giá bằng diện tích hình rada biểu diễn
trong hệ tọa độ đa trục theo công thức như sau:
S=

1
2 2

(ab+bc+....+ga)

Trong đó:
S = chỉ số chịu hạn tương đối
a = phần trăm cây không héo sau để hạn 1 ngày
b = phần trăm cây phục hồi sau 1 ngày tưới nước
c = phần trăm cây không héo sau để hạn 3 ngày
d = phần trăm cây phục hồi sau 3 ngày tưới nước
e = phần trăm cây không héo sau để hạn 5 ngày
g = phần trăm cây phục hồi sau 5 ngày tưới nước

Chỉ số chịu hạn càng lớn thì khả năng chịu hạn càng cao [1].

Trần Thị Hà

21

Lớp: K33A - Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Sinh lý thực vật

2.2.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng diệp lục tổng số
Xác định chỉ số hàm lượng diệp lục tổng số được đo trên máy cầm tay
Chlorophyll meter SPAD-502 (Konica Minolta, Nhật Bản).
Nguyên tắc hoạt động: máy đo chlorophyll meter SPAD-502 xác định
diệp lục tổng số thông qua đánh giá sự hấp thụ ánh sáng ở hai vùng sóng ánh
sáng của phân tử diệp lục, với diệp lục được tách chiết bằng acetone 80% sẽ
hấp thụ ánh sáng vùng xanh (400-500nm) và vùng đỏ (600-700nm) không có
hệ số truyền (transmittances) vùng cận hồng ngoại. Từ đặc tính này của diệp
lục, máy SPAD-502 đánh giá sự hấp thụ của lá ở hai vùng: vùng đỏ và vùng
cận hồng ngoại, sử dụng hai thiết bị truyền, qua đó máy sẽ tính toán ra giá trị
của SPAD tỉ lệ với số diệp lục trong lá.
2.2.2.3. Phương pháp xác định chỉ tiêu huỳnh quang diệp lục
Ánh sáng bức xạ có bước sóng từ 400-700nm cung cấp năng lượng sơ
cấp rất cần thiết cho quá trình quang hợp. Gần như ánh sáng nhận được bởi lá
được hấp thụ cho các quá trình sinh hóa. Tuy nhiên, một tỉ lệ nhỏ của ánh
sáng bức xạ trở lại được phát ra từ các trung tâm phản ứng với bước sóng dài
hơn được gọi là huỳnh quang diệp lục.
Huỳnh quang diệp lục được đo trên máy Chlorophyll fluorometer OS–
30 (ADC, Anh). Thời gian ủ tối là 10 phút để các tâm phản ứng ở trạng thái
“mở” hoàn toàn hay toàn bộ chất nhận điện tử đầu tiên trong mạch vận
chuyển điện tử quang hợp – Quinon A (QA) ở trạng thái oxi hoá.

Máy đo xác định các chỉ tiêu:
 F0 – Cường độ huỳnh quang ổn định, F0 phản ánh sự mất đi năng
lượng kích thích bằng bức xạ trong khoảng thời gian vận chuyển chúng
về tâm phản ứng PSII ở trạng thái “mở”.
 Fm – Cường độ huỳnh quang cực đại, Fm đo được khi các tâm phản ứng
PSII ở trạng thái “đóng”, khi đó QA bị khử.

Trần Thị Hà

22

Lớp: K33A - Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Sinh lý thực vật

 Fvm – Hiệu suất huỳnh quang biến đổi, Fvm phản ánh hiệu quả sử dụng
năng lượng ánh sáng trong phản ứng quang hoá, được xác định như
sau:

Fvm =

Fv Fm -F0
=
Fm
Fm

Lá chọn để đo thuộc cùng một tầng lá (lá thứ 3 tính từ ngọn xuống), là

lá được đánh giá có hoạt động sinh lí, sinh hoá mạnh nhất.
2.2.2.4. Phương pháp xác định hàm lượng proline
Hàm lượng proline được xác định theo phương pháp của Bates và cs
(1973) [8].
* Phương pháp xây dựng đường chuẩn proline
Tiến hành pha proline tinh khiết ở các nồng độ µg/ml, sau đó tiến hành
đo độ hấp thụ quang (OD – optical density) ở bước sóng 520nm trên máy
UV-2450 (Shimadzu, Nhật Bản). Nồng độ proline và mật độ quang học được
trình bày trong bảng 2.2.
Bảng 2.2: Nồng độ proline và giá trị OD

Trần Thị Hà

Nồng độ (μg/ml)

OD

20

0,45

40

0,81

60

1,17

80

1,52

100

1,88

23

Lớp: K33A - Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Sinh lý thực vật

Dựng đồ thị biểu diễn và lập đường chuẩn proline bằng phần mềm Excel.

Hình 2.1: Biểu đồ biểu diễn đường chuẩn proline
Trong đó: X là nồng độ proline (μg/ml); Y là giá trị OD tương ứng với
nồng độ X.
* Phương pháp định lượng proline
Phương pháp định lượng proline tự do trong các mô lá, bao gồm bốn
bước chính được mô tả trong hình 2.2, gồm các bước chính:

Trần Thị Hà

24

Lớp: K33A - Sinh

Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Sinh lý thực vật

Nghiền đồng thể và lọc
`

Mô lá tươi (0,25-0,50g) + 5 ml axit Sulphosalicylic 3%
Nghiền (bằng nitơ lỏng)
Lọc (li tâm)

Phản ứng với ninhydrin
Dịch lọc + 2 ml axit ninhydrin + 2 ml axit axetic
1000C, 1h
Làm lạnh: dừng phản ứng

Tách chiết
Bổ sung: 4 ml Toluen
Lắc đều: 15-20s
Đợi ở nhiệt độ phòng cho tới phản ứng có màu

Đo quang phổ hấp thụ (520 nm)
Tính toán nồng độ
hoặc hàm lượng (µg/g)

Proline tự do

Hình 2.2: Các bước chính của quá trình định lượng proline tự do bằng

phương pháp so màu (theo Bate và cs,1973)
 Cân 0,5g/mẫu nghiền kĩ, thêm 10 ml dung dịch axit sulfosalicylic 3%
(m/v), ly tâm 7000 vòng/phút trong thời gian 20 phút, lọc lấy dịch lọc.

Trần Thị Hà

25

Lớp: K33A - Sinh